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María V. Geijo Vázquez

ESTUDIO DE VARIABLES INMUNOLÓGICAS Y BACTERIOLÓGICASEN RELACIÓN CON LA INMUNIZACIÓN

FRENTE A PARATUBERCULOSIS EN LOS RUMIANTES

Vitoria-Gasteiz, 2010

TESIS DOCTORALESN.¼ 66

Universidad de Leî n

Estudio dE variablEs inmunolî gicas ybactEriolî gicas En rElaciî n con la

inmunizaciî n frEntE a paratubErculosisEn los rumiantEs

Mar’ a V. Geijo V‡z quez

Edición: 1.ª Febrero 2010

Tirada: 50 ejemplares

© Administración de la Comunidad Autónoma del País Vasco Departamento de Medio Ambiente, Planificación Territorial, Agricultura y Pesca

Internet: www.euskadi.net

Edita: Eusko Jaurlaritzaren Argitalpen Zerbitzu Nagusia Servicio Central de Publicaciones del Gobierno Vasco Donostia-San Sebastián, 1 - 01010 Vitoria-Gasteiz

Impresión: Eusko Printing Service, S.L. www.eps-grupo.com

ISBN: 978-84-457-2992-2

D. L.: VI 38-2010

Un registro bibliográfico de esta obra puede consultarse en el catálogo de la Biblioteca General del Gobierno Vasco: .

INFORME DEL DIRECTOR DE LA TESIS (Art. 11.3 del R.D. 56/2005)

Los Dres. D. Ramón A. Juste Jordán y D. Joseba M. Garrido Urkullu

como Directores de la Tesis Doctoral titulada “Estudio de variables

inmunológicas y bacteriológicas en relación con la inmunización frente a

paratuberculosis en los rumiantes” realizada por Dña. María V. Geijo Vázquez

en el Departamento de Producción y Sanidad Animal del Instituto Vasco de

Investigación y Desarrollo Agrario (NEIKER–Tecnalia), informan favorablemente

el depósito de la misma, dado que reúne las condiciones necesarias para su

defensa.

Lo que firmo, para dar cumplimiento al art. 11.3 del R.D. 56/2005, en León

a 12 de julio de 2007.

Dr. D. Ramón A. Juste Jordán Dr. D. Joseba M. Garrido Urkullu

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Índice

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ÍNDICE GENERAL I. INTRODUCCIÓN Y OBJETIVOS ............................................................................... 33

I.1. Introducción..................................................................................................... 35 I.2. Objetivos .......................................................................................................... 39

II. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA ..................................................................................... 41

II.1. Etiología .......................................................................................................... 43 II.1.1. El género Mycobacterium..................................................................... 43 II.1.1.1. Características generales ............................................................... 43 II.1.1.2. Clasificación .................................................................................... 43 II.1.2. Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis ................................... 53 II.1.2.1. Aspectos generales......................................................................... 53 II.1.2.2. Dependencia de la micobactina.................................................... 57 II.1.2.3. Metabolismo y nutrición ............................................................... 58 II.1.2.4. Estructura antigénica ..................................................................... 59 II.1.2.5. Resistencia ....................................................................................... 62 II.2. Epidemiología ................................................................................................. 65 II.2.1. Rango de hospedadores ..................................................................... 65 II.2.2. Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis como potencial agente

zoonótico .............................................................................................. 67 II.2.3. Transmisión ......................................................................................... 74 II.2.4. Distribución y prevalencia ................................................................. 75 II.2.4.1. Prevalencia de la parauberculosis bovina.................................. 76 II.2.4.2. Prevalencia de la paratuberculosis ovina ................................... 78 II.2.4.3. Prevalencia de la paratuberculosis caprina ................................ 79 II.2.5. Importancia económica ...................................................................... 80 II.3. Patogenia .......................................................................................................... 82 II.3.1 Vía de entrada de M. avium subsp. paratuberculosis ....................... 82 II.3.2. Invasión de M. avium subsp. paratuberculosis .................................. 83 II.3.3. Mecanismos patogénicos ................................................................... 84

II.4. Respuesta inmune del hospedador ............................................................. 88 II.4.1. Respuesta inmune innata ................................................................... 88 II.4.2. Respuesta inmune adaptativa ........................................................... 90 II.4.2.1. Respuesta inmune celular ............................................................. 95 II.4.2.2. Respuesta inmune humoral.......................................................... 97 II.4.2.3. Respuesta inmune a la vacunación.............................................. 99 II.4.2.3.1. Respuesta inmune a la vacunación en la especie bovina .... 99 II.4.2.3.2. Respuesta inmune a la vacunación en la especie ovina....... 100 II.4.2.3.3. Respuesta inmune a la vacunación en la especie caprina ... 101

estudio de variables inmunolî gicas y bacteriolî gicas en relaciî n con la inmunizaciî n frente a paratuberculosis en los rumiantes

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Índice

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II.4.3. Factores de resistencia a la enfermedad........................................... 102 II.5. Cuadro clínico y lesional ............................................................................. 104 II.5.1. Cuadro clínico y biopatológico.......................................................... 104 II.5.2. Cuadro lesional.................................................................................... 105 II.5.2.1. Lesiones macroscópicas................................................................. 105 II.5.2.2. Lesiones microscópicas.................................................................. 106 II.5.2.3. Variabilidad de las formas lesionales .......................................... 107

II.6. Diagnóstico..................................................................................................... 112 II.6.1. Diagnóstico clínico-epidemiológico.................................................. 112 II.6.2. Diagnóstico anatomopatológico........................................................ 113 II.6.3. Diagnóstico bacteriológico ................................................................. 115 II.6.3.1. Identificación microscópica en frotis ........................................... 115 II.6.3.2. Aislamiento mediante cultivo ...................................................... 116 II.6.3.2.1. Descontaminación de las muestras......................................... 116 II.6.3.2.2. Enriquecimiento de las muestras ............................................ 117 II.6.3.2.3. Cultivo ........................................................................................ 117 II.6.3.3. Detección del ADN bacteriano..................................................... 121 II.6.4. Diagnóstico inmunológico ................................................................. 123 II.6.4.1. Técnicas de diagnóstico basadas en la inmunidad celular....... 124 II.6.4.1.1. Intradermorreacción (IDR) ...................................................... 124 II.6.4.1.2. Test de detección del interferón-gamma (IFN-γ).................. 125 II.6.4.1.3. Test de transformación linfocitaria (LT) ................................ 128 II.6.4.1.4. Inhibición de la migración linfocitaria ................................... 128 II.6.4.1.5. Test de detección del receptor de interleuquina 2 (IL-2R).. 129 II.6.4.2. Técnicas de diagnóstico basadas en la inmunidad humoral.... 129 II.6.4.2.1. Fijación del complemento ........................................................ 129 II.6.4.2.2. Inmunodifusión en gel de agar (IDGA)................................. 130 II.6.4.2.3. Enzyme linked immunosorbent assay (ELISA)........................... 131

II.7. Tratamiento y control ................................................................................. 135 II.7.1. Tratamiento .......................................................................................... 135 II.7.2. Control basado en la detección y sacrificio...................................... 136 II.7.3. Control basado en la vacunación ...................................................... 137 II.7.4. Medidas higiénico-sanitarias ............................................................. 141

III. MATERIALES Y MÉTODOS ..................................................................................... 145

III.1. Animales estudiados .................................................................................. 147

III.2. Toma de muestras ....................................................................................... 150

III.3. Vacunación ................................................................................................... 151

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Índice

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III.4. Técnicas empleadas .................................................................................... 151 III.4.1. Técnicas serológicas............................................................................ 151 III.4.1.1. Evaluación de la respuesta inmune humoral mediante ELISA

indirecto.............................................................................................. 151 III.4.1.2. Evaluación de la respuesta inmune humoral mediante

detección del interferón-γ ................................................................ 153 III.4.2. Técnicas microbiológicas......................................................................... 156 III.4.2.1. Examen microscópico: Ziehl-Neelsen de muestras fecales ....... 156 III.4.2.2. Cultivo............................................................................................... 157 III.4.2.2.1. Muestras fecales........................................................................ 157 III.4.2.2.2. Muestras ambientales .............................................................. 159 III.4.2.2.3. Tejidos de necropsias............................................................... 160 III.4.2.3. Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)................................ 160 III.4.2.3.1. Muestras fecales........................................................................ 160 III.4.2.3.1.1. Concentración y extracción de las micobacerias......... 160 III.4.2.3.1.2 Extracción del ADN micobacteriano............................ 161 III.4.2.3.1.3. Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)................ 162 III.4.2.3.1.4. Visualización e interpretación de los resultados ........ 163 III.4.2.3.2. Muestras ambientales .............................................................. 165 III.4.2.3.2.1. Concentración y extracción de las micobacerias....... 165 III.4.2.3.3. Leucocitos.................................................................................. 165 III.4.2.3.3.1. Concentración y extracción de las micobacerias....... 165

III.5. Análisis estadístico....................................................................................... 167 III.6. Modelización ................................................................................................. 167

IV. RESULTADOS ............................................................................................................ 169

IV.1. Resultados de las técnicas serológicas .................................................... 171 IV.1.1. Respuesta inmune humoral .................................................................... 171 IV.1.1.1. Especie bovina................................................................................ 172 IV.1.1.2. Especie ovina.................................................................................. 173 IV.1.1.3. Especie caprina............................................................................... 174 IV.1.1.4. Comparación entre especies......................................................... 175 IV.1.2. Respuesta inmune celular ....................................................................... 182 IV.1.2.1. Especie bovina................................................................................ 183 IV.1.2.2. Especie ovina.................................................................................. 188 IV.1.2.3. Especie caprina............................................................................... 193 IV.1.2.4. Comparación entre especies......................................................... 198 IV.2. Resultados de las técnicas microbiológicas ........................................... 201 IV.2.1. Ziehl-Neelsen de muestras fecales ......................................................... 201 IV.2.2. Cultivos fecales ......................................................................................... 204 IV.2.3. Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) de muestras fecales...... 204


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IV.2.3.1. Especie bovina................................................................................ 206 IV.2.3.2. Especie ovina.................................................................................. 207 IV.2.3.3. Especie caprina............................................................................... 208 IV.2.3.4. Comparación entre especies......................................................... 210 IV.2.4. Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) de leucocitos ................ 212 IV.2.4.1. Especie bovina................................................................................ 213 IV.2.4.2. Especie ovina.................................................................................. 215 IV.2.4.3. Especie caprina............................................................................... 217 IV.2.4.4. Comparación entre especies......................................................... 219 IV.3. Resultados de las técnicas complementarias ......................................... 222 IV.3.1. Resultados de los tejidos de necropsias................................................. 222 IV.3.1.1. Cultivos de los tejidos de necropsias....................................... 222 IV.3.1.2. PCR de los tejidos de necropsias.............................................. 223 IV.3.2. Determinación de la carga micobacteriana ambiental ........................ 224

IV.4. Valoración global ........................................................................................ 225 IV.4.1. Correlación entre respuesta inmune celular y humoral...................... 225 IV.4.2. Elaboración de un modelo de patogenia............................................... 230

V. DISCUSIÓN ................................................................................................................ 241 VI. CONCLUSIONES....................................................................................................... 263 VII. RESUMEN. LABURPENA. SUMMARY ................................................................. 267

VII.1. Resumen........................................................................................................ 269 VII.2. Laburpena ..................................................................................................... 273 VII.3. Summary ....................................................................................................... 276

VIII. BIBLIOGRAFÍA ......................................................................................................... 281

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ÍNDICE DE TABLAS II. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA

Tabla II. 1. Listado de especies y subspecies comprendidas en el género Mycobacterium recogidas en el Bacterial Nomenclature Up-to-date del DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (German Collection of Microorganisms and Cell Cultures), Braunschweig, Alemania.

........................................................................................................................................ 44

Tabla II. 2. Características de M. avium y sus subespecies (Thorel et al., 1990)......................... 54

Tabla II. 3. Antígenos micobacterianos (Stanford, 1983) ............................................................. 60

Tabla II. 4. Antígenos identificados en Map. ................................................................................. 61

Tabla II. 5. Rumiantes silvestres afectados por paratuberculosis............................................... 65

Tabla II. 6. Monogástricos afectados por paratuberculosis......................................................... 66

Tabla II.7. Tipos celulares implicados en los diferentes estadios de la paratuberculosis. Tomado de Coussens ( 2001)...................................................................................... 94

Tabla II.8. Clasificación lesional en la especie bovina.................................................................. 108

Tabla II.9. Clasificación lesional en la especie ovina.................................................................... 109

Tabla II.10. Clasificación lesional en la especie caprina............................................................... 111

III. MATERIALES Y MÉTODOS

Tabla III.1. Explotaciones incluidas en el estudio......................................................................... 147

Tabla III. 2. Lotes de animales y muestreos realizados en el estudio ........................................ 148

Tabla III. 3. Tejidos recogidos en las necropsias. .......................................................................... 150

Tabla III. 4. Reactivos empleados en el ELISA indirecto de NEIKER........................................ 152

Tabla III.5. Protocolo del Bovigam™ γ-Interferon ELISA assay ................................................ 155

Tabla III.6. Reactivos empleados en la tinción de Ziehl-Neelsen Kinyoun............................... 156

Tabla III.7. Reactivos empleados en la elaboración de los medios de cultivo para el aislamiento de micobacterias ..................................................................................... 157

Tabla III.8. Procedimiento de elaboración del medio de Löwenstein-Jensen........................... 158

Tabla III.9. Procedimiento de elaboración del medio de Herrold............................................. . 159

Tabla III.10. Procedimiento de elaboración del medio Agar Middlebrook 7H11. ................... 159

Tabla III.11. Reactivos empleados en la extracción de ADN ...................................................... 161

Tabla III.12.Características y posiciones de los cebadores empleados en la PCR de paratuberculosis........................................................................................................... 162

Tabla III.13. Reactivos empleados en la reacción de PCR ........................................................... 163


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Tabla III.14. Programa de ciclos, temperaturas y tiempos de la reacción de PCR ................... 163

Tabla III. 15. Reactivos empleados en la visualización del producto amplificado................... 164

IV. RESULTADOS

Tabla IV.1. Resultados del Ziehl-Neelsen de frotis fecales en los diferentes rebaños ............. 201

Tabla IV.2. Aislamientos positivos de cultivos fecales................................................................. 204

Tabla IV.3. Resultados positivos a PCR de heces en la especie bovina según la edad de vacunación y estatus del rebaño en los grupos de animales vacunados y controles ........................................................................................................................ 206

Tabla IV.4. Resultados positivos a PCR de heces en la especie ovina según la edad de vacunación y estatus del rebaño en los grupos de animales vacunados y controles ........................................................................................................................ 208

Tabla IV.5. Resultados positivos a PCR de heces en la especie caprina según la edad de vacunación y estatus del rebaño en los grupos de animales vacunados y controles ........................................................................................................................ 209

Tabla IV.6. Resultados positivos en la PCR de leucocitos de animales vacunados y controles de los tres grupos de edad en la especie bovina..................................... 214

Tabla IV.7. Resultados positivos en la PCR de leucocitos de animales vacunados y controles de los tres grupos de edad en la especie ovina....................................... 216

Tabla IV.8. Resultados positivos en la PCR de leucocitos de animales vacunados y controles de los tres grupos de edad en la especie caprina.................................... 218

Tabla IV.9. Aislamientos positivos de cultivos de muestras de tejidos ..................................... 222

Tabla IV.10. Resultados positivos de PCR de muestras de tejidos............................................. 223

Tabla IV.11. Resultados positivos de PCR y aislamientos de cultivos de muestras ambientales ................................................................................................................... 224

Tabla IV.12. Valores medios de IFN-γ0 (inespecífico, en respuesta al antígeno nulo PBS) para cada cohorte en función de la historia clínica del rebaño, edad al comienzo del estudio y tiempo.................................................................................. 231

Tabla IV.13. Valores medios de IFN-γMap (específico, en respuesta al antígeno PPD aviar) para cada cohorte en función de la historia clínica del rebaño, edad al comienzo del estudio y tiempo.................................................................................. 232

Tabla IV.14. Valores medios del índice ELISA para cada cohorte en función de la historia clínica del rebaño, edad al comienzo del estudio y tiempo ................................... 233

Tabla IV.15. Frecuencias de resultados positivos en la PCR de sangre expresadas como porcentaje de positivos ± el error estándar de la media para un intervalo de confianza del 95% ........................................................................................................ 234

Tabla IV.16. Resultados de IFN-γ y ELISA en los grupos con PCR de leucocitos positiva y negativa de los animales no vacunados del lote 18M de ambos rebaños bovinos .......................................................................................................................... 235

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Tabla IV.17. Evolución de la inmunidad innata inespecífica tras la vacunación en los dos rebaños bovinos ........................................................................................................... 236

Tabla IV.18. Resultados de IFN-γ y ELISA en los grupos con PCR de leucocitos positiva y negativa de los animales vacunados del lote 18M de ambos rebaños bovinos.......................................................................................................................... 237

Tabla IV.19. Resultados de IFN-γ y ELISA en los grupos con PCR de leucocitos positiva y negativa de las ovejas no vacunados en los cuatro muestreos .......................... 238

Tabla IV.20. Resultados de IFN-γ y ELISA en los grupos con PCR de leucocitos positiva y negativa de las ovejas vacunadas en los tres muestreos post-vacunación....... 238

Tabla IV.21. Resultados de IFN-γ y ELISA en los grupos con PCR de leucocitos positiva y negativa de las cabras no vacunadas en los cuatro muestreos .......................... 238

Tabla IV.22. Resultados de IFN-γ y ELISA en los grupos con PCR de leucocitos positiva y negativa de las cabras vacunadas en los tres muestreos post-vacunación....... 239

V. DISCUSIÓN

Tabla V. 1. Formas o estadios inmunopatológicos propuestos .................................................. 252


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ÍNDICE DE FIGURAS

PORTADA

Copyright© 2004 Dennis Kunkel Microscopy, Inc. Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis. Microfotografía electrónica de escaneado (SEM) x 3000.

II. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA

Figura II.1. Modelo de patogenia de la IBD planteado por Elguezabal et al., datos sin publicar. IFN-γ0: densidad óptica media de la producción de IFN-γ en respuesta al PBS. IFN-γMap: densidad óptica media de la producción de IFN-γ en respuesta a la PPD aviar ..................................................................................... 73

Figura II.2. Raza Roja Noruega........................................................................................................ 103

Figura II.3. Raza Jersey ..................................................................................................................... 103

Figura II.4. Vaca de raza limousine con caquexia y edema de papada ..................................... 104

Figura II.5. Lesiones macroscópicas de un tramo de yeyuno (izquierda) y aspecto del tramo de yeyuno equivalente de un animal no afectado (derecha)...................... 105

Figura II.6. Ziehl-Neelsen de muestra de heces. ........................................................................... 115

Figura II.7. Aislamientos de micobacterias en medios de Herrold (izda.) y Löwenstein-Jensen (dcha.)................................................................................................................ 118

Figura II.8. Administración de vacuna de paratuberculosis en el pliegue de la papada ........ 137

III. MATERIALES Y MÉTODOS

Figura III.1. Imagen de una PCR. Carriles 1 y 14: marcadores de peso molecular; 2-3: muestra de intestino; 4-5: muestra de nódulo; 6-7: muestra de heces dilución 1/16; 8-9: muestra de heces dilución 1/64; 10-11: control de extracción de ADN; 12: control positivo de PCR; 13: control negativo de PCR.......................... 165

V. DISCUSIÓN

Figura V.1. Modelo de patogenia de la paratuberculosis. IFN-γ 0: densidad óptica media de la producción de IFN-γ en respuesta al PBS. IFN-γ Map: densidad óptica media de la producción de IFN-γ en respuesta a la PPD aviar. ELISA: media del índice ELISA. %ELISA+: porcentaje de resultados positivos al ELISA ......... 255

Figura V.2. Efecto de la vacunación en los animales del lote 18M en base al modelo de patogenia de la paratuberculosis planteado. IFN-γ 0: densidad óptica media de la producción de IFN-γ en respuesta al PBS. IFN-γ Map: densidad óptica media de la producción de IFN-γ en respuesta a la PPD aviar. ELISA: media del índice ELISA. %ELISA+: porcentaje de resultados positivos al ELISA. ........ 259

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ÍNDICE DE GRÁFICAS IV. RESULTADOS

Gráfica IV.1. Índice ELISA (IE) post-vacunación en función de la especie. Medias del IE expresadas como IE muestreo actual / IE muestreo 0. En las barras de error se representa el error estándar de la media ....................................................... 171

Gráfica IV.2. Índice ELISA (IE) post-vacunación en función del estatus del rebaño. Medias del IE expresadas como IE muestreo actual / IE muestreo 0. En las barras de error se representa el error estándar de la media........................................ 171

Gráfica IV.3. Índice ELISA (IE) post-vacunación en función de la vacunación. Medias del IE expresadas como IE muestreo actual / IE muestreo 0. En las barras de error se representa el error estándar de la media ............................................. 172

Gráfica IV.4. Índice ELISA (IE) post-vacunación en función de la edad de vacunación. Medias del IE expresadas como IE muestreo actual / IE muestreo 0. En las barras de error se representa el error estándar de la media............................ 172

Gráfica IV.5. Índice ELISA (IE) en la especie bovina. Medias del IE expresadas como IE muestreo actual / IE muestreo 0. En las barras de error se representa el error estándar de la media ................................................................................... 172

Gráfica IV.6. Medias del ELISA (IE) expresadas como IE muestreo actual / IE muestreo 0 en los rebaños bovinos en función de las edades de vacunación. En las barras de error se representa el error estándar de la media............................ 173

Gráfica IV.7. Índice ELISA (IE) en la especie ovina. Medias del IE expresadas como IE muestreo actual / IE muestreo 0. En las barras de error se representa el error estándar de la media ................................................................................... 173

Gráfica IV.8. Índice ELISA (IE) en la especie ovina. Medias del IE expresadas como IE muestreo actual / IE muestreo 0 en los rebaños ovinos en función de las edades de vacunación. En las barras de error se representa el error estándar de la media ............................................................................................................. 174

Gráfica IV.9. Índice ELISA (IE) en la especie caprina. Medias del IE expresadas como IE muestreo actual / IE muestreo 0. En las barras de error se representa el error estándar de la media ................................................................................... 175

Gráfica IV.10. Índice ELISA (IE) en la especie caprina. Medias del IE expresadas como IE muestreo actual / IE muestreo 0 en los rebaños caprinos en función de las edades de vacunación. En las barras de error se representa el error estándar de la media ............................................................................................................. 175

Gráfica IV.11.Índice ELISA (IE) post-vacunación en rebaños libres y afectados clínicamente de las tres especies. Medias del IE expresadas como IE muestreo actual / IE muestreo 0 en las tres especies. En las barras de error se representa el error estándar de la media..................................................... 176

Gráfica IV.12. Índice ELISA (IE) post-vacunación en controles y vacunados de las tres especies. Medias del IE expresadas como IE muestreo actual / IE muestreo


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0 en las tres especies. En las barras de error se representa el error estándar de la media ........................................................................................................... 176

Gráfica IV.13. Índice ELISA (IE) en controles y vacunados de las tres especies en los sucesivos muestreos. Medias del IE expresadas como IE muestreo actual / IE muestreo 0. En las barras de error se representa el error estándar de la media..................................................................................................................... 177

Gráfica IV.14. Índice ELISA (IE) en animales controles y vacunados en relación a la edad del animal. Medias del IE expresadas como IE muestreo actual / IE muestreo 0. En las barras de error se representa el error estándar de la media..................................................................................................................... 177

Gráfica IV.15. Índice ELISA (IE) en animales controles y vacunados de cada especie en relación a la edad del animal. Medias del IE expresadas como IE muestreo actual / IE muestreo 0. En las barras de error se representa el error estándar de la media ........................................................................................... 178

Gráfica IV.16. Proporción de resultados positivos al ELISA en animales controles y vacunados. En las barras de error se representa el error estándar para un intervalo de confianza del 95%.......................................................................... 178

Gráfica IV.17. Evolución del % de resultados positivos al ELISA en animales controles y vacunados a lo largo del estudio. En las barras de error se representa el error estándar para un intervalo de confianza del 95% ................................. 179

Gráfica IV.18. Evolución del % de resultados positivos al ELISA en animales controles y vacunados a lo largo del estudio en las diferentes especies.......................... 179

Gráfica IV.19. Proporción de resultados positivos al ELISA en vacas controles y vacunadas. En las barras de error se representa el error estándar para un intervalo de confianza del 95%.......................................................................... 179

Gráfica IV.20. Evolución del % de resultados positivos al ELISA en vacas controles y vacunadas a lo largo del estudio según el estatus del rebaño. En las barras de error se representa el error estándar para un intervalo de confianza del 95% ........................................................................................................................ 180

Gráfica IV.21. Proporción de resultados positivos al ELISA en ovejas controles y vacunadas. En las barras de error se representa el error estándar para un intervalo de confianza del 95%.......................................................................... 180

Gráfica IV.22. Evolución del % de resultados positivos al ELISA en ovejas controles y vacunadas a lo largo del estudio según el estatus del rebaño. En las barras de error se representa el error estándar para un intervalo de confianza del 95% ........................................................................................................................ 181

Gráfica IV.23. Proporción de resultados positivos al ELISA en cabras controles y vacunadas. En las barras de error se representa el error estándar para un intervalo de confianza del 95%.......................................................................... 181

Gráfica IV.24. Evolución del % de resultados positivos al ELISA en cabras controles y vacunadas a lo largo del estudio según el estatus del rebaño. En las barras de error se representa el error estándar para un intervalo de confianza del 95% ........................................................................................................................ 181

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Gráfica IV.25. IFN-γ en función de la especie. Medias del IFN-γ expresadas como IFN-γ aviar muestreo actual / IFN-γ aviar muestreo 0. En las barras de error se representa el error estándar de la media ......................................................... 182

Gráfica IV.26. IFN-γ en función del estatus clínico del rebaño. Medias del IFN-γ expresadas como IFN-γ aviar muestreo actual / IFN-γ aviar muestreo 0. En las barras de error se representa el error estándar de la media .............. 182

Gráfica IV.27. IFN-γ en función de la vacunación. Medias del IFN-γ expresadas como IFN-γ aviar muestreo actual / IFN-γ aviar muestreo 0. En las barras de error se representa el error estándar de la media ........................................... 183

Gráfica IV.28. IFN-γ en función de la edad de vacunación. Medias del IFN-γ expresadas como IFN-γ aviar muestreo actual / IFN-γ aviar muestreo 0. En las barras de error se representa el error estándar de la media...................................... 183

Gráfica IV.29. Medias del IFN-γ aviar expresadas como IFN-γ aviar muestreo actual / IFN-γ aviar muestreo 0 en los rebaños bovinos. En las barras de error se representa el error estándar de la media ......................................................... 183

Gráfica IV.30. Medias del IFN-γ expresadas como IFN-γ aviar muestreo actual / IFN-γ aviar muestreo 0 en los rebaños bovinos en función de la edad de vacunación. En las barras de error se representa el error estándar de la media .................................................................................................................... 184

Gráfica IV.31. Relación entre el IFN-γ aviar y el IFN-γ bovino pre-vacunación en la especie bovina...................................................................................................... 185

Gráfica IV.32. Relación entre el IFN-γ aviar y el IFN-γ bovino post-vacunación en la especie bovina...................................................................................................... 185

Gráfica IV.33. Correlación entre el IFN-γ producido frente a la PPD aviar y al PBS pre-vacunación en la especie bovina ....................................................................... 185

Gráfica IV.34. Correlación entre el IFN-γ producido frente a la PPD aviar y al PBS post-vacunación en la especie bovina ....................................................................... 185

Gráfica IV.35 Correlación entre el IFN-γ producido frente a la PPD aviar y al PBS pre-vacunación en el rebaño bovino libre de PTBC .............................................. 186

Gráfica IV.36 Correlación entre el IFN-γ producido frente a la PPD aviar y al PBS pre-vacunación en el rebaño bovino con PTBC ..................................................... 186

Gráfica IV.37 Correlación entre el IFN-γ producido frente a la PPD aviar y al PBS post-vacunación en el rebaño bovino libre de PTBC .............................................. 186

Gráfica IV.38 Correlación entre el IFN-γ producido frente a la PPD aviar y al PBS post-vacunación en el rebaño bovino con PTBC ..................................................... 186

Gráfica IV.39 Correlación entre el IFN-γ producido frente a la PPD aviar y al PBS pre-vacunación en el lote 01M de la especie bovina.............................................. 187

Gráfica IV.40 Correlación entre el IFN-γ producido frente a la PPD aviar y al PBS post-vacunación en el lote 01M de la especie bovina.............................................. 187



26

Índice

24




Gráfica IV.45. Medias del IFN-γ expresadas como IFN-γ aviar muestreo actual / IFN-γ aviar muestreo 0 en los rebaños ovinos. En las barras de error se representa el error estándar de la media.......................................................... 188

Gráfica IV.46. Medias del IFN-γ expresadas como IFN-γ aviar muestreo actual / IFN-γ aviar muestreo 0 en los rebaños ovinos en función de la edad de vacunación. En las barras de error se representa el error estándar de la media..................................................................................................................... 189

Gráfica IV.47. Relación entre el IFN-γ aviar y el IFN-γ bovino pre-vacunación en la especie ovina ........................................................................................................ 189

Gráfica IV.48. Relación entre el IFN-γ aviar y el IFN-γ bovino post-vacunación en la especie ovina ........................................................................................................ 189

Gráfica IV.49. Correlación entre el IFN-γ producido frente a la PPD aviar y al PBS pre-vacunación en la especie ovina.......................................................................... 191

Gráfica IV.50. Correlación entre el IFN-γ producido frente a la PPD aviar y al PBS post-vacunación en la especie ovina.......................................................................... 191

Gráfica IV.51. Correlación entre el IFN-γ producido frente a la PPD aviar y al PBS pre-vacunación en el rebaño ovino libre de PTBC................................................. 191

Gráfica IV.52. Correlación entre el IFN-γ producido frente a la PPD aviar y al PBS pre-vacunación en el rebaño ovino afectado de PTBC.......................................... 191

Gráfica IV.53. Correlación entre el IFN-γ producido frente a la PPD aviar y al PBS post-vacunación en el rebaño ovino libre de PTBC................................................. 191

Gráfica IV.54. Correlación entre el IFN-γ producido frente a la PPD aviar y al PBS post-vacunación en el rebaño ovino afectado de PTBC.......................................... 191

Gráfica IV.55. Correlación entre el IFN-γ producido frente a la PPD aviar y al PBS pre-vacunación en el lote de ovejas del lote 01M................................................... 192

Gráfica IV.56. Correlación entre el IFN-γ producido frente a la PPD aviar y al PBS post-vacunación en el lote de ovejas del lote 01M................................................... 192





ê ndice

27

Índice

25

Gráfica IV.61. Medias del IFN-γ expresadas como IFN-γ aviar muestreo actual / IFN-γ aviar muestreo 0 en los rebaños caprinos. En las barras de error se representa el error estándar de la media ......................................................... 193

Gráfica IV.62. Medias del IFN-γ expresadas como IFN-γ aviar muestreo actual / IFN-γ aviar muestreo 0 en los rebaños caprinos en función de la edad de vacunación. En las barras de error se representa el error estándar de la media .................................................................................................................... 194

Gráfica IV.63. Relación entre el IFN-γ aviar y el IFN-γ bovino pre-vacunación en la especie caprina..................................................................................................... 194

Gráfica IV.64. Relación entre el IFN-γ aviar y el IFN-γ bovino post-vacunación en la especie caprina..................................................................................................... 194

Gráfica IV.65. Correlación entre el IFN-γ producido frente a la PPD aviar y al PBS pre-vacunación en la especie caprina ...................................................................... 195

Gráfica IV.66. Correlación entre el IFN-γ producido frente a la PPD aviar y al PBS post-vacunación en la especie caprina ...................................................................... 195

Gráfica IV.67. Correlación entre el IFN-γ producido frente a la PPD aviar y al PBS pre-vacunación en el rebaño caprino libre de PTBC ............................................. 196

Gráfica IV.68. Correlación entre el IFN-γ producido frente a la PPD aviar y al PBS pre-vacunación en el rebaño caprino afectado de PTBC ...................................... 196

Gráfica IV.69. Correlación entre el IFN-γ producido frente a la PPD aviar y al PBS post-vacunación en el rebaño caprino libre de PTBC ............................................. 196

Gráfica IV.70. Correlación entre el IFN-γ producido frente a la PPD aviar y al PBS post-vacunación en el rebaño caprino afectado de PTBC ...................................... 196

Gráfica IV.71. Correlación entre el IFN-γ producido frente a la PPD aviar y al PBS pre-vacunación en las cabras del lote 01M ............................................................. 197

Gráfica IV.72. Correlación entre el IFN-γ producido frente a la PPD aviar y al PBS post-vacunación en las cabras del lote 01M ............................................................. 197





Gráfica IV.77. IFN-γ en rebaños libres y afectados de las tres especies. Medias del IFN-γ expresadas como IFN-γ aviar muestreo actual / IFN-γ aviar muestreo 0. En las barras de error se representa el error estándar de la media .............. 198

Gráfica IV.78. IFN-γ en controles y vacunados de las tres especies. Medias del IFN-γ expresadas como IFN-γ aviar muestreo actual / IFN-γ aviar muestreo 0. En las barras de error se representa el error estándar de la media .............. 198


28

Índice

26

Gráfica IV.79. IFN-γ en controles y vacunados de las tres especies en los sucesivos muestreos. Medias del IFN-γ expresadas como IFN-γ aviar muestreo actual / IFN-γ aviar muestreo 0. En las barras de error se representa el error estándar de la media ................................................................................. 199

Gráfica IV.80. IFN-γ en controles y vacunados a lo largo de los 36 primeros meses de vida. Medias del IFN-γ expresadas como IFN aviar muestreo actual / IFN aviar muestreo 0. En las barras de error se representa el error estándar de la media..................................................................................................................... 199

Gráfica IV.81. IFN-γ en controles y vacunados a lo largo de los 36 primeros meses de vida en función de la especie. Medias del IFN-γ expresadas como IFN aviar muestreo actual / IFN aviar muestreo 0. En las barras de error se representa el error estándar de la media.......................................................... 200

Gráfica IV.82. Proporción de animales positivos al Ziehl-Neelsen de muestras de heces según el estatus del rebaño. En las barras de error se representa el error estándar para un intervalo de confianza del 95%........................................... 202

Gráfica IV.83. Proporción de animales positivos al Ziehl-Neelsen de muestras de heces en animales vacunados y controles pre- y post-vacunación. En las barras de error se representa el error estándar para un intervalo de confianza del 95%. ....................................................................................................................... 202

Gráfica IV.84. Proporción de animales positivos al Ziehl-Neelsen de muestras de heces en las diferentes especies en los grupos de animales vacunados y controles. En las barras de error se representa el error estándar para un intervalo de confianza del 95%................................................................................................ 203

Gráfica IV.85. Proporción de animales positivos al Ziehl-Neelsen de muestras de heces en las diferentes edades de vacunación en los grupos de animales vacunados y controles en función de la edad de vacunación. En las barras de error se representa el error estándar para un intervalo de confianza del 95%.......... 203

Gráfica IV.86. Proporción de animales positivos a la PCR de muestras de heces en las diferentes especies pre- y post-vacunación. En las barras de error se representa el error estándar para un intervalo de confianza del 95%.......... 204

Gráfica IV.87. Proporción de animales positivos a la PCR de muestras de heces según el estatus del rebaño. En las barras de error se representa el error estándar para un intervalo de confianza del 95% ........................................................... 205

Gráfica IV.88. Proporción de animales positivos a la PCR de muestras de heces en función de la vacunación. En las barras de error se representa el error estándar para un intervalo de confianza del 95% ........................................................... 205

Gráfica IV.89. Proporción de animales positivos a la PCR de muestras de heces en función de la edad de vacunación. En las barras de error se representa el error estándar para un intervalo de confianza del 95%. .......................................... 205

Gráfica IV.90. Proporción de animales positivos a PCR de heces en los grupos de animales vacunados y controles de los distintos rebaños (libres de paratuberculosis y clínicamente afectados) de la especie bovina. En las barras de error se representa el error estándar para un intervalo de confianza del 95%.......... 206

ê ndice

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Índice

27

Gráfica IV.91. Proporción de animales positivos a PCR de heces en los grupos de animales vacunados y controles de los distintos rebaños (libres de paratuberculosis y clínicamente afectados) de la especie ovina. En las barras de error se representa el error estándar para un intervalo de confianza del 95% ......... 207

Gráfica IV.92. Proporción de animales positivos a PCR de muestras de heces en las diferentes especies en los grupos de animales vacunados y controles de los distintos rebaños (libres de paratuberculosis y clínicamente afectados) de la especie caprina. En las barras de error se representa el error estándar para un intervalo de confianza del 95%........................................................... 209

Gráfica IV.93. Proporción de resultados positivos en la PCR de muestras de heces de los rebaños afectados y libres de paratuberculosis en las diferentes especies. En las barras de error se representa el error estándar para un intervalo de confianza del 95%................................................................................................ 210

Gráfica IV.94. Proporción de resultados positivos en la PCR de muestras de heces de animales vacunados y controles en las diferentes especies. En las barras de error se representa el error estándar para un intervalo de confianza del 95%..... ................................................................................................................... 210

Gráfica IV.95. Proporción de resultados positivos en la PCR de muestras de heces de los animales vacunados y controles de los rebaños afectados y libres de paratuberculosis en las tres especies. En las barras de error se representa el error estándar para un intervalo de confianza del 95%................................. 211

Gráfica IV.96. Proporción de resultados positivos en la PCR de leucocitos de las tres especies. En las barras de error se representa el error estándar para un intervalo de confianza del 95% ......................................................................... 212

Gráfica IV.97. Proporción de resultados positivos en la PCR de leucocitos según el estatus del rebaño. En las barras de error se representa el error estándar para un intervalo de confianza del 95% ......................................................................... 212

Gráfica IV.98. Proporción de resultados positivos en la PCR de leucocitos según la vacunación. En las barras de error se representa el error estándar para un intervalo de confianza del 95%. ........................................................................ 212

Gráfica IV.99. Proporción de resultados positivos en la PCR de leucocitos según la edad de vacunación. En las barras de error se representa el error estándar para un intervalo de confianza del 95%.................................................................... 213

Gráfica IV.100. Proporción de resultados positivos en la PCR de leucocitos de animales vacunados y controles en la especie bovina. En las barras de error se representa el error estándar para un intervalo de confianza del 95%. ....... 213

Gráfica IV.101. Proporción de resultados positivos en la PCR de leucocitos de animales vacunados y controles de rebaños libres y afectados de la especie bovina. En las barras de error se representa el error estándar para un intervalo de confianza del 95%............................................................................................... 214

Gráfica IV.102. Proporción de resultados positivos en la PCR de leucocitos de animales vacunados y controles en la especie ovina. En las barras de error se representa el error estándar para un intervalo de confianza del 95%. ....... 215


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Índice

28

Gráfica IV.103. Proporción de resultados positivos en la PCR de leucocitos de animales vacunados y controles de rebaños libres y afectados de la especie ovina. En las barras de error se representa el error estándar para un intervalo de confianza del 95%............................................................................................... 216

Gráfica IV.104. Proporción de resultados positivos en la PCR de leucocitos de animales vacunados y controles en la especie caprina En las barras de error se representa el error estándar para un intervalo de confianza del 95%......... 217

Gráfica IV.105. Proporción de resultados positivos en la PCR de leucocitos de animales vacunados y controles de rebaños libres y afectados de la especie caprina. En las barras de error se representa el error estándar para un intervalo de confianza del 95%............................................................................................... 218

Gráfica IV.106. Proporción de resultados positivos en la PCR de muestras de leucocitos de rebaños libres y afectados de paratuberculosis en las diferentes especies. En las barras de error se representa el error estándar para un intervalo de confianza del 95%............................................................................................... 219

Gráfica IV.107. Proporción de resultados positivos en la PCR de muestras de leucocitos de animales vacunados y controles en las diferentes especies. En las barras de error se representa el error estándar para un intervalo de confianza del 95% ....................................................................................................................... 220

Gráfica IV.108. Proporción de resultados positivos en la PCR de leucocitos de animales vacunados y controles sin vacunar de las diferentes especies a lo largo de los cuatro muestreos. En las barras de error se representa el error estándar para un intervalo de confianza del 95% .......................................................... 221

Gráfica IV.109. Proporción de resultados positivos en la PCR de leucocitos de animales vacunados y controles sin vacunar de los dos rebaños de las diferentes especies a lo largo de los cuatro muestreos .................................................... 221

Gráfica IV.110. Correlación entre el índice de ELISA y el índice del IFN-γ producido frente a la PPD aviar en los bovinos pre-vacunación.................................... 225

Gráfica IV.111. Correlación entre el índice de ELISA y el índice del IFN-γ producido frente a la PPD aviar en los bovinos post-vacunación .................................. 225

Gráfica IV.112. Correlación entre el índice de ELISA y el índice del IFN-γ producido frente a la PPD aviar pre-vacunación en el rebaño bovino libre de paratuberculosis ................................................................................................. 226

Gráfica IV.113. Correlación entre el índice de ELISA y el índice del IFN-γ producido frente a la PPD aviar post-vacunación en el rebaño bovino libre de paratuberculosis ................................................................................................. 226

Gráfica IV.114. Correlación entre el índice de ELISA y el índice del IFN-γ producido frente a la PPD aviar pre-vacunación en el rebaño bovino afectado de paratuberculosis ................................................................................................. 226

Gráfica IV.115. Correlación entre el índice de ELISA y el índice del IFN-γ producido frente a la PPD aviar post-vacunación en el rebaño bovino afectado de paratuberculosis ................................................................................................. 226

Gráfica IV.116. Correlación entre el índice de ELISA y el índice del IFN-γ producido frente a la PPD aviar en los ovinos pre-vacunación ...................................... 227

ê ndice

31

Índice

29

Gráfica IV.117. Correlación entre el índice de ELISA y el índice del IFN-γ producido frente a la PPD aviar en los ovinos post-vacunación .................................... 227

Gráfica IV.118. Correlación entre el índice de ELISA y el índice del IFN-γ producido frente a la PPD aviar pre-vacunación en el rebaño ovino libre de paratuberculosis. ................................................................................................ 227

Gráfica IV.119. Correlación entre el índice de ELISA y el índice del IFN-γ producido frente a la PPD aviar post-vacunación en el rebaño ovino libre de paratuberculosis ................................................................................................. 227

Gráfica IV.120. Correlación entre el índice de ELISA y el índice del IFN-γ producido frente a la PPD aviar pre-vacunación en el rebaño ovino afectado de paratuberculosis ................................................................................................. 227

Gráfica IV.121. Correlación entre el índice de ELISA y el índice del IFN-γ producido frente a la PPD aviar post-vacunación en el rebaño ovino afectado de paratuberculosis ................................................................................................. 227

Gráfica IV.122. Correlación entre el índice de ELISA y el índice del IFN-γ producido frente a la PPD aviar en los caprinos pre-vacunación................................... 228

Gráfica IV.123. Correlación entre el índice de ELISA y el índice del IFN-γ producido frente a la PPD aviar en los caprinos post-vacunación................................. 228

Gráfica IV.124. Correlación entre el índice de ELISA y el índice del IFN-γ producido frente a la PPD aviar pre-vacunación en el rebaño caprino libre de paratuberculosis ................................................................................................. 228

Gráfica IV.125. Correlación entre el índice de ELISA y el índice del IFN-γ producido frente a la PPD aviar post-vacunación en el rebaño caprino libre de paratuberculosis ................................................................................................. 228

Gráfica IV.126. Correlación entre el índice de ELISA y el índice del IFN-γ producido frente a la PPD aviar pre-vacunación en el rebaño caprino afectado de paratuberculosis ................................................................................................. 229

Gráfica IV.127. Correlación entre el índice de ELISA y el índice del IFN-γ producido frente a la PPD aviar post-vacunación en el rebaño caprino afectado de paratuberculosis ................................................................................................. 229

Gráfica IV.128. Valores medios de IFN-γ0 (inespecífico, en respuesta al antígeno nulo PBS) para las cohortes 18M y total de edades en función de la historia clínica del rebaño, edad al comienzo del estudio y tiempo............................. 231

Gráfica IV.129. Valores medios de IFN-γMap (específico, en respuesta al antígeno PPD aviar) para las cohortes 18M y total de edades en función de la historia clínica del rebaño, edad al comienzo del estudio y tiempo............................. 232

Gráfica IV.130. Valores medios de índice ELISA para las cohortes 18M y total de edades en función de la historia clínica del rebaño, edad al comienzo del estudio y tiempo ..................................................................................................................... 233

Gráfica IV.131. Frecuencias de resultados positivos en la PCR de sangre para las cohortes 18M y total de edades en función de la historia clínica del rebaño, edad al comienzo del estudio y tiempo ........................................................................... 234

i. introducciî n y objetivos

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36


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1.

2.

3.

4.

ii. revisiî n bibliogrç fica

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44

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maría v. geijo vázquez...estudio de variables inmunol gicas y bacteriol gicas en relaci n con la...

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