manual de operacion del cromatografo1

UNIVERSIDAD POLITÉCNICA DE TLAXCALA

Operación de la ChemStationAgilent del GC-MSD y del equipo

Volumen 1G1701CA versión C.00.00

Manual para el usuario

Cromatografía de gases

DICIEMBRE DE 2012

Espectrometría de masas y configuración del hardware Página 1

MS Conceptos básicos y configuración del hardware

En esta sección vamos a discutir:• Comparación del MS Otros detectores de GC• Componentes funcionales de la MS• Fundamentos de la espectrometría de masas• Cómo configurar el GC -MS

En este capítulo, se tratarán los fundamentos básicos de la espectroscopia de masas, así como la forma correcta de configurar su sistema GC-MSD

Detector de Conductividad Térmica (TCD): Éste es el primer detector para GC, aún muy utilizado. Funciona separando la corriente del gas portador y pasándola por un par de filamentos emparejados. La muestra que pasa por un filamento diluye el gas portador, y el filamento se calienta, cambiando su resistencia en comparación con el filamento de referencia. Responde a todos los compuestos con una conductividad térmica diferente de la del gas portador.Detector de Ionización de Llama (FID): Este detector es probablemente el más popular. La combustión de la muestra en una llama de hidrógeno/aire produce iones que se recogen y se convierten en una corriente. Responde a la mayoría de los compuestos orgánicos. La mayoría de los compuestos inorgánicos y algunos orgánicos con heteroátomos dan una respuesta mala o ninguna en absoluto. El FID es más sensible que el TCD.


Detector de Captura de Electrones (ECD): Los electrones lentos producidos por una fuente de Ni63 se recogen en un ánodo, dando lugar a una corriente. Los compuestos que captan estos electrones reducen la corriente y producen una señal.Es un detector muy sensible para compuestos halogenados.Detector Fotométrico de Llama: La combustión de una muestra en una llama de hidrógeno/oxígeno produce una emisión óptica de compuestos de P y S. Un tubo fotomultiplicador equipado con un filtro para seleccionar solamente las longitudes de onda deseadas, detecta esta emisión. Este detector resulta especialmente útil para pesticidas.Detector Termoiónico NP: Este detector es similar al FID, con la excepción de que el colector contiene un elemento adicional de una sal de Rb. Los iones se forman cuando los compuestos pasan a través de este elemento. Este detector es específico para N y P y resulta especialmente útil para pesticidas.Detector Selectivo de Masas: Los iones se forman bombardeando la muestra con un haz de electrones a vacío. Estos iones se separan de acuerdo a la relación masa/carga y se miden las masas y abundancias. Este detector puede hacerse muy específico mediante una selección apropiada de masas.

Comparación entre detectores de GC

Se muestra un diagrama con las sensibilidades y los rangos de funcionamiento útiles de los diversos detectores.La máxima sensibilidad que se puede alcanzar con cualquiera de los detectores depende de la naturaleza del compuesto, de las condiciones experimentales, de la matriz de la muestra y de otros factores. El MSD tiene un rango útil equivalente al de los detectores GC comúnmente utilizados. También tiene una sensibilidad similar a la de estos otros detectores.


Componentes funcionales del sistema de MS

.Introducción a la interfase

Interfase capilar directa (MSD 5972/73)

Ventajas:

Compuestos eluyen directamente a partir de la columna analítica hasta la fuente de iones

Simple, sin piezas adicionales, no hay flujos adicionales para establecer

Maximiza la sensibilidad

Desventajas:

Debe purgar para cambiar la columna Limitada a columnas de fase estacionaria entrecruzadas de bajo

sangrado Máximo flujo de gas portador

Interfase separador jet (MSD 5972/73)

Ventajas:


Pueden utilizarse flujos mayores Mayor capacidad de columna Menor presión de vacío en el regulador

Desventajas: Numerosos parámetros (diámetro y alineación del inyector,

espacio, velocidad del flujo de gas, y presión del jet separator) deben ajustarse correctamente para obtener resultados óptimos

Las piezas extra implican lugares adicionales en los que pueden producirse fugas de gases.

Interfase por división capilar (MSD 5972)

Ventajas: Flujos mayores permitidos

Desventajas: Regulada por un restrictor no ajustable

Razones de vacío en la EM

• Proporcionar suficiente recorrido libre• Proporcionar colisión sin trayectorias de iones• Reducir las reacciones por iones moleculares• Reducir la interferencia de fondo• Aumentar la vida útil del filamento• Evitar las descargas eléctricas•Aumentar la sensibilidad

INSTRUMENTO DE CONTROL

En instrumento de control de desplega la pantalla de inicio del GC/MSD Chem Station, en el monitor se presentan los parametros de ajuste a si como los instrumentos de medición de ambos equipos, al igual se muestran las pantallas de adquisición de datos en tiempo real del espectro y de los iones totales presentes en el analito.


La pantalla de inicio esta dividida en tres secciones

1.- Estatus actual del equipo

En esta sección se muestra los parametros actuales en que el eqipo se encuentra como son Temperatura del horno, Temperatura den inyector, flujo de gas de arrastre en columna, Temperatura del puerto auxiliar hacia espectoscopia de masas, estatus de encendido de la fuente de detención de masas.

2.- Edición de parametros de ajuste del cromatografo de gases acoplado a masas

En esta sección se muestran los parámetros de cada una de las partes que constituyen al cromatografo de gases i están divididos en

a) Puerto de inyección de la muestra con dos opciones inyección manual y por torre de inyección automática.

Donde se pueden ajustar la temperatura del inyector, presión, flujo total de gas de arrastre y el ajustar el modo de trabajo de la inyección modo Split ( la muestra es dividida en las partes a elegir de 0.1 a 7500 y solo una parte es llevada hacia la columna) en y modo splitless ( la cantidad inyectada pasa directamente a la columna).


Nota: Se recomienda usar el modo Gas Saver para ahorrar flujo de gas en las corridas de muestras que no afecta la calidad de la señal.

b) Columna capilar con opciones de conexión hacia detector FID, TCD y Masas.

En esta plantilla se muestran las condiciones de adecuación de la columna instalada como son presión dentro de la columna del gas de arrastre, y por un cálculo interno fija el flujo óptimo a esa presión y viceversa. Pero también se puede trabajar en modo de presión constante, o manejar rampas de presión o temperatura si se desea.


Existe un apartado para dar de alta o cambiar de columna de trabajo dentro del software (posterior a haber hecho el cambio físico de columna). Ver apartado TAL

NOTA: Para dar de alta una columna nueva se requiere tener información del fabricante de la columna, así como su longitud, diámetro interno, espesor de película, temperatura máxima de trabajo y fase estacionaria.

c) Horno de cromatografo de gases.


En esta pantalla se determina trabajar a temperatura constante o con rampas de temperatura a diferentes velocidades de calentamiento. Primero se especifica la temperatura inicial del horno con un tiempo de sostenimiento, posteriormente se fija un rampa de temperatura de 0 a 120 °C con un tiempo de 0 a 999.9 min como limites seleccionado a que temperatura final debe de llegar al final del tiempo elegido. Este procedimiento se repite según el número de rampas a utilizar para el análisis, (máximo seis rampas).

Se debe colocar una temperatura de post run que indica la temperatura y el tiempo en minutos, a la cual permanecerá el horno después del tiempo de análisis resultado de la suma de tiempos para cada rampa capturada. Esta aplicación ayuda al equipo a eliminar cualquier residuo que haya quedado en la columna como son compuestos de mayor peso molecular que podrían interferir en el próximo análisis.

d) Detectores FID (Detector de ionización de flama),TCD (Detector de conductividad térmica)

Para el análisis de señal existen ambos detectores FID frontal y TCD posterior, se debe elegir uno de ellos para analizar las muestras el detector TCD es el mas usado donde la muestra para por un filamento que se encuentra encendido y mide la conductividad térmica de cada compuesto sin destruir la muestra.

El detector FID requiere el uso de gases adicionales Hidrogeno y Aire para generar la flama que destruye a la muestra para formar los iones


que posteriormente son detectados y registrados como compuestos. Se recomienda usar los siguientes flujos de cada uno de los gases para este detector.

Hidrogeno 30 ml/min

Aire 300 ml/min

Nitrógeno 30 ml/min

Para cada detector primero de deben de fijar los flujos de cada gas y encender el detector a la temperatura de trabajo una vez alcanzado la temperatura se procede a encender el filamento para TCD y la flama para FID. En la pantalla se observa una línea continua que se debe a esperar a que se estabilice que es indicio que los detectores se encuentran estables y listos para el análisis.

Nota: Para el detector FID pueda que existan problemas de encendido de la flama y aparezca una nota (FLAME OUT SHUT DOWN), este evento puede ocurrir por tres factores principales.

1) La presión dentro de la columna no se ha alcanzado, debido a que no se le dio tiempo al gas de arrastre alcanzar el flujo y presión dentro de la columna capilar.

2) Las gases de ignición Hidrogeno y Aire no han alcanzado el flujo nominal de 30 y 300 ml/min respetivos para asegurar la formación de flama

3) La temperatura del detector no ha llegado a su temperatura de trabajo superior a 200 °C por lo cual el sistema de seguridad del equipo no permite encender la flama.

e) Puerto auxiliar de acoplamiento a espectrómetro de masas

En esta sección de determina la temperatura del puerto de comunicación del cromatografo de gases hacia el espectrómetro de masas, por donde la columna de acopla en la parte del detector del masas. Se recomienda usar al menos la misma temperatura que alcanzo el horno al final del método para evitar la condensación de algún material y dañe el detector del masas.

Nota: para usar el espectrómetro de masas se deben de apagar ambos detectores FID y TCD, así como los gases que utilizada cada


detector y solo se habilita el gas Helio que es el gas de arrastre que permite utilizar el masas y que no interfiere en el análisis de espectros de iones.

f) Parámetros de escaneo de espectroscopia de masas.

La espectroscopia de masas requiere de ciertas condiciones de trabajo que hay que activar para poder realizar un análisis adecuado. En primera instancia nos permite determinar la masa molecular del analito o analitos de interés así como un detallado análisis espectral de lo iones que conforman a la muestra para cada componente.


En la sección de espectroscopia de masas aparece la pantalla principal de ajuste de parámetros para el análisis se inicia con la función solvent delay que de forma opcional se puede activar indicando el tiempo en que se enciende el detector después de dejar pasar antes el solvente que por pruebas anteriores se conoce su tiempo de retención y que se desea no ser leído por el detector.

En el modo de adquisición de los datos existen tres formas de realizarlo

Modo SCAN: Es aplicable cuando no se tiene información previa de la muestra y se desea un análisis completo de la muestra, para ello se una vez seleccionado el modo SCAN se procede a capturar los parámetros del escaneo.

En la pestaña Scanning Mass Range se indica en que tiempo se enciende el detector y el rango de masa de los iones a buscar de 50 hasta 800 (amu).

En la pestaña de Threshold and sampling rates se indica el grado de sensibilidad que s desea el detector funcione un bajo threshold por debajo de 100 permite la detección de componentes traza pero con la inconveniencia de poder confundirlo con el ruido y perder sensibilidad, un alto valor de threshold 350 permite eliminar que el detector registre ruido pero pudiera no detectar compuestos de


interés por su baja concentración. Se recomienda utilizar un threshold nominal de 150 a 200.

Modo SIM: Es recomendable utilizarlo una vez realizado el modo SCAN cuando se desea encontrar iones específicos que sabes con certeza que existen en tu muestra eliminado iones que deseas no analizar.

En primera instancia se registran los iones a analizar asignado relación masa / carga en forma de grupos de búsqueda se elige el grupo (1) y os iones que entran dentro del grupo


Manual de uso rápidoPara poder realizar un análisis en el espectrómetro de masas seguir las siguientes indicaciones en cuanto al encendido y apagado del equipo.

Encendido:

1.- Abrir el tanque de gas He, que se encuentra en la parte externa del laboratorio.

2.- Encender el regulador de voltaje, que se encuentra a la salida interna del edificio.

3.- Abrir la línea de paso del gas He.

4.- Verificar que la columna se encuentra conectada al espectrómetro de masas, de no ser así realizar la instalación:

a) Retirar la tuerca ciega.b) Realizar el corte de 2mm de la columna para gases.c) Colocar la tuerca, el oring y realizar la limpieza con metanol

antes de su colocación.d) Abrir el espectrómetro de masas y retirar los tornillos que

aprietan el cuadrupolo.


e) Retirar las tarjetas electrónicas que obstruyen el paso al conector del cromatografo de gases.

f) Introducir 2mm de la columna al espectrómetro de masa, (verificar retirando el cuádruplo) en total se utilizan 16cm

aproximadamente de columna.

g) Apretar la tuerca hasta el tope con los dedos, después con la llave inglesa de 3/8 apretar hasta encontrar resistencia, entonces se da por ultimo ¼ de vuelta.

Puerto de entrada al espectro de masas Puerto de inyección


5.- Encender el cromatógrafo de gases.6.- Encender la computadora.

7.- Verificar en la ventana del espectrómetro de masas que los dos tornillos que la sostiene se encuentren libres.

8.- Verificar que la válvula de aire este totalmente cerrada.

9.- Presionar manualmente el cuádruplo y encender el equipo, no dejar de presionar hasta que en la pantalla del equipo

aparezca la palabra “PUM DOWN”.

10.- Cerrar la ventana del espectro de masas.

11.- Abrir desde el escritorio el programa de “masas”.

12.- En la ventana de “View” ir a donde dice “tune and vacum control”.

13.- Aparece una ventana indicando las condiciones del cuádruplo, seleccionar “ok”.


14.- En la ventana de “vacum” seleccionar la opción de “pum down”.

15.- Aparece un cuadro y se escoge la opción “EI” y “ok”.

16.- Aparece nuevamente las condiciones en las que se encuentra el cuádruplo y se leda “ok”.

17.- Aparece la venta con las condiciones de operación y el tiempo aproximado para realizar el pum down esperar a que desaparezca y controlar que la presión se encuentre en “ok” y a menos de 50mmTorr.

18.- Apagar el “Gas aver”.

19.- Encender la impresora.

20.- En la ventana de “tune” realizar el “standar tune”, para saber las condiciones en que se encuentra el equipo.

21.- En la ventana de “tune” realizar el “autotune”, para saber las condiciones en que se encuentra el equipo, es importante que el porcentaje de agua y de nitrógeno sea menor al 5%.

22.- Si no se alcanzan dichas condiciones es necesario dejar estabilizar el equipo por lo menos dos horas, y volver ha realizar el “autotune”.

23.- Una vez alcanzadas las condiciones en la venta de “view” elegir la opción Data analisys y se puede empezar a programar el análisis.

Apagado:

Una vez terminado el análisis se procede a ventear y apagar el equipo de la siguiente manera:

1.- Bajar la temperatura a 35° de:

a) Horno

b) Puerto de inyección

c) Columna auxiliar

2.- Una vez que las temperaturas han llegado a la temperatura mencionada en la ventana de “view” seleccionar “tune and vacum control”.

3.- En ventana de “tune” seleccionar “vent tune”, aparecerá una pantalla con las condiciones a las que se tiene que llegar y el tiempo


aproximado de venteo.

4.- Apagar el “gas aver”.

5.- Una vez llegado a las condiciones, abrir lentamente la válvula para realizar el venteo total.

6.- Apagar el equipo de masas usando su botón de encendido y apagado.

7.- Apagar el cromatografo de gases desde su botón de encendido y apagado.

8.- Apagar la computadora.

9.- Apagar la impresora.

10.- Cerrar la línea de gas interna.

Análisis Cualitativo de Datos

Integrador RTE

El integrador de la ChemStation puede manejar cromatogramas complejos, pero es más lento en comparación al integrador RTE. Es recomendable el integrador RTE para trabajos rutinarios cuantitativos y el integrador de la ChemStation para trabajos rutinarios cualitativos.El muestreo de datos selecciona los datos que se utilizan para calcular la sensibilidad a la pendiente. El rango esta de 1 a 9. Los valores negativos no están permitidos.

El cuadro Smoothing activa un filtro adicional que actúa sobre los datos cuando se toma la primera derivada para determinar los puntos de inicio/fin.

Detection Filtering (filtro de detección) se utiliza para mejorar la detección de cromatogramas con ruido. Este parámetro permite seleccionar el número de datos a incluir en la medida ponderada variable


Start Threshold (comienzo del umbral) rara vez se cambia. El valor por defecto de 0,2 es óptimo para la mayoría de los cromatogramas. Un pico se detecta o comienza cuando el cálculo de la primera derivada supera el umbral inicial, lo cual viene determinado en parte por el valor del parámetro.

Stop Threshold (final del umbral) determina cuándo finaliza un pico. Este umbral puede ajustarse para variar la cantidad de cola de un pico que se incluye en el área integrada.

Baseline reset (# puntos) es el número de barridos que debe separar dos picos cromatográficos adyacentes con el fin de que las coordenadas de los puntos de inicio y fin de los picos se utilicen para definir la línea base.

If leading or trailing edge se utiliza junto a Baseline Preference para determinar si tiene lugar una caída a la línea base o una tangente de principio a fin en un pico. El parámetro es una medida de la diferencia en amplitud entre los puntos inicio/fin de un pico expresada como un porcentaje de la altura total del pico.

Baseline Preference se utiliza junto a If leading or trailing edge para provocar una caída de la línea base o una tangente de inicio a fin de un pico.

Minimum peak area (área de pico mínima) es el umbral de área. Para análisis de compuestos objetivo.

Peak location, (posición del pico), se puede seleccionar si el tiempo de retención aparecerá en la cima del pico o en el centro (centro del área efectiva).La posición por defecto es el máximo.

Número máximo de picos a reportar. El rango va de 1 a 250

Integrador de la ChemStation


El panel para editar acontecimientos de integración se utiliza para optimizar la integración de la ChemStation y grabar cambios para uso posterior en cuantificación.Los datos del cuadro de diálogo especifican precisamente cómo el integrador de la interpreta los datos iniciales recogidos, durante el análisis. Identifica los compuestos de una muestra a partir de los tiempos de retención de los picos integrados y calcula la cantidad de los mismos a partir del área bajo los picos. La integración puede realizarse con los eventos por defecto, pero la mayoría de las muestras requieren eventos adicionales para optimizar el reconocimiento de picos y la definición de los puntos de la línea base.De todos los parámetros de integración, el Umbral y la Anchura de Pico controlan la detección de picos. Si estos parámetros no están ajustados correctamente, los picos de interés no se detectarán. Todos los demás parámetros controlan como se integra el pico tras la detección del mismo.

Los eventos iniciales no se pueden borrar de la tabla de eventos. Se describen a continuación:

Initial Area Reject: los picos que tienen un área inferior a este número no se almacenan, ni se utilizan en cálculos ni se incluyen en el informe.

Initial Peak Width: la anchura de pico es la anchura completa del pico a media altura. Este parámetro informa al integrador sobre las anchuras iniciales de pico a esperar. El rango está comprendido entre 0 o 0,001 y 100,0 (en minutos). El valor por defecto del sistema es 0,02. Se establece un rango aceptable para picos desde aproximadamente un tercio hasta tres veces el dato de anchura inicial del pico.


Initial Threshold: determina la sensibilidad inicial del integrador. El rango es de -12,0 a 25,0.

Shoulder Detection: los hombros, a menudo aparecen cuando dos (o más) picos están tan próximos que no existen espacios entre ellos.Pureza de Pico

Impuro

Puro

Esta función nos permite detectar picos superpuestos, esto con la finalidad de evitar errores en el momento de la búsqueda o el análisis cuantitativo. Un pico debe tener las siguientes características:

1. Cargue el fichero de datos.2. Integre el cromatograma.3. Seleccione View / Review Peak Purity en el menú.4. Realice un barrido en la pantalla Peak Purity en busca de picos con componentes múltiples.


Búsqueda de librerías en la ChemStation

La búsqueda en las librerías puede ser incorrecta debido a la coincidencia con espectros desconocidos, pero esta información no se debe dejar pasar desapercibida ya que sirve para poder localizar a que se deben esas coincidencias. Esta librería debe ser creada con espectros obtenidos en el mismo instrumento y las mismas condiciones.

¿Qué es una búsqueda en librería?

Es comparar un espectro desconocido con uno ubicado en la librería, esto tiene algunas limitantes como son:

Los resultados son insuficientes. Entradas de la librería correctas. El compuesto desconocido no este en la librería.

Factores que afectan a la búsqueda de librerías

Entre las principales están:

- Estrategia de búsqueda- La librería- Condición del espectro conocido

También existen factores que afectan a la coincidencia son:

· El tipo de instrumento utilizado para recoger los espectros desconocidos y de referencia.· Las condiciones experimentales utilizadas para recoger los espectros del compuesto desconocido y del de referencia.· Las opciones del espectro para corrección de fondo.· Parámetros de estrategia utilizados durante la búsqueda PBM.· La calidad de los espectros en la base de datos.

Pasos para crear una librería de usuario


Se pulsa Create Library en la caja de diálogo Edit PBM Library y aparece la caja Create New Library.

Se escribe un nombre (8 caracteres máximo) para la nueva librería.

La extensión .L se añade automáticamente. La librería se colocará en la ruta del directorio definida en el

fichero WIN.INI

Adición y edición de datos en la librería de usuario

En este apartado se puede incluir información sobre los compuestos, pero después de que se procesa el dato ya no puede ser modificado.

Conceptos de cuantificación de la ChemStationLa cuantificación en la ChemStation se lleva a cabo configurando una base de datos de cuantificación. Se recomienda realizar la configuración de la cuantificación para cada compuesto utilizando la respuesta de un ion (normalmente el pico base) para construir la curva de calibración y utilizando las respuestas de 2 o mas iones adicionales para cualificar la presencia de ese compuesto. Estos iones deben estar todos presentes y en las proporciones adecuadas. NOTA: ¡Es interesante saber que éste es el

proceso, tanto si los datos se adquirieron en modo Scan como SIM! La diferencia (en referencia a la cuantificación) entre los dos es la sensibilidad.


Paso 3: El ion cualificador eluye simultáneamente con la señal de referencia

Paso 2: Señal de referencia en la ventana del tiempo de retención

Paso 1: Los picos se integran en la ventana de señales extraídas

El proceso de cuantificación La curva de calibración es el elemento principal en el proceso de cuantificación.Para un compuesto en particular inyectado en un instrumento particular bajo condiciones experimentales estáticas, el gráfico de respuesta (área) frente a la cantidad inyectada se asemeja a la figura opuesta... Para cuantificar un compuesto desconocido, se ha de determinar el área del pico iónico cuantitativo obtenido a partir de la inyección del compuesto desconocido, y luego calcular la cantidad de compuesto utilizando la curva de calibración.NOTA: Si el compuesto, instrumento, o condiciones experimentales cambian, la curva de calibración puede no ser ya válida. Debería verificarse mediante la inyección de una mezcla de comprobación apropiada, o la curva de calibración debería actualizarse volviendo a analizar patrones válidos.

Patrones internos Patrón interno: compuesto(s) añadido(s) a todas las muestras y patrones previamente al análisis.Ventajas:

Puede corregir pequeñas variaciones en el volumen de inyección

Puede corregir pequeñas variaciones en la respuesta Puede corregir pequeñas variaciones en el tiempo de retención

Requisitos: Químicamente similar al analito(s). Que aún no esté presente en ninguna muestra


Debe(n) ser distinto(s) de los analitos en el tiempo de retención o en la señal.

La misma cantidad añadida a todas las muestras y patrones

El tipo de cuantificación se refiere al procedimiento para la manipulación de muestras y el procesado de datos para obtener resultados cuantitativos. Los dos tipos de cuantificación de la ChemStation son patrón externo y patrón interno.El método de patrón interno elimina las desventajas del método de patrón externo utilizando un componente añadido en cantidades conocidas para servir como factor de normalización. Este componente, el patrón interno, se añade a ambas muestras, de calibración y desconocida.


manual de operacion del cromatografo1

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