platelia™ aspergillus ag 96 pruebas 62794 · 2012-10-03 · médula ósea) y corticoesteroides...

PLATELIA™ ASPERGILLUS Ag96 PRUEBAS 62794PLATELIA™ ASPERGILLUS Ag ES UN ENSAYO INMUNOENZIMÁTICOTIPO SANDWICH EN MICROPLACA PARA LA DETECCIÓN DELANTÍGENO DE GALACTOMANO DE ASPERGILLUS EN MUESTRASDE SUERO PEDIÁTRICO Y DE ADULTOS Y EN MUESTRAS DELÍQUIDO DE LAVADO BRONCOALVEOLAR (LBA)

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TABLA DE CONTENIDOS

1- USO PREVISTO ............................................................................................................57

2- INSTRUCCIONES DE USO ..........................................................................................57

3- RESUMEN Y EXPLICACIÓN ........................................................................................57

4- PRINCIPIO DEL PROCEDIMIENTO.............................................................................57

5- REACTIVOS ..................................................................................................................57

6- ADVERTENCIAS PARA LOS USUARIOS.....................................................................59

7- PRECAUCIONES PARA LOS USUARIOS....................................................................60

8- PREPARACIÓN Y ALMACENAMIENTO DE LOS REACTIVOS ..................................60

9- RECOGIDA DE LAS MUESTRAS.................................................................................61

10- PROCEDIMIENTO ........................................................................................................62

11- CONTROL DE CALIDAD (CRITERIOS DE VALIDEZ)...................................................64

12- INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS.................................................................65

13- LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO ......................................................................66

14- VALORES ESPERADOS ...............................................................................................68

15- CARACTERÍSTICAS DE RENDIMIENTO ESPECÍFICAS.............................................71

16- BIBLIOGRAFÍA .............................................................................................................79

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1- USO PREVISTO The Platelia™ Aspergillus Ag es un ensayo inmunoenzimático tipo sandwich en microplaca para ladetección del antígeno de galactomano de Aspergillus en muestras de suero pediátrico y de adultos yen muestras de líquido de lavado broncoalveolar (LBA). Platelia™ Aspergillus Ag es una prueba que, cuando se utiliza junto con otros procedimientos dediagnóstico como cultivo microbiológico, análisis histológico de muestras de biopsia y evidenciaradiográfica puede usarse como ayuda en el diagnóstico de la aspergilosis invasiva.

2- INSTRUCCIONES DE USOPlatelia™ Aspergillus Ag es un ensayo inmunoenzimático tipo sandwich en microplaca para ladetección del antígeno de galactomano de Aspergillus en muestras de suero pediátrico y de adultosy en muestras de líquido de lavado broncoalveolar (LBA). Platelia™ Aspergillus Ag es una prueba que, cuando se utiliza junto con otros procedimientos dediagnóstico como cultivo microbiológico, análisis histológico de muestras de biopsia y evidenciaradiográfica puede usarse como ayuda en el diagnóstico de la aspergilosis invasiva.

3- RESUMEN Y EXPLICACIÓN Las infecciones de Aspergillus suelen comenzar en el pulmón como vía de entrada luego de lainhalación de las esporas de Aspergillus presentes en el ambiente. Las formas invasivas, que sehan incrementado en los últimos 10 años, constituyen las infecciones más graves. Se producenprincipalmente en pacientes neutropénicos (después de un tratamiento contra el cáncer) y enpacientes tratados con inmunosupresores ( trasplantes de órganos, particularmente trasplante demédula ósea) y corticoesteroides 10. El Aspergillus raras veces se aísla de cultivo de sangre. El diagnóstico suele basarse en evidenciadiagnóstica o radiológica no específica (síntomas clínicos, escáner, radiografía de tórax, etc.) La prueba para el antígeno de galactomano soluble en suero parece ser un método serológicoapto para ayudar en el diagnóstico de la Aspergilosis Invasiva 9, 12, 23, 54, 62. Además, para los receptores de trasplantes de órganos sólidos la detección del antígeno degalactomano en lavado broncoalveolar ha demostrado resultar ventajosa para el diagnóstico dela aspergilosis invasiva en esa población 8,17,18.

4- PRINCIPIO DEL PROCEDIMIENTO 45

Platelia™ Aspergillus Ag es una prueba inmunoenzimática tipo sandwich en microplaca de un pasoque detecta la presencia de galactomano en el suero humano y en el líquido del lavadobroncoalveolar (LBA). El ensayo utiliza anticuerpos monoclonales de rata EBA-2 dirigidos contrael galactomano del Aspergillus y ha sido caracterizado en estudios anteriores 25, 46. Los anticuerposmonoclonales se utilizan: (1) para recubrir los pocillos de las microplacas y unir el antígeno, y (2)para detectar el antígeno unido a la microplaca sensibilizada (reactivo conjugado: anticuerposmonoclonales ligados a peroxidasa). Las muestras de suero o de líquido LBA se tratan con caloren presencia de ETA para desintegrar los complejos inmunes y precipitar proteínas queposiblemente podrían interferir con la prueba 24. Las muestras tratadas y los conjugados se añadena los pocillos recubiertos con anticuerpos monoclonales y se incuban. En presencia del antígenode galactomano se forma un complejo anticuerpo monoclonal - galactomano - anticuerpomonoclonal / peroxidasa. Las tiras se lavan para eliminar el material que no se haya unido. Acontinuación, se añade la Cromógeno solución TMB, que reaccionará con los complejos unidosal pocillo para formar una reacción de color azul. La reacción de la enzima se interrumpe mediantela adición de ácido, que cambia el color azul a amarillo. Se determina la absorbancia (densidadóptica) de las muestras y los controles con un espectrofotómetro calibrado a longitudes de ondade 450 y 620/630 nm.

5- REACTIVOSPlatelia™ Aspergillus Ag: producto Nº 62794 (96 pruebas) Conserve el kit a 2-8ºC. Lleve todos los reactivos a temperatura ambiente (18-25ºC) durante almenos 30 minutos antes de usarlos. Vuelva a llevar todos los reactivos a 2-8ºC inmediatamentedespués de usarlos.

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Devuelva las tiras/placas sin usar para que se proceda a colocarlas en sobres y sellarlas. No elimine el desecante. Después de la dilución, la solución de lavado de trabajo puedemantenerse durante 14 días a 2-30ºC. Todos los demás reactivos, excepto la solución de lavadoconcentrada (R2) y la solución de interrupción (R10), deben usarse dentro de las 8 semanassiguientes a la apertura. Después de la apertura la solución de lavado concentrada (R2) y lasolución de interrupción (R10) son estables hasta su caducidad. Se suministran reactivos encantidad suficiente para realizar 96 pruebas en un máximo de 9 lotes.

*Nota: TMB (3,3’,5,5’-tetrametilbencidina) es un cromógeno no carcinogénico y no mutagénicopara peroxidasa.

Componente Contenido Cantidad

R1 Microwell Strip Plate

Microplaca:- 96 pocillos (12 tiras de 8 pocillos cada una)recubiertos con anticuerpos monoclonalesantigalactomano- Pestañas de las tiras etiquetadas "85"

1 Placa / 12 x 8 Pocillos

R2 ConcentratedWashing

Solution (20X)

Solución de lavado concentrada (20X):- Tampón Tris NaCl (pH 7,4)- 2% Tween® 20- Conservante: <1,5% ProClin™ 300

1 x 70 mL

R3 NegativeControlSerum

Suero Control Negativo:- Suero humano negativo- Negativo para anticuerpos anti-VIH1, anti-VIH-2,

anti-VHC y HBs Ag- Conservante: <1,5% ProClin™ 300

2 x 1,7 mL

R4 Cut-off Control Serum

Suero Control Valor de corte:- Suero humano conteniendo galactomano- Negativo para anticuerpos anti-VIH1, anti-VIH-2, anti-VHC y HBs Ag- Conservante: <1,5% ProClin™ 300

2 x 1,7mL

R5 Positive Control Serum

Suero Control Positivo:- Suero humano conteniendo galactomano- Negativo para anticuerpos anti-VIH1, anti-VIH-2, anti-VHC y HBs Ag- Conservante: <1,5% ProClin™ 300

2 x 1,7 mL

R6 Conjugate Conjugado (listo para usar):- Anti- anticuerpo monoclonal de galactomano

etiquetado peroxidasa- Conservante: <1,5% ProClin™ 300

1 x 8 mL

R7 Sample TreatmentSolution

Solución para tratamiento de la muestra (lista parausar):- Solución ácida de EDTA

1 x 13 mL

R9 Chromogen: TMB

Solution

Cromógeno Solución TMB (lista para usar):- 3,3’,5,5’-tetrametilbencidina* (<0.1%)- H2O2 (<1.0 %)

1 x 28 mL

R10 Stopping Solution

Solución de interrupción (lista para usar):- Solución de ácido sulfúrico 1 N (H2SO4)

1 x 28 mL

Plate sealers - Láminas adhesivas para microplacas 1 x 8 láminas

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6- ADVERTENCIAS PARA LOS USUARIOS 1. Para uso en diagnóstico in vitro.

2. Sólo para uso profesional.

3. No se recomienda usar este kit de prueba en muestras que no sean de suero humano y líquido deLBA.

4. El Control Positivo, el Control de corte y el Control Negativo se fabrican con suero humano sometidoa pruebas para determinar que no es reactivo para HBsAg y anticuerpos de VIH-1, VIH-2 y VCH conpruebas con marcado CE. No obstante, todos los reactivos deben manipularse como si estuviesenen condiciones de transmitir infección. Todas las pruebas deben realizarse de acuerdo con la NormaOSHA sobre Patógenos transportados por la sangre, Nivel 2 u otras prácticas de bioseguridadapropiadas.

5. Use ropa de protección, incluidos bata de laboratorio, protección ocular/facial y guantes desechables(se recomiendan guantes sintéticos, que no contengan látex) y manipule los reactivos del kit y lasmuestras del paciente respetando los requisitos de las Buenas prácticas de laboratorio. Lávese bienlas manos antes de realizar la prueba.

6. No pipetee con la boca.

7. No fume, no beba ni coma en las zonas en las que se manipulan las muestras o los reactivos del kit.

8. Evite las salpicaduras de las muestras o de las soluciones

9. Los vertidos biológicos que no contienen ácido deben limpiarse bien con un desinfectante eficaz.Entre los desinfectantes que pueden usarse se incluyen (aunque sin limitarse a ellos) una soluciónde lejía al 10% (solución al 0,5% de hipoclorito sódico), etanol al 70% o Wescodyne Plus™ al 0,5%.Es posible que la eliminación de los materiales utilizados para limpiar los vertidos deba realizarsecomo si fuesen residuos biopeligrosos.

ATENCIÓN: No ponga dentro del autoclave soluciones que contengan lejía. 10. Los vertidos que contienen ácido deben ser adecuadamente absorbidos (limpiados) o neutralizados

con bicarbonato de sodio, procediéndose luego a enjuagar y secar la zona; si el vertido contienematerial biopeligroso, limpie la zona con un desinfectante químico.

11. Elimine todas las muestras y materiales utilizados para realizar la prueba como si contuviesen unagente infeccioso. Las sustancias químicas de laboratorio y los residuos biopeligrosos debenmanipularse y eliminarse según todas las normativas locales, regionales y nacionales.

12. ATENCIÓN: La siguiente es una lista de sustancias químicas potencialmente peligrosascontenidas en algunos componentes del kit (consulte la Sección 5 - REACTIVOS):

ATENCIÓN: De acuerdo con los requisitos normativos de la UE y EE.UU., algunosreactivos contienen ProClin™ 300 < 1,5%.R43 : Puede provocar sensibilización por contacto con la piel.S23-24-37-60*: No debe inhalarse el vapor/pulverización. Evite el contacto con lapiel. Utilice guantes adecuados. Este material y el recipiente que lo contiene debeneliminarse como residuos peligrosos.

* Las frases de Riesgo(R) y Seguridad(S) proporcionan información específica sobre una preparaciónpeligrosa.

De acuerdo con los Requisitos regulatorios de EE.UU., la solución de interrupciónde ácido sulfúrico 1,0N (H2SO4) es gravemente irritante o corrosiva para la piel ylos ojos, según la cantidad y el tiempo de exposición; exposiciones mayores puedencausar daño ocular, incluido deterioro visual permanente. En caso de contacto conlos ojos, lávense inmediata y abundantemente con agua y acúdase a un médico.Manténgase alejado de las bases fuertes y los agentes reductores; no vierta aguani lejía sobre este componente.

El residuo de este material se considera residuo ácido peligroso; no obstante, si las normativaslocales, regionales, nacionales e internacionales lo permiten, podría neutralizarse a pH 6-8 paraeliminación no peligrosa si se tiene la preparación y el equipo adecuado para hacerlo.

13. Si se solicita, es posible obtener la Hoja de Datos de Seguridad de los Materiales (HDSM) o enwww.bio-rad.com

Xi-Irritante

C-Corrosivo

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7- PRECAUCIONES PARA LOS USUARIOS 1. LAS MUESTRAS DE SUERO CONGELADO O DE LÍQUIDO DE LAVADO BRONCOALVEOLAR

GUARDADAS EN CONDICIONES DESCONOCIDAS PUEDEN DAR FALSOS RESULTADOSPOSITIVOS DEBIDO A LA CONTAMINACIÓN CON HONGOS Y/O BACTERIAS.

2. No use ningún kit ni ninguno de sus reactivos después de que hayan caducado. 3. No mezcle reactivos de otros kits con distintos números de lote, excepto los de la Solución de lavado

(R2, identificación*: 20x de color verde), Cromógeno (R9, identificación*: TMB de color turquesa) y laSolución de interrupción (R10, identificación*: 1N de color rojo), siempre que dichos reactivos seanestrictamente equivalentes y que se emplee el mismo número de lote para la realización de la prueba.

*en la etiqueta del vial

NOTA: La solución de lavado (R2, identificada* de color verde como 20x) no puede mezclarse conla Solución de lavado (R2 identificada* de color azul como 10X) suministrada en kits de reactivoBio-Rad.*en la etiqueta del vial4. Lleve todos los reactivos a temperatura ambiente al menos 30 minutos antes de utilizarlos.5. Mezcle cuidadosamente cada reactivo antes de usarlo.6. Mezcle cuidadosamente la Solución de lavado concentrada (R2) antes de preparar la Solución de

lavado de trabajo, con cuidado de evitar la contaminación microbiana. 7. No realice la prueba en presencia de vapores reactivos (ácidos, alcalinos, aldehídos) o polvo, que

podrían alterar la actividad enzimática del conjugado. 8. Para el pipeteado manual de controles y muestras, use puntas de pipeta individuales a fin de evitar

la contaminación por arrastre de las muestras. 9. Para asegurar el lavado adecuado de los pocillos, realice el número de ciclos de lavado recomendado

y asegúrese de que todos los pocillos estén completamente llenos y que luego se vacíen totalmente.El lavado no debe realizarse manualmente con un frasco lavador.

10. No deje que la microplaca se seque entre la finalización del ciclo de lavado y la adición de reactivos. 11. No use el mismo recipiente para las soluciones de cromógeno TMB y de conjugado. 12. No deje que las soluciones de conjugado o de cromógeno TMB entren en contacto con metales o

iones metálicos. 13. Durante el almacenamiento o la incubación, evite la exposición de la solución de Cromógeno TMB

a la luz intensa. No deje que las soluciones de cromógeno entren en contacto con un agente oxidante. 14. Evite que la solución de interrupción entre en contacto con un agente oxidante. No deje que las

soluciones de interrupción entren en contacto con metales o iones metálicos. 15. Use materiales (tubos, puntas de pipeta, recipientes, etc.) limpios y libres de polvo para reducir al

mínimo la posibilidad de contaminación con esporas de Aspergillus del medio ambiente. Debido aque el galactomano es estable al calor, la esterilización del material usado no garantiza la ausenciade antígeno contaminante. Puede usarse material estándar con las precauciones adecuadas, aunquelo ideal es utilizar materiales libres de pirógenos.

16. Limite el tiempo de exposición al aire de las soluciones (sueros, líquido LBA, Solución de tratamientode muestra, conjugado) o de los recipientes (placas, tubos, pipetas) abiertos.

17. No vuelva a verter en su recipiente original ningún conjugado no utilizado. 18. La solución de cromógeno TMB debe ser incolora. La aparición de una coloración azul indica que el

reactivo está contaminado y no debe utilizarse.

8- PREPARACIÓN Y ALMACENAMIENTO DE LOS REACTIVOS

Micropocillo Tira Placa (R1)Cada bastidor de 12 tiras está embalado en una bolsa. Corte la bolsa con unas tijeras justo debajo dela junta. Abra la bolsa y extraiga el bastidor. Coloque el bastidor que contiene las tiras no utilizadas enlabolsa original. Vuelva a sellar la bolsa cuidadosamente y guárdela a +2-8ºC.Una vez abierta la bolsa envasada al vacío, las tiras conservadas a +2-8ºC en su bolsa original vueltaa sellar cuidadosamente se mantienen estables durante 8 semanas. Compruebe que el desecante sigadentro de la bolsa.

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Solución de lavado (R2)Prepare la solución de lavado de trabajo necesaria añadiendo una parte de solución de lavadoconcentrada (R2) a 19 partes de agua destilada o desionizada. La solución de lavado de trabajo puedeconservarse durante 14 días a 2-30°C. Prepare una cantidad suficiente de solución de lavado de trabajopara completar la prueba (80 mL para una tira: 4 mL R2 + 76 mL de agua destilada). Una vez abierta, la solución de lavado concentrada es estable hasta la fecha de caducidad indicadaen la etiqueta si se conserva a +2-30 °C, en ausencia de contaminación.

Suero de control negativo (R3), Suero de control de valor de corte (R4) y Suero de controlpositivo (R5)Los controles deben tratarse con calor con la solución para tratamiento de muestras (R7) comomuestras del paciente para que sean también un control del tratamiento.Una vez abiertos, estos reactivos son estables durante 8 semanas si se conservan a +2-8ºC, enausencia de contaminación.

Conjugado (R6), Solución de tratamiento de muestra (R7), Solución de cromógeno:Solución TMB (R9)Estos reactivos están listos para usar. Una vez abiertos, estos reactivos son estables durante 8 semanas si se conservan a +2-8ºC, enausencia de contaminación.

Interrupción de la reacción (R10)Este reactivo está listo para usar. Una vez abierto, este reactivo es estable hasta la fecha de caducidad que aparece en la etiqueta siempreque se conserve a +2-8ºC en ausencia de contaminación.

9- RECOGIDA DE MUESTRAS Esta prueba se realiza en suero o líquido LBA (lavado broncoalveolar).

I. SUERO Tome las muestras de sangre de acuerdo con los procedimientos de laboratorio normalizados. Lasmuestras de suero deben estar exentas de contaminación por hongos, esporas y/o bacterias. Conservey transporte las muestras en tubos sellados, no expuestos al aire. Las muestras no abiertas puedenconservarse a 2-8°C hasta 5 días antes de ser sometidas a prueba. Una vez abiertas por vez primera,las muestras pueden conservarse a 2-8°C durante 48 horas antes de ser sometidas a prueba. Paraalmacenamientos más prolongados, conserve el suero a -70°C. Las muestras de suero resisten un máximo de 4 ciclos de congelación/descongelación. Las muestraspreviamente congeladas deben mezclarse bien después de la descongelación y antes de la prueba.Los resultados no son afectados por muestras que contengan 20 mg/L de bilirrubina, muestraslipémicas que contengan el equivalente a 2 g/L de trioleína (triglicérido) o muestras hemolizadas quecontengan 500 mg/dl de hemoglobina. No se han probado las interferencias relacionadas con excesode albúmina.No descomplemente los sueros.

II. LÍQUIDO DE LAVADO BRONCOALVEOLAR (LBA)Tome las muestras de líquido LBA de acuerdo con los procedimientos de laboratorio normalizados. Lasmuestras de líquido LBA deben tomarse en solución salina estéril y probarse sobre muestras limpias(tal como está) o sobrenadantes de muestras centrifugadas (10.000 rpm durante 10 minutos) antes deproceder a tratar la muestra como se indica en la Sección 10.Las muestras de LBA deben estar exentas de contaminación por hongos, esporas y/o bacterias.Conserve y transporte las muestras en tubos sellados, no expuestos al aire. Una vez abiertas por vezprimera, las muestras pueden conservarse a 2-8°C durante 24 horas. Para almacenamientos másprolongados, conserve las muestras de LBA congeladas (-20 ºC o menos) hasta 5 meses.Las muestras de LBA resisten un máximo de 4 ciclos de congelación/descongelación. Las muestraspreviamente congeladas deben mezclarse bien después de la descongelación y antes de la prueba.

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10-PROCEDIMIENTO

Materiales suministrados Véase la sección REACTIVOS.

Materiales necesarios pero no suministrados 1. Agua destilada o desionizada para la dilución de la solución de lavado concentrada. 2. Papel absorbente. 3. Guantes desechables. 4. Gafas protectoras. 5. Hipoclorito sódico (lejía) y bicarbonato sódico. 6. Pipetas o multipipetas, ajustables o fijas, para medir y dispensar 50 µL, 100 µL, 300 µL y 1.000 µL. 7. Tubos de 1,5 mL de polipropileno para microcentrifugadora con cierre hermético, aptos para resistir

temperaturas de hasta 120°C (bloque calefactor) o 100°C (baño maría). • Tapones roscados y tubos: tubos cónicos de 1,5 mL, Cat. Bio-Rad # 224-0100 o equivalente. O• Tubos de tapa a presión: tubos EZ para micropruebas, 1,5 mL, Cat. Bio-Rad # 223-9480 o

equivalente. • Cierres de tapones de microtubos (en EE.UU.: Fischer Scientific Cat. # NC9346739) o equivalente,

fuera de EE.UU.: Cat. VWR # 6054001 o equivalente). Estos cierres sellan de manera segura lostubos de tapa a presión evitando que se abran durante los cambios de presión y temperatura ytambién facilitan su descarga del bloque calefactor o del baño maría.

8. Centrifugadora de mesa de laboratorio para tubos de polipropileno de 1,5 mL capaz de alcanzar10.000 g (Brinkman Cat. # 22-36-280-1 o Cat. VWR Scientific, # 20901-051 o equivalente).

9. Si se utiliza bloque calefactor para el tratamiento de los sueros/líquido LBA:• Bloque calefactor. Se recomiendan los siguientes modelos de bloques calefactores: • Modelo de bloque simple: Cat. Grant # QBD-1 L - fuera de EE.UU.: Cat. Grant # QBD1 distribuido

por VWR en su Cat.: # 460-0074)• Modelo de bloque doble: Cat. Grant # QBD-2 L - fuera de EE.UU.: Cat. Grant # QBD2 distribuido

por VWR en su Cat.: # 460-0076)• Bloque para bloques calefactores: ambos bloques calefactores (QBD-1 L, QBD1 and QBD-2L,

QBD2) deben usarse con el Bloque Grant, Cat. # QB-E1 distribuido fuera de EE.UU. bajo el Cat.VWR: # 460-8517

Si se utiliza baño maría para el tratamiento de los sueros/líquido LBA:• Gradilla circular flotante de microcentrifugadora para matraces de 1L (en EE.UU.: Cat. Científico

VWR # 60986- -100 o Cat. Nalgene: # 5974-1015 o equivalente). • Baño maría a 100 ºC.

10. Agitador Vórtex. 11. Incubador de microplacas a 37 ± 1°C. 12. Lavador de microplacas semiautomático o automático. 13. Lector de microplacas equipado con filtros de 450 nm y 620/630 nm.

Comentarios sobre el procedimiento Los controles negativo, positivo y de corte deben probarse en cada ciclo para validar los resultados dela prueba.

Tratamiento de los sueros/líquido LBATodos los controles de sueros: negativo (R3), de corte (R4) y positivo (R5) deben procesarse al mismotiempo como muestras de suero/líquido LBA:1. Pipetee 300 µL de cada prueba de suero/líquido LBA y realice el control en tubos de polipropileno

de 1,5 mL individuales. 2. Añada a cada tubo 100 µL de muestra de solución de tratamiento (R7). 3. Agite los tubos cuidadosamente, con agitación enérgica o vórtex para homogeneizar totalmente.

Cierre bien el tubo para evitar que se abra durante el calentamiento.

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4. Opción de bloque calefactorCaliente los tubos durante 6 minutos en un bloque calefactor a 120ºC. Los tubos deben colocarseen el block sólo cuando se alcance la temperatura indicada (*).OOpción baño maríaSi utiliza un baño maría: caliente los tubos durante 3 minutos a 100°C (*). Los tubos sólo debencolocarse en el baño maría cuando se haya alcanzado la temperatura indicada.

5. Retire cuidadosamente los tubos calientes del bloque calefactor o del baño maría y colóquelosen una centrifugadora. Centrifugue los tubos a 10.000 x g durante 10 minutos. Utilice elsobrenadante para la detección del antígeno de galactomano.

6. Pruebe el sobrenadante usando el siguiente procedimiento. Después de la preparación, elsobrenadante puede retirarse y conservarse a 2-8°C hasta 48 horas antes de la prueba. Si elanálisis de los resultados indica que es necesario repetir la prueba, tome otra parte alícuota dela muestra para el ensayo.

(*) Para el éxito de la prueba es esencial respetar estrictamente la temperatura y el tiempo indicados,así como el uso de los materiales recomendados. No se base únicamente en la temperatura que aparece en el aparato; compruebe que latemperatura cumple las especificaciones usando un termómetro calibrado que se introducirá enun tubo que contenga aceite mineral: en el interior del tubo debe alcanzarse 120°C en un bloquecalefactor y 100°C en un baño maría.

Procedimiento EIA Cumpla estrictamente el protocolo propuesto.Cumpla las buenas prácticas de laboratorio.1. Lleve los reactivos a temperatura ambiente (+18-25°C) al menos 30 minutos antes de utilizarlos. 2. Prepare la solución de lavado de trabajo.3. Prepare una tabla para la identificación de pruebas y controles de muestras de sueros/líquido LBA

en microplacas. Use un pocillo para el Suero de control negativo (R3), dos pocillos para el Suero decontrol de corte (R4) y un pocillo para el Suero de control positivo (R5).

4. Retire el portaplacas y las tiras de micropocillos (R1) de la bolsa de placas. Vuelva a colocar en labolsa, con el desecante, todas las tiras no utilizadas y selle nuevamente la bolsa.

5. Invierta la botella de conjugado (R6) antes de usarla para homogenizar los componentes. Añada 50µL de Conjugado (R6) a cada pocillo. Luego añada 50 µL del sobrenadante de suero/LBA tratado acada pocillo, como se indicó anteriormente. No añada muestras de líquido LBA/suero a los pocillosantes del conjugado.

6. Precinte la placa con un sellador u otros medios para evitar la evaporación, asegurándose de quetoda la superficie quede herméticamente tapada.

7. Incube la microplaca en un incubador de microplacas seco durante 90 ± 5 minutos a 37°C (± 1°C). 8. Retire el sellador de placas. Aspire el contenido de todos los pocillos en un recipiente para residuos

(que contenga hipoclorito sódico). Lave la placa 5 veces con un lavador de microplacas (usando800 µL de solución de lavado de trabajo). Después del lavado, invierta la microplaca y limpiesuavemente con un papel absorbente para eliminar los restos de líquido.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

A R5 S5 S13

B R4 S6

C R4 S7

D R3 S8

E S1 S9

F S2 S10

G S3 S11

H S4 S12

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9. Añada rápidamente 200 µL de la solución de cromógeno TMB (R9) a cada pocillo, evitando laexposición a una luz intensa.

10. Incube la microplaca en la oscuridad a temperatura ambiente (+18-25°C) durante 30 ± 5 minutos.No utilice película adhesiva durante esta incubación.

11. Añada 100 µL de solución de interrupción (R10) a cada pocillo, siguiendo el mismo orden para laadición de solución de cromógeno TMB. Homogenice bien.

12. Limpie cuidadosamente el fondo de cada placa. 13. Lea la densidad óptica de cada pocillo a 450 nm (filtro de referencia de 620/630 nm). Las microplacas

deben leerse antes de que transcurran 30 minutos de la adición de la solución de interrupción.

11- CONTROL DE CALIDAD (CRITERIOS DE VALIDEZ) Control valor de corte: La O.D. de cada suero de control de corte debe ser ≥ 0,300 y ≤ 0,800.

Control Positivo: El índice del suero de control positivo debe ser superior a 1,50.

I = OD del Control positivo (R5) > 1,50OD promedio de los controles de corte

Control negativo: El índice del suero de control negativo debe ser inferior a 0,40.

I = OD del Control negativo (R3) < 0,40OD promedio de los controles de corte

Si alguno de los controles no cumple los criterios de validez descritos anteriormente el ensayo seconsidera no válido y los resultados de la muestra del paciente no deben incluirse en el informe. Eloperador puede decidir repetir el ensayo, después de revisar el procedimiento, o ponerse en contactocon el fabricante para solicitar ayuda. Si se repite el ensayo, debe usarse una nueva parte alícuota dela muestra.

Ejemplo de cálculo:

Cálculos

Valor promedio de los controles de corte Para calcular el OD promedio de los controles de corte (R4), sume los valores OD de cada control decorte replicado y divida el resultado por 2: (0,513 + 0,533) ÷ 2 = 0,523

Índice Control Negativo Para calcular el índice del control negativo, divida la OD del control negativo por la OD promedio delcontrol de corte:

I = 0,116 = 0,22 0,523

Índice Control Positivo Para calcular el índice del control positivo, divida la OD del control positivo por la OD promedio delcontrol de corte:

I = 1,834 = 3,51 0,523

Muestra Absorbancia (OD)Control negativo (R3) 0,116

Control de valor de corte (R4) 0,5130,533

Control positivo (R5) 1,834

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Validez • Cada OD de control de corte es ≥ 0,300 y ≤ 0,800, indicando que el valor de corte es válido. • El índice del control negativo es < 0,40, indicando que el control negativo es válido. • El índice del control positivo es > 1,50, indicando que el control positivo es válido.

La prueba realizada en este ejemplo se considera válida porque cumple los criterios de validez decada control.

12. INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS La presencia o ausencia del antígeno de galactomano en la muestra de prueba se determina calculandoun índice para cada muestra de paciente. El Índice (I) se calcula dividiendo el valor OD de la muestrapor la densidad óptica promedio de los pocillos que contienen suero de control de corte.

Cálculo de la densidad óptica (OD) promedio del control de corte: Sume las densidades ópticas de los dos pocillos que contienen suero de control de corte (R4) y dividael total por 2.

Cálculo de un índice (I) para cada muestra de prueba: Calcule la relación siguiente para cada muestra de prueba: DO de la muestraI =

OD promedio de los controles de corte

Interpretación de sueros/líquido LBA con un índice < 0,50:Los sueros/líquido LBA con un índice < 0,50 se consideran negativos respecto del antígeno degalactomano. Nota: Un resultado negativo puede indicar que el resultado del paciente está por debajo del límite dedetección del ensayo. Los resultados negativos no excluyen el diagnóstico de aspergilosis invasiva. Serecomienda la repetición de la prueba si el resultado es negativo pero se sospecha la presencia de laenfermedad.

Interpretación de sueros/líquido LBA con un índice ≥ 0,50: Los sueros/líquido LBA con un índice ≥ 0,50 se consideran positivos respecto del antígeno degalactomano. Se recomienda repetir la prueba con una nueva parte alícuota de la misma muestra (suero/LBA) paratodos los pacientes que den positivo.Nota: Un valor de absorbancia inferior a 0,000 puede indicar un error de procedimiento o instrumentalque debe evaluarse. Dicho resultado se considera no válido y debe repetirse la prueba con una nuevamuestra.Se recomienda la inspección regular (dos veces a la semana) de las muestras de suero de pacientesde alto riesgo para aumentar la sensibilidad y la positividad temprana de la prueba. Nota : Platelia™ Aspergillus Ag está destinado a ser utilizado como ayuda para el diagnóstico de laaspergilosis invasiva. Los resultados positivos obtenidos con Platelia™ Aspergillus Ag deberíanconsiderarse conjuntamente con otros procedimientos de diagnóstico, como el cultivo microbiológico,el examen histológico de muestras de biopsia y las evidencias radiográficas.

Ejemplo de cálculo:

Muestra Absorbancia (OD)Control negativo (R3) 0,116

Control de valor de corte (R4) 0,5130,533

Control positivo (R5) 1,834

Muestra de paciente #1 0,134



66

Cálculos Consulte la sección Control de calidad (Criterios de validez) para obtener un ejemplo de cálculos paradeterminar la validez de los controles de los ensayos.

Valor promedio de los controles de corte Para calcular el OD promedio de los controles de corte (R4), sume los valores OD de cada control decorte replicado y divida el resultado por 2: (0.513 + 0.533) ÷ 2 = 0.523

Muestra de paciente #1 Para calcular el índice de la Muestra de paciente #1, divida el OD de la Muestra del paciente #1 por elOD promedio del Control de corte:

I = 0,134 = 0,26 0,523En este ejemplo, la Muestra del paciente #1 es negativa, puesto que el índice de 0,26 es < 0,50.


I = 0,436 = 0,83 0,523En este ejemplo, la Muestra del paciente #2 es positiva, porque el índice de 0,83 es ≥ 0,50.


I = 1,196 = 2,29 0,523En este ejemplo, la Muestra del paciente #3 es positiva, porque el índice de 2,29 es ≥ 0,50.Por favor, consulte la interpretación de los Resultados positivos en la Sección 12.

13- LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO 1. Una prueba negativa de muestras de suero y/o BAL no puede excluir el diagnóstico de

aspergilosis invasiva. Las muestras de suero de pacientes con riesgo de aspergilosis invasivadeben ser sometidas a prueba dos veces por semana.

2. Es necesario seguir el procedimiento y la interpretación de resultados de Platelia™ Aspergillus Agcuando se sometan a prueba muestras para detectar la presencia del antígeno de galactomano. Serecomienda al usuario del kit leer detenidamente el prospecto antes de realizar la prueba. Enparticular, debe seguirse minuciosamente el procedimiento de la prueba para pipetear las muestrasy los reactivos, lavar las placas y programar los pasos de incubación.

3. Si no se añade la muestra o el reactivo como se indica en el procedimiento, el resultado de la pruebapodría ser falsamente negativo. Debería considerarse la posibilidad de repetir la prueba enmuestras adicionales cuando exista la sospecha clínica de aspergilosis invasiva o de error deprocedimiento.

4. La contaminación de los pocillos de muestras de pacientes negativos por pocillos de muestras decontrol/paciente positivos es posible si el contenido de un pocillo se vierte en otro pocillo debido auna manipulación brusca de la microplaca o a una técnica de pipeteado deficiente cuando se añadenlos reactivos.

5. No se ha evaluado el rendimiento de Platelia™ Aspergillus Ag con muestras de neonatos. Losestudios europeos señalan una mayor incidencia en el número de resultados de galactomanopositivos falsos en muestras de población neonatal 13, 15, 33, 44.

6. Platelia™ Aspergillus Ag puede mostrar una detección reducida de galactomano en pacientes conenfermedad granulomatosa (CGD) y síndrome de Job crónicos 56, 58.

7. El uso concomitante de terapia antifúngica contra hongos activos en algunos pacientes conaspergilosis invasiva puede reducir la sensibilidad con Platelia™ Aspergillus Ag 30, 31.

67

8. Platelia™ Aspergillus Ag no se ha evaluado para uso con plasma u otros tipos de muestras comoorina o CSF.

9. No se estableció el rendimiento de Platelia™ Aspergillus Ag para lectura manual y/o determinaciónvisual del resultado.

10. Otros géneros de hongos como Penicillium, Alternaria Paecilomyces, Geotrichum e Histoplasma hanmostrado reactividad con anticuerpos monoclonales EBA-2 de rata usados en el ensayo para ladetección del galactomano de Aspergillus. La histoplasmosis debería analizarse en zonas endémicas,incluidas determinadas regiones de Estados Unidos 36, 50, 59.

11. No se ha evaluado la reactividad cruzada de muestras de líquido LBA con Mycoplasma pneumoniaeo medicamentos/lubricantes anestésicos utilizados para anestesiar la zona del cuello/garganta parael proceso de aspiración.

12. Reacciones positivas sin signos clínicos:Respecto de la detección precoz del antígeno de galactomano en suero o LAB antes de la apariciónde signos clínicos y/o radiológicos debería considerarse lo siguiente. Suelen observarse resultadosde pruebas positivas sin signos clínicos y se ha demostrado que corresponden a pruebas "positivasverdaderas" en pacientes a los que más tarde se les diagnostica aspergilosis invasiva probada oprobable. Sin embargo, en algunos casos particulares, deben tenerse en cuenta factores específicoscuando se interprete la prueba 30:a. Se ha informado de resultados de prueba positivos sin signos clínicos, especialmente en niños

pequeños 44. Aunque algunos de esos casos podrían estar relacionados con la circulación realde antígenos de Aspergillus , la mayoría de los casos pueden considerarse positivos falsos 7.

b. Se ha demostrado la presencia de galactofuranosa en varios alimentos, particularmente cereales,productos de cereales y postres de crema 1, 27. A diferencia de la leche humana, las fórmulas deleche de vaca frecuentemente contienen elevadas concentraciones de galactomano 13. Por lotanto, deben tenerse en cuenta los factores dietéticos en la interpretación del curso de laantigenemia en niños pequeños, y más generalmente en todos los pacientes con una barreraintestinal alterada 6, 13. Todo caso de antigenemia positiva no acompañado de signos clínicosdebe interpretarse incluso con mayor cautela en esta población de pacientes.

c. Se ha informado de resultados de prueba de galactomano positivos en pacientes bajo tratamientocon piperacilina/tazobactam. También se ha informado de ciertos lotes de piperacilina/tazobactam que dieron positivo para el antígeno de galactomano. Por lo tanto, los resultados deprueba positivos en pacientes bajo tratamiento con piperacilina / tazobactam deben interpretarsecon cautela y confirmarse mediante otros métodos de diagnóstico. También se ha informado dela detección de galactomano en algunos lotes de amoxicilina asociada con preparacionesparenterales de ácido clavulánico. Por lo tanto, los tratamientos con betalactamo semisintéticodeben tenerse en cuenta cuando se interprete la prueba 1, 3, 32.Sin embargo, como Platelia™ Aspergillus Ag es capaz de detectar el antígeno de galactomanomucho antes de la aparición de los signos clínicos o radiológicos, no puede excluirse la apariciónde Aspergilosis invasiva. Por lo tanto, los pacientes tratados con piperacilina/tazobactam conresultados de prueba positivos deben ser sometidos a un seguimiento minucioso.

d. Las reacciones positivas en ausencia de signos clínicos puede observarse en pacientes bajotratamiento con productos que contienen galactomano, ya sea parental u oralmente (en presenciade una alteración de la barrera intestinal). La presencia de galactomano en esos productos suelepoder explicarse por el uso de un proceso de fermentación basado en microorganismos fúngicos.Sin embargo, no se observará un resultado positivo en un paciente, a menos que la concentraciónen suero de galactomano exógeno alcance o supere el umbral de detección de la prueba.Por lo tanto, si hay un resultado positivo sospechoso, en ausencia de otros signos clínicosrecomendamos investigar los productos que el paciente está tomando y especialmente susprocesos de producción y el origen de las materias primas utilizadas 14, 41, 49.

13. Se ha informado de reacciones positivas para galactomano en suero y líquido de lavadobroncoalveolar asociado con PLASMA-LYTE™ observadas en varios estudios 14, 41. Por lo tanto, todaadministración de PLASMA-LYTE™ debe tenerse en cuenta cuando se interpreten los resultados deesta prueba.

14. Los resultados de Platelia™ Aspergillus Ag en muestras de líquido de lavado broncoalveolar (LBA)de pacientes noinmunocomprometidos deben interpretarse con cautela 37.

68

15. Los resultados próximos al valor del índice de corte (0,5) deben interpretarse con cautela y basarseen otras evidencias clínicas, radiológicas o de laboratorio de aspergilosis invasiva, puesto que en lainterpretación del resultado del ensayo no se incluye ninguna zona gris.

16. Además, los resultados de Platelia™ Aspergillus Ag en muestras de líquido de lavado broncoalveolar(LBA) con un índice entre 0,5-1,0 tienen menor valor predictivo que los resultados de muestras deLBA con valores del índice > 1,0; por lo tanto, los valores del índice entre 0,5-1,0 deben reexaminarsey basarse en otras evidencias clínicas, radiológicas o de laboratorio de Aspergilosis invasiva 8, 17.

14- VALORES ESPERADOS

I. SUEROLa prevalencia esperada de aspergilosis invasiva varía con la población de pacientes; se ha informadode tasas de 5-20% 10, 16. Los resultados siguientes se han obtenido a partir de estudios clínicos realizados en pacientespediátricos (edad ≤ 21 años) en Estados Unidos y en pacientes adultos de Norteamérica.

A- Pacientes pediátricosSe realizó un estudio clínico sobre un total de 1.954 muestras de suero de 129 pacientes pediátricos(edad ≤21 años) inmunocomprometidos, con alto riesgo de aspergilosis invasiva (AI) y en pacientesdiagnosticados con aspergilosis invasiva probada y probable, en tres centros de prueba de EstadosUnidos para determinar las características de rendimiento de Platelia™ Aspergillus Ag. La distribuciónde los valores del índice para esas poblaciones se muestra en las tablas siguientes:

Pacientes pediátricos diagnosticados sin aspergilosis invasiva (población de control)gráfica 1

Un total de 1.625* muestras desuero pediátrico obtenidas de108 pacientes pediátricosinmunocomprometidos fuesometido a prueba en trescentros de Estados Unidos paradeterminar las característicasde rendimiento de Platelia™Aspergillus Ag. La distribuciónde los valores del índice paralas muestras puede verse en latabla siguiente:

*Nota: 80 muestras, de 4 pacientes de control con resultados del antígeno de galactomanopositivos coincidentes con terapia con piperacilina/tazobactam (Zosyn®) fueron excluidas.

Pacientes pediátricos diagnosticados con aspergilosis invasivagráfica 2

El diagrama de dispersiónrepresenta los resultados delensayo de galactomano para las249 muestras de suero de 17pacientes que participaron eneste estudio diagnosticados conaspergilosis invasiva probada oprobable según lo determinadopor las definicionesEORTC/NIAID. No se esperabaque todas las muestras de suerode cada paciente fuesenpositivas.

Núm

ero

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Distribución del Valor del índice de suerode la población pediátrica de control

(N=1.625)

Índice

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Población pediátrica probada aspergilosis probableDistribución del índice Pacientes pediátricos (N=17)

Número de pacientes

69

La prevalencia esperada de aspergilosis invasiva varía con la población de pacientes; se ha informadode tasas de 5-20% 10, 24. La tasa de prevalencia de este estudio fue de 13,6%.

B. AdultosSe realizó un estudio clínico sobre un total de 1.724 muestras de suero de 172 pacientes leucémicos ycon trasplante de médula ósea (TMO) con y sin aspergilosis invasiva en tres centros de prueba deNorteamérica para determinar las características de rendimiento de Platelia™ Aspergillus Ag. Ladistribución de los valores del índice para esas poblaciones se representa en las tablas siguientes:

Pacientes adultos diagnosticados sin aspergilosis invasiva (población de control)

gráfica 3

Un total de 1.262 muestras desuero obtenidas de 143pacientes leucémicos y contrasplante de médula ósea(TMO) fue sometido a prueba entres centros de prueba deNorteamérica con Platelia™Aspergillus Ag. La distribuciónde los valores del índice puedeverse en la tabla siguiente:

Pacientes adultos diagnosticados con aspergilosis invasivagráfica 4

El diagrama de dispersiónrepresenta los resultados delensayo de galactomano para las462 muestras de suero de 29pacientes que participaron eneste estudio diagnosticados conaspergilosis invasiva probada oprobable según lo determinadopor las definicionesEORTC/NIAID. No se esperabaque todas las muestras de suerode cada paciente fuesenpositivas. La prevalenciaesperada de aspergilosisinvasiva varía con la poblaciónde pacientes; se ha informado de tasas de 5-20% 10, 24. La tasa de prevalencia de este estudio fue de16,9%.

Núm

ero

de

suer

os

Distribución del Valor del índice de suero dela población adulta de control (N=1.262)

Índice

Número de pacientes

Población adulta probada aspergilosis probableDistribución del índice Pacientes adultos (N=29)

Índ

ice

70

Diagnóstico N Positivo (%) Negativo (%)

Controles sin colonización 341 11/341 (3,2%) 330/341 (96,8%)

Controles con colonización 62 12/62 (19,4%) 50/62 (80,6%)

Total controles 403 23/403 (5,7%) 380/403 (94,3%)

Los siguientes gráficos representan ejemplos de un paciente sin signos o síntomas clínicos deAspergilosis invasiva (negativo para Aspergillus) y un paciente con aspergilosis invasiva probada oprobable (positivo para Aspergillus), respectivamente.

gráfica 5

Paciente negativo

gráfica 6

Paciente positivo

II. LÍQUIDO DE LAVADO BRONCOALVEOLAR (LBA)Se realizaron dos estudios sobre un total de 449 muestras de LBA de 178 receptores de trasplante deórgano sólido (TOS) y de trasplante de pulmón con y sin aspergilosis invasiva en Estados Unidos paradeterminar las características de rendimiento del kit Platelia™ Aspergillus Ag con muestras de Líquidode lavado broncoalveolar. De ese total, 403 eran muestras de LBA de 167 receptores de trasplante de órgano sólido y de pulmónsin aspergilosis invasiva. Además, se realizó un análisis retrospectivo en muestras de LBA de 99 pacientes hematológicos conriesgo evaluable elevado en un estudio fuera de Estados Unidos que incluyó a 58 pacientes conaspergilosis invasiva probada o probable.Los valores esperados en las muestras de LBA de los receptores de trasplante de TOS y de pulmóncombinados sin aspergilosis invasiva se representan en la tabla siguiente. Los resultados se presentanmediante muestras de receptores de trasplante con y sin colonización de hongos.

Tabla 1Valores esperados por muestraReceptores de TOS y trasplante de pulmón sin aspergilosis invasivaN = 403 Líquidos LBA

PATIENTE CON ASPERGILOSIS INVASIVA DEMOSTRAD

00,20,40,60,8

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0 10 20 30 40 50 60Días

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PACIENTE CONTROL

00,20,40,60,8

11,21,41,6

0 10 20 30 40 50 60Días

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71

Los valores esperados en las muestras de LBA de los receptores de trasplante de TOS y de pulmóncombinados sin aspergilosis invasiva se presentan por tipo de trasplante en la tabla siguiente.

Tabla 2Valores esperados por muestraReceptores de TOS y trasplante de pulmón sin aspergilosis invasiva por tipo de trasplanteN = 403 Líquidos LBA

Los valores esperados se evaluaron también en un total de 41 muestras de LBA de 41 pacientescon enfermedades hematológicas sin aspergilosis invasiva y se presentan en la tabla siguiente:

Tabla 3Valores esperados por muestraPacientes con enfermedades hematológicas sin Aspergilosis invasivaN = 41 Líquidos LBA

15. CARACTERÍSTICAS DE RENDIMIENTO ESPECÍFICAS

A- REPRODUCIBILIDAD

a) Estudios de reproducibilidad en sueroLa variabilidad interensayo e intraensayo para Platelia™ Aspergillus Ag se determinó en un estudioutilizando un panel de 6 muestras colectivas de suero de pacientes (uno negativo, uno positivo debajo riesgo, dos positivos y dos positivos de alto riesgo) obtenidas en tres centros de pruebasclínicas en Norteamérica. Cada uno de los 6 integrantes del panel fue sometido a prueba portriplicado (x3) en 3 días diferentes, en un lote, en dos centros (número total de replicados en cadacentro = 9). Cada uno de los 6 integrantes del panel fue sometido a prueba por duplicado (x2) en3 días diferentes, en un lote, en un tercer centro (número total de replicados en el tercer centro =6). Un (1) operador realizó todas las pruebas de precisión en cada centro. Los datos fueronanalizados de acuerdo con las normas del Clinical Laboratory Standards Institute (CLSI)(anteriormente National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS)). La densidad óptica(OD) promedio y el valor del índice promedio, la desviación estándar (SD), el coeficiente devariación porcentual (%CV), la precisión dentro del ciclo (intraensayo) y la precisión dentro delcentro (interensayo) para cada integrante del panel en cada centro se muestran en las siguientestablas.

Tipo de trasplante N Positivo (%) Negativo (%)

Corazón 28 3/28 (10,7%) 25/28 (89,3%)

Riñón 25 3/25 (12,0%) 22/25 (88,0%)

Hígado 23 1/23 (4,3%) 22/23 (95,7%)

Pulmón 327 16/327 (4,9%) 311/327 (95,1%)

Total controles 403 23/403 (5,7%) 380/403 (94,3%)

Diagnóstico N Positivo (%) Negativo (%)

Controles 41 8/41 (19,5%) 33/41 (80,5%)

72

Tabla 4

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8 0,

13

0,06

8 0,

15

0,10

4 0,

25

0,08

2 0,

15

0,11

1 0,

34

N/A

N

/A

0,02

8 0,

04

0,05

6 0,

23

%C

V

N/A

N

/A

20,0

%

15,8

%

10,5

%11

,1%

12,5

%14

,3%

7,1%

6,

2%

4,7%

6,

8%

N/A

N

/A

5,8%

4,

1%

3,4%

6,

6%

73

b) Reproducibilidad en Líquido LBALa variabilidad interensayo e intraensayo para Platelia™ Aspergillus Ag se determinó en un estudiousando un panel de 4 muestras colectivas de LBA de pacientes fijadas con galactomano purificado(uno negativo, uno negativo de alto riesgo, uno positivo de bajo riesgo y uno positivo de riesgo medio)en 3 centros de prueba (dos centros de pruebas clínicas de EE.UU. y un centro interno). Cada uno delos 4 integrantes del panel y los controles fueron sometidos a pruebas por duplicado (x2) en 2 ciclospor día en 5 días diferentes en un lote (número total de resultados en cada centro = 120). Dos (2)operadores realizaron todas las pruebas de precisión en cada centro. Los datos fueron analizados deacuerdo con las normas del Clinical Laboratory Standards Institute (CLSI) (anteriormente NationalCommittee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS)). La densidad óptica (OD) promedio y el valordel índice promedio, la desviación estándar (SD), el coeficiente de variación porcentual (%CV), laprecisión dentro del ciclo (intraensayo) y la precisión dentro del centro (interensayo) para cada integrantedel panel se muestran en la siguiente tabla:

Tabla 5 - Resumen de Centros combinados

*Se eliminó del análisis un (1) valor estadístico atípico.

B- REACTIVIDAD CRUZADAPara evaluar el efecto de afecciones médicas potencialmente interferentes no relacionadas con laAspergilosis invasiva se realizó un estudio con un lote del kit Platelia™ Aspergillus Ag. Se sometierona prueba las siguientes muestras de suero para determinar la reactividad cruzada con Platelia™Aspergillus Ag. Se sometió a prueba un total de 151 sueros.

Table 6

* De cada uno de los siguientes tipos: de vejiga, de mama (2), de colon, endometrial, de pulmón, de próstata, renal y escamoso (3).

Resumen

NegativoNegativode alto riesgo

Positivo debajo riesgo

Positivo deriesgo medio

ControlPositivo

ControlNegativo

N= 60 N=60 N=60 N=60 N=60 N=60

OD Índice OD Índice OD Índice OD Índice OD Índice OD Índice

Promedio 0,121 0,29 0,214 0,50 0,375 0,88 0,575 1,35 1,580 3,72 0,047 0,11

Dentro delciclo(Intraensayo)

SD N/A N/A 0,037 0,103 0,035 0,078% 0,029 0,067 0,111 0,265 N/A N/A

%CV N/A N/A 17,4% 20,5% 9,3% 8,9% 5,0% 5,0% 7,0% 7,1% N/A N/A

Total(Interensayo)

SD N/A N/A 0,042 0,095 0,061 0,122 0,070 0,138 0,190 0,438 N/A N/A

%CV N/A N/A 19,6% 18,9% 16,2% 13,9% 12,2% 10,2% 12,0% 11,8% N/A N/A

Patología # Muestras sometidas a prueba # PositivasFactor reumatoide 10 0ANA (anticuerpos antinucleares) positivo 10 0Hipergamaglobulinemia IgG 10 0Hipergamaglobulinemia IgM 10 0Cáncer* 11 0Cirrosis no vírica (biliar primaria; inducidapor el alcohol; inducida por medicamentos) 10 0Transfusiones múltiples 10 0

Mujeres multíparas 10 0

VHA (Virus de la hepatitis A) 10 0

VHC (Virus de la hepatitis C) 10 0

Rubeola 10 0

CMV (Citomegalovirus) 10 0

Sífilis (RPR+) 10 0

Toxoplasmosis 10 0

Micoplasma 10 0

74

C- PRUEBAS CLÍNICAS

Estudios clínicos en norteamérica

I. MUESTRAS DE SUEROSe realizaron pruebas clínicas para evaluar la sensibilidad, la especificidad y el valor predictivo dePlatelia™ Aspergillus Ag en pacientes pediátricos (edad ≤ 21 años) en tres centros situados enEstados Unidos y en pacientes adultos en tres centros situados en Norteamérica. Los estudios serealizaron usando un total de 1.954 muestras de suero tomadas a 129 pacientes pediátricos y untotal de 1.724 muestras de suero tomadas a 172 pacientes adultos de las siguientes poblaciones*:• Pacientes sin signos de aspergilosis invasiva (pacientes de control) • Pacientes con aspergilosis invasiva probable • Pacientes con aspergilosis invasiva probada * El Invasive Fungal Infection Cooperative Group (IFICG) de la European Organization for Researchand Treatment of Cancer (EORTC) y el Mycosis Study Group (MSG) del National Institute of Allergyand Infectious Diseases (NIAID) definieron en 2002 los criterios para el diagnóstico de laaspergilosis invasiva (AI) en pacientes con afección hematológica o trasplante de células madrehematopoyéticas.2

SENSIBILIDAD

A. Pacientes pediátricosLos resultados de este estudio se analizaron en términos de sensibilidad del paciente. La prueba desensibilidad se realizó usando Platelia™ Aspergillus Ag en tres centros en un total combinado de 17pacientes pediátricos inmunocomprometidos diagnosticados con aspergilosis invasiva probada oprobable.

Tabla 7

*Note: 8 de los 17 pacientes dieron resultados negativos del antígeno de galactomano deAspergillus . Los 8 pacientes con resultados de antígeno de galactomano de Aspergillus negativosrecibían terapia con agentes antifúngicos múltiples. El uso concomitante de terapia antifúngicacontra hongos activos en algunos pacientes con aspergilosis invasiva puede dar lugar asensibilidad reducida 31.

B. AdultosLa prueba de sensibilidad se realizó usando Platelia™ Aspergillus Ag en tres centros en un totalcombinado de 29 pacientes adultos con leucemia y trasplante de médula ósea (TMO) diagnosticadoscon Aspergilosis invasiva probada o probable.

Tabla 8

Diagnóstico Número de pacientes SensibilidadIntervalo de

confianza 95%

Aspergilosis probada 11 81,8% (9/11) 52,3-94,9%

Aspergilosis probable 18 77,8% (14/18) 54,8-91,0%

Aspergilosis probada y probablecombinadas

29 79,3% (23/29) 61,6-90,2%

Diagnóstico Número de pacientes SensibilidadIntervalo de

confianza 95%

Aspergilosis probada 9 44,4% (4/9) 18,9-73,3%

Aspergilosis probable 8 62,5% (5/8) 30,6-86,3%

Aspergilosis probada y probablecombinadas

17* 52,9% (9/17) 31,0-73,8%

75

ESPECIFICIDAD

A. Pacientes pediátricosEspecificidad para pacientes pediátricosSe realizaron pruebas de especificidad usando Platelia™ Aspergillus Ag en tres centros sobre un totalcombinado de 108* pacientes pediátricos inmunocomprometidos sin signos de Aspergilosis invasiva(pacientes de control).

Tabla 9

*Nota: Fueron excluidos 4 pacientes con resultados del antígeno de galactomano positivoscoincidentes con terapia con piperacilina / tazobactam.

Especificidad para muestras de pacientes pediátricosSe realizaron pruebas de especificidad usando Platelia™ Aspergillus Ag en tres centros sobre un totalcombinado de 1.625* muestras obtenidas de 108 pacientes pediátricos inmunocomprometidos sinsignos de aspergilosis invasiva (pacientes de control).

Tabla 10

*Nota: Fueron excluidas 80 muestras de 4 pacientes con resultados del antígeno de galactomanopositivos coincidentes con terapia con piperacilina / tazobactam

B. AdultosEspecificidad para pacientes adultosLa prueba de especificidad se realizó usando Platelia™ Aspergillus Ag en tres centros en un totalcombinado de 143 pacientes adultos con leucemia y trasplante de médula ósea (TMO) sin signos deAspergilosis invasiva (pacientes de control).

Tabla 11

Centro Número de pacientes EspecificidadIntervalo de

confianza 95%

1 28 78,6% (22/28) 60,5-89,8%

2 77 93,4% (71/77) 84,0-96,4%

3 38 89,5% (34/38) 75,9-95,8%

Centros combinados 143 88,8% (127/143) 82,9-93,0%


confianza 95%

1 794 98,9% (785/794) 97,9-99,4%

2 731 97,8% (715/731) 96,5-98,6%

3 100 100% (100/100) 96,3-100%



confianza 95%

1 44 86,4 % (38/44) 73,3-93,6%

2 59 86,4 % (51/59) 75,5-93,0%

3 5 100% (5/5) 56,6-100%


76

Especificidad para muestras de pacientes adultosLa prueba de especificidad se realizó usando Platelia™ Aspergillus Ag en tres centros en un totalcombinado de 1.262 muestras obtenidas de 143 pacientes adultos con leucemia y trasplante de médulaósea (TMO) sin signos de aspergilosis invasiva (pacientes de control).

Tabla 12

VALOR PREDICTIVOSe analizaron los valores predictivos positivos y negativos para la población de pacientes que participóen este estudio. Sobre la base de una prevalencia real promedio de 13,6% en pacientes pediátricos yde 16,9% en pacientes adultos observados en este estudio, se calcularon los valores predictivospositivos y negativos como se indica a continuación:

A. Pacientes pediátricosPrevalencia del estudio 13,6%PPV: 39,1% Intervalo de confianza 95%: 22,2-59,2%NPV: 92,2% Intervalo de confianza 95%: 85,3-96,0%

B. AdultosPrevalencia del estudio 16,9%PPV: 59,0% Intervalo de confianza 95%: 43,4-72,9%NPV: 95,5% Intervalo de confianza 95%: 90,5-97,9%La prevalencia esperada de aspergilosis invasiva varía con la población de pacientes; se ha informadode tasas de 5-20% 10, 24.Para poblaciones de pacientes en el extremo inferior de la prevalencia dada a conocer, se ha vuelto acalcular los valores predictivos positivos y negativos usando una tasa de prevalencia del 5%.

A. Pacientes pediátricosPrevalencia calculada 5%PPV: 17,6% Intervalo de confianza 95%: 6,5-39,8%NPV: 97,2% Intervalo de confianza 95%: 92,1-99,1%

B. AdultosPrevalencia calculada 5%PPV: 27,2% Intervalo de confianza 95%: 13,7-46,7%NPV: 98,8% Intervalo de confianza 95%: 95,4-99,7%

II. MUESTRAS DE LÍQUIDO LBA – CARACTERÍSTICAS DE RENDIMIENTOSe procedió a evaluar la sensibilidad y la especificidad de Platelia™ Aspergillus Ag con muestras delíquido LBA en dos estudios en Estados Unidos en 116 muestras de 62 receptores de trasplante deórgano sólido y 333 muestras de 116 receptores de trasplante de pulmón y en un estudio fuera desEstados Unidos en 99 muestras de 99 pacientes hematológicos con riesgo evaluable elevado con ysin aspergilosis invasiva.

A. SensibilidadSe evaluó la sensibilidad en receptores de trasplante de órgano sólido y de pulmón y en pacientes conenfermedades hematológicos diagnosticados con aspergilosis invasiva según los criterios EORTC/MSG.

Centro Número de muestras EspecificidadIntervalo de

confianza 95%

1 349 98,0% (342/349) 95,9-99,0%

2 560 98,6% (552/560) 97,2-99,3%

3 353 98,9% (349/353) 97,1-99,6%


77

I. Receptores de trasplante de órgano sólido con aspergilosis invasivaEn un estudio, del total de 116 muestras de 62 receptores de trasplante de órgano sólido se evaluó lasensibilidad en 5 receptores diagnosticados con Aspergilosis invasiva como se muestra en la tablasiguiente.

Tabla 13Sensibilidad con Bio-Rad Platelia™ Aspergillus AgAspergilosis invasiva probada o probable en receptores de trasplante de órgano sólido por paciente

Tabla 14Sensibilidad con Bio-Rad Platelia™ Aspergillus AgAspergilosis invasiva probada o probable en receptores de trasplante de órgano sólido por tipo detrasplante

II. Receptores de trasplante de pulmón con aspergilosis invasivaEn otro estudio, del total de 333 muestras de 116 receptores de trasplante de pulmón se evaluó lasensibilidad en 6 receptores diagnosticados con aspergilosis invasiva como se muestra en la tablasiguiente.

Tabla 15Sensibilidad con Bio-Rad Platelia™ Aspergillus AgAspergilosis invasiva probada o probable en receptores de trasplante de pulmón por paciente

Diagnóstico N Índice ≥ 0.5 SensibilidadIntervalo de

confianza 95%

Aspergilosis probada 2 1 1/2 (50,0%) 9,4 - 90,6%

Aspergilosis probable 4 3 3/4 (75,0%) 30,0 - 95,4%

Aspergilosis probada yprobable combinadas

6 4 4/6 (66,7%) 30,0 - 90,3%

Tipo de trasplante N Índice ≥ 0.5 SensibilidadIntervalo de

confianza 95%

Corazón 1 1 1/1 (100%) 20,6 - 100%

Riñón 3 3 3/3 (100%) 43,8 - 100%

Hígado 1 1 1/1 (100%) 20,6 - 100%

Total 5 5 5/5 (100%) 56,5 - 100%

Diagnóstico N Índice ≥ 0.5 SensibilidadIntervalo de

confianza 95%

Aspergilosis probada 2 2 2/2 (100%) 34,2 - 100%

Aspergilosis probable 3 3 3/3 (100%) 43,8 - 100%


5 5 5/5 (100%) 56,5 - 100%

78

III. Pacientes con enfermedades hematológicas con Aspergilosis invasivaTambién se evaluó la sensibilidad en un tercer estudio en 58 muestras de 58 pacientes conenfermedades hematológicas diagnosticados con Aspergilosis invasiva como se muestra en la tablasiguiente. En el estudio se realizó un análisis retrospectivo de las muestras de LBA de pacienteshematológicos con riesgo elevado tratados con PlateliaTM Aspergillus EIA en el líquido LBA 29.

Tabla 16Aspergilosis invasiva probada o probable en pacientes con enfermedades hematológicas

B. EspecificidadSe evaluó la especificidad en un total de 98 muestras de LBA de 57 receptores de TOS y 305 muestrasde LBA de 110 receptores de trasplante de pulmón sin aspergilosis invasiva y los resultados se muestranen la tabla siguiente.

Los resultados se presentan mediante muestras de receptores de trasplante con y sin colonización dehongos:

Tabla 17Especificidad por muestraReceptores de TOS y trasplante de pulmón sin aspergilosis invasivaN = 403 Líquidos LBA

La especificidad en las muestras de LBA de los receptores de trasplante de TOS y de pulmóncombinados sin aspergilosis invasiva se presenta por tipo de trasplante en la tabla siguiente (Tabla 18):

Tabla 18Especificidad por muestraReceptores de TOS y trasplante de pulmón sin aspergilosis invasiva por tipo de trasplanteN = 403 Líquidos LBA

Tipo de trasplante N Índice < 0.5 Negativo (%)Intervalo de confianza

95%

Corazón 28 25 25/28 (89,3%) 72,8 - 96,3%

Riñón 25 22 22/25 (88,0%) 70,0 - 95,8%

Hígado 23 22 22/23 (95,7%) 79,0 - 99,2%

Pulmón 327 311 311/327 (95,1%) 92,2 - 97,0%

Total controles 403 380 380/403 (94,3%) 91,6 - 96,2%

Diagnóstico N Índice < 0.5 Negativo (%)Intervalo de confianza

95%

Controles sin colonización 341 330 330/341(96,8%) 94,3 - 98,2%

Controles con colonización 62 50 50/62 (80,6%) 69,1 - 88,6%

Total controles 403 380 380/403(94,3%) 91,6 - 96,2%

Diagnóstico N Índice ≥ 0.5 SensibilidadIntervalo de confianza

95%

Aspergilosis probada 31 31 31/31 (100%) 89,0 - 100%

Aspergilosis probable 27 26 26/27 (96,3%) 81,7 - 99,3%


58 57 57/58 (98,3%) 90,8 - 99,7%

79

También se evaluó la especificidad en un total de 41 muestras de LBA de 41 pacientes conenfermedades hematológicas sin Aspergilosis invasiva y los resultados se muestran en la tablasiguiente:

Tabla 19Especificidad por muestraPacientes con enfermedades hematológicas sin Aspergilosis invasivaN = 41

16-BIBLIOGRAFÍA

Diagnóstico N Índice < 0.5 Negativo (%)Intervalo de confianza

95%

Pacientes de control 41 33 33/41 (80,5%) 66,0 – 89,8%

KRUG-R

Image importée

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