FACULTAD DE INGENIERIA EN INDUSTRIAS

ALIMENTARIAS

PRACTICA 3: ESTERILIZACION

CURSO : MICROBIOLOGÍA DE ALIMENTOS I

DOCENTE : Blga. M. Sc. ALCEADO ROMERO, Margarita

ALUMNOS : CALDAS CIERTO, Nelson

: ATAVILLOS DOMINGUEZ, Carmen.

: CALDERON PINO, Joseferik

I. INTRODUCCION

En el trabajo del laboratorio de Microbiología tienen importantísima

aplicación los procedimientos, técnicas y productos que suprimen o disminuyen la

vitalidad de los microorganismos patógenos. No existe un procedimiento de esterilización

y desinfección aplicable a todos los casos. El método de esterilización a emplearse debe

ser previamente valorado. Actualmente existen valores tabulados de tiempo de

exposición, temperatura y concentración de principios activos para los métodos de

esterilización más usados que nos permiten elegir el más adecuado para cada caso. En la

elección debe tenerse en cuenta también el uso posterior que le será dado (o no) al objeto

a esterilizar.

Se dice que un ambiente es estéril cuando se han eliminado todos los

microorganismos del mismo. La esterilidad se puede alcanzar usando procedimientos

físicos (calor, radiaciones), químicos o mecánicos (filtración). Sin embargo, los

procedimientos de esterilización son costosos y, en ciertas ocasiones, desaconsejables.

Por ejemplo, la esterilización completa de ciertos alimentos no es posible sin destruir sus

características nutritivas.

Se dice que un ambiente es aséptico cuando se han eliminado todos los

microorganismos patógenos. Un ambiente aséptico no tiene porqué ser estéril. La asepsia

también se puede conseguir por procedimientos físicos y químicos.

II. OBJETIVOS

Proporcionar al estudiante conocimientos básicos sobre los principales métodos

empleados en la esterilización, tanto para eliminación o destrucción completa de

microorganismos contenidos en objetos, productos, Etc.

Impartir conocimientos de cómo prevenir el ingreso de los microorganismos en un

ambiente determinado estéril.

III. REVISION BIBLIOGRAFICA

3.1. Esterilización.

La esterilización es un mecanismo por el que se consigue la muerte o

eliminación de todos los microorganismos vivos de una muestra, medio, superficie o

material de trabajo. Entre los microorganismos vivos se incluyen bacterias, hongos,

protistas, virus y sus formas de resistencia. Un objeto esterilizado está, por lo tanto,

totalmente libre de microorganismos incluyendo sus formas de resistencia.

3.2. El calor.

Todos los microorganismos son susceptibles, en distinto grado, a la acción

del calor. El calor provoca desnaturalización de proteínas, fusión y desorganización de las

membranas y/o procesos oxidativos irreversibles en los microorganismos. La efectividad

del calor como método de esterilización depende de: temperatura y tiempo de exposición.

El calor se propaga por tres métodos.

1. Por conducción.

Esta forma de propagación se da en los sólidos, cuando se aplica calor a

un objeto sólido, la zona donde absorbe calor se calienta y sus partículas adquieren

mayor movilidad que el resto del cuerpo y cada partícula transmite el calor a las partículas

vecinas, con el cual el calor acaba por propagarse por todo el objeto. Por ejemplo.

- Tenemos un vaso de leche que está muy caliente. En su interior se introduce una

cuchara. Al pasar un rato, si se toca la cuchara que se encuentra en su interior, se

nota que se va calentando cada vez más. Esta transferencia de calor se ha

producido desde una sustancia, que es la leche, hasta un cuerpo, que es la

cuchara.

2. Por convección

La propagación del calor por convección se da en los líquidos y en los

gases. Es decir cuando calentamos un líquido o un gas en un recipiente, las primeras

partículas en calentarse son las del fondo, por la que parte del líquido o del gas del fondo

se dilata y disminuye su densidad y al ocurrir esto esta parte del líquido o gas asciende

por el recipiente y la parte del líquido o gas que estaba encima baja para ocupar el

espacio dejado, originándose las llamadas corrientes de convección que van calentando

todas las sustancias del recipiente. Ejemplo:

3. Por radiación.

La radiación es la propagación del calor que tiene lugar sin el apoyo del

ningún medio material en forma de ondas.

Ejemplos:

- Las aguas del mar reciben la radiación del sol por eso logran evaporarse.

- Los panaderos, cuando van a sacar el pan del horno, están recibiendo el calor

procedente de este, por radiación..

3.3. métodos de esterilización.

3.4. Por calor.

3.4.1. Acción directa.

Se lleva al rojo el material de material como asas, agujas de diseminación,

etc.

3.4.2. Calor seco.

Como su nombre lo indica se transmite a través de un fluido seco caliente

(aire). La muerte de microorganismos en este caso se produce por deshidratación y por lo

tanto hay que llegar a temperaturas elevadas (160 °C) durante tiempos altos (1 hora o

más). En el laboratorio se utiliza el calor seco pare esterilizar material de vidrio y no para

medios de cultivo, pues las altas temperaturas usadas, pueden alterar la estructura (y la

disponibilidad) de nutrientes tales como proteínas, hidratos de carbono, etc.

3.4.3. Calor húmedo.

Este tipo de calor es más conveniente porque el vapor de agua difunde por

ósmosis a través de la membrana de los microorganismos, produciendo la muerte de los

mismos por coagulación de su protoplasma y no por deshidratación, como en el caso del

calor seco. Los diferentes métodos utilizados son:

3.4.3.1. Ebullición.

Se realiza a 100 °C, a esta temperatura se destruyen todas las células

vegetativas, esporos de hongos y levaduras, y la mayor parte de las esporas bacterianas.

Por lo tanto, cuando solo es necesario conseguir una esterilización “relativa”, puede

recurrirse a este método. En el caso que deban esterilizarse líquidos, estos se llevan

directamente a ebullición por tiempos variables, que dependen de diversos factores a

considerar. En caso de sólidos contenidos en recipientes, el material se sumerge en agua

hirviente por tiempos variables.

3.4.3.2. Vapor fluente.

Consiste en un tratamiento con vapor de agua a presión atmosférica (o sea

vapor saturado a 100 °C). Esta es una técnica útil para tratar sustancias que no admiten

calentamientos superiores a 100 °C sin perder alguna de sus propiedades. Los equipos

usados son sencillos y están constituidos por recipientes con falso fondo perforado, sobre

el cuál se acomoda el material a esterilizar. Este tratamiento se puede realizar también en

el autoclave, trabajando con la espita abierta. El tiempo de calentamiento depende del

material a tratar y su grado de contaminación.

3.4.3.3. Vapor discontinuo o tindalización.

Es cuando actúa el calor en forma fraccionada por tres días consecutivos a

100 °c durante 30 a cuarenta minutos.

En el primer día se destruirán las formas vegetativas, en el segundo día las

formas más activas germinadas de las esporas y en el tercer día las formas espatuladas.

Mediante este método se esterilizan: sustancias orgánicas que sufren descomposición a

altas temperaturas, los aparatos de Arnold y de Coch son muy recomendados.

3.4.3.4. Vapor de agua saturada a presión.

Normalmente se realiza en el laboratorio la esterilización de medios de

cultivo en un equipo denominado autoclave. Las condiciones de tiempo y temperatura

dependen de la naturaleza del medio. Cabe destacar que a menudo la esterilización

presenta dos aspectos a veces incompatibles, se quiere por un lado destruir todos los

microorganismos presentes y por el otro evitar la alteración de los nutrientes. En realidad,

el calor puede provocar la desnaturalización de vitaminas y otros factores de desarrollo, la

separación de azufre coloidal (Cisterna, por ejemplo), caramelización de azúcares, etc.

Por lo tanto se deben considerar para cada caso en particular las variables de la

esterilización (esto es temperatura y tiempo).

El autoclave es el aparato más comúnmente utilizado en los laboratorios

para esterilizar cultivos y soluciones que no formen emulsiones con el agua y que no se

desnaturalicen a temperaturas mayores a 100 °C. Una temperatura de 121 °C (una

atmósfera de sobrepresión) con un tiempo de exposición mayor a 15 minutos sirve para

destruir organismos formadores de esporas.

3.5. Filtración.

La esterilización por filtración se logra por el paso de un líquido o un gas a

través de un material capaz de retener los microorganismos presentes. La esterilización

por filtración se emplea para materiales sensibles al calor, tales como ciertos medios de

cultivo, azúcares, soluciones de antibióticos y otros medicamentos, etc.

Tipos de filtros:

1.- Filtros profundos o Filtros de profundidad: Consisten de un material fibroso o granular

prensado, plegado, activado, o pegado dentro de los canales de flujo. En este tipo de

filtros la retención de las partículas se produce por una combinación de absorción y de

retención mecánica en la matriz.

2.- Membranas filtrantes: Tienen una estructura continua, y la retención se debe

principalmente al tamaño de la partícula. Partículas más pequeñas al tamaño del poro

quedan retenidas en la matriza del filtro debido a efectos electrostáticos.

3.- Filtros de huella de nucleación (Nucleoporo): Son películas muy delgadas de

policarbonato que son perforadas por un tratamiento conjunto con radiación y sustancias

químicas. Son filtros con orificios muy regulares que atraviesan la membrana

verticalmente. Funcionan como tamices, evitando el paso de toda partícula con un tamaño

mayor al del poro.

3.6. Centrifugación.

La centrifugación es una técnica de separación de sólidos o limpieza de

líquidos alternativa a las de clarificación por encolado, o a las de filtración descritas en

capítulos precedentes; utilizando en este caso una operación física, donde se somete al

líquido a limpiar a la fuerza de la gravedad multiplicada por valores muy elevados, donde

casi instantáneamente se produce la sedimentación y separación de los sólidos

contenidos en la fase líquida. Los primeros estudios proceden del año 1928, aunque su

gran desarrollo en la enología viene a partir de los años cincuenta, donde se consigue que

las máquinas funciones en total ausencia de aire, presentando en la actualidad un campo

de gran interés para la industria alimentaria.

3.7. Radiación.

3.7.1. radiación ultravioleta.

La radiación ultravioleta produce una disminución exponencial en el número

de células vegetativas o de esporas vivas con el tiempo de irradiación. Por tanto se

pueden calcular los valores D para la irradiación. Existe una falta de información precisa

sobre la susceptibilidad de las diferentes especies microbianas a la radiación U.V.:

diferentes cepas pueden tener una resistencia distinta. El mayor valor del tratamiento con

radiaciones U.V. Se encuentra en el saneamiento del aire, aunque también pueden

aplicarse para esterilizar superficies de alimentos o para el equipo de los manipuladores

de alimentos.

3.7.2. radiación ionizante.

• La radiación ionizante es altamente letal, puede ajustarse su dosis para producir

efectos pasteurizantes o esterilizantes y su poder de penetración es uniforme.

• Es letal por destrucción de moléculas vitales de los microorganismos, esto lo

consigue sin producción de calor, por lo que los alimentos se conservan frescos. La

mayoría de los daños son a nivel ADN.

• La sensibilidad a la radiación de los microorganismos difiere según las especies e

incluso según las cepas, aunque las diferencias de resistencia entre cepas de una

misma especie son generalmente lo suficientemente pequeñas para no tenerlas en

cuenta a efectos prácticos. • Las bacterias Gram-negativas son generalmente más

sensibles a la irradiación que las Gram-positivas y las esporas aún más resistente.

• En general la resistencia a la radiación de los hongos es del mismo orden que la

de las formas vegetativas bacterianas. Los virus son aún más resistentes que las

bacterias a la radiación.

3.7.3. Rayos gamma.

Las radiaciones gamma tienen mucha energía y son emitidas por ciertos

isótopos radiactivos como es el Co60 pero son difíciles de controlar ya que este isótopo

emite constantemente los rayos gamma en todas direcciones. Estos rayos gamma

pueden penetrar los materiales por lo que un producto se puede empaquetar primero y

después esterilizar.

3.7.4. Rayos catódicos (Radiación con haz de electrones):

Se usan para esterilizar material quirúrgico, medicamentos y otros

materiales. Una ventaja es que el material se puede esterilizar después de empaquetado

(ya que éstas radiaciones penetran las envolturas) y a la temperatura ambiente.

3.8. Preparación para la limpieza y esterilización.

El material de vidrio nuevo o usado, debe limpiarse en forma tal que elimine toda huella

de suciedad original, se evita la así la precipitación y depósito de los agentes

limpiadores:

1. Conocer el grado de dureza del agua.

2. Usar detergentes que no tenga álcalis, que sean fácilmente solubles en agua

tibia, que no precipite en agua fría, tibia o caliente.

3. Que limpie con facilidad y no irrite las manos.

4. No usar detergentes o jabón no garantizado.

3.9. Limpieza del material de vidrio.

1. Hacer la limpieza tan pronto como sea posible

2. Recipientes con cultivos o materiales contaminados, esterilizar en autoclave

antes de lavar para ello quitarle los tapones, para pipetas, colocar estas en una

solución bacteriana, por 24 horas.

3. Hacer hervir material en una olla con agua y detergente por lo menos medio día.

4. Frotar el material con escobilla (tanto por dentro como por afuera), en algunos

casos remojar el material en detergente de un día para otro.

5. Enjuagar con agua de caño a chorro continuo hasta la eliminación del

detergente, continuar el enjuague con agua tibia y enjuagar 2 o 3 con agua

destilada.

6. Escurrir el material sobre soportes de madera o metal.

7. En casos de portaobjetos y cubreobjetos, pasarlos por alcohol al 70 % para su

desengrase.

3.10. Preparación del material después de la limpieza para su

esterilización

1. Confeccionar tapones de algodón para tubos y matraces, colocarlos cuando se

va a esterilizar.

2. Proteger el material de vidrio con papel o con recipientes de metal como en el

caso para pipetas y placas de Petri.

IV. MATERIALES Y MÉTODOS.

4.1. preparación previa del material de vidrio para su esterilización.

4.2.1. Materiales.

materiales de vidrio como: pipetas, placas de Petri, tubos de prueba, jeringas

descartables, balones, matraces, Erlenmeyer, kitasato, etc.

Papel kraft en tiras y en trozos rectangulares y cuadrados.

Algodón

Pedazo de papel engomado /pabilo

Lápiz de cera o plumón indeleble.

4.2.2. Procedimientos. (Para la Limpieza)

El material de vidrio lavar con detergente adecuado, con ayuda de escobillas o

esponjas frotar las superficies internas de los frascos y tubos.

Enjuagar con abundante agua hasta eliminar completamente el detergente.

Continuar el enjuague con agua destilada y dejarla escurrir en soportes

especiales. si es necesario hacer secar en el horno para luego ser envuelto para

la esterilización.

4.2. Preparación del material para la esterilización.

4.2.1 Preparación de tubos de prueba :

Hacer tapones de algodón y colocarlos en los tubos de prueba a esterilizar.

Hacer manojos de tubos taponados (en número de 10 a 12 tubos) sujetos con

pabilos, y cubrir por sus bordes con papel envolvente, asegurando el paquete con

pabilo, o papel engomado.

Ubicar los tubos en las canastillas para facilitar la esterilización.

4.2.2. Preparación de matraces, kitasato, frascos y probetas.

Después de su taponamientos cubrirlos aisladamente con un capuchón de papel

y amarrarlo con pabilo (para matraces, probetas) para frascos que tienen tapas,

retirar las tapas y colocarlos tapones de algodón.

En caso de kitasato , taponar la tabuladora con un poco de algodón y ponerlo un

capuchón de papel para luego amarrarlo con pabilo.

Rotular datos del material y la fecha de la esterilización en el papel.

4.2.3. Preparación de pipetas serológicos y volumétricas.

Colocar tapones de algodón a manera de filtros en las boquillas de pipetas.

Envolver las pipetas con papel kraft, deslizándolo en espiral sobre la superficie de

la pipeta, hasta la boquilla.

Rotular datos de la materia de las pipetas y fecha de la envoltura sobre el papel.

4.2.4. Preparación de las placas de Petri

Se pueden envolver aislamiento o en número de 2 o 3 placas de papel kraft

Colocar las placas en posición invertida, sobre el papel, y doblar las márgenes

del papel unos sobre otros a manera de cubrirlos.

Luego amarrarlo con pabilo o colocar una cinta engomada.

Poner, número de placas y fecha de esterilización.

4.3. Esterilización de material.

4.3.1. Materiales

Frascos o Erlenmeyer conteniendo caldo nutritivo

Dos tubos de prueba

Algodón para taponar

Gradillas metálicas

Papel kraft

Plumón indeleble o lápiz de cera

Autoclave/incubadora

4.3.2. Procedimiento

1. Distribuimos el medio de cultivo (caldo nutritivo) en dos Erlenmeyer

2. Se puso uno de los matraces en el autoclave para esterilizar el medio de cultivo.

Por 121 °c por 15 min a 15 libras de presión.

3. luego colocamos los 2 matraces en la estufa o incubadora (uno de ellos sin

autoclavar) donde permanecieron hasta el siguiente día .transcurrido ese tiempo

observamos la muestra.

V. RESULTADOS

VI. CONCLUCIONES.

Se concluyó que la esterilización mediante el autoclavado es muy eficaz en

donde se determinó que el caldo nutritivo, mediante el microscopio no encontramos

señal de microorganismos el medio se denominó estéril.

A diferencia del otro que no fue al autoclave presento el color turbio y con

crecimiento microbiano.

Se concluyó también que en cualquier medio donde nos encontramos hay

presencia de microorganismos. Mediante la muestra que no se llevó a autoclavar, donde

se encontró diversos tipos de microorganismos en el microscopio.

VII. BIBLIOGRAFÍA [1] Black, J. 1999. Microbiology Principles and Exploration. Fourth edition. John

Wiley& Son, Inc.

[2] Clavell, L.; Pedrique de Aulacio, M. 1992. Microbiología. Manual de Métodos

Generales (2da edición). Facultad de Farmacia. Universidad Central de

Venezuela.

[3] Murray, P. 1999. Manual of Clinical Microbiology. 7th edition. American

Society for Microbiology. Washington, DC.

[4] Standards of Sterilization. 2001. Monitoring the Sterilization Process. Online

Education.URL: http://education.sterra .com/c3/c3_monitoring.htm

Muestra(caldo

nutritivo en el

Erlenmeyer )

Observación

macroscópica

(24 horas)

Observación microscópica

(24 horas)

A

(autoclavado)

Se observó el caldo bien

trasparente y cristal

amarillo

Cuando se observó al

microscopio no se llegó a ver

nada estaba estéril.

B

(sin autoclavar)

La muestra se observó

muy turbio y crecimiento

de microorganismos

Se observó crecimiento

microbiano. De diversas

formas.

HORNO PARA SECADO Y ESTERILIZADO DEL MATERIAL

1. Temperatura y tiempo para secar material en este equipo.

A una temperatura de 50 ° c a un tiempo aproximadamente de 1 hora.

2. Materiales que se pueden esterilizar en este equipo.

Los materiales de vidrio en pírex, pipetas, vasos, matraces, placas, etc.

3. Temperatura y tiempo para esterilizar material en este equipo.

La temperatura necesaria para esterilizar los materiales en este equipo es de

170°c durante 2 horas aproximadamente.