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Algunas referencias en la historia de T. foetus AÑO Autor Primer diagnóstico en el mundo 1888 Kunstler (Francia) Descripción de la enfermedad 1929 Riedmüller, Drescher, Albein (Alemania) Primer diagnóstico en Argentina 1939 Rosembusch Relevamiento en Argentina (8.2%) 1940 Gelormini Diagnóstico, control y epidemiología 1960-1970 Roberts, Stoessel y Villar Fertilidad de los rodeos Nº de rodeos revisados % de rodeos Pos. a Tricho % de rodeos Pos. a Campy % de rodeos Pos. a ambas Baja 181 60 43 19 Desconocida 77 30 18 10

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  • Algunas referencias en la historia de T. foetus

    AÑO AutorPrimer diagnóstico en el mundo

    1888 Kunstler (Francia)

    Descripción de la enfermedad

    1929 Riedmüller, Drescher, Albein (Alemania)

    Primer diagnóstico en Argentina

    1939 Rosembusch

    Relevamiento en Argentina (8.2%)

    1940 Gelormini

    Diagnóstico, control y epidemiología

    1960-1970 Roberts, Stoessel y Villar

    Fertilidad de los rodeos

    Nº de rodeos revisados

    % de rodeos Pos. a Tricho

    % de rodeos Pos. a Campy

    % de rodeos Pos. a ambas

    Baja 181 60 43 19

    Desconocida 77 30 18 10

  • Tricomonosis bovina

    • Etiología: Tritrichomonas foetus• Afecta : Bovinos (Felinos -

    Porcinos-Equinos- Corzo)• Morfología: Eucariote flagelado,

    piriforme --- 8- 18µ x 5-10µ• Movimientos: ondulantes bruscos• Reproducción: asexual simple-

    División binaria• Serotipos: Belfast, Manley y

    Brisbane• Metabolismo: anaerobio

    aerotolerante

    Oxígeno Tiempo generacional

    0 % 3.5 hs10 % 26.8 hs20% Sin crec.

  • Métodos de diagnóstico Tritrichomonas foetus

    Cultivo ELISA PCR, qPCR

  • -5

    0

    5

    10

    15

    20

    25

    30

    1 2 3 4 5M

    illon

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    Lab 2 Lab 3 Lab 4 Lab 5Lab 6 Lab 7 Lab 8 Lab 9Lab 10 Lab 15 Lab 17

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    16

    1 2 3 4 5

    Mill

    ones

    Lab 1 Lab 11 Lab 12Lab 13 Lab 16 Lab 17 b

    Ensayo Nº1: evaluación del operador y especificidad del conjugado para detectar especies de Campylobacter fetus

    A B C D E F G H I J K L M N Resultado

    RC RL RC RL RC RL RC RL RC RL RC RL RC RL RC RL RC RL RC RL RC RL RC RL RC RL RC RL

    L1 N N N N P P N N N N P N N N N P P P P P P P P P P P 14/14

    L2 N N N P P N N P N N N N N P N P P P P P N N P P P P 12/14

    L3 N N P P N N N N P P P P P P N N N N N N N P P P P N 14/14

    L5 P P N N P P P P N N N N N P P N N N N N N N P P P P 14/14

    L6 P P P N N N N N N P P P P P P N N N N N N P P P P P P 14/14

    L7 P N N N N P N N P P P P P P N N P P P P N N N N P P 14/14

    L8 P P P P P P P P N N P P N N N N N N N P P N N N N N 14/14

    L9 N N P P N N P P N N P P P P N N N N N N P P P P N N 14/14

    L10 N N P P N N N N P P P P P P P P P P P P N N N N N N 14/14

    L11 P P P P P P N N P N N P N N P P P P N N N N N N N N 14/14

    L12 P P N P P N N N P P N N N N P P N N N N N N P P P P 12/14

    L13 N N N N N N P P N N P P N N P P P P P P P P P P N N 14/14

    L14 N N N N P P P N N N N P N N P P P P P P P P N N P P 14/14

    L15 P P N N N N P P N N N P P P P N N N P P N N N N P P 14/14

    L16 P P P N N N P P P P P P P P P P P P N N N N N N N N 13/14 L17 P P N N P P N N N N N P P N N N N N P P P P N N P P 14/14 L18 P P N N N N N N P P P N N N N P N N P P P P P P P P 14/14

    Estandarización de las técnicaspara el diagnóstico de Tritrico y Campy en laboratorios de red

  • El diagnóstico por cultivo

    Especificidad

  • Resultados PCR en muestras positivas a cultivo de Tritrichomonas en Laboratorios en Red-2014

    Año 2014Muestras procesadas

    total pos T. foetus pos Tetra sp. S/detLab 1 15 3 (20 %) --- 12 (80%)Lab 2 7 5 (71%) --- 2 (29%)Lab 3 20 9 (45%) 5 (25%) 6 (30%)Lab 4 176 161 (91%) --- 15 (9%)Lab 5 42 9 (21%) 21 (50%) 12 (29%)Lab 6 2 2 (100%) --- ---Lab 7 54 25 (46%) --- 29 (54%)Total 316 214 (68%) 55 (17%) 47 (15%)

  • Campilobacteriosis Genital Bovina

    http://www.google.com.ar/url?sa=i&rct=j&q=&esrc=s&source=images&cd=&cad=rja&uact=8&ved=0ahUKEwjippDh7ILPAhVCgpAKHRthCMwQjRwIBw&url=http://generalidadesdelaganaderiabovina.blogspot.com/2015_05_01_archive.html&psig=AFQjCNH0qRz892-gv5fjUw_8UvUCYR5LEQ&ust=1473529498326046http://www.google.com.ar/url?sa=i&rct=j&q=&esrc=s&source=images&cd=&cad=rja&uact=8&ved=0ahUKEwjIjJf_uIzPAhVDQ5AKHUq8Aw8QjRwIBw&url=http://www.wider.es/casosclinicos/index.php/celulitis-producida-por-campylobacter-fetus-subespecie-fetus-caso-540/?print=print&psig=AFQjCNH_IlpGxo6ksf6rXQDmG2krChxtXQ&ust=1473858945659530http://www.google.com.ar/url?sa=i&rct=j&q=&esrc=s&source=images&cd=&cad=rja&uact=8&ved=0ahUKEwjippDh7ILPAhVCgpAKHRthCMwQjRwIBw&url=http://generalidadesdelaganaderiabovina.blogspot.com/2015_05_01_archive.html&psig=AFQjCNH0qRz892-gv5fjUw_8UvUCYR5LEQ&ust=1473529498326046http://www.google.com.ar/url?sa=i&rct=j&q=&esrc=s&source=images&cd=&cad=rja&uact=8&ved=0ahUKEwjIjJf_uIzPAhVDQ5AKHUq8Aw8QjRwIBw&url=http://www.wider.es/casosclinicos/index.php/celulitis-producida-por-campylobacter-fetus-subespecie-fetus-caso-540/?print=print&psig=AFQjCNH_IlpGxo6ksf6rXQDmG2krChxtXQ&ust=1473858945659530

  • Clasificación histórica y nomenclatura de subespecies de Campylobacter fetus

    1959 1968 1973Florent Elazhary Véron &

    ChantelainVibrio foetusveneralis

    Vibrio fetusveneralis

    C.fetus subsp. veneralis

    Vibrio fetusintermedius

    C. fetus subsp. veneralis biovarintermedius

    Vibrio foetusintestinalis

    Vibrio fetusintestinalis

    C. fetus subsp. fetus

    1913 – Mc Fadyen & Stockman – Vibrio fetusDe estómago de feto ovino abortado.

    1919 – Smith & Taylor – Vibrio fetusDe estómago de feto bovino abortado

  • Principal hospedador e importancia clínica de las subespecies de Campylobacter

    Especie Hospedador Enfermedad / o estado comensal

    C. fetus subespecie veneralis

    Bovino Campylobacteriosis Genital Bovina: infertilidad, muerte embrionaria temprana y ocacional aborto

    C. fetus subespecie fetus

    Ovino Campylobacteriosis Genital OvinaTormentas de abortos

    Bovino Abortos esporádicos

    Hombre Infecciones esporádicas en personas inmunocomprometidas

    Bovino/ Ovino Comensal en el tracto intestinal

  • Etiología: Campylobacter fetus.Afecta : bovinos, ovejas, humanosMorfología: bacterias Gram -

    0.5- 8µ x 0.2-0.5µCaracteristicas: formas curvadas, S o espiral.

    Generalmente 1 flagelo polarCrecimiento: Crecen a 37º C.

    MicroaerófilasEspecies: C. fetus subespecie fetus

    C. fetus subespecie venerealis

    MUESTRAS PARA DIAGNÓSTICO

    Esmegma prepucial obtenida mediante raspado

    Medios de transporte/cultivo: Lander y TTE

    -Cultivo: Baja sensibilidad: i) escasa viabilidad delgermen fuera del hospedador, ii) sensible a determinadosantibióticos; iii) gran sensibilidad a las fluctuaciones de Tª.Mala identificación: heces y comensales

    ESPECIE CatalasaH2S 25º 42º

    Gli1%

    C. f. venerealis + - + V -C. f. fetus + - + V +C. sputorum V + - + V

    Diagnóstico

  • Especificidad

    C. fetus subespecie veneralis C. fetus subespecie fetus

    Que subespecie estoy viendo?

  • Tubo Cant. de Bact. IFD PCR

    1 ++++++++ Positivo

    2 +++++++ Positivo

    3 ++++ Positivo

    4 40-50 x campo Positivo

    5 15-20 x campo Positivo

    6 2000 4-5 x campo Positivo

    7 1000 1 x campo Positivo

    8 500 c/ 4 campos 1 Positivo

    9 250 2-3 en total Positivo

    10 125 negativo Positivo

    11 62 negativo Positivo

    12 31 negativo Positivo

    13 15 negativo Positivo

    14 7 negativo Positivo

    15 negativo negativo Negativo

    Sensibilidad

    Cuantos microorganismos puedo detectar?

  • DIAGNÓSTICOTest Tipo de

    identificaciónVentajas Desventajas

    Inmuno-fluorescencia

    Fenotípica Fácil de realizarEconómicoRápido

    Sensibilidad baja,No diferencia de especies

    Cultivo Fenotípica Aislamiento de cepa para estudios genotípicos

    Equipos, tiempo, medios adecuados,contaminación

    PCR- Hum Genotípica Fácil de hacer, rápido, fácil interpretación, confiable y reproducible

    Equipamiento, contaminación, falsos positivos

    PCR- Van Bergen

    Genotípica Fácil de hacer, rápido, fácil interpretación, confiable y reproducible

    Equipamiento, contaminación, falsos positivos

    ELISA Genotípica Fácil de hacer, rápido, fácil interpretación

    Equipamiento y reactivos (monoclonales)

  • Recolección de muestras para diagnóstico en el macho

    • Lavaje• Hisopado• Raspaje• Aspiración seca

  • • Cantidad óptima de raspajes 3-4. Mínimo 2 negativos consecutivos.

    • Intervalos entre muestreos de 7-10 días.

    El muestreo y el diagnósticoCon las técnicas Tradicionales

  • https://www.youtube.com/watch?v=G-1StrWaHKA

    - VÍDEO DIVULGATIVO

    INTA - Técnicas de muestreo para el diagnóstico de enfermedades venéreas en bovinos

    https://www.youtube.com/watch?v=G-1StrWaHKAhttps://www.youtube.com/user/webinta

  • Aislamiento de Campylobacter en muestras prepuciales de toros

    Toma de muestras prepuciales de 570

    toros por el método del raspador.

    Se cultivaban aquellas que a la MO presentaban Bacterias móviles con morfología

    compatible. Apox. 161

    Tambien aquellos que resultaban

    positivos en PCR.72

  • Secuencia en el procesamiento de muestras

    Toma de muestras prepuciales en medio

    de thioglicolato

    Llegada al laboratorio > 24hs

    Cultivo 24hs a 37ºC y mantenimiento a Tº

    ambiente durante 4 días.

    Observación diaria en contraste de fase a

    400x

    Filtración y siembra de microorganismos móviles

    compatibles con Campy y PCR +

  • Procedimiento utilizado para el cultivo de muestras

  • Cultivo en Jarra

    congelacion

  • Identificación de aislados

    Inmunofluorescencia

    Maldi Tof

    qPCR

  • Identificación bacteriológica a partir de MALDI- Biotyper

    Bacteria + Matriz

    Cristaliza

    Se ioniza con un laser

    Las moléculas generadas se leen en

    un detector iones

  • Aislados de Muestras Prepuciales

    Bacterias móviles filtrables (0,65micras) ,

    micoaerófilas67Campylobacter

    60

    C. sputorum

    53

    C. hyointestinalis

    2

    C. Fetus

    5

    Arcobacter7

    A. cryaerophilus

    5A. butzleri

    219

    425

    29/161

    2351

  • ArcobacterInvestigation of bovine venereal campylobacteriosis in beef cow herds in New ZealandPor: McFadden, AM; Heuer, C; Jackson, R; et ál..NEW ZEALAND VETERINARY JOURNAL Volumen: 53 Número: 1 Páginas: 45-52 Fecha de publicación:FEB 2005Campylobacter fetus subsp venerealis was not cultured from any of the 54 bulls sampled. Four other species of Campylobacter and related organisms were cultured, Arcobacter cryaerophilus, Campylobacter jejuni, Campylobacter fetus subsp fetus and Helicobacter cinaedi.

    Campylobacter cryaerophila and Campylobacter fetus subspecies venerealis as a cause of serial abortions in two cattle herds in North-Rhine-WestfaliaPor: Parvanta, MFTIERARZTLICHE UMSCHAU Volumen: 54 Número: 7 Páginas: 364-+ Fecha de publicación: JUL 1999Tissues from aborted bovine fetuses from two cattle herds were examined microscopically and culturally for the presence of potential bacterial aborti-facients. An aetiological association between infection with Arcobacter cryaerophilus was established for the first time in one of the herds. This indicated the need to use placental tissue for the direct isolation of C. cryoaerophila

    First isolation in Chile of Arcobacter cryaerophilus from a bovine abortionPor: Fernandez, H; Rojas, X; Gajardo, TARCHIVOS DE MEDICINA VETERINARIA Volumen: 27 Número: 2 Páginas: 111-114 Fecha de publicación: 1995Context Sensitive Links Cerrar abstractCerrar abstractThe first isolation of Arcobacter cryaerophilus in Chile from the abomasum of an aborted bovine foetus is reported.

    Arcobacter

    http://apps.webofknowledge.com/full_record.do?product=UA&search_mode=GeneralSearch&qid=1&SID=X2seA6fSfz7juLkAGDH&page=1&doc=40http://apps.webofknowledge.com/full_record.do?product=UA&search_mode=GeneralSearch&qid=1&SID=X2seA6fSfz7juLkAGDH&page=2&doc=52&cacheurlFromRightClick=no

  • Isolation rates of Campylobacter fetus subsp venerealis from bovine preputial samples via passive filtration on nonselective medium versus selective medium, with and without transport médium (2013)Chaban, Bonnie; Guerra, Alvaro Garcia; Hendrick, Steven H.; et ál..AMERICAN JOURNAL OF VETERINARY RESEARCH, 74-8, 1066-1069

    Filtración Cultivo directo

    Agar sangre86%

    Agar Skirrow

    32%

    TEM 24 hsFiltraciónCultivo

    Agar sangre40%

    Agar Skirrow

    35%

    Pocos aislados de C. fetus veneralis

  • Desarrollo de una q-PCR para el diagnóstico conjunto de Tritrichomonas

    foetus y Campylobacter foetus veneralis en muestras prepuciales.

  • Ventajas de la q-PCR

    • La Q-PCR permite, empleando un fluorocromo de unión

    inespecífica (SYBR Green; Go Taq Green), identificar

    fragmentos amplificados de DNA concretos a partir de

    la temperatura de fusión ( Tm, melting temperature)

    • Es específica para el fragmento amplificado que se está

    buscando; y cuyos resultados son obtenidos a partir de la

    observación de la curva de disociación de las muestras de

    DNA analizadas.9

    • Ello permite, a diferencia de PCR convencional, prescindir

    del posterior empleo de técnicas de electroforesis para la

    visualización de los resultados de todas las muestras

    https://es.wikipedia.org/wiki/SYBR_Greenhttps://es.wikipedia.org/w/index.php?title=Temperatura_de_fusi%C3%B3n_(ADN)&action=edit&redlink=1https://es.wikipedia.org/w/index.php?title=Curva_de_disociaci%C3%B3n&action=edit&redlink=1https://es.wikipedia.org/wiki/PCR_en_tiempo_real#cite_note-Ririe1997-9https://es.wikipedia.org/wiki/Electroforesis

  • • Tb. esta técnica lleva a la obtención de

    resultados más rápidos, y/o en el

    menor gasto de reactivos empleados

    en las técnicas de electroforesis.

    • Permite el diagnóstico de ambas

    enfermedades es una única muestra.

    Ventajas de la q-PCR

  • Métodos

    Extracción Diseño de primers

    Fluoroforo

    • SybrGreen

    • Go- Taq

  • Resultados: Curvas de disociación de Trico y Campy

  • Resultados: Muestras con igual cantidad de ADN de Trico y Campy

  • Resultados: Muestras con diferencias de una dilución base 10.

  • Resultados: Muestras con diferencia de dos diluciónes base 10.

  • Test de concordancia para Campylobacter

    qPCR (+) (-) Marginal(+) 72 9 81(-) 1 141 142

    Marginal 73 150 223

    ACUERDO OBSERVADO 0,96ACUERDO ESPERADO 0,5472

    ÍNDICE KAPPA

    0,901 ( 0,841 , 0,961 )

    Medidas de concordancia - Kappa

    Muy buenaI.C 95%

    PCR

    Fuerza de la concordanciaERROR ESTÁNDAR

    0,031

  • Test de concordancia para Trichomonas foetus

    qPCR (+) (-) Marginal(+) 41 2 43(-) 3 176 179

    Marginal 44 178 222

    ACUERDO OBSERVADO 0,98ACUERDO ESPERADO 0,6849

    ÍNDICE KAPPA

    0,929 ( 0,867 , 0,990 )

    Medidas de concordancia - Kappa

    Muy buenaI.C 95%

    Cultivo

    Fuerza de la concordanciaERROR ESTÁNDAR

    0,032

  • Test de concordancia para Campylobacter y T. foetus

    qPCR (+) (-) Marginal(+) 3 0 3(-) 0 218 218

    Marginal 3 218 221

    ACUERDO OBSERVADO 1,00ACUERDO ESPERADO 0,9732

    ÍNDICE KAPPA

    1,000 ( 1,000 , 1,000 )

    Medidas de concordancia - Kappa

    Muy buenaI.C 95%

    PCR

    Fuerza de la concordanciaERROR ESTÁNDAR

    0,000

  • Valores CT promedios:

    • Muestras positivas a Campy(72) : 24.8

    • Muestras Positivas a Trico (41): 24.6

    • Muestras negativas: 37.7

    • Muestras Positivas a Trico y a Campy(5): 23.6

  • Especificidad Trichomonas

    Agente CT Resultado

    T. foetus 13 Positivo

    T. gallinarum 13 Positivo

    T. suis 14 Positivo

    T. mobilensis 26 Positivo

    Tetratrichomonas 35 NEGATIVA

  • Especificidad a Campylobacter:

    Campylobacter CT Resultado

    C. f. v. intermedius 11.8 Positivo

    C. fetus veneralis 13.2 Positivo

    C. fetus veneralis 12.5 Positivo

    C. fetus fetus NEG NEGATIVO

    C. fetus veneralis 12.8 Positivo

    C. fetus fetus 32.1 NEGATIVO

    C. fetus fetus 31.3 NEGATIVO

    C. Hyo Hyo 30.6 NC

    C. Hyo Law NEG NEGATIVO

    C. C. f. v. intermedius 12.8 Positivo

    • 53 cepas de Sputorum Todas NEGATIVAS

    • 2 cepas de C. hyo Negativas

  • Etapa 3. Reproducibilidad y solidez técnica Diagnóstico de T. foetus: qPCR versus Cultivo

    qPCR (+) (-) Marginal(+) 30 3 33(-) 9 1179 1188

    Marginal 39 1182 1221

    ACUERDO OBSERVADO 0,99ACUERDO ESPERADO 0,9428

    ÍNDICE KAPPA

    0,828 ( 0,732 , 0,925 )

    Medidas de concordancia - Kappa

    Muy buenaI.C 95%

    CULTIVO

    Fuerza de la concordanciaERROR ESTÁNDAR

    0,049

  • qPCR (+) (-) Marginal(+) 11 25 36(-) 15 1170 1185

    Marginal 26 1195 1221

    ACUERDO OBSERVADO 0,97ACUERDO ESPERADO 0,9505

    ÍNDICE KAPPA

    0,338 ( 0,137 , 0,540 ) DébilI.C 95%

    IF

    Fuerza de la concordanciaERROR ESTÁNDAR

    0,103

    Etapa 3. Reproducibilidad y solidez técnica Diagnóstico de C. fetus: qPCR versus IF

  • qPCR (+) (-) Marginal(+) 34 1 35(-) 2 1184 1186

    Marginal 36 1185 1221

    ACUERDO OBSERVADO 1,00ACUERDO ESPERADO 0,9435

    ÍNDICE KAPPA

    0,956 ( 0,907 , 1,006 ) Muy buenaI.C 95%

    PCR Abril

    Fuerza de la concordanciaERROR ESTÁNDAR

    0,025

    Etapa 3. Reproducibilidad y solidez técnica Diagnóstico de C. fetus: qPCR versus PCR

  • Muchas Gracias

    Muchas Gracias

    Algunas referencias en la historia de T. foetusNúmero de diapositiva 2Métodos de diagnóstico � Tritrichomonas foetusNúmero de diapositiva 4Número de diapositiva 5Número de diapositiva 6Resultados PCR en muestras positivas a cultivo de Tritrichomonas en Laboratorios en Red-2014Número de diapositiva 8Clasificación histórica y nomenclatura de subespecies de Campylobacter fetusPrincipal hospedador e importancia clínica de las subespecies de Campylobacter Número de diapositiva 11EspecificidadSensibilidadDIAGNÓSTICORecolección de muestras para diagnóstico en el machoEl muestreo y el diagnóstico�Con las técnicas TradicionalesNúmero de diapositiva 17Aislamiento de Campylobacter en muestras prepuciales de torosSecuencia en el procesamiento de muestrasProcedimiento utilizado para el cultivo de muestrasNúmero de diapositiva 21Número de diapositiva 22Número de diapositiva 23Identificación de aisladosIdentificación bacteriológica a partir de MALDI- BiotyperAislados de Muestras Prepuciales ArcobacterIsolation rates of Campylobacter fetus subsp venerealis from bovine preputial samples via passive filtration on nonselective medium versus selective medium, with and without transport médium (2013)�Chaban, Bonnie; Guerra, Alvaro Garcia; Hendrick, Steven H.; et ál..�AMERICAN JOURNAL OF VETERINARY RESEARCH, 74-8, 1066-1069 Número de diapositiva 29Ventajas de la q-PCRVentajas de la q-PCRMétodosResultados: Curvas de disociación de Trico y Campy Resultados: Muestras con igual cantidad de ADN de Trico y CampyResultados: Muestras con diferencias de una dilución base 10. Resultados: Muestras con diferencia de dos diluciónes base 10.Test de concordancia para CampylobacterTest de concordancia para Trichomonas foetusTest de concordancia para Campylobacter y T. foetusValores CT promedios: Especificidad TrichomonasEspecificidad a Campylobacter:Etapa 3. Reproducibilidad y solidez técnica �Diagnóstico de T. foetus: qPCR versus CultivoEtapa 3. Reproducibilidad y solidez técnica �Diagnóstico de C. fetus: qPCR versus IFEtapa 3. Reproducibilidad y solidez técnica �Diagnóstico de C. fetus: qPCR versus PCRMuchas Gracias