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PCR

REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA Del Inglés: “Polymerase Chain Reaction”

Desarrollada por Kary Mullis en 1985. Automatizada a partir de 1988 Uso de la Taq DNA Polimerasa PCR

Molécula de ADN

REPLICACIÓN DEL ADN

La reacción en cadena de la polimerasa

La PCR es un método rápido, de bajo costo y sencillo para copiar fragmentos específicos de ADN a partir de cantidades mínimas de ADN original.

Comprende la preparación de la muestra del ADN y de una mezcla maestra de cebadores, y luego la detección de los productos de reacción.

La detección no requiere necesariamente el uso de radioisótopos o de productos químicos tóxicos.

Procedimientos de la PCR: Etapas Desnaturalización: La reacción se calienta a altas

temperaturas para reducir la doble hélice del ADN a cadenas simples. Estas cadenas se tornan accesibles a los cebadores.

Hibridación: Se enfría la mezcla de reacción. Los cebadores hibridan con las regiones complementarias de las cadenas del ADN patrón, y se forman nuevamente cadenas dobles entre los cebadores y las secuencias complementarias.

Extensión: La Taq polimerasa sintetiza una cadena complementaria. El enzima lee la secuencia de la cadena opuesta y extiende los cebadores agregando nucleótidos en el orden en que pueden emparejarse. El proceso entero se repite una y otra vez.

PCR

Replicación In vitro de ADN Permite generar millones de copias de un

segmento de ADN Componentes: ADN, dNTPs, Mg+2, buffer, Taq

polimerasa, primers o cebadores. Consta de 3 etapas:

• denaturación • Hibridización o alineamiento • Polimerización

y de 30-35 ciclos

1 ciclo

AMPLIFICACION

EXPONENCIAL

Esquema de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), mostrando 3 ciclos de amplificación

Procedimientos de la PCR: Ciclo 1

Desnaturalización completa del patrón de ADN

Temperatura óptima para la hibridación

Temperatura óptima para la extensión

Número de ciclos de la PCR

Etapa final de extensión

Procedimientos de la PCR: Condiciones de los ciclos

Hay que evitar la contaminación del ADN con las

siguientes medidas:

Separando las zonas de extracción del ADN y de la PCR.

Empleando equipo de laboratorio dedicado a un solo uso.

Esterilizando en autoclave y haciendo alícuotas.

Añadiendo una reacción testigo.

Procedimientos de la PCR: Condiciones de la mezcla de reacción

Procedimientos de la PCR: Componentes

Componentes:

• Agua desionizada estéril

• Solución tampón de PCR 10X

• Mezcla de dNTP

• Cebador

• Taq polimerasa

• MgCl2

• ADN patrón

Consideraciones:

• ADN patrón

• Cebadores

• Concentración de MgCl2

• Taq polimerasa

• dNTP

Procedimientos de la PCR: Equipos

Micropipetas

Termociclador

Unidades de electroforesis

Fuente de energía eléctrica

Equipo fotográfico

Lectura de los resultados de la PCR En la PCR convencional, la visualización de los resultados se realiza al final

del proceso. La forma más habitual conlleva la separación electroforética de los fragmentos amplificados en un gel de agarosa, la posterior tinción con bromuro de etidio (u otro colorante fluorescente) y la observación final transiluminando con luz ultravioleta.

Reacción en cadena de la ligasa (LCR) El método e la reacción en cadena de la ligasa utilizan una ligasa

termoestable. E la figura 17-7 se presenta el proceso esquemáticamente. Se utiliza 4 cebadores que se alinea en regiones inmediatamente adyacentes al molde. 2 de ellas se alinean con la cadena superior. El segundo par de cebadores es complementario del

primero y se alinea con la cadena opuesta.

Tecnología de la PCR en imágenes

Las siguientes fotografías muestran la forma en que se lleva a cabo la tecnología de la PCR

La mezcla para la PCR se prepara sobre hielo

Los tubos de reacción se colocan en el termociclador.

Se cierra el termociclador, se bloquea y se programa

Hay diferentes tipos de termocicladores: el de color negro es una tétrada, y en él se pueden procesar simultáneamente 4 conjuntos de 96 muestras. Los cuatro más pequeños, de color blanco tienen, cada uno, una capacidad de 96 pocillos.

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