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Javier Rodríguez Sevilla, 29 de septiembre de 2015

Soluciones para el análisis de Dioxinas y 3MCPD

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Análisis de Dioxinas

• Entre los compuestos más tóxicos que existen. 70.000 veces más que el Cianuro. • Subproductos de procesos industriales, como combustiones con Cl y aromáticos. • Solubles en las grasas y se acumulan en tejido adiposo de los animales

• Se mide como TEQ o cantidad equivalente de toxicidad o la cantidad de 2,3,7,8-TCDD necesaria para producir la misma toxicidad

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Extracción automatizada con FMS PLS+PowerPrep+PowerVap

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Alternativas con nuestro Thermo ScientificTM ASETM 350 y Kit SP3 ST de Cape Tech.

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Thermo Scientific™ DFS™ Magnetic Sector GC-HRMS: Patrón oro para medir Dioxinas

GC-HRMS sector magnético DFS– diseñado para Dioxinas * * o cualquier otro compuesto que requiera la más alta sensibilidad

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10.91 11.0910.299.09 11.609.268.81 11.268.78 10.04 10.539.749.338.478.137.68 7.92 9.638.407.59

DFS GC-HRMS: Patrón oro para medir Dioxinas

Sensibilidad < 20 fg TCDD

¿Especificaciones?

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DFS GC-HRMS: Patrón oro para Dioxinas

Sensibilidad – 20 fg TCDD

¿Especificaciones? ¡Esta es la nuestra!

GC-HRMS sector magnéticoThermo Scientific DFS : El MS preferido para confirmación en España y en todo el mundo:

• probado y establecido en análisis de Dioxinas…………...¡¡más de 10 años !! • complimiento de TODOS los métodos oficiales………….en todo el mundo • sensible, robusto, máxima confianza en identificación...maxima fiabilidad • larga vida operativa a máximas prestaciones

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• Cumplimiento de todas las

normativas mundiales • Dioxinas, PCBs, BDEs • EPA 1613,1668,1614 y otras • Masa exacta, uso PFK, lockmass

trace etc.

• Por Referencias • Laboratorio publicos y privados

Dioxinas en todo el mundo etan equipados con cientos de HRMS (MAT95 & DFS)

• Literatura científica: muchos trabajos en Dioxinas y POPs con DFS

¿Porque es el método de referencia para Dioxinas y PCBs?

• Sensibilidad • La mejor especificación en Dioxinas • e.g. 40% mejores que QQQ

• Apuesta segura • GC-HRMS desde hace 3 decadas

obtiene los mejores resultados en Dioxinas en tests round robin test (MAT95 & DFS)

• Unica configuración Dual GC para confirmación con 2 columnas distintas

• Especificaciones del análisis • Mejores ratios, linealidad, precisión, etc

combinados con robustez y larga vida de la instrumentación

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Alternativas con nueva normativa Europea: Triple Cuadrupolo

• El triple cuadrupolo GC-MS Thermo Scientific™ TSQ 8000™ Evo fue empleado para detectar y confirmar niveles traza de PCDD/Fs en extractos de muestras, segun las nuevas normativas EU Commission Regulation 589/2014 y la reciente Regulation No. 709/2014 para screening y confirmación

• Se pesenta una validación exhaustiva del TSQ 8000 Evo GC-MS/MS para confirmación de dioxinas.

• Se comprobó la sensitibilidad, linealidad, chromatografia, LOD/LOQs y la precisión de las medidas.

• Los datos adquiridos con GC-MS/MS se han comparado con los datos adquiridos con GC-HRMS para las mismas muestras y se comprobaron las incertidumbres.

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DFS GC-HRMS

Experimental

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Thermo ScientificTM TSQTM 8000 Evo GC-MS

• Sistema GC-MS de triple cuadrupolo avanzado de ultima tecnologia presentado en ASMS 2014

• Celda de colisión rápida con opticas de alta velocidad con tecnologia EvoCell para obtener velocidad rápidas de transiciones SRM, alta precisión y alta sensibilidad

• Fuente de iones ExtractaBrite™ calefactada para trabajar con matrices sucias • Fuente de iones totalmente extraible, calefactada, y bajo vacío. Cuando es

necesario limpiarla o cambiar un repuesto se extrae sin romper vacio.

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Condiciones GC & MS

Thermo Scientific™ TRACE™ 1310 GC Parameters Column TG-5 SIL MS, 60 m x 0.25 x 0.25 Injection Volume (mL): 2 Liner SSL single taper 4mm ID 78.5mm Inlet (°C): 260 Inlet Module and Mode: splitless Carrier Gas, (mL/min): He, 1.2 Oven Temperature Program time (min): 33

TSQ 8000 Evo Mass Spectrometer Parameters Transfer line (°C): 280 Ionization type: EI Ion source(°C): 300 Electron energy (eV): 40 Acquisition Mode: SRM Q1 Peak Width (AMU): 0.7 Q3 Peak Width (AMU): 0.7

GC

MS DFS Mass Spectrometer Parameters

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Muestras

• Muestras en matriz (previamente analizadas en un equipo GC-HRMS) proporcionadas por el EU-RL, Freiburg

• Muestras elegidas estaban naturalmente contaminadas con niveles bajos de PCDD/Fs. • Comprobado y validado los LOQs en matriz asi como los controles de precisión para el contenido total

de dioxina a niveles bajos.

• Extracción y Clean-up de acuerdo con los metodos existentes para alimentos y piensos ya sea automaticamente (PowerPrep™ SPE) o parte automático parte manual (GPC, multi-capa silica, Florisil®, carbon).

Mixed animal fat Fish meal Egg fat 11 Egg fat 2 Weighted sample: 10.0 g fat 60.2 g sample (= 10.0 g fat) 0.52 g fat 0.51 g fat Lipid content [%]: n/a 16.6 n/a n/a Moisture content [%]: n/a 5.3 n/a n/a Final volume: 40 µl 40 µl 10 µl 10 µl

13C Internal standard 13C Internal standard 13C Internal standard 13C Internal standard 2378 TCDF 50 50 10 10 12378 PCDF 50 50 10 10 23478-PCDF 200 200 40 40 123478 HxCDF 100 100 20 20 123678 HxCDF 100 100 20 20 234678 HxCDF 50 50 10 10 123789 HxCDF 50 50 10 10 1234678 HpCDF 100 100 20 20 1234789 HpCDF 50 50 10 10 OCDF 100 100 20 20 2378 TCDD 50 50 10 10 12378 PCDD 100 100 20 20 123478 HxCDD 100 100 20 20 123678 HxCDD 200 200 40 40 123789 HxCDD 50 50 10 10 1234678 HpCDD 200 200 40 40 OCDD 600 600 120 120

13C Recovery standard 13C Recovery standard 13C Recovery standard 13C Recovery standard 1234-TCDD 50 50 10 10

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Adquisición de y Procesado de Datos

• Datos adquiridos mediante Monitorización de la Reacción Seleccionada por ventanas de tiempo (timed-SRM) en Triple Cuadrupolo o Mediante timed-SIM en Alta resolución.

• Se adquieren un mínimo de 12 puntos cromatográficos por pico.

• El procesado de datos se realiza con el programa

Thermo Scientific™ TargetQuan 3.1. • El programa realiza automáticamente los cálculos

para convertir la concentración cálculada a partir de las curvas de calibración de cada compuesto en TEQ y los chequeos de control exigibles segun norma

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Test Sensibilidad: patrones crecientes • Superposición de cromatogramas SRM (ion cuant.) de 6 congéneres TCDD en cada

nivel de concentración. • Concentraciones representadas como cantidad absoluta en columna.

RT: 13.37 - 14.94 SM: 3B

13.4 13.5 13.6 13.7 13.8 13.9 14.0 14.1 14.2 14.3 14.4 14.5 14.6 14.7 14.8 14.9Time (min)

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10014.78

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13.6513.52 14.8614.38 14.4113.76 14.6713.53

14.56

NL: 8.47E4TIC F: + c EI SRM ms2 321.890@cid20.00 [258.925-258.935] MS 19May2014_11NL: 8.33E4TIC F: + c EI SRM ms2 321.890@cid20.00 [258.925-258.935] MS 19May2014_03NL: 8.49E4TIC F: + c EI SRM ms2 321.890@cid20.00 [258.925-258.935] MS 19May2014_05NL: 8.25E4TIC F: + c EI SRM ms2 321.890@cid20.00 [258.925-258.935] MS 19May2014_06NL: 8.35E4TIC F: + c EI SRM ms2 321.890@cid20.00 [258.925-258.935] MS 19May2014_07NL: 8.38E4TIC F: + c EI SRM ms2 321.890@cid20.00 [258.925-258.935] MS 19May2014_08NL: 8.53E4TIC F: + c EI SRM ms2 321.890@cid20.00 [258.925-258.935] MS 19May2014_09NL: 8.48E4TIC F: + c EI SRM ms2 321.890@cid20.00 [258.925-258.935] MS 19May2014_10

1368-TCDD10 fg

IR % = 9

1379-TCDD25 fg

IR % = 6

1378-TCDD100 fg

IR % = 7

1478-TCDD250 fg

IR % = 6

2378-TCDD1000 fgIR % = 4

1234-TCDD500 fg

IR % = 11

Inj. No. Concentration10 fg 25 fg 100 fg 250 fg 500 fg 1000 fg

1 3129 7011 25940 60219 87635 2392162 3045 6209 25998 59108 85789 2401623 3047 7055 27425 58262 87578 2372744 2637 7440 25734 59335 87079 2336555 2678 6376 27805 58583 83897 2344706 2964 6513 27097 58902 85373 2385547 2828 6931 26347 59936 86844 2427408 2699 6579 25033 55519 79471 232038

mean 2878.4 6764.3 26422.4 58733.0 85458.3 237263.6STDEV 192.5 411.7 940.7 1452.1 2730.3 3625.3% RSD 6.7 6.1 3.6 2.5 3.2 1.5

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DETERMINACION DE DIOXINS EN EXTRACTOS DE MUESTRA

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Chromatografia y Selectividad 2,3,7,8-TCDD en extractos

95 fg 28 fg 98 fg

Alimento peces Mezcla grasa animal huevo

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Comparación con GC-HRMS

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Ratios iónicos: IR muestra de huevo vs. IR Teórico

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Mezcla de grasas animales: Precisión del contenido total de Dioxina (n=13)

Obtener estimaciones válidas de las concentraciones de PCDD/Fs en los extractos es crítico.

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Esquema análisis de Dioxinas y PCBs

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Conclusiones

• Excelente sensibilidad para ambas técnicas (ex: 28 fg 2378-TCDD absolutos on column QQQ y < 20 fg GC-HRMS)

• Mayor selectividad en Alta Resolución y Masa Exacta además del análisis con dos columnas ( 2 GC) de diferente selctividad en DFS para confirmar positivos

• Medidas de Precisión para el contenido total de dioxinas (WHO-PCDD/F-TEQ-ub) para dos niveles de muestras contaminadas (pienso y grasa animal) obtuvieron valores de %RSD <6% (n=13). Desviación del contenido total de dioxina en QQQ del dato analizado con GC-HRMS dentro del ±20% para todas las matrices y muestras.

• El triple cuadrupolo TSQ 8000 Evo es un sistema sensible y robusto adecuado para la cuantificación a bajos niveles de dioxinas y furanos en alimentos y piensos. Confirmación negativos ( muestras nivel < limite máximo)

• El GC HRMS DFS es el instrumento oficial de confirmación. (> limite máximo)

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DETERMINACION DE 3-MCPD EN ACEITES Y GRASAS

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2 MCPD, 3 MCPD y Glicidol: derivados del Glicerol

Se producen en refinado (desodorización a alta temperatura). Casi todos los aceites y grasa refinados los contienen. Forman esteres con los ácidos grasos y se liberan con la digestión de la comida

MRL 3-MCPD libre: 20 µg/kg Glicidol es cancerígeno y mutagénico

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Alternativas analíticas: Analisis directo o indirecto

Análisis directo: análisis de todos los ésteres originales

El cromatograma muestra >27 analitos

Eliminación de matriz: GPC, SPE

LC-MS/MS QQQ ó LC-MS/MS HRMS (Orbitrap)

Jan Kuhlmann SGS •Compositional Analysis of Lipids / June 20-21 2013 / Het Pand, Ghent, Belgium

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Analisis directo: desafío cromatográfico

Tanto mono como di-esteres no se separan isómeros por LC y la respuesta MS es muy diferente de un isómero a otro. P ej 2 palmitoil 3-MCPD es 40% menos que 1 palmitoil 3-MCPD Riesgo de no contar con 3-MCPD libre NESTLE M. Dubois; Oral presentation AOCS Annual Meeting 2011,

Cincinnati, Ohio

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Analisis indirecto: cromatografia sencilla. Mayor preparación

Aceite vegetal hipotético 3 acidos grasos relevantes

Rotura del ester: alcalina/ácida/enzimática 3 min – 16 h

Cromatograma muestra tres analitos. LOQ de 0,05 a 0,25 mg/kg

Matriz: extr liq/liq Derivatización: p.ej. HFBA/Acetona/PBA

GC-MS/MS Jan Kuhlmann SGS •Compositional Analysis of Lipids / June 20-21 2013 / Het Pand, Ghent, Belgium

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Ventajas/desventajas del método indirecto

• Solo 3 compuestos de referencia (patrón y patrón interno) • Eliminación de matriz e instrumentación menos sofisticada / costosa • Menos riesgos de subestimar MCPD libre • Separación cromatográfica sencilla

• Reacciones químicas isomerización o transformación de los analitos. MCPD glicidol o formación de artefactos • Derivatización para el análisis por GC

Jan Kuhlmann SGS •Compositional Analysis of Lipids / June 20-21 2013 / Het Pand, Ghent, Belgium

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Solución para uso en rutina para análisis de 3-MCPD

Evaldo de Armas. Pittcon 2012 Thermo Fisher Scientific

Metodo AOAC: preparación de muestra con cromatografia FLASH, concentración en rotavapor y derivatización liquido/liquido Thermo Scientific: QuEChERS modificado, concentración y derivatización Thermo Scientific™ TriPlus RSH™ Autosampler Sampling volume : 1.0mL Thermo Scientific™ Trace ™ GC Column : Thermo Scientific™ TraceGOLD TG-5MS 15 m × 0.25 mm I.D. df = 0.25mm (Thermo Scientific p/n 26-098-1300) Injection mode : PTV 2.0mm I.D. Siltek Baffled liner Injection program : 250℃ Splitless (1.0 min.) Split Flow 50ml/min. Cleaning Temp. 300℃ for 2.0 min. Solvent Valve Temp. 120℃ Oven Temp : 50℃(1 min)→40℃/min→250℃(1min) Equilibration time 0.5min. Flow : Constant flow 1.5 ml/min. Transfer line Temp : 280℃ Mass Spectrometer: Thermo Scientific™ TSQ Quantum ™ XLS Ion Source Temp. : 250℃ Emission Current : 50uA Detector Gain : 3.0×105 Ionization mode : EI Analytical mode : SRM Q1 and Q3 at 1.0u

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Solución para uso en rutina para análisis de 3-MCPD

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Nadie es perfecto: no hay método perfecto

Metodos directos: Faltan sustancias de referencia/ int std. Aplicación dificil por esto para esteres de ac. Grasos poliinsaturados (Oliva, aceite de pescado) Algunas grasas y emulsificadores dificiles de pasar por SPE Separación cromatográfica Solución: mejoras en método, Instrumentación más sofisticada Metodos indirectos: La neutralización o la transesterificación dificulta aplicación a muestras ácidas. P ej. Ac grasos libres. Solución añadir más concentración de reactivo para romper el ester.

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Conclusiones análisis 3-MCPD

•Estudios interlaboratorio encargados por la Comisión Europea en 2013 concluyen que los laboratorios prefieren el método indirecto para el análisis en rutina

•Los métodos directos e indirectos actuales muestran similares resultados en aceites simples y grasas

•Estan apareciendo nuevos métodos que deben ser evaluados y verificar sus resultados en distintas matrices: análisis directo por GC-HRMS, la separación enzimática del ester, pretratamiento acido para convertir los esteres glicidicos en esteres de MBPD

Jan Kuhlmann SGS •Compositional Analysis of Lipids / June 20-21 2013 / Het Pand, Ghent, Belgium