Objetivo: Adquirir habilidad para el manejo de colorantes, microscopio, condiciones de asepsia y métodos de aislamiento

1) Métodos de coloración y observación de microorganismos

2) Manejo en condiciones de asepsia

3) Obtención de cultivos puros

4) Conservación de cultivos puros

PRÁCTICO N° 3

Técnicas para la observación, aislamiento y conservación de microorganismos

Síntesis del práctico 1

Laboratorio

Esterilización• Autoclave - horno

• Radiación

• Filtración

• Productos químicos

Medio de cultivo Observación Aislamiento

Práctico 2

Composición química• Fuente de energía/carbono • Base mineral• Agua

Preparación de medios

Líquidos• Pesar drogas• Disolver con agua destilada • Regular pH• Fraccionar

Sólidos

• Pesar drogas• Disolver con agua destilada• Regular pH• Agarizar• Fundir• Fraccionar

Esterilización en autoclave

Siembra de suelo

Incubación

Práctico 1

Métodos de coloración y observación de microorganismos

Características del microscopio óptico

Aumento: objetivo x ocular

Resolución: objetivo de inmersión (aceite de inmersión)

Tipos de microscopios

Campo claro Contraste de fases Campo oscuro Fluorescencia

Métodos de coloración

Objetivo: Aumentar el contraste de los microorganismos con el fondo

Tipos de coloración:

• Simples (un solo colorante)• Dobles (dos colorantes, coloraciones diferenciales)

Colorantes más utilizados:

• Safranina• Azul de metileno• Fucsina• Cristal violeta• Azul de algodón

Manejo en condiciones de asepsia

Atmósfera: cámara de flujo, lámpara UV

Superficie de la mesa de trabajo: alcohol, hipoclorito

Obtención del material: ansa estéril

Flameado de recipiente

Preparación y fijación de un extendido por calor

Coloración

Observación

Secuencia de una coloración

Secuencia de una coloración simple

Equipo de coloración Flamear un portaobjeto Esterilizar el ansa

Extender Fijar al calorExtraer una alícuota

Secuencia de una coloración simple (cont.)

Agregar el colorante Esperar un minuto Lavar

Secar

Observar

Secuencia de una coloración simple (fijación con ácido)

Portaobjeto enterrado

Colorear con fucsina Fijación con ácido acéticoEsperar 5 minutos

Actividad: colorear con fucsina los cultivos de suelo (fijado por calor) y el

portaobjeto enterrado (fijado con ácido acético).

Coloración simple (Rossy-Cholodny)

Hongo tabicado

Hongos

Bacterias

Actinomycetes

Partícula de arena

Coloración doble (Gram)

1) Teñir el extendido con Cristal Violeta (1 minuto) Todas las bacterias se tiñen de violeta

2) Añadir Lugol para fijar el colorante (1minuto)

3) Decolorar con alcohol Las bacterias G + quedan violetas y las G – se decoloran

4) Teñir con fucsina (30 segundos) Las bacterias G + quedan violetas y las G – rosadas

Coloración doble (Gram)

Bacterias G-

Bacterias G+

Actividad: observar al microscopio bacterias Gram + y Gram –

Métodos de aislamiento

Aislamiento en medio sólido:

Consiste en separar e inmovilizar individuos en un medio solidificado.

Aislamiento biológico:

Consiste en inocular animales o vegetales y aislarlas de la sangre,

tejidos, etc.

Cultivo puro: cultivo de microorganismos genéticamente iguales.

Aislamiento: Método para obtener un cultivo puro.

Obtención de cultivos puros

Aislamiento en medio sólido por estriado

Obtención de cultivos puros

Fundir el agar

Esterilizar el ansa

Colocar en caja de Petri

Trazar estrías sobre el agar

Dejar solidificar

Incubar

Obtención de cultivos puros

Cultivos puros en caja de PetriCrecimiento confluente

Colonias aisladas

Actividad 1: realizar estrías en superficie.

Actividad 2: observar estrías en caja de Petri y cultivos puros en pico de flauta

Conservación de cultivos puros

Formas de conservación de cultivos puros

• Liofilización: desecación mas congelación

• Subcultivos seriados: repiques periódicos ( 4-5°C)

• Congelación: -90° C recubierto con glicerol

Síntesis del práctico N° 3

Técnicas microbiológicas

Normas de manejo en microbiología

Asepsia

Atmósfera

Sup. de trabajo

Manejo de material y recipiente

Observación

Microscopio ÓpticoTipos:

• Campo Claro• Contraste de Fase • Campo Oscuro• Florescencia

Coloración tipos •Simples

•Dobles

Conservación

Liofilización

Congelación

Subcultivos seriados

Aislamiento

• Medio sólido (estrías)

• Biológico (vegetales o animales)