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Agilent GC/MS Triple Cuadrupolo.

Sensibilidad y robustez en

aplicaciones en matriz compleja –

Parte II

Juan AybarEspecialista de Producto

GCMS LCMSAGILENT TECHNOLOGIES

901.11.68.90

Agenda1. Principales aplicaciones de interés con sistemas

GC Triple Cuadrupolo

2. Importancia del backflush y los sistemas de flujo capilar

3. Determinaciones de anabolizantes en laboratorios de dopaje

4. Screening de dioxinas

5. Conclusiones

Notas de aplicación GC Triple Cuadrupolo

• Aplicaciones medioambiente, alimentación, toxicología, clínica …

• Alta sensibilidad

• Elevada presencia de material coextraído de la matriz

• Importancia de la confirmación MS/MS

• Aplicaciones básicamente cuantitativas

• Entorno regulado

Principales aplicaciones emergentes en mercado alimentario

Hormonas Esteroideas (difíciles de medir con técnicas convencionales)

• GC/QQQ

Micotoxinas (más de 3,000 conocidas; efectos tóxicos inmediatos)

• Típicamente LC/MS

Dioxinas en alimentos (tradicionalmente requiere high-res y personal especializado)

• GC/QQQ – Rápido, simple, más sensible que convencional GC

Toxinas marinas (pequeña molécula producida por mariscos)

• LC/QQQ (cuantificación de targets conocidos)

• LC/TOF (descubrimiento de desconocidos)

Alérgenos (aspectos químicos de la identificación)

• LC/MS, LC/Q-TOF, GC/QQQ – Alérgenos de pequeña molécula

GCQQQ

7890A GC y 7000 Series Triple Cuadrupolo GC/MS Características dirigidas al alto rendimiento

Todos los beneficios del Agilent 7890

Las capacidades del GC son aún más valiosasen análisis MS/MS de trazas en matriz compleja:

• Nuevo 7693 Automatic Liquid Sampler (ALS)

• Nuevo Multi-mode Inlet (MMI)

• Nuevas configuraciones de backflush usando la Pressure-Controlled Tee (PCT)

7890A-7000B GC/MS/MSCaracterísticas dirigidas al alto rendimiento

El único sistema MS/MS del mercadodotado de una celda de colisión de altapresión, dotada de aceleración lineal y “quenching por helio” para reduccióndel ruido por neutros

Nueva Extraction Source de altasensibilidad. La mayor temperatura de trabajo (hasta 350 ºC) fabricada con el material más inerte

El único MS/MS del mercado con dos analizadores cuadrupolares e hiperbólicosde cuarzo y trabajando a alta temperatura(hasta 200 º C)

Dotado del neuvo software MassHunter para datosGC/MS/MS

El único sistema MS/MS del mercadocon las novedosos ramped-iris, detección de triple eje y EM de triple canal

Todos los beneficios del

7890 GC

Pérdida de señal en inyecciones replicadas con alta presencia de matriz

Multi-baffled liner –Típico de PTV clásicos

Backflush minimiza el efecto memoria, lasinterferencias provenientes de la matriz y los cambiosen RT disminuyendo las necesidades de mantenimiento

Extractos de lechuga y pimiento inyectados 3 veces con 2 min backflush y 3 veces sin backflush.Se muestra la primera/tercera inyección de cada serie. Sin backflushing, la tercera inyección (B) muestra carryover y cambios en RTs comparado con la primera inyección (A).

MEZCUA ET AL.: JOURNAL OF AOAC INTERNATIONAL VOL. 92, NO. 6, 2009

Nuevas configuraciones paraGC/MS Backflush

Vent

EPC

Column 1 Column 2

Purged Ultimate Union (PUU)

Agilent MS System

5975C MSD7000A QQQ

Agilent 7890A GC

Injection Port

Z ml/min

Z+ ml/min

P

Control integrado en software

Purged UltimateUnion

Horno GC 7890

Análisis de esteroides

anabolizantes en

laboratorios de dopaje

P. Van Eenoo, W. Van Gansbeke, N. De Brabanter, K. Deventer, F.T. DelbekeDoCoLab, Ghent University (UGent),

Technologiepark 30, B-9052 Zwijnaarde, Belgium

Quantitative•Steroid Profile

•Testosteron, epitestosterone (d3-Tgluc, d3-EpiTgluc)

•Androsterone, etiocholanolone (d4-Agluc, d5-E)

•DHT, 5a-androstane3a,17b-diol, 5b-androstane3a,17b-diol (d3-DHTgluc, d5-bab)

•DHEA, androstenedione (d3-DHTgluc)

•11b-OH-androsterone, 11b-OH-etiocholanolone (d4-Agluc, d5-E)

• 5a-androstanedione, 5b-androstanedione (MT)

•Norandrosterone (MT)

•THC-COOH (MT)

•Salbutamol (salb-d3)

Qualitative• anabolic agents

• beta-2-agonists

• hormone antagonists and modulators

• narcotics

• beta-blockers

• stimulants

• diuretics/masking agents/corticosteroids

Qualitative

• 52 Anabolic agents (or metabolites)

• 6 Beta-2-agonists• 11 Hormone antagonists and modulators (or metabolites)

• 12 Narcotics (or metabolites)

• 18 Beta-blockers • 32 stimulants (or metabolites)

• 2 diuretics/masking agents & 2 corticosteroids

Objetivo: Quant + Qual cumpliendo con los requerimientos de la WADA (MRPLs)

135 compuestos

MRM-transitions

Establecimiento de los MRMs necesario para QUANT/QUAL

Hasta 500 MRM/sDwell time MRM de

hasta 1 ms

Norandrosterone: 1 ng/ml Clenbuterol: 0.1 ng/ml

Boldenone metab.: 0.5 ng/ml Epimetenediol: 0.1 ng/ml

O

HHO

Cl

NH2

Cl

CH CH2 NH C

CH3

CH3

CH3OH

HHO

OH

HO

OH

Cromatogramas - Validación

Resultados cuantitativosNecesidades cuantitativas6 points, r2>0.98, RSD<2/3RSDmax, bias<15%

• Perfil de esteroides– Testosteron, epitestosterone : 1-200 ng/ml– Androsterone, etiocholanolone : 48-4800 ng/ml– 5a-androstane3a,17b-diol, 5b-androstane3a,17b-diol : 4-400 ng/ml– DHT, DHEA, androstenedione : 4-400 ng/ml– 11b-OH-androsterone, 11b-OH-etiocholanolone : 40-4000 ng/ml– 5a-androstanedione, 5b-androstanedione: 4-400 ng/ml

•Norandrosterone : 1-20 ng/ml

• THC-COOH : 5-100 ng/ml• Salbutamol : 100-2000 ng/ml

El cambio: el detector

Agilent 7000 QqQ MS• MS/MS – increased selectivity/sensitivity

• higher scan rate – more substances in SRM than SIM on 5975

• tested for H2

Objetivo: 1 single method• quantitative: SP, THCA, Salbutamol, NA

• qualitative: all conjugated doping agents

• with a fast turn-around

DIOXINAS, FURANOS y

PCBs

Determinación de dibenzo-p-dioxinas policloradas (PCDDs) ydibenzo-p-furanos policlorados (PCDFs) en alimentos usando elsistema 7000B Tandem Cuadrupolo GC-MS/MS

Chris SandyEMEA GC-MS Food Segment Scientist

Agilent Technologies UK

AgradecimientosDr Karl Petitt, Ms Karolina Songin

Marchwood Scientific Services, UKProf. Peter Fuerst, Dr Thorsten Bernsmann

CVUA-MEL, Munster, Germany

Introduccion / Background

¿Qué son las dioxinas?

• Las dioxinas son un grupo de contaminantes orgánicos altamente tóxicos y persistentes• No se fabrican de manera deliberada, siendo subproductos de la incineración de residuos, fabricación de pesticidas y productos químicos y fabricación de papel• 80% de la exposición en humanos proviene a través de la alimentación• Las dioxinas se acumulan en los tejidos grasos de ternera, pollo, cerdo y pescado• Legislación admite análisis GCMS, pero precisa confirmación HR-GCMS

EC 1881/2006Establecimiento de los nivelesmáximos de contaminantes en alimentos

7890-7000B GC-MS/MS Configuracion para análisis de dioxinas

7000BTQ

7890A

MS-TeeG3186B

PCM2uL cold pulsed splitless injectionCO2 MMI

2.0m x 0.25mm ID Uncoated deactivated Fused silica

60m x 0.25mm ID x 0.25umDB5-MSUI (122-5662UI)

0.9 ml/minConstant flow


MS-Tee



QQQ

PCMMMI

MS-Tee


QQQ

PCMMMI


Concurrent Back Flush

15 minutos después de la inyección, la pre-columna se ventea en backflushmientras que el análisis sigue en la

columna principal

TSSegment Start Time

(min.)Peak Number Analyte RT (min.) Pre-cursor 1 Product 1 CE (V) Pre-cursor 2 Product 2 CE (V)

1 25.00

1 1 13C-2378-TCDF 35.43 317.8 254 35 315.8 252 35

1 2 2378-TCDF 35.47 305.8 243 35 303.8 241 35

1 3 13C-1234-TCDD 35.77 333.8 270 20 331.8 268 20

1 4 13C-2378-TCDD 36.79 333.8 270 20 331.8 268 20

1 5 2378-TCDD 36.80 321.8 259 20 319.8 257 20

2 40.00

2 6 13C-12378-PCDF 42.55 351.8 288 30 349.8 286 30

2 7 12378-PCDF 42.56 339.8 277 30 337.8 275 30

2 8 13C-23478-PCDF 44.00 351.8 288 30 349.8 286 30

2 9 23478-PCDF 44.02 339.8 277 30 337.8 275 30

2 10 13C-12378-PCDD 44.45 367.8 304 21 365.8 302 21

2 11 12378-PCDD 44.48 355.8 293 21 353.8 291 21

3 46.00

3 12 13C-123478-HxCDF 48.04 385.8 322 35 383.8 320 35

3 13 123478-HxCDF 48.06 373.8 311 35 371.8 309 35

3 14 13C-123678-HxCDF 48.21 385.8 322 35 383.8 320 35

3 15 123678-HxCDF 48.22 373.8 311 35 371.8 309 35

3 16 13C-234678HxCDF 48.96 385.8 322 35 383.8 320 35

3 17 234678-HxCDF 48.97 373.8 311 35 371.8 309 35

3 18 13C-123478-HxCDD 49.17 403.8 340 22 401.8 338 22

3 19 123478-HxCDD 49.19 389.8 327 22 387.8 325 22

3 20 13C-123678-HxCDD 49.30 403.8 340 22 401.8 338 22

3 21 123678-HxCDD 49.32 389.8 327 22 387.8 325 22

3 22 13C-123789HxCDD 49.63 403.8 340 22 401.8 338 22

3 23 123789-HxCDD 49.65 389.8 327 22 387.8 325 22

3 24 13C-123789-HxCDF 50.04 385.8 322 35 383.8 320 35

3 25 123789-HxCDF 50.06 373.8 311 35 371.8 309 35

4 51.00

4 26 13C-1234678-HpCDF 51.84 421.8 358 30 419.8 356 30

4 27 1234678-HpCDF 51.86 409.8 347 30 407.8 345 30

4 28 13C-1234678-HpCDD 53.11 437.8 374 20 435.8 372 20

4 29 1234678-HpCDD 53.13 425.8 363 20 423.8 361 20

4 30 13C-1234789-HpCDF 53.69 421.8 359 30 419.8 357 30

4 31 1234789-HpCDF 53.70 421.8 358 30 419.8 356 30

5 55.00

5 32 13C-OCDD 56.23 471.7 408 20 469.7 406 20

5 33 OCDD 56.24 459.8 397 20 457.8 395 20

5 34 13C-OCDF 56.41 453.7 389.9 35 455.8 391.8 40

5 35 OCDF 56.42 443.7 381 25 441.7 378.6 30

Full GC-QQQ MRM Settings

Isómeros de PCDDs/PCDFs nativosTetra Penta Hexa Hepta Octa

Curva de: 2378-TCDD 100fg – 10pg inyectados

Fuente : CVUA-MEL

Curva de : 12378-PCDD 100fg – 10pg Inyectados

Fuente : CVUA-MEL

Reproducibilidad en area de pico (n=15)Extracto de cerdo añadido - nativas - 200 fg inyectados

Inj # 2378-TCDF 2378-TCDD 12378-PCDF 23478-PCDF 12378-PCDD

Acq. Date-Time Area* Area* Area* Area* Area*

1 09/04/2010 13:39 1039 668 791 898 480

2 09/04/2010 14:43 1189 702 891 877 565

3 09/04/2010 15:47 1104 728 882 879 606

4 09/04/2010 16:51 1035 756 789 852 563

5 09/04/2010 17:55 993 704 806 948 587

6 09/04/2010 18:58 1071 661 834 897 623

7 09/04/2010 20:02 1013 654 799 1012 568

8 09/04/2010 21:06 975 635 864 953 610

9 09/04/2010 22:10 1085 618 792 835 565

10 09/04/2010 23:13 1076 709 829 873 531

11 10/04/2010 00:17 942 799 745 1003 554

12 10/04/2010 01:21 957 679 853 834 540

13 10/04/2010 02:24 1050 584 877 914 579

14 10/04/2010 03:28 935 606 802 923 666

15 10/04/2010 04:32 1051 661 855 891 642

Mean 1034 678 827 906 579

Stdevn 68 57 42 54 46

%RSD 6.60 8.48 5.11 5.98 8.02

* Raw (uncorrected) peak area

Reproducibilidad en área de pico (n=15) Extracto de cerdo añadidoNativas - 200 fg inyectados , 13C-ISTDs - 2pg Inyectados

* Raw (uncorrected) peak area

0.00

2.00

4.00

6.00

8.00

10.00

12.00

Peak

Are

a %

RS

D

Native

13C-ISTD

Conclusiones1. GCQQQ buena elección para

aplicaciones de alta sensibilidad en presencia de matriz

2. Capacidad de implementar métodos Quant/Qual –pesticidas, drogas y esteroides anabolizantes … - gracias al gran número de transiciones/unidad de tiempo que son capaces de manejar

3. Screening de dioxinas (y compuestos similares) como alternativa a los sistemas de alta resolución

4. Más de notas de aplicación:

Juan [email protected]

901.11.68.90AGILENT TECHNOLOGIES

mailto:[email protected]



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