practicos de bioquímica-1

UNIVERSIDAD DE SANTIAGO DE CHILE Facultad de Química y Biología

Departamento de Biología Dr. Pablo Nelson Hunt

LABORATORIO 1

Separación de Proteínas por Cromatografía de Exclusión Molecular.

Introducción Para estudiar la función o las propiedades de una proteína, como por ejemplo su secuencia, actividad, o estructura, es de gran importancia obtenerla como una especie pura. Los métodos habitualmente utilizados en la purificación de proteínas, se basan algunas de las características de éstas, incluyendo su tamaño, carga o capacidad de unión. El conjunto de métodos que tienden a separar proteínas provenientes de un extracto es denominado fraccionamiento, entre los que destacan las cromatografías en columna. Los métodos cromatográficos habitualmente utilizados en el estudio de proteínas son las cromatografías de exclusión molecular o filtración en gel, de intercambio iónico, de afinidad y el HPLC. En el presente práctico se nos presenta como objetivo la separación de proteínas contenidas en una mezcla, mediante una cromatografía de exclusión molecular, utilizando como fase estacionaria Sephadex G75. Una de estas proteínas es la fosfatasa ácida de germen de trigo. Procedimiento Experimental. 1.- Preparación de la columna. Se montará una columna de Sephadex G-75.

• Coloque un pedazo de lana de vidrio en el fondo de la columna de vidrio. • Cierre la llave de paso de la columna y llénela con agua destilada. Posteriormente, abra

la llave de paso y deje escurrir el agua hasta llegar a la mitad de la columna. De esta forma evitará la formación de burbujas a la salida de la columna.

• Agregue la suspensión de Sephadex G-75 y deje sedimentar. Posteriormente, abra el flujo de la columna y continúe agregando Sephadex hasta formar una columna empaquetada de 10 a 12 cm.

• Equilibre la columna haciéndole pasar 2 volúmenes de agua.



2.- Sembrado y elución de la muestra. Se utilizarán dos muestras. La primera de ellas, una solución de Azul Dextrano, y la segunda una mezcla que contiene albúmina sérica de bovino (BSA; 2mg/mL), fosfatasa ácida de germen de trigo (2mg/mL), y citocromo C (1mg/mL).

• Eluya el agua de la columna hasta que la superficie del gel esté a punto de secarse. • Con una micropipeta agregue 500 µL de muestra. • Eluya muy lentamente, hasta que la muestra haya ingresado completamente en el gel. • Agregue agua a la columna. • Comience la elución de la muestra, colectando fracciones de 1 mL en tubos eppendorf.

3.- Confección del cromatograma. En papel milimetrado, se confeccionarán los perfiles de elución de proteínas obtenido.

• Mida la absorbancia de cada una de las fracciones colectadas a 280 y 550 nm, usando eluyente como blanco.

• Grafique Abs v/s número de fracción. • Interprete los resultados obtenidos, y guarde fracciones representativas para los

máximos. No olvide guardar un mínimo como control negativo..



LABORATORIO 2

Determinación de la Concentración de Proteínas por el Método de Bradford

Introducción Se han descrito numerosos métodos que permiten determinar la concentración de proteínas, todos ellos presentan ventajas y desventajas. La elección del método dependerá de la naturaleza de la proteína, la naturaleza de los otros componentes en la muestra o la sensibilidad o sencillez deseadas. Los métodos más tradicionalmente usados se basan en diferentes propiedades químicas y físicas de las proteínas., siendo los principales los ensayos de Biuret, Lowry y Bradford. Este último se basa en la propiedad del colorante azul de coomassie G-250 de unirse a las proteínas, presentando un máximo de absorción a 595 nm. La coloración es proporcional a la concentración de proteínas, obteniéndose un comportamiento lineal en el rango de 0 a 30 µg de proteínas. Anteriormente, fue determinado mediante el método de absorción UV la presencia de máximos de absorbancia a 280 nm en las fracciones colectadas en la separación cromatográfica. El objetivo del presente práctico será calcular la concentración de proteínas presentes en las fracciones más importantes. Procedimiento Experimental. 1.- Elaboración de una curva de calibración. Se trabajará a partir de una solución stock de BSA de concentración 1mg/mL. El reactivo de Bradford disponible es comercial, y se utilizará en una dilución 1:5.

• Disponga de 10 tubos eppendorf, los cuales contendrán 0, 2, 4, 6, 8, 10, 20, 30, 40 y 50 µg de BSA.

• Enrase a un volumen final de 50 µL con agua destilada. • Agregue 950 µL de reactivo de Bradford. • Mezcle y deje esperar por 5 minutos. • Mida absorbancia a 595 nm. • Grafique en un papel milimetrado los datos obtenidos y trace la recta correspondiente

al rango lineal.



2.- Determinación de la concentración de proteínas de la muestra. Para la medición de proteínas, Ud deberá seleccionar las fracciones correspondientes a los máximos de su cromatograma. También será deseable utilizar un mínimo.

• En tubos eppendorf agregue 10 µL la muestra y enrásela a 50 µL con agua destilada. • Repita procedimiento anterior. • Recuerde que los valores de absorbancia obtenidos al medir las muestras deben entrar

en el rango lineal de la curva de calibración. De no ser así, plantéese las soluciones al problema.



LABORATORIO 3

Separación Electroforética de Proteínas en Geles de Poliacrilamida en Condiciones Desnaturantes

Introducción Una molécula con carga neta posee la capacidad de poder moverse a través de un campo electrico. Este fenómeno, denominado electroforesis, es ampliamente utilizado para la separación de diversas macromoléculas, como proteínas, DNA y RNA. Sin embargo, esta técnica no es utilizado para la purificación de grandes cantidades de proteínas; mas bien se utiliza como método analítico, que nos permitirá separar y visualizar el número de proteínas, y por ende, el grado de pureza de una muestra. Este objetivo es de gran importancia a la hora de determinar eficiencia de un proceso de fraccionamiento de proteínas. Otra ventaja que nos proporciona esta técnica es que nos permite estimar propiedades de la proteínas como su punto isoeléctrico y su masa molecular relativa. En experiencias anteriores, Ud ha separado proteínas mediante una técnica cromatográfica y posteriormente ha cuantificado la cantidad de éstas mediante el método de Bradford. En el presente práctico, se buscará verificar el grado de pureza de sus fracciones, a la vez de determinar las proteínas presentes en cada una de ellas, valiéndose del método de electroforesis en gel de poliacrilamida en condiciones desnaturantes. Procedimiento Experimental 1.- Preparación del gel de poliacrilamida. El gel a preparar está formado por un gel separador (inferior) y un gel concentrador (superior). Para la preparación de éstos realice las siguiente mezclas:

Gel Separador (5 mL poliacrilamida 10%): • H2O 1,9 mL • 30% mezcla Acrilamida 1,7 mL • 1,5 M Tris (pH 8,8) 1,3 mL • 10% SDS 0,05 mL • 10 % Persulfato de Amonio 0,05 mL • TEMED 0,002 mL



Gel Concentrador (2 mL poliacrilamida 5%):

• H2O 1,4 mL • 30% mezcla Acrilamida 0,33 mL • 1,0 M Tris (pH 6,8) 0,25 mL • 10% SDS 0,02 mL • 10 % Persulfato de Amonio 0,02 mL • TEMED 0,002 mL

• Antes de armar el sistema de vidrios (según las instrucciones del profesor o del

ayudante), lávelos con agua y etanol.

• Vierta la solución del gel separador, hasta aproximadamente ¾ de la capacidad de los vidrios. Posteriormente, agregue ½ mL de etanol o isopropanol. Una vez gelificada la solución, retire el alcohol.

• Vierta la solución del gel separador, y coloque la peineta antes su gelificación.

2.- Preparación de la muestra. De cada muestra se cargarán 20 µL por bolsillo, que contengan 1 y 5 µg de proteínas. Además de sus muestras, se dispondrá de una solución patrón de BSA (1mg/mL), de la cual se cargarán 1 µg.

• En tubos eppendorf coloque sus muestras, con buffer de carga y complete con agua hasta 25 µL (la proporción de muestra y buffer de carga dependerá de la concentración de este último).

• Coloque sus muestras en agua hirviendo por 5 minutos. • Posteriormente ponga los tubos en hielo, hasta cargar las muestras.

3.- Carga y corrida de la muestra.

• Coloque el gel en la cámara de electroforesis, según instrucciones, y posteriormente agregue buffer de corrida (25 mM Tris, 250 mM glicina, 0,1% SDS).

• Con ayuda de una jeringa Hamilton, cargue 20 µL de cada muestra. • Cargue 5 µL del estándar de peso molecular. • Conecte la cámara de electroforesis a la fuente de poder y aplique 180 V. • Una vez finalizada la corrida electroforética, retire el gel y corte el gel separador. • El gel será fijado y teñido en una solución de ácido acético en metanol, que contiene

azul de coomasie (Comercial). • El ayudante le facilitará una fotografía de su gel, a partir de la cual Ud. determinará

los tamaños relativos de cada muestra resuelta.



LABORATORIOS 4 y 5

Determinación de las Propiedades Cinéticas de la Enzima Fosfatasa Acida de Germen de Trigo

Introducción Las enzimas son proteínas con un gran poder catalítico y un alto grado de especificidad por su sustrato. Estas proteínas poseen gran importancia en todos los procesos bioquímicos. Actuando en forma concertada, catalizan cientos de reacciones que llevan, entre otros, al metabolismo de nutrientes, la conservación o transformación de energía o la biosíntesis de macromoléculas. La reacción más simple que pueden catalizar las enzimas está representada por la ecuación:

Donde E, S y P, representan a la enzima, al sustrato y al producto, respectivamente, mientras que ES y EP representan los complejos transitorios enzima-sustrato y enzima-producto. Para caracterizar el funcionamiento de una enzima, es importante determinar el como las condiciones ambientales, el pH y la temperatura, afectan su capacidad catalítica. En este trabajo práctico se trabajará con la fosfatasa ácida de germen de trigo, la cual cataliza la hidrólisis de fosfatos monoésteres, con liberación de fosfato inorgánico, según la siguiente reacción:

Dentro de los objetivos a cumplir, se encuentran el determinar las condiciones óptimas de trabajo de la fosfatasa ácida de germen de trigo, así como los parámetros cinéticos de ésta, comparando las actividades específicas tanto de la enzima comercial como la purificada en prácticos anteriores. En este ensayo, se usará un sustrato artificial, el p-nitrofenil fosfato (NPP). El grado de hidrólisis de éste se determinará espectrofotométricamente cuantificando el p-nitrofenol liberado, que en solución alcalina, absorbe fuertemente a 405 nm.



Procedimiento Experimental. 1.- Elaboración de una curva de calibración de p-nitrofenol.

• Prepare 6 tubos que contengan 0, 125, 250, 500, 750 y 1000 µL de una solución de p-nitrofenol 60 µM (en NaOH 0,05M).

• Enrase cada uno de los tubos a 1 mL con NaOH 0,05 M. • Para cada uno de los tubos lea la absorbancia a 405 nm. Verifique que su blanco sea el

apropiado. • En papel milimetrado grafique la curva obtenida

2.- Determinación de las condiciones óptimas para la actividad de la fosfatasa ácida de germen de trigo. Se verificará la obtención de producto a tiempos fijos en diferentes condiciones de pH y temperatura.

• Prepare un tubo que contenga 200 µL de amortiguador y 200 µL del sustrato p-nitrofenil fosfato (pNPP 2,5 mM, diluído en el amortiguador correspondiente), por cada temperatura de ensayo (4, 37 y 60ºC).

• Preincube cada tubo a la temperatura de ensayo por 2-5 minutos. • Prepare una dilución de enzima que sea 1:20 con respecto al stock (10 mg/ml) en el

amortiguador respectivo. • Agregue 100 µL de la dilución de la enzima (1:20) a cada tubo de reacción. Mezcle e

inmediatamente saque una alícuota de 100 µL y deje el tubo de reacción a la temperatura correspondiente.

• Adicione la alícuota a un tubo que contenga 900 µL de una solución de NaOH 0,05 M. Guarde el tubo en oscuridad. Este es el control denominado tiempo cero de reacción.

• Al cabo de 5, 10 y 20minutos de incubación, retire nuevas alícuotas del tubo de reacción y adiciónelas a respectivos tubos que contengan 900 µL de NaOH 0,05 M.

• Determine la absorbancia a 405 nm de cada uno de los tubos. Verifique que su blanco sea el apropiado.

• Calcule los µmoles de Pi formados en cada tubo a diferentes tiempos y la velocidad (µmoles/min).

• Grafique en papel milimetrado la actividad enzimática con respecto a la temperatura y el pH de reacción.



3.- Determinación de los parámetros cinéticos de la fosfatasa ácida de germen de trigo y el efecto del fosfato en la reacción. Tras determinar los parámetros óptimos de pH y temperatura para el funcionamiento de la enzima, aplique éstos en la determinación de Km y Vmax para la enzima comercial.

• Prepare un serie de 5 tubos que contengan 0, 50, 100, 150 y 200 µL de p-NPP 2,5 mM y enráselos a 400 µL con el amortiguador apropiado. Repita esta serie, pero adicionando además 5, 10 o 20 µL de fosfato de sodio (50 mM).

• Preincube los tubos a la temperatura apropiada por 2-5 minutos. • Agregue 100 µL de la dilución de la enzima (1:20) a cada tubo de reacción. Mezcle e

inmediatamente saque una alícuota de 100 µL y adiciónela a un tubo que contengan 900 µL de NaOH 0,05 M.

• Seleccione 2 tiempos de reacción (5, 10, 20 o 30 minutos) y retire nuevas alícuotas del tubo de reacción, adicionándoselas a respectivos tubos que contengan 900 µL de NaOH 0,05 M.

• Determine la absorbancia a 405 nm de cada uno de los tubos. • Confeccione las curvas pertinentes tanto en presencia como en ausencia de fosfato y

determine los valores de Km y Vmax. 4.- Determinación de los parámetros cinéticos de la fosfatasa ácida de germen de trigo purificada en los prácticos anteriores. Trabaje con las mismas condiciones de pH y temperatura utilizadas anteriormente y determine los valores de Km y Vmax para una fracción de su enzima purificada.

• Prepare un serie de 5 tubos que contengan 0, 50, 100, 150 y 200 µL de p-NPP 2,5 mM y enráselos a 400 µL con el amortiguador apropiado.

• Preincube los tubos a la temperatura apropiada por 2-5 minutos. • Agregue a cada tubo de reacción 100 µL de su enzima diluida en el amortiguador

apropiado, dejándola a una concentración 0,5 mg/mL (proteína total). Mezcle e inmediatamente saque una alícuota de 100 µL y adiciónela a un tubo que contengan 900 µL de NaOH 0,05 M.

• Incube los tubos a los mismos tiempos anteriormente utilizados y retire nuevas alícuotas del tubo de reacción, adicionándoselas a respectivos tubos que contengan 900 µL de NaOH 0,05 M.

• Determine la absorbancia a 405 nm de cada uno de los tubos. • Determine los valores de Km y Vmax. Calcule la actividad espécífica y comparela con la

obtenida para la enzima comercial.



Soluciones.

• Tampón Citrato (citrato de sodio 100mM; EDTA 150mM pH 5.0). • Tampón PBS (NaCl 137mM, KCl 2,6mM, NaHPO4 8mM, KH2PO4 1,8mM, pH 7,4). • Tampón Tris (Tris 100mM, pH 9,5) • Solución NaOH 0.05 M • Solución de p-nitrofenol 60 µM en NaOH 0,05M. • Solución stock de p-nitrofenil fosfato de sodio 25 mM en agua. • Solución stock de fosfatasa ácida 10mg/ml. • Solución de Fosfato de Sodio 50 mM en agua.

practicos de bioquímica-1

Documents