aplicaciones lc-ms de triple cuadrupolo y tof/qqtof usando ... · desecho carga (p.e. 2 min)...

Aplicaciones LC-MS de Triple cuadrupolo y TOF/QqTOF usando pre-concentración online.

14 de febrero de 2011

Página 1Jaume C. Morales

Especialista Productos LC/MS

Agilent Technologies

Retos Analíticos en Análisis de Aguas

• Sensibilidad y Selectividad: Muy bajos niveles (especialmente en aguas debido a su elevada ingesta).

– Uso MS y preconcentración

• Rapidez y reducción supresión ionización.

– Mejorar con UHPLC la cromatografía sin incrementar el tiempo.

– Reducir los tiempos con UHPLC manteniendo la resolución


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– Reducir los tiempos con UHPLC manteniendo la resolución cromatográfica.

• El elevado número de potenciales contaminantes conocidos y “desconocidos” que pueden llegar a emerger: “Screening” de cientos/miles de compuestos.

• Automatización preconcentración y “clean-up”.

•

• ………

¿La Respuesta al Dilema?

¿¿¿¿ Inyección Directa o Preconcentración ???

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• La preconcentración permitirá utilizar MS menos sensibles (+económicos).• La preconcentración consumirá más fungibles y mano de obra.

Dependerá del nº de muestras a procesar

Directiva de la Unión Europea – Análisis de Aguas Potables 98/83/EC

• Límite para un único pesticida 100 ng/litro (ppt’s - total pesticidas: 500 ng/l).

• La elevada ingesta de agua /persona (7-20Kg/semana –muy

superior al resto de alimentos) exige


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superior al resto de alimentos) exige detectar niveles muy bajos.

• La medida de compuestos se realiza preferentemente por LC-MS/MS debido a sus múltiples ventajas.

�¿Hasta donde podemos llegar con Inyección Directa?


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Directa?

Ejemplos con Inyección Directa

Ultra trace determination of 35 pesticides and other organicmicropollutants in water by Direct Injection (100µL)

Rapid Resolution LC/MS Triple QuadLlorca-Porcel, Diaz, Valor – LABAQUA // Analytica Chimica Acta, 624 (2008) 90-96


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AGILENT LC/MSD Triple Cuadrupolo

Datos cortesia de APPLUS+Labaqua

Sistema RRLC 1200 + Agilent 6410 QqQ

Ganador mejor poster

AGILENT LC/MS user meeting –

Almeria 2007

Límites de detección de unos pocos ppt’sInyectando 100µL agua

Kits de Aplicaciones para LC/MS-QqQ

Kits Base de Datos DMRM

• Adaptables a la cromatografía del usuario.

• Chequeo opcional de la aplicación on-site.

• Kit 600 pesticidas incluye:

– Columna y mezcla de test específica.

– QuEChERS Trial pack para preparación muestra.


Página 7

5990-4254EN

– DVD con los parámetros del métodos/s (LC y MS).

– Nota de aplicación y guía de inicio rápido.

– Ejemplos con distintas configuraciones y HPLC’s.

• Kit 200 compuestos de interés Toxicológico incluye:

– Columna y mezcla de test específica.

– DVD con los parámetros del métodos/s.

– Nota de aplicación y guía de inicio rápido.

– Contiene esencialmente drogas de abuso y fármacos

5990-4253EN

Ejemplo Condiciones 300 Pesticidas del Kit AplicacionesConfig. 1290 Infinity UHPLC / 6460- Agilent Jet Stream QqQ


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Agilent Jet Stream

1290 Infinity UHPLC 6460-QqQ

1290 Infinity UHPLC + 6460 QQQ Jet StreamProductividad y Sensibilidad: Análisis de 300 Pesticidas en 15 min. con dMRM Columna 150x2,1 STM-C18

600 Dynamic MRM Transitions9 replicates analyzed at 200 pg level

Mean area %RSD = 3.2

Mean height %RSD= 3.6

Column: 2.1 x 150mm, 1.7umMobile phase: A = H2O w/5 mM ammonium formate + 0.01% formic

B = MeOH w/5 mM ammonium formate + 0.01% formicLC Gradient: 8%B (T=0) to 92%B (T=15 min), hold 3 minColumn Temperature: 70°CLC flow rate: 0.5 ml/min

40 Pesticidas en 1 min

PW ~2 seg. FWHM

RSD% � � incertidumbre

Rango Calibrado


Página 9

15min

Rango Calibrado0.5 a 500 ppb

Iny.: 5µL

Cribado Masivo de Plaguicidas mediante

UHPLC/MS con Masa Exacta


Página 10

Nuevo Agilent 6540 Ultra High DefinitionAccurate Mass UHD Q-TOF

� 500 ppb exactitud de masa

� Sensibilidad a nivel de femtogramos

Excepcional exactitud de masa, sensibilidad, rango dinámico y resolución

… complemento perfecto para el UHPLC 1290 Infinity


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� Sensibilidad a nivel de femtogramos

� 5 órdenes de magnitud de rango dinámico

� 40,000 Resolución

� 20 Spectra/sec

� Excelente linealidad y fidelidad isotópica

� Agilent Jet Stream/HPLC-Chip

1290 Infinity/6540-UHD-QTOF: Fast UHPLC“Screening” 250 Pesticidas en 90 segundos.

4x10

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

1.4

1.6

1.8

2

2.2

2.4 145.06481924909

146.06893917868

Counts vs. Mass-to-Charge (m/z)

145 145.5 146 146.5 147

4x10

1.6

1.8

2

2.2

2.4

2.6

2.8

3

3.2

3.4

3.6

3.8

4

4.2

4.4

4.6

4.8

5

5.2 74.9Cpd 201: Naphthol, 1-

1290/6540 90seg análisis250 pesticidas (125pg on-column)

MS con masa exacta

1-naphthol

Mass [M+H]+ = 145.06489

Resolution = 24909

0.06 ppm


Página 12

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

1.4

1.6

Counts vs. Acquisition Time (sec)

58 60 62 64 66 68 70 72 74 76 78 80 82 84 86 88 90

4x10

0

0.5

1

1.5

2

2.5

3

3.5

4

4.5

5

5.5

422.20805938636

423.21126333121

424.21395629032


421.5 422 422.5 423 423.5 424 424.5 425 425.5

Fenpyroximate E

Mass [M+H]+ = 422.20806

Resolution = 38636

-0.25ppm

4x10

0

0.5

1

1.5

2

2.5

3

3.5

4

4.5

5

5.5

6

6.5

7

7.5

8

8.5

9732.468714

47094

733.47226542144

734.47514735133


731 731.5 732 732.5 733 733.5 734 734.5 735 735.5 736 736.5 737 737.5 738

Spinosad A

Mass [M+H]+ = 732.4687

Resolution = 47094-0.77ppm

90s

LC/MS-TOF(/QTOF):“Screening” de

cualquier compuesto ionizado

6540-QTOF Resolución

espectral: 25-47K

2 seg. 2 seg.

2 seg.

1290 Infinity/6540-UHD-QTOF: 10 ppb Pesticidasen Pimiento Rojo en 90 segundos

2.1 x 50 mm x 1.8µm Eclipse Plus C181.2 mL/min, 60 ºC

90s

10 ppb’s


Página 13

1111

Counts vs. Acquisition Time (sec)Counts vs. Acquisition Time (sec)Counts vs. Acquisition Time (sec)Counts vs. Acquisition Time (sec)4444 6666 8888 10101010 12121212 14141414 16161616 18181818 20202020 22222222 24242424 26262626 28282828 30303030 32323232 34343434 36363636 38383838 40404040 42424242 44444444 46464646 48484848 50505050 52525252 54545454 56565656 58585858 60606060 62626262 64646464 66666666 68686868 70707070 72727272 74747474 76767676 78787878 80808080 82828282 84848484 86868686 88888888

1a

1b

3a 4a

4b

2a

2b

3b

Name RT Mass Mass (Tgt) Diff (Tgt, ppm) Score (Tgt)

1a tricyclazole 0.652 189.036175 189.036068 0.57 98.10

1b propazine 0.929 229.109356 229.109423 -0.29 97.50

2a diethofencarb 0.953 267.146937 267.147058 -0.45 85.49

2b cyprodinil 0.936 225.126620 225.126598 0.10 98.82

3a cyproconazole 0.925 291.114106 291.113840 0.91 97.92

3b paclobutrazol 0.923 293.129448 293.129490 -0.14 96.74

4a tetraconazole 0.972 371.021290 371.021530 -0.65 99.45

4b azoxystrobin 0.957 403.116637 403.116821 -0.45 99.19

50 pg on-column

Exactitud m/z (promed. abs. ) : 0.45ppm

90s

4 seg.

10 ppb’s

UHD-TOF/QTOF: Resolución Espectral Independiente de la Frecuencia de AdquisiciónEjemplos con Pesticidas y Péptidos

15000

20000

25000

30000

35000

Reso

luti

on

azoxystrobin 404 m/z

cyproconazole 292 m/z

cyprodinil 226 m/z

diazinon 305 m/z

linuron 249 m/z

paclobutrazol 294 m/z

Pesticidas (m/z: 190-404)


Página 14

0

5000

10000

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

Acquisition Rate (scans/second)

paclobutrazol 294 m/z

propazine 229 m/z

tetraconazole 372 m/z

tricyclazole 190 m/zPéptidos (m/z: 368-1468)

40.000

…y además una excelente fidelidad isotópica

�¿Hasta donde podemos AUTOMATIZAR la preconcentración


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preconcentraciónde muestra?

Ejemplos con Preconcentración de muestra

Gerstel MPS-3: SPE Desechable automatizado(“clean-up”) acoplado a Agilent 6410 QQQ

Sistema típico para cartuchos SPE de 1 sólo uso.

Típico para muestras sucias: aguas residuales, frutas,

verduras,…..


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Configuración para Inyección Grandes Volúmenes

Bomba

GradientesDetectorColumnaInyector

Configuración con Inyección Directa*: según las condiciones utilizadas el volumen de inyección está limitado por las dimensiones de la columna*

Válvulas controladas por Agilent LC-1200 Infinity / MH o Chemstation

Configuración con Columna Concentradora

Desecho Carga(p.e. 2 min)

Concentración

Para analitos NO muy polares se podrán inyectar directamente volúmenes elevados de agua

ConcentradoraBomba de

Carga Isocrática

Pre-Columna Concen-tradora

en válvula 2 posiciones

Bomba

Gradientes

Inyector

Columna

SeparadoraDetector

(p.e. 2 min)

Análisis

Requiere 2 bombas

Concentración

Permitirá la inyección de grandes volúmenes. La elución de la columna

concentradora se realiza en sentido contrario a su sentido de carga

* Volumen típico de inyección 1-2 (5) % del V0 de la columna utilizada. V0(col. 100 x 4.6mm) =1.0ml

Compartimento Termostatizado de Columnas: opción con 2 bombas y válvula 6 vías

Preconcentración de Muestra*Backflush

/Fraccionamiento de Muestra

Fase de carga de muestra

Bomba de carga

* Al eluirse la muestra de la columna pre-concentradora en sentido contrario al de su carga, ya no es imprescindible que

ésta esté disuelta en eluyente sin poder de elución

Fase de elución de muestra

Bomba de elución

Configuración para Inyección Directa o con Pre-concentración de hasta 5.0 ml. de Muestra Sin necesidad de reconexión de capilares

ALS* 900µl (hasta 5.0ml)Una bomba de carga

cuaternaria dará mayor flexibilidad para limpiar y acondicionar

la pre-columnaPreconcen-

tración

ALS 100µl

*G1363A #020 inyector analítico con dosificador de 900µl

Con LC/MS-QqQ para cambiar de configuración se requerirá cerrar el software conectar/desconectar eléctricamente (ON/OFF) los módulos que interese y reiniciar el software para

reconocer los módulos conectados

Separación

Mientras no hayan eluido todos los analitos de la precolumna no se

podrá proceder a su lavado y preacondicionado

SB-C18: 9.4X 50mm 846975-202 (o rellenada con SB-Aqua)

Configuración para Inyección Directa o con Preconcentración de hasta 5.0 ml. de Muestra Con posibilidad de desacoplar pre-columna y columna para limpiar precolumna en modo “backflush” (con bomba analítica –B) y sin necesidad de reconexión de capilares

Preconcentración• Podría ser una válvula de 6 vías.

• Ësta configuración ofrece la flexibilidad de

Separación

ofrece la flexibilidad de disponer de 1 de cada

ACR: Tiempos de ciclo más cortos

• Tiempos de ciclo más breves y mayor capacidad de análisis de muestras para laboratorios de HTy desarrollo de métodos

• Regeneración de • Regeneración de columna de alternante con válvula de 2ps/10pt

• Mayor velocidad de producción

Sinregeneración

Análisis 1 Análisis 2 Análisis 3Regen. Regen.

Conregeneración Análisis 3Regen.Análisis 1

Regen.Análisis 2

• Para efectuar la regeneración en modo backflushbastará intercambiar las conexiones de la bomba de regeneración y del desecho

Agilent LC-MS QQQ neutral herbicide analyser

6 pre-columnas enriquecimiento regenerables (backflush)

Sistema pre-concentración Sistema analítico

Solución “Neutral Herbicides Analysis System” Directiva Aguas Potables: 98/83/EC

Esquema Sistema Preconcentración en Cartucho de Enriquecimiento Reutilizable. Elución en modo “backflush”


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Permitirá pre-concentrar hasta 100mL agua

Inyec.: 900-1.800µL, hasta 4.5mL

Ciclo: 20min/mta 80 mtas/ día

“Neutral Herbicides Analysis System”

“Neutral Herbicides Analysis System” Su Aspecto:

� SPE – injector program

Software Control: MassHunter

“Neutral Herbicides Analysis System”: Estándar añadido sobre blanco de matriz a 100 ng/l (ppt’s)

Estándar de calibración 100 pptVolumen Inyección 900 µl

Directiva Aguas Potables: 98/83/EC: Límite para un único pesticida 100 ng/litro (ppt’s)(total pesticidas 500 ng/l)

�Atrazine Carbendazim Carbetamide Chloridazon Chlortoluron Chloroxuron Cyanazine

��LinuronMetamitronMethabenzthiazuronMetoxuron Metsulfuron methyl Monolinuron Monuron

29 herbicidas:


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(total pesticidas 500 ng/l) Cyanazine Desethylatrazine Desisopropylatrazine Desmetryn Diflubenzuron Diuron Fenuron Irgarol 1051 Isoproturon

Monuron Neburon Prometryn Propazine Simazine Terbutryn Terbutylazine Trietazine

Resultados: MRM’s de 1 a 100ppt’s Metoxuron

• Metoxuron 1 to 100 ppt; injection volume 900 µl

Solvent Blank

Cal 1; 1 ppt

Cal 2; 5 ppt

Cal 3; 10 ppt

Cal 4; 50 ppt

Cal 5; 100 ppt

Página 27

Curva Calibrado de 1 a 100 ppt’sMetoxuron

• Metoxuron 1 to 100 ppt; injection volume 900 µl• Calibration points measured in triplicate

R2= 0.9969 5 niveles por triplicado

Resultados: MRM’s de 1 a 100ppt’s Terbutilazina

• Terbutylazine 1 to 100 ppt; injection volume 900 µlSolvent Blank

Cal 1; 1 ppt

Cal 2; 5 ppt

Cal 3; 10 ppt

Cal 4; 50 ppt

Cal 5; 100 ppt

Responses

Ejemplo de Calibración Terbutilazina

3 réplicas a 5 niveles de calibración: 1-100 ppt


Página 30


Resultados: MRM’s de 1 a 100ppt’s Monolinuron

• Monolinuron 1 to 100 ppt; injection volume 900 µlSolvent Blank

Cal 1; 1 ppt

Cal 2; 5 ppt

Cal 3; 10 ppt

Cal 4; 50 ppt

Cal 5; 100 ppt

Ejemplo de Calibración 1-100ppt’s Monolinuron

• Monolinuron 1 to 100 ppt; injection volume 900 µl• Calibration points measured in triplicate


TOF software Acquisition screen

TOF EIC bottom standard 0.05 ug/l (45pg on column)

Resumen Herramientas Agilent para Maximizar el Rendimiento y Productividad en Análisis de Aguas

• LC/MS-QqQ 6490 con iFunnnel:la máxima sensibilidad actual para evitar la preconcentración,

• Máxima Flexibilidad para automatizar etapas de análisis, preconcentración y “clean-up”:


Página 35

• LC/MS combinando estación preparaciónde muestra Gerstel MPS-3 con HPLC’s analíticos y semi-preparativos.

Agilent LC/MS-TOF & QTOF’sTrue Hi-Def TOF Technology

“All Performances All Time”

Potencialidad de la Masa Exacta Robusta en SeguridadMedio Ambiental.

¿Preguntas?


Página 36Mass Spec/tacular

Isidre Masana Especialista de Productos LC/MS AGILENT TECHNOLOGIES 901.11.68.90 [email protected]

C L E A R LY B E T T E R M S S O L U T I O N S

Mass SpectrometryNEWNEW

Muchas Gracias por rellenar los cuestionarios

Mass SpectrometryTechnologyProductsSolutions

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Jaume C. MoralesEspecialista Productos LC/MS AGILENT TECHNOLOGIES 901.11.68.90 [email protected]

aplicaciones lc-ms de triple cuadrupolo y tof/qqtof usando ... · desecho carga (p.e. 2 min)...

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