Tema 1 -Medida de los analitos por fotometra y espectrofotometra

1. Espectro electromagntico: distribucin energtica del conjunto de la radiacin electromagntica.

2. Interaccin de la energa radiante con la materiaLa energa radiante (radiacin electromagntica) puede manifestarse como movimiento ondulatorio (radiacin electromagntica) o como si estuviese integrada por un flujo de partculas discretas o paquetes ondulatorios energticos denominados fotones, es decir presentando propiedades electromagnticas y energticas. Ambos modelos son complementarios.

2.1. Parmetros ondulatorios:

Amplitud(A): longitud del vector elctrico mximo en la onda. Longitud de onda (): distancia entre dos puntos que se encuentran en el mismo punto de vibracin. Perodo (T): tiempo en segundos (s) que tarda una partcula en realizar una vibracin completa. Frecuencia (v): nmero de oscilaciones completas que una partcula realiza en una unidad de tiempo, generalmente un segundo.

3. Comportamiento de la materia ante la radiacin electromagntica La materia est constituida por tomos, iones o molculas.

En los tomos los electrones se disponen en orbitales ms o menos alejados del ncleo adoptando una configuracin caracterstica.

En las molculas los enlaces covalentes entre tomos se forman porque los electrones que los constituyen se localizan alrededor de los dos centros atmicos, de tal manera que se minimizan las fuerzas de repulsin. Las zonas interatmicas, ocupadas por electrones enlazantes, se conocen como orbitales moleculares y se pueden considerar como la superposicin de orbitales atmicos.

Cuando se incide sobre la materia con una energa radiante, tienen lugar determinadas transiciones electrnicas desde unos orbitales a otros. Estas transiciones electrnicas determinan cambios en el estado energtico de tomos o molculas, cambios que son caractersticos de cada especie atmica o molcula, por ello cada tomo o molcula absorbe una energa radiante de caractersticas definidas.

En base a este comportamiento, se aplican las tcnicas analticas espectroscpicas para identificar y/o cuantificar en muestras biolgicas los parmetros indicadores de estados fisiolgicos o patolgicos

3.1.Absorcin atmica: en los tomos, los electrones ocupan alrededor del ncleo determinados niveles energticos que definen orbitales caractersticos para cada tipo de tomo. En estas condiciones, un tomo, se encuentra en su estado fundamental o de menor energa, su configuracin electrnica es estable y tiende a mantenerla o a recuperarla si sta ha sido alterada, por incidir sobre ella radiacin

3.2. Absorcin molecular: los espectros de absorcin de las molculas poliatmicas son ms complejos que los espectros atmicos al presentar un mayor nmero de transiciones entre sus numerosos estados, esto supone una gran cantidad de lneas espectrales, tantas que se superponen entre ellas dando lugar a los espectros de bandas que abarcan un intervalo considerable de longitudes de onda.

3.3. Emisin: proceso que se produce cuando la materia se relaja y cede su exceso de energa en forma de fotones.

4. Ley de Lambert-Beer

Ley que indica la relacin directamente proporcional que existe entre la absorbancia de una muestra y su concentracin, al ser constantes los valores del trayecto ptico, la longitud de onda de la radiacin incidente, la absortividad (cantidad de luz absorbida por una solucin. La relacin directamente proporcional entre la absorcin de la radiacin por parte del analito y su concentracin en la muestra no es lineal en cualquier situacin. Existen una serie de condiciones limitantes o desviaciones de esta ley que dependen de determinadas caractersticas del analito o que tienen un origen instrumental o qumico, en las que la relacin no presenta linealidad. Estas desviaciones son:

Dependientes de las caractersticas del analito Limitaciones qumicas Limitaciones instrumentalesLa Ley de Lambert-Beer se cumple para un trayecto ptico de 1 cm (cubeta estandarizada).

4.1. Curva de calibracin: representacin grfica en un eje de coordenadas de absorbancia (ordenadas) frente a concentracin (abscisas). Para construir la curva de calibracin (que debe ser una recta) se ensayan varias soluciones de concentraciones conocidas y se determinan sus absorbancias, luego se representan grficamente sus concentraciones frente a sus absorbancias.La concentracin de la muestra a analizar se obtiene por interpolacin de su absorbancia en la curva de calibracin.

4.2. Linealidad: en las determinaciones fotomtricas se debe conocer la linealidad, que es el intervalo de concentraciones del cromgeno entre las cuales existe una relacin lineal entre concentracin y absorbancia.

5. Conceptos Fotometra: medida de las magnitudes relativas a las radiaciones, evaluadas segn la impresin visual producida por stas y basndose en ciertas convenciones.

Fotmetro: instrumento que sirve para medir la intensidad de una fuente luminosa.

Espectrmetro: aparato utilizado para medir la distribucin de una radiacin compleja en funcin de la longitud de onda o de la frecuencia si se trata de ondas y de la masa o de la energa de las partculas individuales si se trata de partculas.

Espectrofotometra: en qumica analtica es una tcnica de medicin que asocia el anlisis espectral de la espectroscopia a la medicin de magnitudes fotomtricas relativas, en la mayora de los casos relacionados con las propiedades de la materia.

Permite aislar, en la radiacin compleja emitida por una fuente, una radiacin casi monocromtica que caracteriza cualitativa y cuantitativamente la materia que ha atravesado.

En el rango de concentraciones adecuado las leyes de absorcin de Lambert-Beer permiten un anlisis cuantitativo.

6. Tcnicas espectroscpicas analticasCada tipo de radicacin afecta a un nivel diferente de la estructura atmica y molecular, esto nos permite clasificar diferentes tipos de tcnicas espectroscpicas.

7. Sistemas pticos espectroscpicos Espectrofotmetro: instrumento que combina las propiedades del espectrmetro y del fotmetro y permite la determinacin de intensidades relativas de radiaciones simples, elegidas a voluntad entre las muestras dadas.

Un espectrofotmetro consta de:

Fuente de radiacin: es el origen de la emisin energtica en forma de radiacin electromagntica lo suficientemente potente y estable para que sea posible su deteccin y su medida una vez que ha atravesado la muestra. Sistema de depsito de la muestra biolgica Selector de longitud de onda: tiene la funcin de seleccionar o discriminar una banda estrecha de longitud de onda de las procedentes de la fuente de radiacin con la finalidad de aumentar la sensibilidad de la medida de absorbancia. Detectores: sistemas que amplifican y transforman la energa radiante no absorbida por la muestra en energa elctrica y la convierten en una seal elctrica y cuantificable. Sistemas de registro y presentacin de datos.

Los sistemas pticos utilizados en espectrofotometra tienen su base en stos cuatro fenmenos:

1. Absorcin2. Emisin3. Dispersin4. Luminiscencia-fluorescencia, fosforescencia y quimioluminiscencia.Aplicaciones clnicas Muchos de los mtodos analticos espectrofotomtricos resultan de la aplicacin de la ley de Lambert-Beer. La selectividad en la absorcin o emisin de energa por parte de la materia, ha hecho posible el desarrollo de mtodos analticos cuya finalidad es la deteccin en fluidos y tejidos biolgicos de:

Ausencia o presencia de parmetros analticos. Cuantificacin de la concentracin de estos parmetros. La actividad de numerosas enzimas. Estos parmetros son indicadores de determinados estados tanto fisiolgicos como patolgicos y, junto a otras pruebas, permiten la prevencin, el diagnstico, el tratamiento o la evaluacin del seguimiento del tratamiento de estos estados de salud.

TEMA 2 - ESPECTROFOTOMETRA UV-VISIBLE

1) Definicin y fundamentos:La espectroscopia ultravioleta-visible o espectrofotometra ultravioleta-visible (UV/VIS) es una espectroscopia (estudio de la interaccin entre la radiacin electromagntica y la materia) de fotones y una espectrofotometra. Utiliza radiacin electromagntica (luz) de las regiones visible, ultravioleta cercana (UV) e infrarroja cercana (NIR) del espectro electromagntico. La radiacin absorbida por las molculas desde esta regin del espectro provoca transiciones electrnicas que pueden ser cuantificadas.

Todas las sustancias pueden absorber energa radiante. La absorcin de las radiaciones UV, visibles e IR depende de la estructura de las molculas, y es caracterstica para cada sustancia qumica. El color de las sustancias se debe a que absorben ciertas longitudes de onda de la luz blanca que incide sobre ellas y slo dejan pasar a nuestros ojos aquellas longitudes de onda no absorbida.Esta espectrofotometra utiliza radiaciones del campo UV de 80 a 400 nm, principalmente de 200 a 400 nm (UV cercano) y de luz visible de 400 a 800 nm, por lo que es de gran utilidad para caracterizar las soluciones en la regin ultravioleta-visible del espectro. Se rige por una ley muy importante: la ecuacin de Beer-Lambert.

1.1. Fuentes de radiacin: Lmparas descarga de Deuterio e Hidrgeno. La excitacin elctrica a presin reducida de estos elementos genera una radiacin continua en la banda espectral correspondiente al UV Lmparas de filamentos de Tungsteno. Origina radiacin de la regin visible e infrarrojo cercano del espectro entre 350-2.500nm Lmparas de arco de Xenn. La excitacin elctrica de una atmsfera de Xenn genera una radiacin continua en la banda espectral de 250 a 600 nm

2) Finalidad diagnstica:La espectrometra UV/Visible se utiliza habitualmente en la determinacin cuantitativa de soluciones de iones metlicos de transicin y compuestos orgnicos muy conjugados.

Soluciones de iones metlicos de transicin Las soluciones de iones metlicos de transicin pueden ser coloreadas (es decir, absorben la luz visible) debido a que los electrones en los tomos de metal se pueden excitar desde un estado electrnico a otro. El color de las soluciones de iones metlicos se ve muy afectado por la presencia de otras especies, como algunos aniones o ligandos.

Compuestos orgnicosLos compuestos orgnicos, especialmente aquellos con un alto grado de tambin absorben luz en las regiones del espectro electromagntico visible o ultravioleta. Los disolventes para estas determinaciones son a menudo el agua para los compuestos solubles en agua, o el etanol para compuestos orgnicos solubles. Los disolventes orgnicos pueden tener una significativa absorcin de UV, por lo que no todos los disolventes son adecuados para su uso en espectrometra UV. El etanol absorbe muy dbilmente en la mayora de longitudes de onda. La polaridad y el pH del disolvente pueden afectar la absorcin del espectro de un compuesto orgnico.

Aunque los complejos de transferencia de carga tambin dan lugar a colores, stos son a menudo demasiado intensos para ser usados en mediciones cuantitativas.

El espectrofotmetro UV/Vis puede utilizarse como detector para la Cromatografa Lquida de Alta Resolucin HPLC. La presencia de un analito da una respuesta que puede ser proporcional a la concentracin. Para resultados precisos, la respuesta del instrumento al analito debe compararse con la respuesta a un estndar, lo que es muy similar al uso de curvas de calibracin. La respuesta para una concentracin particular se conoce como factor de respuesta.

3) Ventajas e inconvenientes:

- Ventajas: 1) Rapidez2) Uso fcil3) Precisin extrema4) Versatilidad5) Eficiencia en el costo6) Sensibilidad7) Anlisis de superficies irregulares y materiales duros8) Preparacin mnima de la muestra - Inconvenientes: 1) En aquellas muestras que requieren disolucin es necesario que esta se lleve a cabo en el disolvente adecuado; y si estamos utilizando una celda de paso fijo es necesario asegurarse que la distancia no vare para anlisis cuantitativo. 2) Los problemas asociados con dichas celdas incluyen la aparicin de burbujas que dan lugar a bandas errneas. 3) Suele aparecer la banda del disolvente, pudiendo llegar a interferir. 4) Las ventanas de las clulas no estn completamente paralelas. 5) En slidos, hay problemas a la hora de tomar la misma cantidad de muestra.

Tema 3. Nefelometra y turbidimetra

DEFINICIN: QU ES?

Nefelometra y / o Turbidimetra son mtodos analticos basados en la dispersin de partculas suspendidas en lquidos.

-Turbidimetra: es la medicin de la luz transmitida a travs de una suspensin, tiene la ventaja de permitir la valorizacin cuantitativa, sin separar el producto de la solucin. Las mediciones, pueden efectuarse con cualquier espectrofotmetro.-Nefelometra:mide la luz dispersada en direccin distinta a la luzemitida (generalmente con ngulos que oscilan entre 15 y 90).Utiliza como instrumento el nefelmetro (en el que el detector seubica con un ngulo que oscila entre 15 y 90 ej. a 90). Se sueleutilizar para concentraciones ms diluidas.Permite mayor sensibilidad con concentraciones menores de partculas suspendidas.Constituye un mtodo ms exacto para la medida de la opacidad.

FUNDAMENTO: EN QU SE BASA?Cuando la luz atraviesa un medio transparente en el que existe una suspensin de partculas slidas, se dispersa en todas direcciones y como consecuencia se observa turbia.

La turbidez es la propiedad ptica de una muestra que hace que la radiacin sea dispersada y absorbida ms que transmitida en lnea recta a travs de la muestra. Es ocasionada por la presencia de materia suspendida en un lquido. Y para medirla utilizamos ambos mtodos. La dispersin no supone la prdida neta de potencia radiante, slo es afectada la direccin de la propagacin, la intensidad de la radiacin es la misma en cualquier ngulo.

En la turbidimetra se compara la intensidad del rayo de luz que emerge con la del que llega a la disolucin. En cambio, en la nefelometra la medida de la intensidad de luz se hace con un ngulo de 90 con respecto a la radiacin incidente.

El instrumento usado en la nefelometra, el nefelmetro en cambio en turbidimetra se utiliza el turbidmetro que es un fotmetro de filtro.

El procedimiento de la nefelometra generalmente es emprico y slo se consideran 3 factores:1. La concentracin: Mayor sea el nmero de partculas, mayor es la dispersin.2. Tamao de la partcula: Factores como el pH, la velocidad y orden de la mezcla, concentracin de los reactivos y la fuerza inica.3. Longitud de onda: Generalmente las muestras se iluminan con luz blanca, pero si estn coloreadas, se debe escoger una porcin del espectro electromagntico en la que la absorcin del medio se reduzca al mnimo

Diferencias turbidimetria y nefelometraLa nefelometra se basa en la medicin de radiacin dispersa, en cambio la turbidimetra en la medicin de la intensidad de un haz disminuido.

Factores para la eleccin entre turbidimetra y nefelometra:

- Intensidad de la radiacin transmitida o dispersada con la intensidad de la radiacin procedente de la fuente.La mejor eleccin cuando la muestra contiene pocas partculas dispersantes es la nefelometra. La turbidimetra es buena cuando las muestras contienen grandes concentraciones de partculas dispersantes.

- Tamao de las partculas dispersantes. En la nefelometra la intensidad de la radiacin dispersada a 90 es mayor si las partculas son bastante pequeas para que se produzca una dispersin Rayleigh. Si las partculas son mayores la intensidad de la dispersin disminuir.En turbidimetra la seal consiste en la disminucin relativa de la radiacin transmitida, por lo que el tamao de las partculas dispersantes es menos importante.

FINALIDADES: PARA QU SE UTILIZA?Se utilizan normalmente en el anlisis de la calidad qumica del agua, para determinar la claridad y para el control de los procesos de tratamiento. Tambin para la determinacin de iones sulfato.

Turbidimetra:-Se utiliza para el anlisis de fibringeno, triglicridos, complejos Ag-Ac y otras sustancias.- Aplicable cuando la dispersin es suficientemente grande (concentracin alta de partculas).

Nefelometra:- Preferible para concentraciones bajas de partculas, ya que la dispersin es menor y la disminucin de intensidad del haz incidente es pequea. - Se suele utilizar para medir concentraciones especficas de colonias de bacterias en algn medio de cultivo, o de muchas protenas utilizando el principio de dispersin luminosa molecular.

TEMA 4 - FLUORIMETRA Y QUIMIOLUMINISCENCIA

FLUORESCENCIA, FOSFORESCENCIA Y QUIMIOLUMINISCENCIA

Dentro de los fenmeno llamado luminiscencia se encuentran el de fluorescencia, fosforescencia y quimioluminiscencia.

FLUORESCENCIA

Definicin y fundamentoEs la luminiscencia causada nica y exclusivamente por rayos ultravioleta. El trmino fluorescencia proviene del mineral que presenta este fenmeno por naturaleza, la fluorita.

La fluorescencia se produce cuando una molcula absorbe luz de una determinada longitud de onda(energa), y emite luz de una longitud de onda superior (menor energa).

Cuando una molcula es excitada por un haz de luz de una intensidad y energa determinadas, absorbe energa y se produce el paso de sus electrones de un estado basal a un estado excitado, liberando esta energa en forma de luz, resultando en una emisin fluorescente o fluorescencia.

Fluorimetra

La fluorimetra combina la fotometra con la alta sensibilidad y especificidad del fenmeno fluorescente. Para la medida de la fluorescencia se usan:- Fluormetros que usan filtros interferenciales o filtros de vidrio.- Espectrofluormetros que usan prismas o redes de difraccin.

Los componentes bsicos de estos aparatos son:1. Fuente de luz de excitacin (energa radiante):Se pueden emplear lmparas de arco de xenn o lmparas de mercurio

2. Rendijas de excitacin y emisin:Son iguales a las del espectrofotmetro(orientan el haz de luz).

3. Monocromadores (de excitacin y de emisin):- Monocromadores de excitacin: para seleccionar la longitud de onda de excitacin deseada.- Monocromadores de emisin: para eliminar las longitudes de onda emitidas no deseadas

4. Cubetas:De slice o cuarzo. Las de plstico pueden causar fluorescencia adicional con prdida de sensibilidad.

5. Detector:Fototubos multiplicadores capaces de cuantificar la pequea seal fluorescente.

Los fluormetros estn diseados en ngulo recto para que la luz procedente de la lmpara (de excitacin) no llegue al monocromador de emisin y al detector.

La mayor ventaja de la fluorimetra=> su enorme sensibilidad (respecto a las tcnicas colorimtricas) por el aumento de la intensidad de la radiacin de excitacin y la sensibilidad del dispositivo de deteccin.

La seal fluorescente depender =>del solvente, pH, temperatura, de la absorbancia de luz por la solucin, de interferentes que aporten fluorescencia no deseada, de compuestos que atrapan luz (atenan la fluorescencia que se pierde en forma de calor).

AplicacionesEn bioqumica:- anlisis de alimentos y frmacos.En bioqumica clnica:- muestras biolgicas de iones, enzimas, coenzimas, vitaminas, algunos medicamentos, etc.Su gran aplicacin es el fluoroinmunoanlisis que utiliza Ac marcados con una sustancia fluorescente, especficos de la sustancia a estudiar.

FOSFORESCENCIA

DefinicinLa fosforescencia es un fenmeno en el cual ciertas sustancias tienen la propiedad de absorber energa y almacenarla, para despus emitirla gradualmente en forma de luz .

El principio fsico en el que se basa la fosforescencia es el mismo que el de la fluorescencia, la principal diferencia radica en la forma de emitir la luz absorbida. En la fluorescencia es casi simultnea, y en la fosforescencia es retardada.

En la fosforescencia, los tomos poseen estados metastables donde se pueden almacenar energa durante un tiempo relativamente largo. Y, emiten esta energa absorbida (con longitud de onda bastante mas larga que la de absorcin) de forma gradual, durante minutos, horas e incluso das.

Fosforimetra

Tcnica espectroscpica luminiscente basada en la deteccin y anlisis de la emisin de radiaciones electromagnticas de una especie excitada por absorcin de fotones.Los mtodos fosforescentes y fluorescentes se complementan, ya que los compuestos fuertemente fluorescentes presentan una dbil fosforescencia y viceversaVentajas (con respecto a la fluorescencia)- Ms tiempo de vida- Ms sensibilidad- Ms selectividad- Ms linealidad de la respuesta- Posibilidad de utilizar concentraciones de < ng/ml

Inconvenientes- Necesidad de utilizar bajas temperaturas (nitrgeno lquido).- Imprecisin en las medidas.- Cierta dificultar experimental.

Tipo de luz utilizada:- Ultravioleta- Visible- Infrarrojo prximo

Aplicaciones- Presencia de frmacos en sangre- Presencia de frmacos en orina (til para control de dopaje)- Presencia de Uranio en orina, suelo, agua, vegetales, filtros,...- Determinacin de cidos nucleicos, aminocidos, pirina, pirimidina, enzimas, hidrocarburos del petrleo, vitaminas, pesticidas,...

Aparatos utilizados en fosforimetraSe utiliza el fosformetro o espectrofosformetro, este aparato presenta dos componentes adicionales al fluormetro:

Fosforoscopio, u obturados rotatorio. ste alterna la irradiacin de la muestra y la medicin de la intensidad de fosforescencia, despus de un tiempo determinado. Un compartimento especfico, para la muestra, que permita mantener la muestra a la temperatura adecuada (Nitrgeno lquido). Suele ser con ventanas de cuarzo.

QUIMIOLUMINISCENCIA

DefinicinFenmeno que en algunas reacciones qumicas, la energa liberada no slo se emite en forma de calor o de energa qumica sino en forma de luz.

FundamentoNormalmente, en estas reacciones de quimioluminiscencia se liberan molculas con estado excitado que al bajar a su estado emiten la diferencia de energa en forma de luz.A medida que progresa la reaccin, los cambios de la composicin qumica y la luz, disminuyen hasta desvanecerse por completo como resultado de la conversin. Generalmente la quimioluminiscencia es muy breve.

Relacionado con la quimioluminiscencia: Bioluminiscencia: fenmeno producido por reacciones qumicas de origen biolgico, uno de los casos ms conocidos es la luz emitida por las lucirnagas, tambin algunas bacterias, hongos, insectos...

Tipos de quimioluminiscencia:Quimioluminiscencia directa: marcaje de sustancias slidas con ster de acridina (quimioluminiscente) recubiertas por Acs especficos contra la sustancia a analizar. Cuando se oxida la sustancia empleada para el marcaje se emite luz. Quimioluminiscencia indirecta: emplea como marcaje una enzima y produce una fuerte emisin de luz.Permite hacer numerosas lecturas y aumentar la precisin.

Ventajas- Alta sensibilidad y especificidad.- Alta precisin.- No emplea radioactividad.- No genera riesgo contaminante ni ruido de fondo.- Equipo automatizado y fcil manejo.- Los resultados obtenidos son equiparables con Radioinmunoanlisis.

Aplicaciones- No es muy usada en la clnica.- Anlisis medioambientales (restos de impurezas en el aire, contaminantes atmosfricos...)- Clnica forense (para la determinacin de rastros de sangre)

Diferencia entre fosforescencia, fluorescencia y quimioluminiscencia:el elfenmenofosforescencia es el mismo que el de la fluorescencia, la principal diferencia radica en la forma de emitir la luz absorbida. En la fluorescencia es casi simultnea, y en la fosforescencia es retardada, y en la quimioluminiscencia se basa a partir de reacciones qumicas liberando energa en forma de luz que se va apagando a medida que cesa la reaccin.

Tema 5Espectrofotometra de absorcin atmica y fotometra de llama

ESPECTROFOTOMETRA DE ABSORCIN ATMICAEs una tcnica para determinar la concentracin de un elemento metlico determinado en una muestra. Puede utilizarse para analizar la concentracin de ms de 62 metales diferentes en una solucin. Los elementos a analizar se encuentran en forma de vapor de tomos. Ahora bien, en absorcin atmica existe una fuente independiente de luz monocromtica, especfica para cada elemento a analizar y que se hace pasar a travs del vapor de tomos, midindose posteriormente la radiacin absorbida.

Para poder analizar la muestra es imprescindible tenerla atomizada utilizando un flujo de gas oxidante mezclado con gas combustible, es decir, que mediante un flujo la muestra lquida o en disolucin va a ser aspirada por un capilar; Cuando la solucin sale del capilar el gas la dispersa en forma de fina niebla. Para que la precisin de los anlisis sea buena hay que poder reproducirlas en todas las medidas: el flujo de los gases y el tamao de gota.

En esta atomizacin se dan 3 fases: DESOLVATADAEl liquido disolventes evapora y la muestra permanece seca. VAPORIZACINLa muestra slida se evapora a gas. ATOMIZACINLos compuestos de la muestra se dividen en tomos libres.

En un espectrofotmetro de AA es necesario utilizar una llama aunque esta tambin la podemos sustituir por un horno de grafito.Las llamas utilizadas en la AA son similares a la tcnica de emisin de llama

Llama de aire-hidrocarburos Llama de aire acetileno Llama de oxido nitroso-acetilenoLa temperatura de la llama es lo suficientemente baja como para no excitar los tomos de la muestra de su estado basal. Segn la temperatura encontramos tres tipos de llamas: llamas fras. llamas calientes. llamas mas calientes.La ms utilizada en analtica clnica es la Llama caliente ya que puede atomizar hasta 30 elementos.

COMPONENTES:Fuente de luz: lmpara de ctodo hueco que consiste en un nodo de wolframio y un ctodo cilndrico cerrados hermticamente en un tubo de vidrio lleno de nen/argn, y el ctodo est constituido con el metal cuyo espectro se desea obtener

Quemador: es un mechero en el cual se dan dos procesos; Nebulizacin y Atomizacin de la muestra para obtener una mayor sensibilidad.

Monocromador: son prismas o redes de difraccin que sirven para hacer pasar la luz atreves del sistema ptico.

Detector: el sistema de deteccin puede estar formado por foto celdas, fotomultiplicador, etc. Que reciben la energa lumnica proveniente de la muestra y la convierte en una seal elctrica proporcional a la energa recibida.

NOTA: Las cubetas a utilizar pueden ser de cristal o de plstico, macrocubetas o microcubetas.

APLICACIONESEn qumica analtica se emplea para medir las concentraciones de elementos metlicos en los lquidos biolgicos, los principales metales que se miden son: Aluminio- arsnico-bario cadmio- calcio- cobre- cromo- hierro-litio-magnesio-manganeso-mercurio-nquel plata-platino- plomo -selenio y zinc.

FOTOMETRIA DE LLAMAEs una tcnica de emisin que utiliza una llama como fuente de excitacin y un fotodetector electrnico como dispositivo de medida. Se pueden realizar anlisis monoelementales o multielementales, en este segundo caso se emplean sistemas selectores entre la muestra y el detector que son capaces de discriminar en un periodo de tiempo corto varias longitudes de onda de emisin de los diferentes elementos que se pretenden analizar en la muestra.

En la fotometra de llamase pueden realizar 2 tipos de anlisis:ANALISIS CUALITATIVOIdentifica los componentes de una muestra y examina las longitudes de onda del espectro de emisin (la muestra debe estar disuelta)

ANALISIS CUANTITATIVOEs ms sencillo y preciso, sirve para detectar metales alcalinos o alcalino trreos tambin determina la cantidad de sustancias en una muestra.

El equipo de llama se compone de:

MONOCROMADOR: PrismasFOTODETECTOR: Dispositivo encargado de captar la seal ptica proveniente del monocromador y transformarlo en una seal electrnica capaz de ser convertida en un valor legible. MEDIDOR: Se encarga de tomar la D.O de la muestra. REGISTRADOR: convierte un resultado en valor numrico.La llama en el espectrofotmetro durante el anlisis requiere combustible y oxidante, tpicamente en forma de iones.Estos mtodos a menudo son capaces de analizar elementos metlicos en ppm, billones e incluso hasta rangos ms bajos de concentracin. Se debe controlar las etapas necesarias de los tomos que constituyen una muestra hasta su estado fundamental, para ello; hay que sustituir la llama por una cmara de grafito y con esto aumenta tambin la sensibilidad.Es esencial que la temperatura de la llama se mantenga constante, para lo cual se precisan reguladores.

ATOMIZADORES CON LLAMA Su funcin es convertir los tomos combinados de la muestra en tomos en estado fundamental, para ello es necesario suministrar a las muestras una cantidad de energa suficiente para disociar las molculas y romper sus enlaces.

FUNCIONES BASICAS DE LA LLAMA: Permite pasar la muestras a analizar de estado liquido a gaseoso. Descompone los compuestos moleculares en tomos individuales o molculas sencillas. Excita estos tomos o molculas.Las condiciones que debe cumplir una llama deben de ser, que tenga la temperatura adecuada y que en ella se forme un ambiente gaseoso que permita las funciones mencionadas. Adems el ruido de fondo de la llama no debe interferir en las observaciones.

APLICACIN:Es una tcnica aplicable para la cuantificacin de diversos componentes como los elementos alcalinos o alcalinotrreos, aunque en realidad solo se miden concentraciones de sodio (Na) potasio (K) y litio (Li), pero suele utilizarse otras tcnicas para esta medicin ya que resulta ms econmicas; Las muestras habitualmente utilizadas son lquidos biolgicos que deben de estar en solucin acuosa con determinados diluyentes y estos suelen contener litio o cesio.

Cono interno: hay una combustin parcial es decir sin equilibrio trmicoen esta se forman productos de oxidacinintermedios, se produce una gran emisin de luz (proviene del combustible, no de la muestra), es muy poco utilizada en el trabajo analticoZona interconal: o llamada parte caliente de la llama y en ella tiene lugar una combustin completa. Es la ms utilizada en anlisisCono externo: es la zona de combustin secundaria. Se enfra por el aire circundante y es una zona poco til.

Tema 6 - Refractometra y Reflectancia

REFRACTOMETRIA

Es una tcnica analtica que consiste en la medida del indice de refraccin de un lquido con objeto de investigar su composicin si se trata de una disolucin o de su pureza si es un compuesto nico. La medida continua en una columna cromatogrfica puede indicar la composicin o pureza del eluyente.

Principios bsicos La refractometra de la luz es un fenmeno de desvo que experimenta el haz incidente al atravesar una solucin, ocasionado por la diferente naturaleza del aire y de la solucin sobre la que incide. El ngulo de desvo se denomina ngulo de refraccin.Se conoce como ndice de refraccin (n) de una solucin a la relacin entre la velocidad de la luz en el aire y la velocidad de la luz a su paso por esta solucin. Su valor es directamente proporcional a la cantidad de sustancias disueltas en la misma. Esta relacin vara dependiendo de caractersticas como la concentracin de sustancias disueltas, el tipo de disolvente, etc. Se puede calcular la concentracin de solutos en una solucin midiendo su ndice de refraccin.En suero y plasma, el indice de refraccin depende fundamentalmente de la protena mayoritaria, la albmina.

Refractmetro clnicoSon instrumentos basados en el fenmeno de la refraccin de la luz para medir la concetracin de sustancias disueltas en una solucin acuosa. Las determinaciones se realizan gracias a la refraccin entre el prisma, de ndice de refraccin elevado y la muestra.En el caso de muestras de baja concentraccin, la diferencia entre los ndices de refraccin de la muestra y el prisma es elevada y el ngulo de refraccin es amplio. Cuando las muestras presentan una concentracin de solutos elevada, la diferencia entre los ndices es menor y, por lo tanto el ngulo de refraccin es tambien menor.En el laboratorio de anlisis clnicos se emplea el refractmetro para la medicin de la concentracin de solutos tales como la albmina en muestras sricas y/o plasmticas , y la medida del peso especfico en orina.

REFRACTMETROMedida-Colocar sobre el prisma una (s) gota (s) de la solucin a analizar y cerrar la placa.-Dejar un tiempo para que la solucin problema fluya sobre la superficie del prisma.-Dirigir el refractmetro hacia la luz para obtener un buen contraste luz-sombra.-Rotar el ocular hasta enfocar la escala.-Mirar por el ocular leyendo directamente en la escala de concentracin .-Corregir la medida si la temperatura es diferente a la de calibracin del refractmetro.

UtilizacinEn la actualidad se emplea poco ya que sus medidas estn incluidas en otros sistemas analticos ms sencillos, rpidos (como la tira reactiva) y automatizados (auto-analizadores que incluyen tanto el peso especfico como la concentracin de albmina).

Donde se emplea-en la industria vitivincola: para determinar los azcares totales de un mosto y a partir de alli poder hacer una estimacion del grado alcoholico -en la industria alimenticia: en los laboratorios de bromatologia-en veterinaria.

REFLECTOMETRA

ESPECTROFOTOMETRIA DE REFLEXION

1. TIPOS DEREFLEXINCuando un haz de luz incide sobre una superficie, la luz es reflejada por esta superficie, producindose a la vez dos tipos de reflexin:--Una reflexin especular, en donde la luz es reflejada como lo hara en un espejo.--Una reflexin difusa (reflectancia), que consiste en la reflexin producida al penetrar la luz en las capas internas de la superficie iluminada.Dentro de la fase solida, la luz sufre una serie de fenmenos de absorcin y dispersin. Este tipo de reflexin es de inters para las mediciones que se realizan con las tcnicas de qumica seca.

2. ESPECTROFOTMETRODE REFLEXIONLa fotometra de reflectancia implica la medida de la intensidad de la luz que es reflejada por una fase slida, tras iluminar sta con un haz de luz de una longitud de onda que es absorbida por los productos de inters.Los espectrofotmetros de reflexin miden la reflectancia y la relacionan con la concentracin del analito de inters.

Sus componentes son:a. Fuente de luz: se emplean dos tipos de lmparas, que pueden ser de haluro de tungsteno o de xenn.b. Sistemas pticos: consisten en combinaciones de lentes, espejos y filtros.c. Reactivos de fase slida: aqu radica una de las diferencias fundamentales con la fotometra de absorcin. La muestra se situa en los reactivos de fase solida (tiras reactivas, reactivos multicapa). Todos los componentes necesarios para que se produzca la reaccin se encuentran impregnados en estas unidades, en las que tiene lugar la reaccin y la lectura.d. Detector y procesador de datose. Lectura: se puede hacer de dos formas

Lectura sobre la superficieLa muestra se aplica sobre la superficie del reactivo, difunde y se produce la reaccin. El color resultante se determina midiendo la reflectancia sobre la superficie. Este mtodo se emplea en los sistemas que utilizan tiras reactivas.Lectura por el reverso de la superficieLa muestra se aplica sobre la superficie del reactivo, difunde y se produce la reaccin. La lectura se hace por el reverso de la superficie de la muestra. Este mtodo se emplea en los sistemas que utilizan reactivos multicapas o slides.

3. REACTIVOS PARAQUMICASECALos reactivos de qumica seca constituyen la manera de introducir la muestra en los fotmetros de reflexin. Son unidades de reaccin con una slida: poseen en forma deshidratada, todos los componentes que se necesitan para la identificacin de un analito determinado.Modo de empleo: la muestra que contiene el analito a determinar (suero, plasma, sangre total, orina) se aplica sobre la superficie del reactivo en fase slida, y a partir de esta difunde a la matriz, disolviendo los componentes de reaccin que contiene; cuando los reactivos se disuelven se produce la reaccin, que se cuantificara por fotometra de reflectancia.

Todos los sistemas constan de tres partes:Parte soporteEst constituida por una lamina de plstico, sobre la cual se construye el reactivo de fase solida.Parte reflectante Su funcin es reflejar la luz; est hecha de materiales reflectantes como metales, o materiales fibrosos como el papel.Parte reactivaContiene, en forma deshidratada todos los reactivos y sustancias auxiliares necesarias para que se produzca una reaccin. Los reactivos son reconstituidos mediante rehidratacin por el agua de la muestra

A veces se aaden otras capas con funciones complementarias como una capa difusora (con lo cual la muestra difunde rpidamente hacia los laterales y se distribuye uniformemente) o una capa separadora de plasma (la utilizan los sistemas preparados para trabajar con sangre total, su funcin es retener las clulas y permitir el paso del plasma hacia la matriz del reactivo).

La estructura de las capas depende del sistema reactivo de fase solida que se trate, variando de unos a Otros.

4. SISTEMAS REACTIVOSLos reactivos de fase slida empleados en la qumica seca se engloban en dos tipos: las tiras reactivas y las pelculas multicapa.

Tiras reactivas

Se utilizan para:-anlisis de orina-autocontrol de la glucemia-en sistemas de diagnstico rpido en la consulta mdica y a la cabecera del enfermo.Consisten, bsicamente en un soporte de plstico que sirve de soporte a una matriz de celulosa que contiene los reactivos secos necesarios para que se produzca una reaccin con el componente a estudiar.

Tira reactiva del sistema Seralyzer (Ames): consiste en una matriz de celulosa impregnada de reactivos secos que se unen a una lamina soporte de plstico; sobre ella lleva una franja cdigo, que tiene como finalidad ser leda cuando se la inserta en el instrumento.

Tira reactiva del sistema Reflotron (Boheringer Mannheim): consta de una lmina soporte al cual se le adhiere el sistema reactivo separado en dos zonas:-una est unida a la lamina. Incluye una serie de capas destinadas a la preparacin de la muestra.-la otra se encuentra inicialmente separada de la lmina soporte, y se pone en contacto con ella por simple presin cuando se desea que el plasma entre en contacto con los reactivos para desencadenar la reaccin; esta zona lleva en su superficie una laminilla transparente a travs de la cual se realizara la lectura.La disposicin en dos bloques hace posible que la parte destinada a la preparacin de la muestra se puedan llevar a cabo etapas de preincubacin o eliminacin de interferentes.Esta tira incorpora tambin una capa separadora de fibra de vidrio para la obtencin de plasma, con lo cual evitamos la centrifugacin previa al anlisis.

Ventajas de las tiras: al mantener los reactivos deshidratados aportan una prolongada estabilidad al sistema, que puede ser de meses e incluso de uno o dos aos.

Pelculas multicapa o slides

Estn constituidas por diferentes capas muy finas, a travs de las cuales se van produciendo todas las etapas necesarias para la determinacin cuantitativa del analito. Tiene la apariencia de una diapositiva y est constituido por cuatro capas (que incluyen todos los componentes del sistema). El sistema de ms amplia implantacin es el Ektachem (Kodak).

Capa difusora: sobre ella se deposita la muestra. Lleva sustancias capaces de reflejar la luz, es la superficie reflectante. Homogeneza la muestra antes de que llegue a la capa reactiva, distribuyndola por toda la superficie. Retiene clulas, cristales y pequeas y grandes molculas, as la muestra se convierte en un filtrado libre de protenas, eliminndose las interferencias.

Capa reactiva: pueden ser una o varias, son las que contienen los reactivos.

Capa soporte: est hecha de plstico transparente y sobre ella se depositan todas las dems capas una tras otra. Tiene doble funcin: servir de soporte y dejar pasar la luz, ya que la lectura se hace por la parte inferior (la opuesta a la de la aplicacin de la muestra).

5. INSTRUMENTOS DE MEDIDA PARA BIOQUIMICASANGUNEASon tres los sistemas que se emplean actualmente. Dos de ellos trabajan con tiras reactivas: Seralyzer y Reflotron; el tercero trabaja con slides o reactivos multicapa.

Seralyzer (Ames)Emplea tiras reactivas. Tras aplicarle la muestra de suero se coloca la tira en una plataforma termostatizada a 37 que se introduce en el aparato. All es irradiado por un haz de luz que incide sobre la zona reactiva de la tira; all se produce la reflexin. Los valores de reflectancia son convertidos en valores de concentracin.

Reflotron -Emplea tiras reactivas. Se puede trabajar con sangre total, suero o plasma; ya que incorpora una capa separadora, que consigue la separacin de los eritrocitos del plasma. -Despus de aplicar la muestra, la tira reactiva se introduce en el aparato. El plasma pasa al reservorio situado en la parte inferior de la tira; la reaccin comienza cuando (por accin del aparato) se presiona la capa reactiva sobre la capa reservorio del plasma.-La luz reflejada por la zona de reaccin se recoge en un detector de medida, que convierte los valores de reflectancia en valores de concentracin.

EktachemEmplea los slides. Ofrecen medianos y grandes analizadores, cuya finalidad es ser utilizados en el laboratorio clnico.La muestra de suero se aplica en la superficie del slide por el autoanalizador, luego es transferida a una cmara de incubacin. La muestra se difunde a travs de las capas, producindose la reaccin. La lectura se produce por irradiacin que incide en la cara inferior del slide. La luz reflejada es recogida por un detector.

6. SISTEMAS PARA ANLISIS DE ORINALos dos sistemas ms difundidos para anlisis de orina son: Sistema Clinitek y Sistema Urotron. Ambos incluyen las tiras reactivas y los lectores de tira de orina.

Estructura de las tiras reactivas:-un soporte (lamina de plstico blanca).-zonas de papel impregnando con los reactivos, que van fijados al soporte.-cada zona reactiva tiene impregnados reactivos distintos, de manera que cada uno tomara una coloracin diferente cuya intensidad depender de la concentracin del componente en la orina.

Modo de empleo:1. Sumergir la tira reactiva en la orina2. Eliminar el exceso de orina3. Leer el resultado. Se puede hacer visualmente sobre una carta de colores o empleando un fotmetro de reflexin.

Sistema ClinitekSe emplea la tira reactiva Multistix-10-SG.Est preparada para la determinacin de diez parmetros:- Glucosa- Bilirrubina- Cuerpos cetnicos- densidad- sangre- pH- protenas- urobilingeno- nitritos - leucocitos.Esta tira aporta la ventaja de poder hacer la determinacin de densidad de la orina sobre una de las zonas reactivas.

Sistema UrotronSe emplea la tira reactiva COMBUR-9-TEST.Est preparada para la determinacin de nueve parmetros:- glucosa- bilirrubina- cuerpos cetnicos- angre- pH- protenas- urobilingeno- nitritos - leucocitos.

7. VENTAJAS Y DESVENTAJAS DE LA QUIMICA SECAVENTAJAS:- el usuario solo necesita aplicar la muestra al reactivo en fase slida para iniciar el anlisis, que tiene lugar en unos minutos- no se precisa preparacin previa de los reactivos. Son nicos para cada parmetro y desechables.- Tienen larga estabilidad - Son fciles de almacenar.

DESVENTAJAS:- Su costo es ms elevado que el de la qumica convencional- No es prctico para laboratorios con gran carga de trabajo, ya que por cada tira solo se puede realizar la determinacin de un analito.

UTILIDADES DE LAQUMICASECA

Se pueden hacer todo tipo de determinaciones bioqumicas, electrolitos, enzimas, perfil lipdico y pruebas derivadas.En los laboratorios clnicos de hoy en da, se emplea esta tcnica para el anlisis de orina, mediante el uso de la tira reactiva.

CUADRO RESUMEN DE LOS TEMAS 1-6

Tema 7 - CENTRIFUGACIN

Fundamentos de lastcnicasde centrifugacin - es una tcnica de separacin de particulas que se basa en la distinta velocidad de desplazamiento de laspartculasen un medio lquido al ser sometidas a un campo centrifugo; cuando se centrifuga una solucin => se rompe la homogeneidad y se produce la separacin de solvente y soluto y las 1s partculas en sedimentar son las de mayor masa.

Velocidad de sedimentacin - es proporcional a la masa de la partcula y esta propiedad nos permite separar partculas de diferente masa => a (+) masa => (+) velocidad de sedimentacin.

ge (gravedad efectiva) - es el tiempo que provoca la sedimentacin forzada cuando se acelera; para acelerar la sedimentacin se puede aumentar la W (velocidad angular); a (+) W => (+) velocidad de sedimentacin; la velocidad de sedimentacin es util para caracterizar partculas y en concreto se usa un valor que llamamos coeficiente de sedimentacin, que es una caracterstica de todas las partculas que nos da informacin de dicha partcula; conocerlo, nos facilita conocer => tamao, densidad y forma de las partculas y adems nos permite disear mtodos de aislamiento de partculas.

Tipos de centrifugas:1)- de sobre mesa o baja velocidad o "clnicas": son de pequeo tamao, no necesitan refrigeracin, max.velocidad hasta 10.000 rpm, tiles para partculas grandes (clulas, precipitados,...)2)- microfugas: son una variante de la anterior; tubos cortos para volmenes muy pequeos, no necesitan refrigeracin, velocidad mas de 10.000 rpm, para volmenes pequeos, se usan en biologia molcular.3)- alta velocidad: velocidad entre 18.000 y 25.000 rpm, necesitan refrigeracin, algunas tienen sistema de vacio, tiles para separar fracciones celulares (membranas, orgnulos) pero no sirven para virus ni ribosomas o macromolculas.4)-ultra-centrifugas: velocidad a partir de 50.000 rpm, necesitan refrigeracin, sistema de vacio; hay 2 tipos => 1.analticas (analizan las propiedades de la sedimentacin, tienen detectores, determinan la concentracin de parametros mediante la DO) 2.preparativas (preparar la muestra para luego analizar => aislar virus, macromolculas)

Tipos de rotores:a)- flotantes o basculantes: posicin de 90 con el eje, los tubos utilizadosestnunidosal brazo del rotor por su parte superior; se usan paravolmenespequeosde muestra; se utiliza enbiologamolecular.b)- de ngulo fijo/angulares: en ngulo fijo (+ o - entre 20-30 con el eje); son para volmenes mas grandes y se usan en clnica habitualmente;c)- rotoresverticales: se produce en vertical (ngulo 0); para volmenes muy grandes; se consigue un "pellet" (sedimento muy poco concentrado); gradiente de densidad isopcnica.

Centrifugacinanaltica- con esta se pretende estimar propiedadesfsicasde alguna partcula en concreto, es decir, sus propiedades hidrodinmicas; para esto se tiene que cumplir:- aplicacin en sustancias, en mezclas lo + puras posibles y no a grandes mezclas- se pueden aplicar velocidades elevadas de giro sin que repercute en la muestra- rotor utilizado: deben permitir alinear el tubo con los sistemas pticos que miden la sedimentacin en cada momento.Caractersticas:- pocovolumende muestra- pureza elevada- velocidad de giro elevada- en BQ se utiliza para determinar el coeficiente de sedimentacin y saber que particulas, que composicin tiene la muestra- lossistemaspticos miden la DO de la muestraAplicaciones:- averiguar la pureza de un compuesto- determinar la proporcin relativa de sus componentes- en investigacin => para conocer e interpretar las estructuras moleculares de diferentes compuestos.

Centrifugacin preparativa - a diferencia de la anterior, es la tcnica que nos permite preparar o adecuar la muestra para su posterioranlisis; hay 2 mtodos:

A)- Centrifugacin preparativa diferencial; es el mtodo mas comn de separacin que nos permite separar las partculas en funcin de su velocidad de sedimentacin (e.j.sangre); el resultado es la obtencin de un sobrenadante y un "pellet" (material sedimentado); es inespecfico, ya que a priori, no se conoce en que fraccin va a quedar cada partcula; muy til para separar clulas y orgnulos sub. celulares.

B)- Centrifugacin preparativa en gradiente de densidad: es mas compleja que la anterior; presenta muchas ventajas ya que permite la separacin de varios o todos los componentes de la muestra; en los tubos hay un fluido que dearribaabajo va de menos a mas denso; esto permite separar la muestra por gradiente; la muestra se va colandosegnsu masa y densidad; esto implica la utilizacin de un soporte fluido cuya densidad aumenta de la parte superior hacia la parte inferior; las caractersticas de este gradientes del fluido son:- materialinerte(no altera la muestra)- que no se vea alterado por cambios de temperatura (resistente)- que noabsorbaradiacin UV (no interfiera en la medicin)- ser isoosmotico (ni hipo ni hiper respecto a la muestra)- no sercorrosivo, inflamable- ser asptico- el intervalo de densidad debe ser suficiente-re-utilizableEjemplos de fluidos gradientes que pueden separar laspartculasdeinters:- Sacarosa (alta viscosidad => para estudio de protenas)- Ficoll (polisacridode alto pesomolcula; menos viscoso que la anterior; para separacin de clulas y orgnulos subcelulares)- Percoll (menos viscoso que las anteriores; para estudios de fisiologa vegetal (micro-algas) y en investigacin.Hay 2 tipos de fluidos - zonal (masa) y isopcnica (densidad)Zonal - se lleva a cabo mediante un gradiente de densidad y laspartculasse separan en funcin de su masa; a (+) masa (+) velocidad de sedimentacin (+) abajo; para protenas,macro-molculas, y estructuras subcelulares; caractersticas => si parte de la muestra tiene poco peso nopodrcon la centrifugacin atravesar las zonas mas densas del fluido; cuanto (+) grande => se sedimentara (+) abajo (atravesar las zonas mas densas); la densidad mxima del soporte tiene que ser inferior o como mucho igual a la de densidad mxima de la muestra, porque si es muy denso nopodrnatravesar, pero si es muy bajo quedarn apelotonados todas abajo.

Isopcnica - cadapartculase quedar (se coloca) donde encuentra su propia densidad; para lipoprotenas (LDL) segn su densidades; caractersticas => la densidad mxima del soporte fluido tiene que ser mayor a la densidad mxima de la muestra (porque si la muestra tiene componentes de 15 de densidad y el liquido solo 10, cuando centrifugamos los de 15, 13, 11... quedarn abajo sin separarse).

Definicin de gradiente de densidad - es la distribucin nohomogneade un fluido en la que concentracin del mismo va de menos a mas (columna)consiguindoseas una distribucin gradual de densidad.

Tema 8 - CROMATOGRAFIA

La cromatografia - agrupa un importante y diverso conjunto demtodosque permiten separar componentes queestnestrechamente relacionados en muestras complejas; la muestra a trabajar se disuelve en FM (fasemvil) que puede ser gas o liquido y este FM se hace pasar atravsde FE (fase estacionaria) que esta incluida en un soporte que puede ser una columna o una superficie solida; las 2 fases (FM y FE) se eligen de manera que los componentes de la muestra se distribuyen de forma distinta entre ambas; los componentes que se unan fuertemente a la FE se mueven (+) lentamente con el flujo de la FM; los componentes de la muestradbilmenteunidos a la FE semovernrpidamenteal serarrastradospor la FM;Conclusin: la diferente movilidad de los diferentes componentes de la muestra hacen posible laseparacinde los mismos y esto permite un estudio tanto cualitativo como cuantitativo de la muestra.

MUESTRA (diferentes componentes) => disuelto en FM (fasemvil) de forma gas o liquido => pasar por FE (fase estacionaria) con soporte (columna o superficie solida) =>SEPARACIN: componentes con (-) afinidad (movilidadRPIDA) y componentes con (+) afinidad (movilidad LENTA) => Resultado en BANDAS para suanlisiscualitativo y cuantitativo de la MUESTRA.

Ventajas de la cromatografia - sonmtodosrpidos, simples, tienen un moderado coste, un amplio campo deaplicacincomomtododeseparaciny ademas, la posibilidad de llevar a cabo unanlisiscuantitativo, una vez que se han separado los componentes (cualitativo) en bandas.

Clasificacinde losmtodosCromatogrficas

Cromatografia de ADSORCIN - es la mas antigua (la que se hizo); FE es solida, FM es liquido o gas; laseparacindepende de la polaridad (segnlas cargas +/- de lasmolculas) de lasmolculasde la muestra(soluto); se suelen hacer en columna; las sustancias a separar (muestra) se colocan disueltas en la parte superior de la columna; los distintos disolventes que van pasando por la columna, separar los componentes por la diferente solubilidad de cada uno en el lquido disolvente; tras la cromatografia cada componente eluye en momentos diferentes yasson separados y cuantificados; adsorbentes (FE) => e.j. carbonatoclcico; disolventes (FM) e.j. acetona, metanol, agua. Utilidad => se usa para laseparacinde diversas sustancias en orina.

Cromatografia de REPARTO - FE suele ser liquido y FM liquido o gas (+ soluble + acuosa); se puede hacer en columna o plana; Rf (factor deretencin) => d1 o d2 o d3/ d (es la distancia recorrida proporcionalmente por dicha sustancia d1/d2/d3 dividido entre el frente cromatogrfico/ d); permite separar la sustanciasegnsu solubilidad.

Cromatografia de INTERCAMBIO INICOLas sustancias se separan por el intercambio de iones; se basa en lainteraccininica del soluto con la FE que tiene grupos funcionales cargados; FM suele ser liquido FE solido; se hacen en columna; el soporte (FE) suele ser una resina cargada positivamente o negativamente; si su carga (del soporte) es positiva => la elucin (lo que sale de la columna) cargada positivamente y si la columna esnegativa=> el eluyente sera negativo; para conseguir separar las otras cargas retenidas en la columna, se introduce untampnde ph adecuado en la columna para que las cargas retenidas se eluyan.Utilidad => en BQ para separar aminocido,pptidos,protenas, nucletidos y todos los compuesto de naturalezainica(Hb, isoenzimas).

Cromatografia de PENETRABILIDAD oexclusinMOLECULAR (exclusinpor tamao)Llamadafiltracinde geles; se lleva a cabo en gel (como FE) de forma esferas queestnllenos de poros que pueden ser de mayor o menor tamaosegnla sustancia utilizada para fabricar el gel; separa sustancia enfuncinde su tamao y forma (no afecta el eluyente, el pH ni la fuerzainica); los de mayor tamao no caben en el poro y pasan por entre las esferas y llegan los primeros; una vez introducidas en el gel, lasmolculasmas pequeas tardaran mas en salir de la red porosa; quedaran retenidas (+) tiempo; Las de mayor tamao, al no caber en el poro, pasan entre las esferas y eluyen las primeras; a (+) tamao => (+) velocidad; a (-) tamao => (-) velocidad (son losltimosen salir, porque se retienen en los poros); Fe es solida (gel) y FM es liquida (puede ser agua osolucinelectroltica); laelucinsolo depende de la forma y tamao de lapartcula. Utilidad => separar sustancias de gran peso molecular (pptidos,protenas,polisacridos,cidosnucleicos,purificacinde ciertas sustancias, etc.).

Para realizar estudios - Cromatografia de AFINIDADFE es solida (gel) y FM es liquida; Gel recubierto de Ac anti algo (hormonas, enzimas...); metemos la muestra con distintacomposicin, tenemos Ac anti alguno de sus componentes; losdemscomponentes eluirn atravsde la columna; quedara el Ag y estospodrnsalir modificando el ph de launin.Utilidad => para saber si hay algunas enzimas, hormonas, vitaminas... (para enfermedades que buscan una de las enzimas o hormonas y que cantidad hay).

Anlisiscualitativo (identificacin)Si comparamos lainformacinde la espectroscopia de masas o RMN con la cromatografia, este es limitada; la cromatografia nos da datos del tiempo deretenciny de laposicinde la sustancia en la FE tras laelucin(extraccinde una sustancia del medio que le ha adsorbido); los datos deintersse obtienen a partir de cromatogramas obtenidos de una misma sustancia problema, con diferentes FM y a diversas temperaturas deelucin; es unatcnicamuy utilizada para detectar la presencia o ausencia, de determinados componentes en mezclas de las que se conoce su identidad; si en la cromatogrfica no aparece el pico de una determinada sustancia, significa que este ausente ( o aconcentracininferior); se utiliza para favoreceranlisisespectroscpicosposteriores de muestra muy compleja;separacinprevia para un estudio posterior de las diferentes bandas igual no siempre ha de ser propio al cuantitativo (solo se sabe si hay o no hay estos componentes);CROMATOGRAMA

Anlisiscuantitativo (cuantificar)Segnlastcnicas:- en la cromatografia plana => elreacubierta por las sustancias separadas, las bandas, se recortan, diluyen y en una cubeta se mide laconcentracinespectrofotometricamente.- en la cromatografia en columna => la altura o elreade los diferentes picos obtenidos nosdarlainformacincualitativa al compararlos con determinados patrones.Para esto se realizan cromatogramas de distintos patrones, obtenidos con diluciones de unpatrncuyacomposicines similar a la de la muestra problema y se representangrficamentelas alturas oreasde picosegnlaconcentracin; larepresentacindaruna linea recta, luego se comparan los datos de nuestra muestra con lagrfica; losanlisiscuantitativosestnbasados en lagrficaasobtenida.

Cromatografia plana - FE se encuentra extendida en una superficie plana y FM es liquida y se desplaza por capilaridad o por adsorcin; 2 tipos =>

1)-Cromatografia en papel (PC) - FE generalmente es liquida, se encuentra adsorbida entre las fibras de una tira de papel;tambininterviene un proceso deadsorcinsobre el soporte solido (cromatografia de reparto);tcnica:- colocar en una tira de papel de filtro una gota desolucinde la muestra con un capilar omicro-pipeta(eldimetrono > 5 mm)- dejar secar- colocar la tira en una cubeta de vidrio cerrada con eluyente liquido; el proceso puede tener lugar de 2 formas => ascendente (el eluyente sube por el soporte de papel apoyando en el fondo del recipiente) o descendente (el papel se mantiene colgado de la parte superior del recipiente y el eluyente va descendiendo); el descendente es masrpido, pero no obtienen buenas separaciones;- dejar que este fluya por la tira de papel (desarrollodel cromatograma)- al finalizar, sacar la tira de la cubeta sealando el nivel exacto alcanzado por el liquido, secar y proceder al revelado.

Rf = distancia recorrido por la sustancia (d1/d2/d3) distancia recorrido por el liquido dedesarrolloEl valor de Rf esta condicionado por factores => lacomposicindel liquido dedesarrollo, la temperatura derealizacindetcnica, lascaractersticasdel soporte (grosor, tamao de poro etc.); para considerar el valor de Rf comocaractersticode cada sustancia, es necesario especificar las condiciones en que se ha realizado lamedicin; es imprescindible estandarizar las condiciones (Ta, pH, etc.)

Revelado con procedimientosfsicos=> pulverizar una sustancia fluorescente (e.j.fluoresceina) sobre el soporte de papel y al iluminarlo con fuente de luz ultravioleta, se observan las distintas manchas oscuras sobre un fondo fluorescente.Revelado con procedimientosqumicos=> pulverizar el soporte de papel con agentes reveladores que den reacciones coloreadas con los distintos componentes de la muestra problema.Ladeterminacincuantitativa de cada componente se hace mediante fotometra (medida del color de las distintas manchas obtenidas tras el revelado) o someter una mezcla depatrnal mismodesarrollocromatogrficodel problema y comparar los resultados.

2)- Cromatografia en capa fina (TLC) -tcnicade reparto liquido-liquido quetambininterviene un proceso deadsorcin; el soporte de FE es un material poroso, pulverulento, extendido sobre una superficie de vidrio,plsticoo metal (e.j.celulosa, gel de silice/oxido de aluminio/silicato magnesico, poliamida); FM fluye por capilaridad; es unatcnicamasrpida, mas sensible y fiable que PC. Utilidad =>separacinde sustancias de bajo peso molecular (aminocidos, lpidos, hidratos de carbono, etc.); se suele hacer de forma ascendente (semejante al PC) y frecuentemente se utiliza latcnicabidimensional, combinando 2 sistemas distintos de disolventes; laelucinse realiza mediante el raspado de las distintas manchas en el soporte y posteriorextraccincon disolventes adecuados; una vezextrados, se procede laidentificacin(anlisiscualitativo) y sucuantificacin(anlisiscuantitativo); Drogas => en papel.

Cromatografia en columna - se realiza el transporte de una sustancia atravsde una columna por laadicincontinuada de FM (puede ser liquido o gas); el desplazamiento (porpresino por gravedad) de los distintos componentes de la muestra es decir, su velocidad demigracin, depende del tiempo que permanezcan en la FM; el 1er eluyente que sale de la columna es el que tiene (-) afinidad con la FE; FE se encuentra en el interior de la columna; la diferencia de velocidad de los distintos componentes al atravesar la columna permite suseparacin; el tiempo que pasa desde que se inyecta la muestra en la columna hasta que el pico alcanza el detector => tiempo deretencin(tR); el proceso sera mas efectivo cuanto mas separadas aparezcan unas bandas de otras;ensanchamiento de bandas=>este efecto no deseable se puede producir durante laseparacincromatogrfica, lo que disminuye laresolucinde latcnicaque es la capacidad de una columna para separar 2 sustancias; se produce una difuminacin (solapamiento), se mezclan los componentes de las bandas; para evitar, se utiliza columnas dedesarrollosuficientemente largas que van a incrementar el grado deresolucincromatogrficayasobtener elmximorendimiento del proceso (optimizacin: conseguir que los distintos componentes de una mezcla se separen totalmente y en el menor tiempo posible);tcnica=>(1)- se inyecta la muestra en la columna(2)-adicincontinuada de FM(3)- desplazamiento de los distintos componentes de la muestra(4)- aislamiento de las distintas sustancias que hayan podido separadas (pasar suficientemente FM atravsde la columna) hasta que las diferentes fracciones individuales salgan y detectadas por el detector o recogidas(5)- a la salida de la columna, un detector identificara cada una de las fracciones(6)- con la seal recogida por el detector se obtiene unagrficadonde aparecen una serie de picos (cromatogrfico) que se utiliza para elanlisiscualitativo y cuantitativo.Aplicacin=>determinacinde Hb-glicosilada; separacinde sustancia en orina, en BQ =>separacinde aminocidos,pptidos,protenas,nucletidos, Hb,isoenzimas,polisacridos; purificacinde sustancias, muestrasorgnicascomplejas, compuestosrgano-metlico.

Cromatografia de gasesLa muestra se volatiza y luego se inyecta en una columnacromatogrfica; este proceso se lleva a cabo por laaccinde un gas inerte (FM) cuyafuncines la de transportar la muestra atravsde la columna; la mas utilizada es la cromatografia de gas-liquido (GLC) con FM gaseosa y FE liquida retenida sobre la superficie de un solido inerte.Componentesbsicos:(1)- Gas portador (FM):qumicamenteha de ser inerte, a lapresinadecuada y sin agua e impurezas (puede ser => He, N, H, CO2)(2)- Sistema deinyeccinde la muestra: volatiliza la muestra; el sistema mas utilizado para lainyeccinde la muestra es con unamicro-jeringaaplicada en la cabeza de la columna(3)- Columnas dedesarrollo: hay 2 tipos => de relleno (empaquetadas) y capilares (tubulares abiertas); hoy endase utilizan las capilares por su gran rapidez y eficacia(4)- Sistema dedeteccin: el detector idealdeberatener adecuada sensibilidad, buena estabilidad, gran reproductibilidad, amplio margen de temperaturas, reducido tiempo de respuestas, alta fiabilidad,fcilmanejo, no destruir la muestra; los mas usados =>ionizacinde llama, conductividadtrmica, termoinicos, capturaelectrnica,emisinatmica.Aplicacin=> paraanlisiscualitativo, recurrir a =>los tiempos ovolmenesderetencinde las sustancias analizadas; para el cuantitativo, se utilizan =>lospicosoreasdel cromatograma obtenido; las aplicaciones mas importantes son:-mtododeseparacininmejorable para muestrasorgnicascomplejas, compuestosrgano-metlicosy sistemasbioqumicos;- proporcionar un medio adecuado que puede llevar a caboanlisismas complejos.

Cromatografia delquidosde altaresolucin(HPLC)Sonmtodosmas utilizados en la actualidad, que se caracterizan por =>- permite estudiarlquidosutilizando columnas capilares (+) largas, (-) tiempo para (+)resolucin- su gran sensibilidad- su capacidad para proporcionar determinaciones cuantitativas exactas- su gran utilidad a la hora de separar sustancias novoltilesotermo-lbiles- poder ser utilizados para sustancias de granintersen la industria en muchos campos de la cienciaEstatcnicapuede ser utilizada para separar =>plaguicidas, hidrocarburos,aminocidos,protenas,cidosnucleicos, azucares, drogas, terpenoides (molculavegetal)

Los componentesbsicos:(1)- sistema impulsor de la FM: debe estar libre de vibraciones para no afectar el flujo(2)- inyector: en actualidad es un dispositivo que evita las interferencias en la corriente de disolvente(3)- formador de gradiente (no es indispensable): actualmente con una sola bomba(4)- columna: materialplsticocompresible que elimina los espacios muertos de la columna(5)- detector: 3 sistemasbsicos(la absorbancia, el indice derefraccin, la fluorescencia(6)- registro-integrador: se obtiene unagrficaen forma de picos (cromatograma) que identifica las sustancias analizadas y se puede calcular para elanlisiscuantitativo.

Tema 9 - ELECTROFORESIS

Electroforesis - proceso de laseparacinde las especies cargadas de iones opartculascoloidales enfuncinde su distinta velocidad demigracin, cuandoestnsometidas a laaccinde un campoelctrico; velocidad demigracin(movilidadelectrofortica: unidad /tiempo)=> la velocidad de desplazamiento de las diferentes sustancias durante el transcurso de la electroforesis; el desarrollo de latcnicaelectrofortica, depende de la densidad de carga y condicionada por una serie deparmetros(pH, fuerza ionica, diferencia de potencial del campoelctricoaplicado, la naturaleza de la muestra, interacciones entre la muestra y soporte elegido); es unaherramientapractica para el analisis de compuestos biologicos y un metodoanaltico/preparativo => separa macromoleculas en una mezcla para la posterior tecnicas mas complejas; la sustancia se desplaza enfuncinde su carga y que depende de:(1) la carga de la sustancia (2) el voltaje del campoelctricocreado (3) el coeficiente de friccion/rozamiento entre el soporte y la sustancia => sustancias (+) se dirigen hacia el polo negativo (ctodo) y las (-) hacia el polo positivo (nodo);

Los componentesbsicosde un equipo de electroforesis- Fuente dealimentacinelctrica: su intensidad enfuncinde las necesidades de laseparacinde muestras; el voltaje aplicado influye en el resultado de la electroforesis; el calentamiento que se puede generar del aumento del voltaje se soluciona con un sistema derefrigeracin.- Cubeta: donde se coloca lasolucintampn; tiene que garantizarse su correcta limpieza- Puente salino: tiene que estar en contacto con eltampnutilizado, depositado en la cubeta; sobre el colocaremos nuestro soporte-Tampnamortiguador: fijar pH adecuado => proporciona una fuerzainicaque permite el movimiento de cargas; no se ha de utilizar eltampnpara mas de 2 o 3 separaciones; a +concentracindeltampn-migracin(lenta) => peorseparacinyresolucin.- Soporte: sobre el donde se coloca/se aplica la muestra con un aplicador y donde aparecen las bandas con las sustancias separadas tras el procesoelectrofortico; se puede realizar directamente en unasolucintamponada(electroforesis libre) o sobre un soporte que permita que las fracciones quedan permanentemente separadas y hacer sucuantificacin(electroforesis zonal); laeleccindel tipo de soporte depende del objetivo delanlisis.- Producto de transparentado (para el acetato de celulosa)- Cubeta detincin- Equipo de revelado- Peine

Lascmarasde electroforesis preferibles son aquellas cuyo tamao es reducido, porque =>- presentan una menor superficie deevaporacin- las diferencias de temperatura se minimizan entre un compartimento y otro- permiten unareduccindel tamao de las aplicaciones y pueden procesar mas muestras al mismo tiempo

Factores que intervienen en el desarrollo electrofortico (condicionan su utilidad en el laboratorio):(1)- carga neta de la sustancia enmigracin (es el grado deionizacin) de las distintas sustancias en la muestra sometida a electroforesis, depende de pH del medio en el que se lleva a cabo todo el proceso (se determina por lautilizacindeltampnadecuado); es importante en sustancias como protenas que tienen uncarcteranftero => puede ser (+) o (-); puntoisoelctrico(pi) => valor pH con cargas (+) y (-) es = 0 (cargas neta nula) => sustancia no migra (permaneceinmvilen el punto deaplicacin; si pH final > pi => esta cargada (-), la sustancia migrara hacia el polo (+)/nodoy si pH final < pi => esta cargada (+), migrara hacia el polo (-)/ctodo;

(2)-fuerzainicadel medio -tambindepende deltampn; la corrienteelctricaes transportada por todos los iones presentes en la muestra y en eltampn; cuando mas concentrado eltampn, mas corriente transportada por los iones de el y menos sera la transportada por la muestra (migra mas despacio); laconcentracindeltampndebe ser suficiente para mantener constante pH adecuado y proporcionar fuerzainicaque permita el movimiento de cargas => si es > a la requerida => lamigracinde las sustancias en la muestra sera mas lenta (no se consigue laseparacindeseada)

(3)-estructura y el tamao de la sustancia - es importante en aquel procesoelectroforticaque selecciona lasmolculasenfuncinde sutamao => retiene laspartculasmas grandes y deja pasar lapequeas.

(4)-potencial del campoelctricoaplicado durante el proceso- cuanto maspotencial elctrico aplicado => mas la movilidadelectroforticade una sustancia; aunas, aumentar el voltaje para acelerar el procesoelectroforticopuedetambinaumentar la temperatura y puede causar =>alteracindebidas al calor (lasprotenasplasmticasse desnaturaliza por el calor) yevaporacindeltampnutilizado (queda + concentrado y aumenta su fuerzainica=> dificulta eldesarrolloelectrofortico)

(5)- soporte - se emplea en electroforesis zonal => al final del proceso las fracciones quedan permanentemente separadas y seafcilproceder a sucuantificacin(electroforesis libre => se realiza directamente en unasolucintamponada); tipos de soporte (depende del objetivo delanlisis) => no restrictivos: acetato de celulosa y gel de agarosa (se usa endiagnsticosclnicos); suseparacinelectroforticasolo se hace enfuncinde su cargaelctrica(aunas, las sustancias con elevado peso molecular se ven frenadas o no se desplazan totalmente); restrictivos: gel dealmidny gel de acrilamida/ poliacrilamida (ofrecen alguna resistencia en proceso que depende del tamao de los poros del soporte, del tamao ycaractersticasestructurales de la sustancia muestra); proporcionan buenas separaciones de las fracciones.

-Acetato de celulosa:su estructura deja gran cantidad de huecos de aire; cuando se sumerge en el tampon estos huecos se llenan y eltampnes el encargado de transportar la corrienteelctricapor el soporte y se produce la electroforesis; "el cellogel" es el mas usado; ventajas =>fcilmanipulacin, rapidez deejecucin, elevadaproductividad,fcillectura; desventaja => es material opaco y puede hacer desaparecer las bandas masdbilesaltransparentar-lo; no es del todo uniforme en su porosidad; puede producir distorsiones en el trazadaelectrofortica; puede producir efectoshipercrmicos(no debidos a la muestra);

-Gel de agarosa: tiene elevado tamao de poro, formado por agarosa;ventajas => mayorsolucin(por launiformidadde los poros que favorece la misma velocidad del desplazamiento => bandahomogneayntida), ausencia de efectoscromatogrficos(adsorcin/ intercambioinico), no reaccionaqumicamentecon la muestra, transparencia completa (contiene mucha agua) que evita ladistorsinen el trazado y resultadoserrneospor efectoshipercrmicosque producen otros medios opacos; carece de cargaselctricas; no presenta problemas de endosmosis; es adecuados para lacuantificacinpordensitometra; inconveniente => solo separa enfuncinde las cargas, por su elevado tamao de poro;

-Gel dealmidn: esdifcilde preparar (considerable dificultad para obtener un soporte de espesor y porosidad uniforme) y es depreparacinextempornea=> desventaja; ventaja => proporciona un mayor numero de fracciones de la muestra a separar que otros soportes.

-Geles de poliacrilamida, ventajas => proporcionan mayor n de fracciones y mejorresolucinen las bandas por lo que se usan eninvestigacin; el tamao del poro puede variarsesegnlacomposicindel gel, por lo que pueden separar las sustanciassegnsu carga y tamao; sonqumicamenteinertes.

(6)- laintensidad ycaractersticasgenerales de la corrienteelctricaaplicada - el voltaje aplicado es muy decisivo: mayor voltaje => mejor es laresolucin; pero esto puede generar el calor y laevaporacinde parte del agua contenida en el soporte y puede deteriorar la muestra; electroforesis convencional sobre gel de agarosa, no tiene este problema, dada la breveduracindel proceso (20 minutos y el moderado voltaje; en cambio, los sistemas que utilizan voltajes elevados deben llevar dispositivos derefrigeracinque mantiene la temperatura durante todo el proceso.

(7)- el revelado - se puede recurrir a diversos procedimientos, enfuncinde la sustancia y de la sensibilidad requerida; electroforesis deprotenasplasmticas=> utilizan el colorante azul de coomasie que proporcionan mayor sensibilidad y capaz de detectar desde 1/2micro-gramodeprotena; lautilizacinde sustancias fluorescentes como la fluoresceina aumenta la sensibilidad hasta 1 nanogramo; latincinde plata mejora unas 100 x la sensibilidad obtenida con el colorante de coomasie.

Electroforesis deProtenasSurealizacines posible, porque tienen diferente masa, tamao, peso molecular (a mas peso molecular (pm) => menos movilidadelectrofortica), estructura ycarcteranftero(pueden estar cargadas positivo (+) o negativo (-), lo que conseguimos con la influencia de pH).Se utilizatampnVeronal (pH 8,6) => todas las fracciones proteicas del suero se encuentran cargadas (-) => aplicando a muestra en elctodo, migraran hacia elnodo /el polo (+); procedimiento:(a)- sumergir 10 minutos las tiras de acetato de celulosa en eltampn(b)- colocar las tiras en el puente de la cubeta de electroforesis, una vez eliminado el exceso de humedad(c)- proceder al deposito individual de la muestra sobre el soporte, mediante "el aplicador" (micro o macro)(d)- introducir el puente de la cubeta, en contacto con eltampndepositado en la misma(e)- tapar la cubeta, conectar todo el dispositivo a una fuente de corriente continua ajustando la intensidad de corriente enfuncinde las necesidades(f)- transcurrido el tiempo adecuado demigracin, desconectar el equipo y revelar las tiras mediante latincinadecuada que se fijeespecficamentea la muestra procesada; si la muestra es plasma,saldruna banda mas (fibringeno); si el soporte es de acetato de celulosa, la muestra de suero obtiene 5 bandas => albumina (la que mas migra), alfa-1, alfa-2, beta (cuando el soporte es gel de agarosa, esta banda se divide en 2: beta-1 y beta-2), gamma (es la que menos se desplaza en suero nopatolgicos/la banda mas ancha).(g)- proceder a lacuantificacinde cada una de las fracciones obtenidas => se puede utilizar el aparato espectrofotometra odensitometra.

Espectrofotometra=> recortar cuidadosamente cada una de las bandas obtenidas; introducir cada banda en un tubo con una sustancia capaz de disolverla completamente; realiza la lectura del color (la DO obtenida de cada banda es proporcional a laconcentracinde la sustancia incluida)

Densitometra=> transparentar el fondo de tira mediante una sustancia transparentadora adecuada (importante conseguir el puntooptimode transparentado de las tiras); introducir la tira en un densitmetro, se obtiene unagrfica, en el que aparecen cuantificadas cada una de las fracciones presentes en la sustancia sometida a laseparacinelectrofortica;densitmetro(el aparato) produce proteinograma; albumina: la mas abundante y la que migra mas lejos (peso molecular inferior => queda menos retenida); gamma globulina: la banda es mas ancha y la de mayor peso molecular => menos se desplaza; alfa-1globulina: es la menos abundante con peso molecular menos que albumina; si espatolgicose ve unaalteracinen alguna de las bandas; beta globulina: tiene menos peso molecular que alfa-1 y alfa2.

Precauciones generales (durante el procesoelectrofortico)- sumergir completamente las tiras (gel de agarosa o de acetato de celulosa) para evitar burbujas quepodrandar lugar a manchas opacas sobre la tira;- aplicar la muestra en forma de linea fina, mediante un capilar o un aplicador para evitar el exceso quepodradar lugar adistorsinen el trazado;- no utilizar eltampnpara mas de 2 o 3 procesoselectroforticos- asegurar el contacto con los electrodos (preferentemente de grafito)- garantizar la correcta limpieza de la cubeta y de todos los recipientes utilizados- mantener un estado de hidratacin de las tiras (ni demasiada humedad para evitar ladifusinde las bandas, ni demasiada sequedad quepodrapropiciar el deposito deprotenasen exceso)

Otras aplicaciones - de forma semejante a la electroforesis deprotena,tambinse realiza con frecuencia en el laboratorio, la de otras sustancias de granintersclnico=> lipoprotenas, hemoglobina y otras susceptibles deionizacinenfuncindel pH.

Electroforesis de muestras de orina - ladeteccinde laprotenade Bence-Jones => aparece como 1 o 2 bandas en la zona beta-gamma y mas raramente en la zona de alfa-2 o alfa-1; elmtodoelectroforticoes el procedimiento mas seguro para sudeteccin, ya que el llamado "test de calor" para labsquedade estaprotenaproporciona aproximadamente 2/3 de falsos negativos y 1/5 de falsos positivos y las tiras reactivas que detectanprotenasen orina no sontilespara el hallazgo deprotenade Bence-Jones.

Interpretacinde los distintos trazadoselectroforticos- lamayorase realiza por una persona experta, es suficiente para obtener unainterpretacin; frecuentemente, se proporciona mayorinformacinsobre larelacinentre los distintos trazados o patroneselectroforticosy ciertaspatologas; dichos patronesproporcionaninformacinacerca de lo que ocurre en el organismo durante determinados procesos; las enfermedades tienen patrones predominantes, sin embargo, al no serespecficos, no permiten por si solos llevar a cabo el diagnostico.

Electroforesis capilar y su diferencia con la convencionalElectroforesis convencional (explicado anteriormente) => ha sido utilizado durante muchos aos para separar especies complejas de elevado peso molecular deintersbiolgicoybioqumico; se puede utilizar un sistema derefrigeracinpara evitar elcalentamiento(efecto Joule) que se produce al aumentar el potencialelctrico(asconseguir mas velocidad) que puede afectar negativamente a la calidad de laseparacinyresolucin); el soporte es papel o gel.Electroforesis capilar => es unatcnicaalternativa para paliar la dificultad delcalentamientoque se produce (efecto "Joule" =>la dependencia directa entre velocidad/resoluciny campoelctrico); se utiliza comosoporteun tubo capilar con undimetrointerno < a 0,1 mm y longitud entre 50 cm - 1 m; el soporte de latecnologautilizada ofrecen separaciones convolmenesde muestra extraordinariamente pequeos (0,1 - 10 nL), con una elevadaresoluciny rapidez y los resultados son mas fiables; no haymanipulacin=> todo esta automatizado y digitalizado; se puede aumentar el campoelctricosin peligro; latecnologade la electroforesis capilar permite evaluar de forma cuantitativa cualquierparmetroestableincluidoen una muestra liquida; Utilidad =>anlisisdeprotenas, vitaminas, grasas, carbohidratos, pesticidas,anlisisgentico, iones.

Tema 10 -BIOLOGAMOLECULAR

Lastcnicasdebiologamolecular - se aplican en el laboratorioclnico(microbiologia, bioquimica, hematologa etc.)para el diagnostico depatologasde origen genetico de las que es conocido el gen causante; se basan en la capacidad de los acidos nucleicos de auto-reconorse => detectar y unirse unica y exclusivamente a su secuencia complementaria; capacidad deauto-duplicarse; se usan entcnicasde transferencia de Southern Blot y de NorthernBloty lastcnicasdeampliacindecidosnucleicos mediante RCP/PCR para el diagnostico de enfermedad infecciosas,anlisisde paternidad y unpatrnde huellas de ADN;

ADN /acido desoxirribonucleico => una largamolculanicade doble cadena (bicatenario/dicatenario) formada por launinde 2 cadenas helicoidales de polinucletidos enrollados a lo largo de un ejecomn; las cadenas corren en direcciones opuestas; esta en elncleo; esta formado por cadenasnucletidosen los que elazcar(pentosa) es la desoxiribosa y las bases nitrogenadas son la purnicas (adenina, guanina) y pirimidnicas (citocina, timina); situado en elncleoy forma cromosoma; es donde se guarda lainformacinnecesaria para fabricarprotenas; es uncdigoque setraduciren aminocidosy luegoprotenas.

ARN /acido ribonucleico => es unamolcula (con variaciones ARNn, ARNt, ARNr, etc.)formada por unanicacadena (monocatenario) helicoidal compuesta de unasucesindenucletidos; sale delncleo (esta en el citoplasma); es lasucesindenucletidos, donde el azucar/pentosa es la ribosa y las bases nitrogenada sonpurnicas(adenina, guanina) y pirimidnicas (citocina y uracilo); no forma cromosoma;es el encargado de transmitir lainformacinque guarda el ADN (intermediario para lasntesisprotenas).

Hibridacin decidosnucleicos - consiste en lafijacin"in vitro" de ADN o ARN marcada (en lamayoracon un isotopo radioactivo, sustanciaqumicao enzimas) a su correspondiente cadena complementaria procedente de la muestrabiolgicaperteneciente al paciente; estatcnicase basa en la capacidad de loscidosnucleicos deautor-reconocerse=> detectar y unirsenicayexclusivamentea su secuencia complementaria; reactivos necesarios: (1) acido nucleico diana de la muestra (2) sondas de hibridacin => fragmentos decidosnucleicos marcados, se elaboran en el laboratorio y su secuencia de bases es complementaria a la secuencia genmica del ADN diana.

Los sistemas de marcaje de sonda o sistemas indicadores - sistema mediante los cuales se marca la secuenciagnica=> para poder visualizar una secuencia de ADN/ARN conocida y facilitar el posterior sistema dedeteccin de la enfermedad determinada y lectura de resultados; esta secuencia de ADN es la que se busca en la muestra del paciente, son especificos porque contienen una secuencia de bases que es complimentaria a la secuenciagenmicadel DNA diana; tipos de sonda:a.Qumico- la sonda se une a sustanciasqumicasb. Radioactivo - se incorporan a la estructura molecular de la sonda isotopos radiactivosc.Enzimtico- se une la enzima y la secuencia de acido nucleico mediante una cadena carbonadad. Antignico - se dota a la secuencia de la sonda de capacidadantignicamodificando alguno de susnucletidose. Colorimtrico - se une la sonda a compuestos coloreados o capaces de formar compuestos coloreados; Bromuro de Etidio => se usa como marcadorrpidode ADN, que tiene la capacidad de intercalarse en las cadenas de ADN, y al incidir con luz UV emite una luz rojiza anaranjada que es mayor cuando este unido el ADN (sirve para detectar el ADN).

Tcnicasdehibridacin(1)Extraccindel acido nucleico/purificacindecidosnucleicos (tcnicadel fenol-cloroformo) => se dispone en el mercado de sistemas de aislamiento de ADN a partir de sangreperifricao declulasensuspensin(leucocitos) para laobtencinde ADN puro;tcnicadeextraccin:- lisis celular => romper la membrana celular y nuclear consolucinde lisis celular (mediante laaccindel reactivo yincubacin)- desproteinizacin => quitar todo lo que no sea materialgenticocon latcnicade fenol-cloroformo; lasprotenasparcialmente degradadas, se eliminan de ladisolucinmediante unaextraccincon fenol-cloroformo (medianteaplicacinde reactivo,centrifugaciny decantacin repetitivo)-comprobacinde la efectividad de ladesproteinizacin(mediante lectura de absorbancia porespectrofotometra) => se calcula larelacindeabsorbenciasa las 2 ondas y larelacinoptima oscila entre 1,6 (260) y 2 (280); es para comprobar si la muestra es pura.Aplicacin=> diagnostico de leucemia mieloidecrnica(LMC) y talasemias

(2)Tcnicade SouthernBlot- fases:-purificacindecidosnucleicos contcnicade fenol-cloroformo => obtener ADN puro-digestindel ADN por EdR:incubacinde ADN o ARN de la muestra con EdR (endonucleasas derestriccin=> enzimas que seccionan la cadena); objetivo: romper el ADN en diversos fragmentos; se incuba la EdR con el ARN a 37oC y se comprueba la efectividad del proceso, disolviendo una pequeacantidadde ADN en azul de bromofenol y realizar una electroforesis en un minigel de agarosa => se observan sus fragmentos bajo la luz UV (se obtienen diferentes fragmentos de ADN con regiones diana);-separacinde los fragmentos de ADN: disolver el gel de agarosa;- desnaturalizacin del gel: mezclar el gel de agarosa con diferentes soluciones dedesnaturalizacin, centrifugar y decantar el sobrenadante hasta que quede limpio;desnaturalizacindel ADN => separar las dos hebras de ADN para poder juntarse con elhbrido(en un medio astringente para que no se unan entre ellas) mediante calor (alerta: no fundir el gel porque se estropea el ADN).-electroforesis(para separar los fragmentos portamao); en gel de agarosa o poliacrilamida.- transferencia a un filtro de nitrocelulosa: hacer pasar el gel por unabateradesolucinde elevada fuerzainica => afinidad por el ADN; fija las bandas a un soporte mas estable antes de lahibridacin; Porabsorcin, por capilaridad, ascienden las bandas al papel de nitrocelulosa que es muy resistente y manejable (fijadas para siempre).- prehibridacin ehibridacindecidosnucleicos: launinde las sondas marcadas (con isotopos radiactivos) con el ADN dianadesnaturalizado(para marcar la secuenciagnica, si esta o no); se realiza en unacmaradehibridacincon condiciones controladas de temperatura a 42C, pH, humedad,concentracinde sales, medio astringente etc; se uniran a la sonda, no entre ellos;- lavado y revelado: una vez acabado el proceso dehibridacin, se elimina el exceso de radiactividad con un lavado de filtros (para quitar el exceso de radiacividad), se procede el secado, se pone en contacto con la pelicula radiografica; unos dias despues revelar la pelicula y lectura de resultados segun el metodo de marcaje usado. Presencia o ausencia del fragmento de acido nucleico responsable de la enfermedad genetica y se realiza la lectura de los resultados.

Ladeteccin/lectura de los resultados:- marcajequmico=> mediante quimioluminiscencia (se mide la luz emitida por las sondas de la muestra con espectroscopia de luminiscencia)- marcaje radiactivo => autorradiografa recuento de centelleo (medir la cantidad de radiactividad emitida por la muestra; p.e. isotopos 32P, 125I)- marcajeenzimtico=> espectroscopia (se aade al medio un sustratocromgenoque al reaccionar se convierte en producto coloreado; a mas color, mas cantidad de muestra; el color es lo que se busca)- marcaje antignico=> espectroscopia y microscopia (Ac contra ese Ag que esta marcada la sonda; el Acestarmarcado con fluorescencia)- marcaje colorimtrico => espectroscopia (lectura de la DO absorbida por la muestra)Aplicacin=>deteccinde talasemias alfa, reordenamiento de genes, variaspatologas.

Astringencia => el grado deinterso afinidad de la sonda por su acido nucleico diana; cuando lascondicionesdel ensayo son optimas => aumenta su nivel.

Digoxigenina => es una sustancia capaz de reaccionarqumicamentey formar compuestos coloreados; se une a la sonda de marcaje; es un marcadorantignico,qumicoycolorimtrico.

Bromuro de etidio => es un marcadorrpidodecidosnucleicos; es mutagnico ycancergeno; tiene la capacidad de intercalarse en el ADN cuando se expone a la luz UV, emite un color naranja, rojizo que es mayor cuando este unido al ADN; sirve para detectar el ADN.

Azul de bromofenol => es un indicador de pH, se disuelve en el gel; es usado como frenteelectrofortico, para poder ver (azul) como corre el gel y asegurarnos que las bandas no se salgan (tiene menos peso que el ADN y corre mas).

Western Blot => la mismatcnicapero para el estudio de lasprotenas;sntesisde determinadasprotenas(enfermedades); se hacen con marcadores Ac anti esaprotena.

EdR (endonucleasas derestriccin) => son enzimas (hay + de 100 diferentes) que seccionan una cadena de ADN tras reconocer una secuencia especifica constituida entre 4-8 pares de bases nitrogenadas que delimitan las denominadas zonas derestriccin; estos fragmentos sepodranseparar y reconocer por electroforesis en gel de agarosa o poliacrilamida y van a ser utilizadas de secuencias de ADN (y ARN) para cortar trozos grandes de ADN en fragmentos mas pequeos; el ARN nose corta porque ya lo encontramos de diferentes tamaos; con la electroforesis los separaremos por tamao sonextradosde microorganismos; pueden ser romos o cohesivos; en latcnicaNorthern Blot no se necesitan (no hace falta cortar) ya que el ARN son copias pequeas de ADN.

Tcnicade NorthernBlot- es similar a latcnicade SouthernBlot; la diferencia es que se utiliza ARN; lacomposiciny estructura del acido nucleico es diferente por lo que lastcnicassernsimilares desde el momento de ladesnaturalizacin del ADN en latcnicadeSouthernBlot; muchas veces se trabaja con el ARN porque no se rompe / no se ha de desnaturalizar => son trozos pequeos, no necesitan endonucleasas derestriccin.

Ampliacindecidosnucleicos mediante PCR/RCP (reaccinen cadena de la polimerasa