instituto de parasitología y biomedicina lópez-neyra · 2 finalmente quisiera mencionar que...

MEMORIA CIENTÍFICA 1997/1999

Instituto de Parasitologíay

Biomedicina "López-Neyra"

C/ Ventanilla , 11 - 18001 Granada, España.Teléfono: (3458) 203802 - Fax: (3458) 203323

Coordinación Editorial: Luís Miguel Ruíz Pérez Dolores González Pacanowska

Diseño y maquetación: Jose Manuel Almarza Rodríguez Manuel Hidalgo Fernández Emilio J. Castro Bolívar

INTRODUCCIÓN ........................................................................................................................................................................ 1

DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA Y FARMACOLOGÍA MOLECULAR ................................................................... 3

GENES ABC EN PROTOZOOS PARÁSITOS ............................................................................................................................. 4

ANÁLISIS FUNCIONAL Y ESTRUCTURAL DE PROTEÍNAS ENZIMÁTICAS DEL METABOLISMO

DE PIRIMIDAS Y MECANISMOS MOLECULARES DE RESISTENCIA ............................................................................. 14

IMPACTO DE LAS ENFERMEDADES PROTOZOARIAS. ESTRATEGIAS EN EL DISEÑO

RACIONAL DE FÁRMACOS ................................................................................................................................................... 19

DEPARTAMENTO DE BIOLOGÍA MOLECULAR ............................................................................................................. 26

INACTIVACIÓN GÉNICA MEDIADA POR RNAs INHIBIDORES CARACTERIZACIÓN Y

OPTIMIZACIÓN DE RNAs CATALÍTICOS ............................................................................................................................ 27

BIOLOGÍA MOLECULAR Y CELULAR DE TRYPANOSOMA CRUZI ................................................................................ 32

ENFERMEDAD DE CHAGAS: IDENTIFICACIÓN DE ANTÍGENOS DEL PARÁSITO T. CRUZI

Y MECANISMOS MOLECULARES DE REGULACIÓN DE LA EXPRESIÓN GÉNICA, EN

UN CONTEXTO DE INTERÉS BIOSANITARIO ..................................................................................................................... 34

CÉLULAS INMORTALES Y FORMACIÓN DE PATRÓN DURANTE OOGÉNESIS EN DROSOPHILA .......................... 43

DEPARTAMENTO DE BIOLOGÍA CELULAR E INMUNOLOGÍA ................................................................................. 46

INMUNOPATOLOGÍA EN LA MALARIA, MIMETISMO MOLECULAR, E INTERLEUQUINA-2 .................................. 47

REGULACIÓN DE LA APOPTOSIS EN CÉLULAS NORMALES Y TUMORALES ............................................................ 51

BASES MOLECULARES DE LAS ENFERMEDADES AUTOINMUNES ............................................................................. 59

MECANISMOS DE TRANSMISIÓN DE SEÑALES DE ACTIVACIÓN POR RECEPTORES DE MEMBRANA .............. 63

SEMINARIOS ............................................................................................................................................................................ 68

RESUMEN DE DATOS ECONOMICOS ................................................................................................................................ 78

PERSONAL DE SERVICIOS ................................................................................................................................................... 79

TABLA DE CONTENIDOS

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El Instituto de Parasitología y Biomedicina “López-Neyra”(IPBLN) perteneciente al Consejo Superior de Investigaciones Cien-tíficas está dedicado específicamente a la investigación en el cam-po de las ciencias biomédicas. Los áreas de investigación en cursoabarcan temáticas diversas en el campo de la inmunología, biolo-gía molecular y celular y enfermedades infecciosas. Desde su crea-ción como Instituto Nacional de Parasitología, ha evolucionadohacia un Instituto de investigaciones de contenido mas amplio,moderno, bien equipado y que aborda cuestiones diversas de ca-rácter tanto básico como aplicado. En el momento actual cuentacon tres Departamentos, once grupos de investigación y una tra-yectoria ascendente en lo que se refiere a producción científica ycaptación de recursos.

Los fines del Centro se encuadran dentro del estudio de proce-sos y organismos de interés biomédico con especial incidencia entemas relacionados con enfermedades de importancia sanitariamundial. El desarrollo de nuevos compuestos y herramientas parael tratamiento de enfermedades, la creación de nuevos sistemas dediagnóstico las bases moleculares de procesos patológicos talescomo el cáncer o enfermedades infecciosas e inmunes son algunosde los aspectos que aquí se recogen. El IPBLN ofrece un gran po-tencial en el campo de las investigaciones biomédicas y es su de-seo el interaccionar de una manera más significativa con el sectorprivado. El Centro también cumple una importante funciónformativa colaborando en la enseñanza de Cursos de Especializa-ción, Programas de Doctorado y acogiendo múltiple estudiantes detercer ciclo que realizan aquí su Tesis Doctoral. Es de destacar elambiente de colaboración con otros países que se refleja en la par-ticipación de investigadores del centro en redes y proyectos inter-nacionales siendo especialmente significativa la colaboración conpaíses europeos y con latinoamérica.

Debe señalarse la labor desarrollada por los servicios centralesdel Instituto no sólo estando a disposición de los investigadores delpropio centro sino de la comunidad científica en general. El servi-cio de secuenciación, síntesis de oligonucleótidos, cultivos celula-res e informática merecen una mención especial sin dejar de dedi-car un particular reconocimiento a aquellas personas cuya labordiaria contribuye al funcionamiento y desarrollo del centro y a queocupe un lugar importante en el contexto de la investigaciónbiomédica internacional.

The Institute of Parasitology and Biomedicine “López-Neyra”(IPBLN) forms part of the Consejo Superior de InvestigacionesCientíficas and its activity is specifically devoted to research in thearea of biomedical sciences. The fields of research cover a widerange of issues concerning immunology, cell biology, molecularbiology, and specific aspects related to infectious diseases. Sincethe foundation nearly forty years ago of the centre as the NationalInstitute of Parasitology, the IPBLN has broadened its spectrum ofresearch projects and now constitutes a modern, well-equipped in-stitution involved in both basic and applied research. At present,there are three departments that bring together a total of elevengroups with an increasing capability for scientific production andresource acquisition.

The objectives of the research activity include processes andorganisms of biomedical interest with a special incidence in dis-eases of world-wide impact. The development of new compoundsand tools for the treatment of infectious diseases, the design of newprocedures for diagnostic and the understanding of the molecularbases of diseases are all important goals. The IPBLN offers a greatpotential although a more significant interaction with private en-terprises would be desirable. The centre also fulfils an importantteaching role participating in special courses, postgraduate coursesand accommodating many students. An atmosphere of mutual col-laboration and interaction with other countries is reflected by theparticipation of scientists in international networks and projects.The relationship with Latin-American and European countries isalso noteworthy.

The services provided by the central facilities aid enormouslynot only the personnel of the Institute itself but also have been madeavailable to the general scientific community. The facilities of DNAsequencing, oligonucleotide synthesis, cell culture and computerscience are worth mentioning although the dedication and work ofall those that contribute towards the well-functioning and develop-ment of the Institute should be acknowledged.

Finally I would like to highlight that although the lack of spacehas been a constraint for the development of the Institute duringthe past few years, the recent establishment of a Health ScienceCampus in the city of Granada where the building of a new insti-tute is foreseen, is a future project that bestows new expectations to

Introducción

INTRODUCCIÓN

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Finalmente quisiera mencionar que aunque la falta de espacioha sido una constante en los últimos años, en estos momentos laconstrucción de un nuevo campus de ciencias de la salud en al ciu-dad de Granada prevé la creación de un nuevo edificio para elInstituto que constituye un proyecto de futuro que abre grandesperspectivas a los que aquí trabajamos. El traslado a un nuevo edi-ficio no solo implica la mejora de las instalaciones y condicionesde trabajo sino que plantea un abanico de posibilidades de activi-dad científica y de incorporación de nuevos investigadores que su-pone un estímulo enorme para el futuro desarrollo de este centroadecuando su actividad a lo que constituye una investigación devanguardia en el área de las ciencias biomédicas.

those who work in the IPBLN. The possibility of moving to newpremises not only implies an improvement of the working condi-tions and facilities but also provides a whole new range of poten-tial scientific activities and facilitates the recruitment of new scien-tists. A new building will allow for the eventual development of theInstitute whose future challenge will be the adjustment of its activ-ity to ensure its presence at the forefront of progress in the area ofbiomedical sciences.

Introducción

Dolores González Pacanowska Directora

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JEFE DEPARTAMENTO/DEPARTMENT HEAD

Francisco Gamarro Conde

INVESTIGADORES DE PLANTILLA/STAFF RESEARCH SCIENTISTS

Santiago Castanys CuelloDolores González Pacanowska

Luis M. Ruiz Pérez

INVESTIGADOR CONTRATADO/RESEARCH ASSOCIATE

Esther Fárez Vidal

BECARIOS PREDOCTORALES/PREDOCTORAL FELLOWS

Flora E. Arana FigueroaVíctor Bernier VillamorClaribel Gallego GarcíaFernando Hidalgo ZarcoRamón Hurtado GuerreroCarmen Jiménez Jiménez

Isabel Leal CortijoAdriana Parodi Talice

Javier Peña DíazF. Javier Pérez-Victoria Moreno de BarredaJosé M. Pérez-Victoria Moreno de Barreda

Carmenza Spadafora MejíaCristina Torres García

PERSONAL TÉCNICO/TECHNICAL ASSISTANTS

Aurora Constan GutiérrezPilar Navarro Cuesta

Departamento de Bioquímica y FarmacologíaMolecular

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L M ultidrug resistance is a major concern in medicine since itconstitutes a serious obstacle to successful chemotherapy againstdiseases such as those produced by protozoan parasites, infectionscaused by pathogenic fungi and cancer. In all of the above, thecells evades the cytotoxic effects of the therapy by pumping out thedrugs by means of overexpressed membrane proteins belonging tothe superfamily of ABC (ATP-binding cassette) transporters. Thesetransporters, include P-glycoproteins (Pgps), the product of themdr1 gene, and MRPs (multidrug resistance-associated protein),

a multirresistencia a fármacos constituye uno de los problemasque obstaculizan el éxito del tratamiento terapéutico en la luchacontra el cáncer, enfermedades producidas por protozoos parásitoso infecciones producidas por hongos patógenos. En todos estoscasos, las células evaden los efectos citotóxicos mediante la elimi-nación de las sustancias citotóxicas a través de unas proteínas so-bre-expresadas, principalmente en la membrana plasmática, perte-necientes a la superfamilia de transportadores ABC (ATP-BindingCassette). Estos transportadores se han descrito en células tumora-

FUNCIONALIDAD DE LOS GENES ABC EN LOS PROTOZOOS PARÁSITOS

LEISHMANIA Y TRYPANOSOMA CRUZI.FUNCTIONAL ROLE OF ABC GENES IN THE PROTOZOAN PARASITES

LEISHMANIA AND TRYPANOSOMA CRUZI.

Dpto. de Bioquímica y Farmacología Molecular

GENES ABC EN PROTOZOOS PARÁSITOSABC GENES IN PROTOZOAN PARASITES

JEFES DE GRUPO

GROUP LEADERS

Francisco Gamarro CondeSantiago Castanys Cuello

BECARIOSPREDOCTORALES

PREDOCTORAL FELLOWS

José M. Pérez-Victoria Moreno de BarredaFlora E. Arana FigueroaCristina Torres GarcíaCarmenza Spadafora MejíaAdriana Parodi TaliceF. Javier Pérez-Victoria Moreno de Barreda

PERSONAL TÉCNICO

TECHNICAL ASSISTANTSPilar Navarro Cuesta

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found in cancer cells exhibiting MDR (multidrug resistance) phe-notype. They are also present in protozoan parasites like Trypa-nosoma cruzi, responsible for Chagas'disease, in the Leishmaniaspecies, responsible for Leishmaniasis, as well as in Plasmodiumfalciparum responsible for Malaria. Also, they are present in thepathogenic fungi like Candida albicans, Saccharomyces cervisiaeand Schizosaccharomyces pombe, where ABC transporters arelarge polypeptides (140-190 kDa) with a common structural or-ganization composed of two homologous halves, each containinga cytosolic nucleotide-binding domain (NBD), responsible for ATPhydrolysis and a transmembrane domain (TM), involved in drugtransport. The number of predicted transmembrane a-helices var-ies from 4 to 8 for each half, as reported for MRP, whereas theinitially proposed value of 6 for Pgp is still a matter of debate.

The general objective of our project is the molecular and func-tional characterization of drug resistance mechanisms, and theinvolvement of ABC genes, especifically Pgp and MRP genes, indrug resistance in protozoan parasites.The functionality of ABCtransporters is being studied using parasites transfected with theabove mentioned genes, to determine their contribution to the re-sistance against conventional and experimental drugs. The mecha-nisms of Pgp and MRP-mediated drug transport, including sub-strate specificity, use of chemosensitizers, drug efflux and intrac-ellular distribution of fluorescent drugs and analogues, are beingstudied. To further unravel the biological role of parasites ABCgenes, null mutants will be studied by using the gene knock-outtechnique. The soluble nucleotide binding domains will beoverexpressed in E. coli and their mechanism of ATP binding andhydrolysis will be studied using nucleotide fluorescent analoguesand/or photoreactive derivatives. The effects of in vitro and invivo phosphorylation of the transporters will be studied.

les que presentan un fenotipo de multirresistencia a fármacos, tam-bién conocido como fenotipo MDR (de multidrug resistance), me-diado en unos casos por una proteína denominada glicoproteína-P(Pgp), producto del gen mdr1, y en otras ocasiones por otra proteí-na diferente, conocida como MRP (de multidrug resistance-associated protein). Estas proteínas también están presentes en losparásitos Trypanosoma cruzi, responsable de la enfermedad deChagas, Leishmania, responsable de la leishmaniasis y Plasmo-dium falciparum responsable de la Malaria. Igualmente, se handescrito en otros organismos como hongos (Candida albicans,Saccharomyces cerevisiae y Schizosaccharomyces pombe), en don-de confieren resistencia a antifúngicos y otras sustancias. Los trans-portadores ABC son grandes polipéptidos (entre 140-190 kDa), quepresentan como característica estructural el poseer dos mitadeshomólogas, cada una de ellas conteniendo un dominio de unión anucleótidos (NBD), responsable de la hidrólisis de ATP, y un domi-nio de transmembrana (TM) involucrado en el transporte de sus-tancias.

El objetivo principal de nuestro proyecto es la caracterizaciónmolecular y funcional de genes ABC, específicamente genes Pgp yMRP en protozoos parásitos. Los estudios funcionales se están lle-vando a cabo con parásitos transfectados con estos genes, al objetode analizar su capacidad de conferir resistencia a fármacos con-vencionales o experimentales. Estudiaremos el mecanismo de trans-porte mediado por la Pgp y MRP, la especificidad de sustrato, asícomo el efecto de revertidores sobre el eflujo de fármacos o sustra-tos fluorescentes. Paralelamente, la obtención de mutantes nulospara estos genes, permitirá definir más específicamente su papelfuncional. Mediante la expresión de los NBDs en E. coli, estamosanalizando el mecanismo de unión e hidrólisis del ATP. Mediantemutagénesis dirigida estudiaremos las consecuencias funcionalesde mutar aminoácidos localizados tanto en los dominios TM comoen los NBDs, al igual que investigaremos el efecto de la fosforila-ción in vitro e in vivo de estos transportadores.

Genes ABC en protozoos parásitos

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A NEW FAMILY OF ABC GENES .

Previous results have suggests that members of ABC super-family of transporter proteins are required for proper cholesteroltrafficking within cells. Recently, it has been characterized in mam-malian cells a new family of ABC transporters, called human ABC1(hABC1), a transporter of 2201 aminoacids coding for a proteinof 220 Kda, that is expressed in a variety of tissues with highestexpression levels in placenta, liver, lung, adrenal glands and fetaltissues. From a structural standpoint, ABC1 possesses all of thetypical features of ABC transporters, i.e. two symmetric halveseach with six transmembrane spanners and a nucleotide bindingdomain (NBD). In addition, a long charged region, reminiscent ofthe regulatory domain of CFTR but unique in that it is equippedwith an extra hydrophobic segment, links the two halves of themolecule. The expression of ABC1 transporters during embryonicdevelopment correlates with the occurence of programmed celldeath during the engulfment and clearance of apoptotic cells. Ithas been considered that this transporter molecule included inthe ABC1 family is involved in membrane lipid transport(phosphatidylserine) and is regulated by sterol levels. More re-cently, it has been described in Caenorhabditis elegans the CED-7 protein with sequence similarity to ABC1, that functions in theengulfment of cell corpses during programmed cell death.

The exposure of phosphatidylserine on the surfaces of dyingcells may act as a marker for their recognition by macrophages.However, the mechanism of cell corpse engulfment remains largelyunknown. ABC transporters can function as membrane flippasesto translocate lipids from one monolayer of the lipid bilayer toanother. Such translocation may result in the reorganization ofmembrane lipid composition and the redistribution or the modu-lation of certain cell-surface membrane proteins.

Our research group is involved in the molecular and func-tional characterization of homologues ABC1 genes in the proto-zoan parasites Leishmania and T. cruzi. We proposed that ABC1genes could be involved in the pathogenesis and the infectivity ofthese parasites and represent good chemotherapeutic targets inthe treatment of these parasitic diseases. ␣

UNA NUEVA FAMILIA DE TRANSPORTADORES ABC.

Estudios recientes han sugerido que algunos miembros de lasuperfamilia de transportadores ABC están implicados en el trans-porte de colesterol dentro de la célula. Muy recientemente, se hacaracterizado en mamíferos una nueva familia de transportadoresABC denominada ABC1. El ABC1 de humanos (ABC1h) posee untamaño de 2201 amino ácidos, codifica para una proteína de 220kDa y posee altos niveles de expresión en una variedad de tejidos,tales como placenta, hígado, pulmón, glándulas adrenales y tejidofetal. Estructuralmente, los transportadores ABC1 poseen todas lascaracterísticas de los transportadores ABC como es una simetría enlas dos mitades en las que se puede dividir el gen, cada mitad con 6dominios de transmembrana y un dominio de unión a nucleótidos.Además, poseen una larga región cargada, reminiscente del domi-nio regulador presente en el gen CFTR, con un segmento extrahidrofóbico que une las dos mitades de la proteína. Se ha observa-do que su expresión en tejidos embrionarios se correlaciona con laaparición y presencia de muerte celular programada, necesaria parael proceso de ingestión y eliminación de células apoptóticas. Se hasugerido que estas proteínas podrían estar implicadas en el trans-porte de lípidos (fosfatidilserina) a la membrana plasmática en unproceso que esta regulado por los niveles de esterol. Mas reciente-mente, se ha descrito en Caenorhabditis elegans la proteína CED-7 con alta homología al gen ABC1, e implicado en la ingestión decélulas apoptóticas durante el proceso de muerte celular programa-da. La exposición de fosfatidilserina en la superficie de células apop-tóticas dispara el proceso de fagocitosis por parte de los macrófa-gos. Se cree que los transportadores ABC1 podrían funcionar comoflipasas de membrana que translocarían lípidos (fosfatidilserina)desde una monocapa de la bicapa lipídica a otra. Esta translocaciónpodría originar un cambio en la reorganización de la composiciónlipídica de la membrana plasmática y la redistribución de ciertasproteínas de superficie.

Nuestro grupo de investigación, está actualmente involucradoen la caracterización molecular y funcional de genes ABC1 en losprotozoos parásitos Leishmania y T. cruzi. Creemos que estos genespodrían estar implicados en la patogénesis e infectividad de estosparásitos, constituyendo por consiguiente unas proteínas de graninterés como blanco terapéutico en el tratamiento de estas enfer-medades parasitarias.


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DRUG RESISTANCE IN PROTOZOAN PARASITES

Another general objective of the group is the molecular andfunctional characterization of drug resistance mechanisms in pro-tozoan parasites, selection of parasite genetic markers of predic-tive value for resistance in Leishmania to Glucantime and Am-photericin B. Glucantime is the drug of choice for the treatment ofleishmaniasis. The identification of potential candidate genes inthe Glucantime resistance mechanism is being determined. It willbe of interest to explore the possibility of using any of the genesthat associate with decreased drug sensitivity as genetic markersfor human isolates that did not respond to drug treatment. Also,we will study the involvement of thiol metabolism as a detoxifica-tion mechanisms. Glutathione (GSH) and trypanothione (T[SH]2)play an important role in the detoxification mechanism of proto-zoan parasites. In affirmative case, the amounts of GSH andT[SH]2 in wild-type and resistant parasites to Glucantime, willbe determined using the fluorescent thiol reagentmonobromobimane and then separated by HPLC. Also, the ex-pression of the enzymes involved in GSH and T[SH]2 synthesiswill be determined.

Other objective of the group is the study of Leishmania resis-tance mechanisms to Amphotericin B (AmB), an antileishmanialdrug of increasing use in the second line of drug treatment afterantimonials. It is now assumed that about 25% of visceral leish-maniasis in India are refractory to antimonials. The increase useof AmB can lead to severe clinical resistance and although AmBresistance is not yet described, the emergence is at risk since wewere able to obtain easily resistant lines to this drug by in vitrodrug pressure. Using an AmB L. donovani resistant line, obtainedby our colleage Prof. Philippe Loiseau (Faculté de Pharmacie,Université de Paris-Sud, France), we proposed to study the struc-tural and functional modifications in relation to drug detoxifica-tion mechanisms. Specifically, the involvement of ABC transport-ers (ABC1) in the modification of plasma membrane fluidity inthe resistant parasites. Firstly, the presence of extrachromosomalelements as a drug response will be studied. Secondly, we willdetermine the involvement of ABC transporters in the AmB resis-tance, using specific probes for: MDR-like, MRP-like and ABC1transporters. Recent studies suggested that one of the physiologi-cal role of these proteins is to catalyze the transport of cellular

RESISTENCIA A FÁRMACOS EN PROTOZOOS PARÁSITOS.

Otro objetivo de interés para nuestro grupo es la caracteriza-ción molecular de los mecanismos de resistencia a fármacos enprotozoos parásitos, al objeto de seleccionar marcadores de resis-tencia de valor predictivo, en casos de fallo terapéutico. Actual-mente, nuestro interés se centra en el estudio de los mecanismos deresistencia a fármacos en Leishmania, específicamente a Glucanti-me y Anfotericina B. El Glucantime es el fármaco de elección en eltratamiento de la leishmaniasis. La identificación de genes poten-cialmente candidatos a ser empleados como marcadores de resis-tencia a Glucantime, es de gran interés dado que permitirá el trata-miento alternativo en los casos de resistencia. Paralelamente, esta-mos realizando estudios de implicación de los tioles como meca-nismo de detoxificación celular en los parásitos resistentes. Tantoel Glutation (GSH) como el tripanotión (T[SH2]) pueden jugar unpapel importante en el proceso de resistencia a fármacos en parási-tos. En caso afirmativo, determinaremos tanto las cantidades deGSH como T[SH2] en parásitos salvajes y resistentes a Glucanti-me, como la expresión de los enzimas implicados en la síntesis deestos tioles.

Nuestro interés se extiende también hacia otro fármaco, Anfo-tericina B, empleado en la segunda línea de tratamiento de la leish-maniasis. Actualmente se sabe que un 25% de los casos de leish-maniasis visceral en India no responden al tratamiento con antimo-niales. Se ha incrementado significativamente el empleo de Anfo-tericina B en el tratamiento de la leishmaniasis y esto podría llevara la aparición de nuevos casos de resistencia a fármacos. Conside-ramos que es importante conocer los mecanismos de resistencia aAnfotericina B que desarrolla el parásito para buscar vías alternati-vas de tratamiento. Nuestro grupo dispone de una línea de Leish-mania donovani resistente a Anfotericina B, cedida por el Prof.Philippe Loiseau (Faculté de Pharmacie, Université de Paris-Sud,France). Estamos interesados en conocer el gen(s) implicados en laresistencia a Anfotericina B, presencia de elementos extracromo-somales y la implicación de los mecanismos de detoxificación ce-lular. Específicamente queremos estudiar la implicación de los trans-portadores ABC (ABC1) en la modificación de la permeabilidadde la membrana plasmática en los parásitos resistentes, así comootros transportadores ABC. Estudios recientes sugieren que unaposible función de estos transportadores es catalizar el transporte


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lipids (phosphatidylserine) across membranes. We have recentlyisolated in Leishmania an ABC1 gene and we are interested in theinvolvement of this gene in the modification of plasma membranefluidity as a drug response. In affirmative case, we will block thefunctionality of these proteins using chemosensitizers agents of ABCtransporters. Although the mechanism of action of AmB relies onits affinity for membrane ergosterol, which is responsible for trans-membrane channels letal for the parasite, we will study the involve-ment of thiols as a general detoxification mechanism in the AmBresistant parasites.

NEW REVERSAL AGENTS OF THE MULTIDRUG RESISTANCE PHENOTYPE

IN EUKARYOTIC CELLS

Numerous modulators or chemosensitizers are known to alterthe ability of ABC transporters (Pgp or MRP) to maintain subtoxicintracellular drug concentrations. Some examples include calcium-channel blockers such as verapamil, detergents such as Triton X-100, and immunosuppressants such as cyclosporin A. These com-pounds are known to reverse MDR in cancer cells by competingwith drug binding to Pgp. However, they are themselves effluxedand require high concentrations for an efficient and durable inhi-bition, which produces undesirable side-effects. It therefore remainsa need to develop new classes of modulators of Pgp and MRP, thatbare less toxicity to the host. Since ATPase activity is critical forthe transporter functioning, the specific inhibition of ATP bindingand hydrolysis within the NBDs would constitute a good tool torevert cell MDR phenotype. Flavonoids constitute a group of inter-esting polyphenolic compounds with a wide distribution in fruitand vegetables, with approximately one gram of mixed flavonoidspresent in the daily Western diet. Different biological activities havebeen described such as anti-allergic, anti-inflammatory, antiviral,antiproliferative, anticarcinogenic and antiparasitic activities.However, their effects as chemosensitizers of MDR phenotype inparasites and cancer cells remain unknown. Also, sesquiterpeneshave shown a wide range of biological activities such as cytotoxic,antitumor-promoting, immunosuppressive and more recently a re-versal activity of the multidrug resistance phenotype in cancer cells.

de lípidos a través de la membrana plasmática. Estamos interesa-dos en conocer si la sobre-expresión de ABC1 podría alterar la per-meabilidad de la membrana y llevar a una resistencia a Anfoterici-na B. En caso afirmativo, llevaríamos a cabo el bloqueo funcionalde este transportador mediante el empleo de quimiosensibilizado-res (compuestos naturales: flavonoides y sesquiterpenos). ␣

BÚSQUEDA DE NUEVOS REVERTIDORES DEL FENOTIPO DE

MULTIRRESISTENCIA A FÁRMACOS EN ORGANISMOS EUCARIOTAS.

Se ha descrito un gran número de moduladores o quimiosensi-bilizadores que alteran la capacidad de los transportadores ABC(Glicoproteína-P o MRP) para mantener concentraciones subtóxi-cas del fármaco, entre ellos destacan los bloqueadores de los cana-les de calcio verapamil, detergentes como Triton X-100 y agentesinmunosupresores como la Ciclosporina A. Estos compuestos ac-túan compitiendo por los sitios de unión a fármaco de estos trans-portadores. Sin embargo, presentan la desventaja de que se requie-ren altas concentraciones para conseguir un efecto eficaz y durade-ro, lo que conlleva a producir un significativo efecto citotóxico.Por consiguiente, se hace necesario la búsqueda racional de nuevassustancias revertidoras/ quimiosensibilizadoras del fenotipo MDRcon bajo efecto citotóxico. Dado que para la funcionalidad de estostransportadores es imprescindible la actividad ATPasa, la inhibi-ción específica de la unión e hidrólisis de ATP en el dominio deunión a nucleótidos (NBD), constituye una buena herramienta paratratar de revertir el fenotipo MDR en organismos eucariotas. Losflavonoides representan un grupo de compuestos polifenólicos conuna amplia distribución en frutas y vegetales. Se estima que aproxi-madamente en la dieta mediterránea consumimos diariamente 1gramo de estos compuestos, lo que nos da una idea de su baja toxi-cidad. Se ha descrito que estos compuestos poseen diferentes acti-vidades como anti-bacterianos, anti-virásicos, anti-alérgicos, anti-tumorales y más recientemente anti-parasitarios. Se desconoce suactividad y potencialidad como moduladores del fenotipo MDR enparásitos y células tumorales.


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The main focus of our research project is the use of the recom-binant NBDs from different protozoan parasites such as Leishma-nia, Trypanosoma cruzi and Plasmodium falciparum, as biologicalmaterial to screen series of modulators such as flavonoids, ses-quiterpenes and other natural products, for a rational drug-designof MDR reversal agents in eukaryotic cells. Also, this study will beextended to mammalian cells, specifically the line NIH-3T3-G185that over-express the human MDR1. This is a collaborative projectwith: Dr. Attilio Di Pietro (Institute de Biologie et Chimie desProteines, CNRS, Lyon, France) with the use of flavonoids as re-versal agents, and Prof. Angel Gutierrez Ravelo (InstitutoUniversitario de Bio-Orgánica "Antonio Gonzalez", Universidadde la Laguna, Tenerife, Canary Islands, Spain) with the use of ses-quiterpenes and other natural products as reversal agents. The invivo results with the C-terminal nucleotide-binding domain (NBD2)of Leishmania, show that some flavonoids (Kaempferide, Apige-nin, chalcones) bind with high affinity to the cytosolic NBD2 andare able to both increase the daunomycin accumulation in a L.tropica line overexpressing the transporter, and inhibit the para-site growth in presence of drug. Also, we have observed that the invitro ability of dihydro-b-agarofuran sesquiterpenes to inhibitgrowth of resistant parasites is not related to the binding to thecytosolic NBDs, suggesting the binding to the transmembrane do-mains of Leishmania Pgp-like transporter and blocking the dauno-mycin efflux. Further efforts to elucidate the specific target ofdihydro-b-agarofuran sesquiterpenes in the Pgp-like transporterand to determine if these compounds are transported, are neces-sary for a better knowledge of their mechanism of action.

It is necessary to extend the assays of reversal agents to a highernumber of natural compounds for a further structure-activity rela-tionships. The ability of the selected reversal agents, to reverse thefunctionality of ABC transporters from different eukaryotic cells,will give us information about the specificity of the above com-pounds. In vitro experiments to answer this questions are under-way. Also, these studies will be extended to MRP transfected mam-malian cells.

El objetivo principal del proyecto que actualmente estamos lle-vando a cabo en colaboración con el Dr. Attilio di Pietro (Institutede Biologie et Chimie des Proteines, CNRS, Lyon, Francia) y conel Prof. Angel Gutiérrez (Instituto Universitario de Bio-Orgánica"Antonio González", Universidad de la Laguna, Tenerife), se cen-tra por una parte en el empleo del dominio NBD de protozoos pará-sitos: Leishmania, Trypanosoma cruzi y Plasmodium falciparum,como material para llevar a cabo una selección racional de com-puestos (flavonoides y otros compuestos naturales) que se unancon gran afinidad a la proteína recombinante NBD, y que poste-riormente puedan ser empleados en estudios in vivo de reversióndel fenotipo de multirresistencia a fármacos en protozoos parási-tos. En el caso de células de mamíferos, los estudios los estamosrealizando en la línea celular NIH-3T3-G185 transfectada con elgen MDR1 humano. Hasta el momento, los estudios realizados conla proteína recombinante de Leishmania han demostrado que algu-nos flavonoides (DMA-Kaempferide, apigenina o chalconas) seunen con gran afinidad al NBD2 y revierten in vivo la acumulaciónde fármacos, llevando a una reversión del fenotipo MDR en estosparásitos.

Otros compuestos como los sesquiterpenos, se unen con bajaafinidad al NBD aunque sin embargo poseen un significativo efec-to revertidor del fenotipo MDR tanto en parásitos como en célulasde mamíferos, lo que sugiere que este tipo de compuestos se unen alos dominios de transmembrana compitiendo por el sitio de unión afármacos.


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MOLECULAR CHARACTERIZATION OF PROTEIN KINASES OF TRYPANOSOMA

CRUZI AS NEW DRUG TARGETS

The level of protein phosphorylation can determine the bio-logical activity of a protein, their subcellular localization or inter-action with DNA or other proteins. Protein kinases are the proteinsinvolved in the complex processes that control differentiation, me-tabolism, growth, gene expression, and other cellular processes.Two classes of protein kinases could be considered: serine/threo-nine kinases, able to phosphorylate serine/threonine residues, andtyrosine kinases that phosphorylate at this amino acid. Protein ki-nase CK1, also known as casein kinase CK1, is a family of multi-potential Ser/Thr protein kinases common to all eukaryotic cells.These enzymes have shown the ability to phosphorylate a wide va-riety of cellular proteins such as the nuclear protein p53, SV40, thecytosolic protein glycogen synthase and the associated membraneinsulin receptor. As described, in some cases CK1 phosphorylationchanges the biological properties of the protein substrates. CK1has been generally isolated as a monomer protein, with a widevariability in molecular mass (from 26 to 60 kDa), due to the pres-ence of many isoforms of the CK1 family coded by different genesthat differ in size. Five members of the CK1 family have been clonedfrom mammalian cells (isoforms a, b, g, d and e). In S. cerevisiaeand S. pombe, four different genes have been characterized. Oneof these isoforms, HRR25, has been characterized as a gene in-volved in DNA repair since mutations in this locus induced an in-creased susceptibility to DNA damaging agents.

In Xenopus laevis, the a isoform CK1 have been characterized.In Plasmodium falciparum, the CK1 isoform of 37 Kda appear tobe one of the smallest and perhaps the most primitive CK1 enzymesknow. Individual CK1 isoforms in lower eukaryotes are found inthe cytoplasm as well as in the nuclei and play essential roles in theregulation of cellular morphogenesis and DNA repair.

Our focus has been the molecular characterization and stagespecific expression of these protein kinases in T. cruzi, the etiologi-cal agent of Chagas' disease and the most important cause of heartdisease in many areas of Latin America. T. cruzi is a protozoanparasite with a complex life cycle, existing as extracellular flagel-lated epimastigotes and trypamostigotes in the invertebrate host,

CARACTERIZACIÓN MOLECULAR DE PROTEIN-KINASAS DE TRYPANOSOMA

CRUZI COMO BLANCO DE ACCIÓN DE FÁRMACOS.

El nivel de fosforilación de proteínas puede determinar la acti-vidad biológica de una proteína, su localización subcelular o suinteracción con ADN u otras proteínas. Las proteínas kinasas pue-den dividirse en dos clases: serina/treonina kinasas capaces de fos-forilar residuos serina/treonina, y las tirosina kinasas que fosfori-lan en este amino ácido. Las proteínas kinasas CK1, también cono-cidas como casein kinasa 1 es una familia de serina/treonina kina-sas presente en todos los organismos eucariotas, capaces de fosfo-rilar una amplia variedad de proteínas celulares tales como la pro-teína nuclear p53, SV40, la proteína citosólica glucógeno sintasa yel receptor de membrana para insulina. CK1 se ha aislado comouna proteína monomérica con una amplia variedad de tamañosmoleculares desde 26 a 60 kDa, debido a la presencia de diferentesisoformas codificadas por diferentes genes que difieren en tamaño.Se han caracterizado 5 genes de CK1 de células de mamíferos (iso-formas α, β, γ, δ y ε). En S. cerevisiae y S. pombe se han caracteri-zado 4 genes CK1, una de las isoformas HRR25 ha sido caracteri-zada como un gen implicado en reparación del ADN dado quemutaciones en este gen conllevan a un incremento en la susceptibi-lidad a los agentes que dañan al ADN.

En Plasmodium falciparum, la isoforma de CK1 de 37 kDarepresenta una de las proteínas kinasas mas pequeñas y primitivasdescritas hasta el momento. Las isoformas de CK1 de organismoseucariotas inferiores se localizan en el citoplasma así como en elnúcleo donde juegan un papel esencial en la regulación de morfo-génesis celular y reparación del ADN.

El interés de nuestro laboratorio se centra en la caracterizaciónmolecular y expresión estadio específica de esta protein kinasa deT. cruzi, agente etiológico de la enfermedad de Chagas y una de lascausas mas importantes de enfermedades cardíacas de Sudaméri-ca. T. cruzi es un protozoo parásito con un complejo ciclo de vidaque presenta unos estadios de su ciclo de vida en el hospedadorinvertebrado y vector (formas epimastigotas y tripomastigotas) yun estadio intracelular (formas amastigotas) en las células del hos-pedador vertebrado. A través de su ciclo de vida, el parásito en-cuentra un ambiente hostil y estresante que requiere una rápida res-


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and following transmission to a mammalian host, as intracellularaflagellated amastigotes in macrophages. Throughout its life cycle,the parasite encounter hostile, changing environments that requirerapid responses to ensure their survival. It is important for identi-fication of new drug targets in T. cruzi, to study basic cellular pro-cesses such as phosphorylation and dephosphorylation, one of themajor mechanism of signal transduction.


ORGANISMOS FINANCIADORES/FUNDING AGENCIES

- Bioquímica y Biología Molecular de la resistencia a fármacos en parásitos. Grupo de investigación Junta de Andalucía, CVI130. (1990-2000).

- Desarrollo de nuevos procedimientos de diagnóstico para evaluar la intervención de la glicoproteina-P en los fenómenos de resistenciaal tratamiento farmacológico en pacientes con leucemias agudas, síndrome de inmunodeficiencia adquirida y portadores de trasplantesorgánicos. CICYT-PETRI, PTR94-0125. (1995-1997).

- Funcionalidad de los genes glicoproteina-P en la resistencia a fármacos en protozoos parásitos. DGICYT, PB94-0051. (1995-1998)

- A network approach to research on leishmaniasis in Central America with emphasis on drug sensitivity in the fiel. European Commision.INCO-DC, IC18-CT96-0028. (1996-1998).

- Influencia de una familia de transportadores ABC en el ciclo de vida de Trypanosoma cruzi. DGICYT, PM95-0003. (1996-1999).

- Ayuda complementaria al proyecto Europeo: Creación de una red destinada al estudio de la leishmaniosis en Centroamérica con énfasisen el estudio in vivo de la sensibilidad a fármacos. DGESIC, UE97-0019. (1997-2000).

- Mecanismo molecular de la resistencia a Glucantime en Leishmania. DGESIC, PM97-0139. (1998-2001).

- Principios activos de naturaleza vegetal y sintética como potenciales revertidores de la resistencia a fármacos en las enfermedadesparasitarias. European Community. FEDER, IFD97-0747-CO4-03. (1999-2001).

- Los dominios de unión a ATP de transportadores ABC de Protozoos parásitos, como modelo en la búsqueda racional de compuestosrevertidores del fenotipo de multirresistencia a fármacos. DGESIC, PM98-0115. (1999-2001).

puesta por parte del parásito para asegurar su supervivencia. Con-sideramos de gran interés la identificación de nuevos blancos tera-péuticos en T. cruzi centrándonos en proteínas que regulan proce-sos celulares básicos como son la fosforilación y defosforilaciónde proteínas.

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TESIS DOCTORALES/DOCTORAL THESES

- Laura Barreiro Parrillo. Caracterización molecular del gen tcpgp1A de Trypanosoma cruzi asociado a la resistencia a fármacos.Universidad de Granada. 1997.

- Carlos Robello Porto. El locus H de Trypanosoma cruzi: caracterización de los genes pteridina reductasa 1 y TCP17. Universidad deGranada. 1998.

PUBLICACIONES/PUBLICATIONS

- Robello, C., Navarro, P., Castanys, S. and Gamarro, F. A pteridine reductase gene ptr1 contiguous to a P-glycoprotein confers resistanceto antifolates in Trypanosoma cruzi. Mol. Biochem. Parasitol. (1997). 90: 525-535.

- Gamarro, F. and Castanys, S. Mecanismo molecular de resistencia a farmacos en parasitos. ARS Pharmaceutica. (1997). 38: 137-149.

- Chiquero, M. J., Perez-Victoria, J. M., O'Valle, F., Gonzalez-Ros, J. M., del Moral, R. G., Ferragut, J. A., Castanys S. and Gamarro, F.Altered drug membrane permeability in a Multidrug-resistant Leishmania tropica line. Biochem. Pharmacol. (1998). 55: 131-139.

- Arana, F. E., Perez-Victoria, J. M., Repetto, Y., Morello, A., Castanys, S. and Gamarro, S. Involvement of thiol metabolism in theresistance to Glucantime in Leishmania tropica. Biochem. Pharmacol. (1998). 56: 1201-1208.

- Robello, C., Dallagiovanna, B., Engel, J. C., Gamarro, F. and Castanys, S. A new member of YER057c family is located contiguous toan ABC transporter of Trypanosoma cruzi. Gene. (1998). 220: 1-12.

- Perez-Victoria, J. M., Chiquero, M. J., Conseil, G., Dayan, G., Di Pietro, A., Barron, D., Castanys S. and Gamarro, F. Correlationbetween the affinity of flavonoids binding to cytosolic site of Leishmania tropica multidrug transporter and their efficiency to revertparasite resistance to daunomycin. Biochemistry. (1999). 38: 1736-1743.

- Perez-Victoria, J. M., Gonzalez, A. G., Tincusi, B. M., Jimenez, I. A., Bazzochi, I. L., Castanys, S., Gamarro, F. and Ravelo, A. G.Natural Sesquiterpenes as modulators of multidrug resistance phenotype in Leishmania tropica. J. Med. Chemistry. (1999). 42: 4388-4393.


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- Foulquie, M. R., Louassinin, M., Castanys, S., Gamarro, F., Benitez, R. and Adroher, F. J. Different catalytic activities of hexokinaseand phosphofructokinase in wild-type and Glucantime-resistant Leishmania promastigotes appears not causatively related to resistance.European J. Protistology. (1999). 35: 338-341.

- Torres, C., Barreiro, L., Dallagiovanna, B., Gamarro, F. and Castanys, S. Characterization of a new ATP-binding cassette transporter inTrypanosoma cruzi associated to a L1Tc retrotransposon. B.B.A. (1999).␣ 91329: 1-5.

- Robello, C., Dallagiovanna, B., Castanys, S., Gamarro, F. and Ehrlich, R. Trypanosoma cruzi: molecular cloning of a gene coding fora putative vacuolar protein. Experimental Parasitology. (1999). (In press).


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uestro grupo esta dedicado a la caracterización de la enzimabifuncional dihidrofolato reductasa-timidilato sintasa como blancode acción de fármacos en los géneros Leishmania y Trypanosomaasí como de los mecanismos moleculares de resistencia utilizadospor estos organismos frente a inhibidores específicos de estas enzi-mas.

La dihidrofolato reductasa (DHFR; EC 1.5.1.3) y la timidilatosintasa (TS;EC 2.1.1.45) son enzimas que junto con la serina hi-droximetil transferasa, son de importancia fundamental en el meta-bolismo intermediario de nucleotidos pirimidínicos y acidos

ANÁLISIS FUNCIONAL Y ESTRUCTURAL DE PROTEÍNAS ENZIMÁTICAS DEL

METABOLISMO DE PIRIMIDINAS Y MECANISMOS MOLECULARES DE

RESISTENCIA.

N ur group is dedicated to the characterization of the bifunc-tional enzyme dihydrofolate reductase-thymidylate synthase as adrug target in parasitic protozoa. We are also interested in themolecular mechanisms involved in resistance to inhibitors ofthymidylate biosynthesis.

Dihydrofolate reductase (DHFR; EC1.5.1.3) and thymidylatesynthase (TS;EC 2.1.1.45) are enzymes, that together with serinehydroxymethyl transferase, are of major importance in the inter-mediary metabolism of pyrimidine nucleotides and nucleic acids.

FUNCTIONAL AND STRUCTURAL ANALYSIS OF ENZYMATIC PROTEINS OF

PYRIMIDINE METABOLISM AND MOLECULAR MECHANISMS OF RESISTANCE

O


ANÁLISIS FUNCIONAL Y ESTRUCTURAL DE PROTEÍNAS ENZIMÁTICAS DELMETABOLISMO DE PIRIMIDINAS Y MECANISMOS MOLECULARES DE RESISTENCIA

FUNCTIONAL AND STRUCTURAL ANALYSIS OF ENZYMATIC PROTEINS OFPYRYMIDINE METABOLISM AND MOLECULAR MECHANISMS OF RESISTANCE

JEFE DE GRUPO

GROUP LEADERLuis M. Ruiz Pérez

BECARIOS

PREDOCTORALESPREDOCTORAL FELLOWS

Claribel Gallego GarcíaIsabel Leal Cortijo

PERSONAL TÉCNICO

TECHNICAL ASSISTANTSAurora Constan Gutiérrez

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Análisis funcional y estructural de proteínas enzimáticas del metabolismo de pirimidinas y mecanismos moleculares de resistencia

nucleicos, catalizando secuencialmente reacciones en la síntesis denovo de la timidina 5' monofosfato (dTMP). En este ciclo, elH

4folato ademas de actuar como transportador de grupos monocar-

bonados, sufre una oxidación y posterior reducción durante las re-acciones catalizadas por la TS y la DHFR respectivamente. El blo-queo de tanto la actividad DHFR como de la TS da lugar a unadisminución de dTMP en la celula y “muerte celular por falta detimina”. Estos dos enzimas estan siendo extensamente estudiadaspor su crucial papel en la síntesis de DNA y su importancia comoblanco de agentes quimioterapéuticos.

Dentro de los protozoos examinados hasta el momento, ambasactividades se presentan formando parte de una misma proteínabifuncional (DHFR-TS). La actividad DHFR y la TS estan presen-tes en la misma cadena polipeptídica y forman un dímero con dossubunidades de Mr= 100.000-240.000. A esta marcada diferenciaestructural se une el hecho de que los protozoos dependen de lasintesis “de novo” para satisfacer sus necesidades de folatos y porotra parte, carecen de ruta de síntesis de bases púricas lo que con-vierte a la síntesis del dTMP en la ruta mayoritaria de utilización defolato en estos organismos. La perturbación del metabolismo delfolato constituye por tanto un blanco de acción para la quimiotera-pia. De hecho inhibidores de la dihidrofolato reductasa como lapirimetamina o el trimetoprim se han utilizado con éxito en el tra-tamiento de algunos tipos de malaria. Los inhibidores de la DHFRimpiden la regeneracion de H

4folato a partir de H

2folato producto

generado en la sintesis de dTMP. Se han desarrollado numerososinhibidores de la DHFR, entre los más importantes se incluye almetotrexato (MTX) el trimetoprim y la pirimetamina.

Hemos clonado y caracterizado el gen para el enzima bifuncio-nal de Trypanosoma cruzi, y Leishmania tropica, Asimismo, he-mos desarrollado sistemas de expresión heterólogos para estos en-zimas y los de Leishmania major y Trypanosoma brucei que per-miten obtener miligramos de proteína homogénea lo que constitu-ye un material ideal para llevar a cabo los estudios de estructura/función e interacción con inhibidores.

La aproximación al desarrollo de inhibidores la llevamos a cabomediante: i) Diseño racional y ensayos de inhibidores basado enlos conocimientos estructurales de la DHFR-TS de Leishmaniamajor y el modelado de la DHFR de Trypanosoma. ii) Intentos de

These enzymes catalyze sequential reactions in the de novo synthe-sis of thymidine 5’ monophosphate (dTMP). In this cycle, H

4folate

not only acts as a methyl group donor but also undergoes oxidationand further reduction during the reactions catalyzed by TS andDHFR respectively. The blockage of either of these enzymes resultsin “thymineless death”. Bot enzymes are being extensively studieddue to their crucial role in DNA synthesis and their importance asdrug targets.

All protozoa examined so far exhibit a bifunctional enzyme con-taining both TS and DHFR activities. The activities are present onthe same polypeptide which forms a dimer of two subunits of iden-tical molecular weight Mr=100.000-200.000. Apart from this struc-tural difference, the fact that protozoa lack the enzymes requiredfor "de novo" purine biosynthesis together with the high require-ments of these organisms of preformed folates, makes the synthesisof dTMP a major target for chemotherapeutic intervention. Inhibi-tors of dihydrofolate reductase such as pyrimethamine have beenuse in the treatment of malaria and trimethoprim is an effectiveantibacterial agent. The development of selective inhibitors is basedon the existence of specific structural differences that may be ex-ploited in drug design. We have effective expression systems forproduction of recombinant protein for the bifunctional enzyme ofTrypanosoma cruzi, Trypanosoma brucei, Leishmania major as wellas the human enzyme. Production of the individual DHFR domainsis also available. The approach to drug design is being performedin three different ways i) Rationale design and inhibitor develop-ment based of the structural knowledge of the Leishmania majorenzyme and modelling studies of the enzyme of Trypanosoma cruzi.ii) crystallization of the bifunctional enzyme and individual DHFRdomain of Trypanosoma cruzi iii) combinatorial chemistry for in-hibitor development and massive screening against bifunctionalenymes.

Regarding drug resistance, we have isolated and character-ized a mutant DHFR-TS highly resistant to MTX which presents a30-fold increase in the overall K

i value for methotrexate a competi-

tive inhibitor of DHFR. The initial inhibitory complex seemed tobe unaffected by the alteration, but the subsequent slow-bindingstep of inhibition in the wild-type enzyme is absent. Cloning andsequencing of the altered gene revealed a single base change whichresulted in a M53R mutation in the DHFR domain.

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cristalización del enzima bifuncional de Trypanosoma cruzi. iii)Desarrollo mediante química combinatorial y ensayos masivos deinhibidores de la DHFR de Leishmania y Trypanosoma.

En relación con los mecanismos de resistencia, hemos aisladoy caracterizado un mutante de Leishmania major resistente a meto-trexato y que presenta una mutación en el enzima bifuncionalDHFR-TS. Concretamente, presenta un cambio en una metioninaen posición 53 por una Arg. La metionina 53 teoricamente formaparte de un bolsillo hidrofóbico que aloja al grupo p-aminobenzoilodel inhibidor. La medida de parámetros cinéticos del estado esta-cionario indicaron que esta mutación no produce cambios signifi-cativos en la Km de ninguno de los cuatro sustratos del enzima,pero disminuye unas cuatro veces la eficiencia catalítica de la DHFRmientras que la Kcat de la actividad TS no se modifica significati-vamente, igualmente, disminuye 30 veces la Ki para el MTX. Ade-más, como punto relevante de esta mutación parece que esta impli-cada en que se elimine el paso de unión lenta de la inhibición quese atribuye en la enzima salvaje a un cambio conformacional en elcomplejo enzima-MTX. Este gen en experimentos de transfecciónconfiere ademas una elevada resistencia a metotrexato en celulassalvajes permitiendo utilizar del gen DHFR-TS mutante comomarcador primario.

Hemos caracterizado en cepas de Leishmania resistentes aMTX, la aparición de distintos elementos extracromosómicos, asícomo la evolución de estos mecanismos de resistencia y los genespresentes en estos elementos, con el fin de identificar proteínasasociadas a la resistencia a MTX.

The alignment of the DHFR domain with monofunctionalDHFRs showed that Met-53 is equivalent to Leu-28 in E. coli andPhe-31 in human and mouse. These residues have been implicatedin the binding of antifolates. A L28R mutation has been character-ized in E. coli in strains resistant to trimethoprim (TMP) and sev-eral substitutions of Phe31 in the murine enzyme render proteinswith increased Ki values for MTX and TMP. Structural studies ofthese monofunctional DHFRs showed that residues correspondingto Met-53 are involved in a hydrophobic binding pocket for the p-aminobenzoyl moiety of MTX. Transfection of Leishmania majorpromastigotes with the mutant gene results in parasites highly re-sistant to methotrexate. The appearance and evolution of extrach-romosomal elements in response to drug selection has also studiedand genes involved in drug resistance have been characterized.


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Análisis funcional y estructural de proteínas enzimáticas del metabolismo de pirimidinas y mecanismos moleculares de resistencia


- Proteínas enzimáticas: blanco de acción de fármacos. Grupo de investigación Junta de Andalucia CVI-199. (1991-2000).

- Papel de los elementos extracromosomales en la resistencia a fármacos en especies del genero Leishmania. FIS, 94/0241. (1994-1997).

- Estudios sobre enzimas implicados en la ruta de síntesis de timidilato como blanco de acción de fármacos en parásitos protozoos.CICYT, SAF94-0793. (1994-1997).

- Soil ciliated protozoa as bioindicators of desertification. European Commission INTAS, 94-3747. (1994-1997).

- Blancos de acción de fármacos en protozoos parásitos. Caracterización molecular y desarrollo de estrategias para el diseño de inhibido-res específicos. CICYT, BIO97-0659. (1997-2000).

- Development of inhibitors of malarial and trypanosomal dihydrofolate reductase as antiparasitic agents through combinatorial chemistry.European Commission INCO-DC, ERB3514PL961401. (1997-2000).

- Ayuda complementaria al proyecto Europeo "Development of inhibitors of malarial and trypanosomal dihydrofolate reductase asantiparasitic agents through combinatorial chemistry". CICYT, BIO97-2004-CE. (1997-2000).


- Ana Camacho Páez. Metabolismo nucleotídico en Leishmania major: Caracterización de la desoxiuridina 5’-trifosfato nucleótidohidrolasa. Universidad de Granada. 1998.

- Andrea Montalvetti Domínguez. 3-hidroxi-3-metilglutaril-CoA reductasa de Leishmania major: Caracterización y regulación de unaenzima soluble. Universidad de Granada. 1999.

- Javier Peña Díaz. Estudios sobre la 3-hidroxi-3-metilglutaril-CoA reductasa de Trypanosoma cruzi. Universidad de Granada. 1999.

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- Martin, A., Palacios, G., Olmo, A., Martin-Gonzalez, A., Ruiz-Perez, L.M. and Gutierrez, J.C. Karyotypic variability in ribosomal DNAsubchromosome size among colpodid ciliates, a possible tool to differentiate colpodid species. Appl. Environ. Microbiol. (1997). 63:1602-1605.

- Peña-Diaz, J., Montalvetti, A., Camacho, A., Gallego, C., Ruiz-Perez, L.M. and Gonzalez-Pacanowska, D. A soluble eukaryotic HMGCoAreductase in the protozoan Trypanosoma cruzi. Biochem. J. (1997). 324: 619-626.

- Camacho, A., Arrebola, R., Peña-Diaz, J., Ruiz-Perez, L.M. and Gonzalez-Pacanowska, D. Description of a novel eukaryotic deoxyuridine5´-triphosphate nucleotidohydrolase in Leishmania major. Biochem. J. (1997). 325: 441-447.

- Alvarez-Fortes,E., Ruiz-Perez, L.M., Bouillaud, F., Rial, E. and Rivas, L. Expression and regualtion of mitochondrial uncouplingprotein 1 from brown adipose tissue in Leishmania major promastigotes. Mol. Biochem. Parasitol. (1998). 93: 191-202.

- Zuccotto, F., Brun, R., Gonzalez-Pacanowska, D., Ruiz-Perez, L.M. and Gilbert, I. The structure-based design and sinthesis of selectiveinhibitors of Trypanosoma cruzi dihydrofolate reductase. Bioorg.Med.Chem. Lett. (1999). 9: 1463-1468.

- Perez, J., Gallego, C., Bernier-Villamor,V., Camacho, A., Gonzalez-Pacanowska, D. and Ruiz-Perez, L.M. Apurinic/apyrimidinicendonuclease genes from the Trypanosomatidae Leishmania major and Trypanosoma cruzi confer resistance to oxidizing agents in DNArepair-deficient Escherichia coli. Nucleic Acids Res. (1999). 27(3): 771-777.

- Chowdhury, S.F., Bernier-Villamor, Hurtado-Guerrero,R., Leal,I., Brun, R., Croft, S.L., Goodman,J.M., Maes, L., Ruiz-Perez, L.M.,Gonzalez-Pacanowska, D. and Gilbert, I.H. Design, synthesis, and evaluation of inhibitors of trypanosomal and leishmanial dihydrofolatereductase. J. Medical Chem. (1999). 42: 4300-4312.

- Camacho, A., Hidalgo-Zarco, F., Bernier-Villamor, V., Ruiz-Perez, L.M. and Gonzalez-Pacanowska, D. Properties of Leishmaniamajor deoxyuridine 5´-triphosphate nucleotidohydrolase, a unique nucleotide hydrolyzing enzyme in kinetoplastida. Biochem. J. (1999).(In press).


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arasitic diseases are major health problems world-wide. A com-bined study of the biochemistry, structure and mechanism of para-site-specific enzymes and metabolic pathways offers a new approachto rationale drug design. It not only provides information relativeto the mode of action of known and new drugs but also data can beobtained regarding the molecular, structural and functional differ-ences between the metabolism of the parasite and that of the eu-karyotic host. These specific differences may be exploited in theidentification of new lead compounds useful in the treatment ofparasitic diseases.

as enfermedades parasitarias constituyen en la actualidad ungrave problema sanitario a escala mundial. Un estudio combinadode la bioquímica, estructura y mecanismo de enzimas y rutas espe-cíficas del parásito ofrece un nuevo enfoque al diseño racional defármacos ya que provee de información con respecto al modo deacción de fármacos utilizados en la actualidad y de función desco-nocida y por otra parte permite desarrollar las diferencias molecu-lares, estructurales y funcionales entre el metabolismo del parásitoy el hospedador en la creación de nuevos cabezas de serie.

L P

IMPACTO DE LAS ENFERMEDADES PROTOZOARIAS. ESTRATEGIAS EN EL DISEÑORACIONAL DE FÁRMACOS

IMPACT OF PROTOZOAN DISEASES. NEW STRATEGIES IN RATIONALE DRUG DESIGN

JEFE DE GRUPO

GROUP LEADERDolores González Pacanowska

INVESTIGADOR

CONTRATADO

RESEARCH ASSOCIATE

Esther Fárez Vidal

BECARIOS

PREDOCTORALES

PREDOCTORAL FELLOWS

Javier Peña DíazVíctor Bernier VillamorRamón Hurtado GuerreroFernando Hidalgo ZarcoCarmen Jiménez Jiménez

PERSONAL TÉCNICO

TECHNICAL ASSISTANTSAurora Constan Gutiérrez

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Nuestros estudios se centran en las especies de los géneros Leish-mania y Trypanosoma (familia Trypanosomatidae) que son proto-zoos parásitos responsables de un elevado número de enfermeda-des que afectan tanto al hombre como a animales. El protozoo he-matozoario Trypanosoma cruzi es el agente etiológico responsablede la enfermedad de Chagas. Esta enfermedad según la OMS afec-ta en la actualidad a 20 millones de personas en el continente sud-americano, donde al menos 70 millones de personas viven en zo-nas endémicas. En cuanto a los parásitos del género Leishmania,producen al menos cinco formas diferentes de la enfermedad quevan desde una versión cutánea más leve (muy común en la cuencamediterránea) a la leishmaniasis visceral, una forma mucho másdevastadora de la enfermedad que afecta al sistema reticuloendote-lial. La identificación, aislamiento y caracterización de blancos deacción de fármacos en los protozoos parásitos Leishmania spp. yTrypanosoma cruzi es el objetivo central de nuestras investigacio-nes que se refieren a diferentes procesos metabólicos susceptiblesde ser inhibidos y que son esenciales para la supervivencia de estosorganismos.

DESOXIURIDINA 5'-TRIFOSFATO NUCLEÓTIDO HIDROLASA (dUTPasa).

En la mayoría de los sistemas biológicos, el uracilo no es uncomponente usual del DNA. Puede presentarse sin embargo comoresultado de la desaminación de la citosina, un hecho que tienelugar con una frecuencia relativamente baja. Esta situación nor-malmente se resuelve a través de los mecanismos de reparaciónque actúan específicamente eliminando residuos de uracilo. Si seda la circunstancia de que la cantidad de dUTP aumenta por enci-ma de determinados niveles, se facilita la incorporación masiva deuracilo al DNA celular activándose consecuentemente el mecanis-mo de excisión y reparación lo que conlleva la fragmentación delDNA y la muerte celular. Este proceso destructivo no tiene lugarbajo condiciones normales debido a que el enzima desoxiuridina5'-trifosfato nucleótido hidrolasa (dUTPasa), (EC 3.6.1.23) degra-da el dUTP dando lugar a dUMP y PPi.

En nuestro laboratorio se han aislado los genes que codificanlas dUTPasas de las especies L. major y T. cruzi. Para su aislamien-to se ha recurrido a la expresión en mutantes de E. coli deficientes

Our studies are centered on Trypanosoma cruzi the causal agentof Chagas’ disease and Leishmania spp which cause a spectrum ofdi-seases in humans and other animals (dogs, rats and other ro-dents) that ranges from simple cutaneous lesions to visceral infec-tions associated with parasitism of the reticulo-endothelial system.Different clinical forms of leishmaniasis are usually associated withdistinctly different species of the parasite that produce at least fivedifferent diseases with differing symptoms. During the past fiftyyears Pentostam and Glucantime (antimonials) which often pro-duce side-effects, have been used as the first line treatment againstvisceral leishmaniasis. The identification, isolation andcharacterisation of drug targets in the protozoan parasites Leish-mania spp. and Trypanosoma cruzi is the main objective of ourresearch. We are performing the characterisation of metabolic routesthat are essential to viability and can be inhibited in a species-specific fashion.

DEOXYURIDINE 5’-TRIPHOSPHATE NUCLEOTIDOHYDROLASE (dUTPase).

In most biological systems, uracil is not a u1sual component ofDNA. However, it can be found as a result of cytosine deamination,an event that occurs at a low frequency. This situation is resolvedby means of the DNA repair system, which specifically eliminatesuracil residues. If the amount of intracellular dUTP increases, thenucleotide is available to DNA polymerase, is incorporated to DNAand activation of the DNA excision-repair mechanism occurs. Theenzyme deoxyuridine 5'-triphosphate nucleotidohydrolase(dUTPase, EC 3.6.1.23) catalyses the hydrolysis of dUTP to dUMPand pyrophosphate. It is involved in the removal of dUTP from thedNTP pool thus preventing this nucleotide to be available for DNApolymerase and therefore all the consequences resulting directlyfrom the incorporation of uracil in DNA. Futhermore, it plays anessential role in de novo biosynthesis of dTTP by furnishing thesubstrate for thymidylate synthase. Its widespread presence in avariety of organisms, including bacteriophages and certainretroviruses with a relatively small genoma, suggests that thedUTPases are vital to DNA replication in all systems.

We have isolated the genes encoding dUTPase in Leishmaniamajor and Trypanosoma cruzi by genetic complementation of Es-

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cherichia coli defective mutants. The amino acid sequence of eu-karyotic dUTPases is highly conserved and there are five consen-sus motifs common to all enzymes. However, a comparative analy-sis of trypanosomal dUTPases revealed the existence of profounddifferences. The Leishmania and T. cruzi dUTPases are highly simi-lar to each other but the lack the five characteristic motifs of otherdUTPases and present a limited similarity with the dUTPase-dCTPase from the phage T4. We are studying the importance ofdUTPase in cell viability and the biological consequences that de-rive form enzyme inhibition. A detailed kinetic analysis of the en-zyme is underway and the evidence obtained shows that it is adUTPase-dUDPase. Massive inhibitor screening is being performedin order to establish an activity profile. Crystals diffracting at 2-3Å have been obtained and optimisation of crystallisation condi-tions and the collection of diffraction data are currently being ac-complished.

URACIL EXCISION FROM DNA: URACIL-DNA GLYCOSYLASE AND APENDONUCLEASE.

The composition of DNA undergoes changes due to errors in-troduced during replication, recombination or the repair mecha-nism in itself. The are several mechanisms whereby DNA is effi-ciently repaired. However, the most frequent repair process in na-ture involves the excision of the inappropriate base and its replace-ment by the correct one. This mechanism is known as "excisionrepair" and several enzyme systems are involved. The excision ofcertain damaged bases is initiated by DNA glycosylases that catalysethe hydrolysis of the N-glycosidic linkage that joins the damagedbase with the phosphodeoxyribose moiety. When the excision re-pair is initiated by DNA glycosylases (uracil-DNA glyscosylasewhen uracil is the base involved) the process is named "base exci-sion repair" and a free base is released. This initial event gener-ates lesions in DNA called abasic (AP) sites, which consist in placeswhere a purine or pyrimidine base has been eliminated. AP sitesare both cytotoxic and mutagenic and must be corrected to restoregenetic integrity. The major enzymes initiating this DNA excisionrepair process are AP endonucleases, the main class of which (classII AP endonucleases) hydrolyse the phosphodiester bond immedi-ately 5' to the abasic site. Many AP endonucleases also present 3'-

en actividad dUTPasa. La secuencia de aminoácidos de la dUTPasase encuentra bastante conservada entre organismos eucarióticos yexisten cinco motivos consensos comunes a todas las dUTPasasaisladas hasta el momento. Sin embargo, un análisis comparativode la secuencias de tripanosomátidos con la de otros organismoseucarióticos ha puesto de manifiesto la existencia de profundas di-ferencias aunque por otra parte los genes de Leishmania y Trypa-nosoma son altamente homólogos entre si. Estamos estudiando laesencialidad de la dUTPasa para la supervivencia de protozoosparásitos así como las consecuencias biológicas que derivan de suinhibición y su papel en la muerte celular por falta de timina. Se hallevado a cabo una caracterización cinética exhaustiva del enzimahabiéndose demostrado que es una dUTPasa-dUDPasa altamentedependiente de Mg+2. Las colaboraciones establecidas están per-mitiendo el ensayo masivo de inhibidores con el fin de identificarmoléculas cabezas de serie. Asimismo se han obtenido cristales dela dUTPasa de T. cruzi que difractan a 2-3Å. Una optimización delas condiciones de cristalización y recogida de datos de difracciónestá en fase de realización para la determinación de la estructura.

EXCISIÓN DE URACILO DEL DNA: URACIL-DNA GLICOSILASA Y APENDONUCLEASA.

La composición de DNA está sujeta a alteraciones en su se-cuencia o composición nucleotídica. Muchos de estos cambios sonuna consecuencia de errores introducidos durante la replicación, larecombinación o el proceso de reparación en si mismo. Existenvarios mecanismos por los que los tipos de daños que tiene lugaren el DNA son reparados eficientemente. Sin embargo, el procesode reparación del DNA más abundante en la naturaleza es el queimplica la excisión de la base inapropiada del genoma y su reposi-ción por la correcta. Este mecanismo se conoce como reparaciónpor excisión y está mediado por varios mecanismos enzimáticos.La excisión de algunos tipos de bases dañadas es iniciada por unasenzimas denominadas DNA glicosilasas que catalizan la hidrólisisde enlaces N-glucosídicos que unen la base dañada al esqueleto dedesoxiribosa-fosfato. Cuando la reparación por excisión se iniciapor DNA glicosilasas (uracil-DNA glicosilasa cuando la base a eli-minar es el uracilo), el proceso se denomina reparación por exci-sión de bases ya que lo que se libera es una base libre. Este evento

Impacto de las enfermedades protozoarias. Estrategias en el diseño racional de fármacos

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inicial en realidad genera otro tipo de lesiones en el DNA que con-sisten en sitios donde se ha eliminado la base púrica o pirimidínicay que se conocen como sitios AP. La reparación de sitios AP re-quiere la actuación de una segunda clase de enzimas que se cono-cen como AP endonucleasas que reconocen de forma específicasitios AP en el DNA que producen roturas en el DNA duplex me-diante hidrólisis de uno de los enlaces fosfodiester en posición 5' o3' con respecto al sitio AP.

Estamos caracterizando el proceso de reparación por excisiónde bases en tripanosomátidos. Hemos aislado y sobreexpresado losgenes de las enzimas uracil glicosilasa y AP endonucleasa de Trypa-nosoma cruzi y Leishmania major y demostrado su papel en la re-paración del DNA por daño oxidativo. La expresión de los genesen mutantes de Escherichia coli hipersensibles a agentes que da-ñan el DNA confiere resistencia a compuestos alquilantes y oxi-dantes tales como el H2O2 y el metil metano sulfonato. Se está lle-vando a cabo la creación de mutantes de Leishmania que carecende estas actividades con el fin de establecer su papel en el procesoglobal de reparación del daño oxidativo.

METABOLISMO DE ESTEROLES.

Existe abundante información que demuestra que los inhibido-res de la síntesis de ergosterol y otros esteroles interfiere profunda-mente con el crecimiento de parásitos protozoos de la familiaTrypanosomatidae. El ergosterol es el esterol principal de estos or-ganismos y compuestos que inhiben su biosíntesis son agentes an-tiproliferativos que han sido utilizados con éxito en el tratamientode enfermedades producidas por hongos. Su efecto se basa en queel ergosterol y los esteroles relacionados son esenciales para la via-bilidad y funcionalidad de la membrana plasmática. Se ha demos-trado que inhibidores del enzima 3-hidroxi 3-metilglutaril coenzi-ma A (HMGCoA) reductasa presentan un efecto sinérgico con elketoconazol y la utilización combinada de distintos inhibidores dela síntesis de ergosterol se presenta como una estrategia muy pro-metedora en el desarrollo de una fórmula de tratamiento para laenfermedad de Chagas y constituyen un área recomendada por laOMS para el desarrollo de nuevos fármacos. La HMGCoA reduc-

repair diesterase activity that selectively removes fragments of deox-yribose from 3' termini of DNA strand breaks produced by free radi-cal attack.

We have characterised enzymes involved in base excision re-pair in both Leishmania and Trypanosoma cruzi. We have isolatedgenes coding for DNA glycosylase and AP endonuclease and pro-vided evidence regarding their central role in oxidative DNA dam-age. Furthermore, expression of the enzymes in AP endonucleasedeficient Escherichia coli mutants conferred significant resistanceto killing by methyl methane sulphonate and peroxides, oxidizingand alkylating agents that severely damage DNA.

STEROL METABOLISM.

Evidence presented by several laboratories has demonstratedthat inhibitors of ergosterol biosynthesis interfere severely with thegrowth of protozoan parasites of the Trypanosomatidae family suchas Trypanosoma cruzi and various Leishmania species. Ergosterolis the principal sterol of the parasitic trypanosomatid flagellatesand ergosterol biosynthesis inhibitors are effective antiproliferativeagents that have been used in the treatment of diseases producedby fungi and yeast. The basis of their effect is that ergosterol andrelated sterols are essential for viability and membrane function. Ithas been shown that inhibitors of 3-hydroxy-3-methylglutaryl co-enzyme A (HMG-CoA) reductase, and azole drugs such asketoconazole were able to essentially eliminate circulating para-sites and produce complete protection against death. In conclu-sion, the combined administration of ergosterol biosynthesis in-hibitors that act at different points of the sterol biosynthetic path-way appears to be a promising strategy for the development of aneffective treatment of these diseases.

HMG-CoA reductase is the first committed step in the pathwayof isoprenoid biosynthesis and catalyses the synthesis of mevalonicacid from HMG-CoA. This key enzyme plays a critical role in theproduction of the large family of molecules produced by themevalonate pathway. We have cloned the genes coding for HMGCoA

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reductase in the protozoa T. cruzi and Leishmania major. In bothcases, the deduced amino acid sequence is considerably shorterthan that of eukaryotic reductases and the protozoan genes clearlylack sequences encoding a membrane amino terminal domain. Weare performing studies in order to establish the intracellularlocalisation of the enzyme, its biological importance and the mo-lecular mechanisms involved in its regulation. HMGCoA analoguesare being screened for activity in order to establish a structure-activity profile. We are also extending our studies to other enzymesof the pathway such as 24-methyl transferase, 14α demethylaseand squalene synthase.


- Caracterización e importancia biológica de la HMG-CoA reductasa de parásitos protozoos. DGICYT, PB93-0179. (1994-1997).

- Inhibition of Trypanosoma cruzi 3-hydroxy-3-methylglutaryl Coenzyme A reductase. UNDP/World Bank/WHO, T21/181/50 ID 950526.(1995-1998).

- Deoxyuridine triphosphatases (dUTPase) as targets for treatment of infectious diseases and cancer. European Commission BIOMED 2,PL962711. (1997-2000).

- Blancos de acción de fármacos en protozoos parásitos. Caracterización molecular y desarrollo de estrategias para el diseño de inhibido-res específicos. CICYT, BIO97-0659. (1997-2000).

- Inhibition of Leishmania major and Trypanosoma cruzi 3-hydroxy 3-methylglutaryl coenzyme A reductase. UNDP/World Bank/WHO,T24/181/30 ID 980139. (1998-1999).

- Enzymes involved in sterol biosynthesis as targets for treatment of Leishmaniasis. European Commission INCO-DC, IC18-CT980371.(1998-2001).

tasa cataliza la conversión de HMGCoA a ácido mevalónico lo queconstituye uno de los principales puntos de regulación de la sínte-sis de isoprenoides. Hemos aislado y caracterizado los genes quecodifican la HMGCoA reductasa de Leishmania major y Trypano-soma cruzi. En ambos casos codifican para polipéptidos de menortamaño que los observados en el resto de los eucariotas y presentanuna elevada homología con el dominio carboxilo terminal de otrasreductasas. Estamos realizando estudios destinados a establecer sulocalización intracelular, importancia biológica, mecanismos de re-gulación e inhibición por análogos del HMGCoA. Estos estudiosse extienden a otras enzimas de la ruta como son la 24-metil trans-ferasa y la escualeno sintetasa.


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- Ana Camacho Páez. Metabolismo nucleotídico en Leishmania major: Caracterización de la desoxiuridina 5’-trifosfato nucleotidohi-drolasa. Universidad de Granada. 1998.

- Andrea Montalvetti. 3-hidroxi-3-metilglutaril-CoA reductasa de Leishmania major: Caracterización y regulación de una enzimasoluble. Universidad de Granada. 1999.

- Javier Peña Díaz. Estudios sobre la 3-hidroxi-3-metilglutaril-CoA reductasa de Trypanosoma cruzi. Universidad de Granada. 1999.

␣ PUBLICACIONES/PUBLICATIONS

- Peña-Diaz, J., Montalvetti, A., Camacho, A., Gallego, C., Ruiz-Perez, L.M. and Gonzalez-Pacanowska, D. A soluble eukaryotic HMGCoAreductase in the protozoan Trypanosoma cruzi. Biochem. J. (1997). 324: 619-626.

- Camacho, A., Arrebola, R., Peña-Diaz, J., Ruiz-Perez, L.M. and Gonzalez-Pacanowska, D. Description of a novel eukaryotic deoxyuridine5´-triphosphate nucleotidohydrolase in Leishmania major. Biochem. J. (1997). 325: 441-447.

- Tellez-Sanz, R., Bernier-Villamor, V., Garcia-Fuentes, L., Gonzalez-Pacanowska, D. and Baron, C. Thermodynamic characterizationof the binding of dCMP to the Asn229Asp mutant of thymidylate synthase. FEBS Letters. (1997). 409: 385-390.

- Concepcion, J.L., Gonzalez-Pacanowska, D. and Urbina, J.A. Subcellular localization of 3-hydroxy-3-methyl-glutaryl-CoA reductasein Trypanosoma (Schizotrypanum) cruzi epimastigotes. Arch. Biochem. Biophys. (1998). 352: 114-120.

- Bernier-Villamor, V., Camacho, A., Gonzalez-Pacanowska, D., Cedergren Zeppezauer, E., Antson, A. and Wilson, K. Crystallisationand preliminary X-ray diffraction of Trypanosoma cruzi dUTPase. Acta Crystallographica. (1999). D55, 528-530.

- Perez, J., Gallego, C., Bernier-Villamor, V., Camacho, A., Gonzalez-Pacanowska, D. and Ruiz-Perez, L.M. Apurinic/apyrimidinicendonuclease genes from the Trypanosomatidae Leishmania major and Trypanosoma cruzi confer resistance to oxidizing agents in DNArepair-deficient Escherichia coli. Nucleic Acids Research. (1999). 27, 771-777.

- Zucotto, F., Brun, R., Gonzalez-Pacanowska, D., Ruiz-Perez, L.M. and Gilbert, I., H. The structure-based design and synthesis ofselective inhibitors of Trypanosoma cruzi dihydrofolate reductase. Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters. (1999). 9, 1463-1468.

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- Chowdhury, S.F., Bernier-Villamor, V., Brun, R., Croft, S.L., Gonzalez-Pacanowska, D., Goodman, J.M., Hurtado-Guerrero, R., Maes,L., Ruiz-Perez, L.M. and Gilbert, I.. Design, synthesis and evaluation of inhibitors of trypanosomal and leishmanial dihydrofolatereductase. J. Med. Chem. (1999). 42: 4300-4312.

- Camacho, A., Hidalgo-Zarco, F., Bernier-Villamor, V., Ruiz-Perez, L.M. and Gonzalez-Pacanowska, D. Properties of Leishmaniamajor deoxyuridine 5´-triphosphate nucleotidohydrolase, a distinct nucleotide hydrolyzing enzyme in kinetoplastida. Biochem. J. (1999).(In press).


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Departamento de Biología Molecular


Manuel C. López López

INVESTIGADORES DE PLANTILLA/STAFF RESEARCH SCIENTISTS

Alfredo Berzal HerranzAntonio González AguilarAcaimo González Reyes

BECARIOS POSTDOCTORALES/POSTDOCTORAL FELLOWS

Concepción Marañón LizanaMónica Olivares Martín

Mª. Carmen Thomas Carazo


Alicia Barroso del JesúsJosé L. García PérezElena González ReyJosé M. Lage Martín

Lourdes Planelles CarazoElena Puerta Fernández


Vicente Augustin VacasMª. Victoria Longobardo Polanco

Almudena López Barajas de la Puerta

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as ribozimas son moléculas de RNA dotadas de actividad cata-lítica. Su descubrimiento a principios de la década de los ochenta,supuso la identificación de las primeras moléculas de naturalezano proteica capaces de catalizar reacciones en el interior celular.Además permitió la identificación del RNA como la primera espe-cie molecular capaz al mismo tiempo de almacenar informacióngenética (genotipo) y de manifestar una actividad enzimática (fe-notipo). Lo cual tiene importantes implicaciones evolutivas, refor-zando la hipótesis que defiende la existencia de un mundo RNAprebiótico. Desde su descubrimiento inicial se han identificadonumerosos motivos de RNA con actividad catalítica, que partici-pan en distintos procesos biológicos. La gran mayoría de las ribo-zimas naturales identificadas hasta la fecha, catalizan el corte y/oligación del esqueleto fosfodiester de otras moléculas de RNA. Sinembargo, a diferencia del resto de las ribonucleasas conocidas, denaturaleza proteica, las ribozimas muestran una gran especificidad

ibozymes are RNA molecules endowed with catalytic activity.The discovery of ribozymes in the early eighties led to the identifi-cation of the first non protein molecules able to carry out enzy-matic catalysis within the cells. Furthermore, it allowed the identi-fication of the RNA as the first molecular specie able to both storegenetic information (genotype) and show an enzymatic activity (phe-notype). This has significant implications from an evolutionary pointof view. It reinforces the hypothesis of a prebiotic RNA world. Fol-lowing its initial discovery, a number of different RNA motifs en-dowed with catalytic activity have been identified, which partici-pate in different biological events. Most of the currently knownribozymes carry out cleavage and/or ligation of the phosphodiesterbackbone of other RNA molecules. However, ribozymes are differ-ent from the other known ribonucleases (proteins) because theycatalyze a highly sequence-specific reaction. This specificity is de-termined by RNA-RNA interactions of the Watson-Crick type be-tween the ribozyme and the substrate. So, ribozymes can be con-

L R

INACTIVACIÓN GÉNICA MEDIADA POR RNAs INHIBIDORES.CARACTERIZACIÓN Y OPTIMIZACIÓN DE RNAs CATALÍTICOS

GENETIC INACTIVATION MEDIATED BY INHIBITORY RNAs. CHARACTERIZATION ANDOPTIMIZATION OF CATALYTIC RNAs

JEFE DE GRUPO

GROUP LEADERAlfredo Berzal Herranz

BECARIOS


Alicia Barroso del JesusElena Puerta Fernández

PERSONAL TÉCNICO

TECHNICAL ASSISTANTSVicente Augustin Vacas

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Dpto. de Biología Molecular

de secuencia, determinada por interacciones RNA-RNA (tipoWatson-Crick) entre la ribozima y su substrato. De esta manera lasribozimas se pueden considerar como un tipo especial de RNAsantisense, y al igual que para estos se ha pensado en la posibilidadde alterar la especificidad de las mismas mediante la introducciónde simples cambios de secuencia en su dominio de reconocimientodel RNA substrato, y en consecuencia de dirigirlas frente a distin-tos RNAs como inactivadores específicos de la expresión génica.Se considera que los RNAs antisense en general y las ribozimas enparticular, son buenos candidatos para el desarrollo de nuevas es-trategias terapéuticas. Estrategias útiles para el tratamiento de en-fermedades contra las cuales hoy en día no se cuenta con una tera-pia eficaz, incluyendo enfermedades tanto de origen viral comogenético. Sin embargo para poder utilizar estas moléculas de unamanera eficiente, con fines terapéuticos, o sencillamente como in-activadores génicos, es necesario solventar una serie de problemas.Algunos de estos problemas son comunes a cualquier estrategia deterapia génica pero otros son específicos del empleo de estos RNAsinhibidores.

El interés fundamental de nuestro grupo es el desarrollar estra-tegias generales útiles para el diseño y optimización de RNAs inhi-bidores (RNAs antisense y ribozimas), eficientes en la inactiva-ción específica de moléculas de RNA cuya expresión resulta perju-dicial para la célula hospedadora. Para acometer este objetivo pre-tendemos combinar los conocimientos que aportan distintos siste-mas naturales con los derivados del empleo de modelos artificia-les. Utilizaremos fundamentalmente la ribozima tipo hairpin y elRNA antisense natural CopA. Los RNAs substrato que usamos comobase de estudio son: la región TAR y el mRNA del gen codificantepara la proteína Tat del VIH, y la región 5' no codificante del VHC.

Actualmente estamos interesados en el desarrollo de la meto-dología que permita la identificación rápida de dianas útiles en losRNAs substrato para la inhibición mediada por ribozimas o RNAsantisense. Cualquier RNA inhibidor, antisense o ribozimas, debeinteraccionar eficientemente con su secuencia blanco para ser efec-tivo, sin embargo muchos RNAs inhibidores artificiales son inefi-cientes. Para abordar este problema utilizamos tanto estrategias deselección molecular in vitro, como análisis bioquímico del RNAsubstrato con el fin de determinar el contexto molecular a nivel desecuencia y estructura en el cual se localizan las dianas más accesi-

sidered as a special type of antisense RNAs, and similarly to themit is possible to modify the ribozyme’s specificity by the introduc-tion of changes in the primary sequence of its substrate recogniz-ing domain and therefore to design ribozymes against RNA mol-ecules as specific gene suppressers. Antisense RNA in general andribozymes in particular are considered as good candidates for thedevelopment of new therapeutic strategies capable of providingsatisfactory responses to the treatment of both cellular and viraldiseases, against which nowadays there is no efficient therapy.However, before these molecules may be efficiently used as thera-peutic agents, or just as gene suppressers, it is necessary to solveseveral significant obstacles. Some of these problems are commonto any gene therapy strategy, but others are specific to the use ofinhibitory RNAs.

The main interest of our group is the development of generalstrategies for the design and optimization of efficient inhibitoryRNAs (antisense RNAs and ribozymes) for the specific inactivationof RNA molecules which expression is harmful for the host cell. Toachieve this goal we intend to combine the information obtainedfrom various natural systems with the one derived from the use ofartificial models. We are mainly using the hairpin ribozyme andthe natural antisense RNA-CopA as inhibitors. The TAR RNA re-gion and Tat mRNA from HIV and the 5’ non-coding region of HCVare the substrates base of our studies.

Currently, we are focused in developing a method to allow therapid identification of accessible targets within the substrate RNAsfor its inactivation by ribozymes or antisense RNAs. An inhibitoryRNA must interact efficiently with its target sequence to be effec-tive. However many artificial RNAs are ineffective. To approachthis problem we are using both in vitro selection strategies, andbiochemical analysis of the substrate RNA to determine the pri-mary and secondary structure of the RNA region surrounding themost accessible target sequences. We have performed an exhaus-tive analysis of the sequnce requirements surrounding the cleavagesite in the substrate molecule, for the natural hairpinribozyme•substrate system. This analysis has allowed us to identifyup to 24 sequences that can not be used as substrates by the hair-pin ribozyme. Furthermore, we have established the sequences thatare processed by the hairpin ribozyme with a highest catalytic effi-ciency.

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bles. Utilizando el sistema natural ribozima hairpin•substrato he-mos llevado a cabo un exhaustivo análisis con el fin de establecerlos requerimientos de secuencia para las posiciones que rodean elsitio de corte en el substrato. Este análisis nos ha permitido identi-ficar por un lado un total de 24 secuencias que no son procesadaspor la ribozima, y por otro lado establecer cuales son las secuen-cias que son procesadas con una mayor eficiencia catalítica.

Un segundo objetivo es el diseño y caracterización de los pro-pios RNAs inhibidores. Por un lado llevamos a cabo un proyectode optimización de la actividad catalítica de la ribozima tipo hair-pin, ensayando distintas variantes del modelo natural. A partir delanálisis cinético de diferentes variantes estructurales hemos identi-ficado y caracterizado modificaciones que incrementan la eficien-cia catalítica de este motivo con respecto a la molécula salvaje.Además hemos comprobado que alguna de estas modificacionestienen el mismo efecto sobre otros motivos catalíticos ampliamen-te utilizados en experimentos de inactivación génica como es laribozima tipo hammerhead. Una segunda aproximación es el dise-ño de nuevos RNAs antisense específicos, contra secuencias delVHC y el VIH, a partir de los requerimientos estructurales biencaracterizados de los RNAs antisense naturales. Tanto el empleode ribozimas como de RNAs antisense presenta limitaciones deri-vadas de las características y modo de acción de cada una de ellas.Como última aproximación a este objetivo, estamos ensayando laactividad inhibidora de moléculas híbridas (RNA antisense/ribozi-ma) con el fin de establecer si las limitaciones particulares de cadauno de ellos puede ser compensada por la acción combinada deambos. En consecuencia pretendemos optimizar la acción inhibi-dora de estas moléculas de RNA.

Recientemente, hemos iniciado un proyecto encaminado a laobtención de RNAs inhibidores eficientes en la inactivación espe-cífica de RNAs virales. Virus implicados en distintas infeccionescontra las cuales actualmente no existe una terapia eficaz. Hemosiniciado este estudio con los virus VHC, VIH y virus implicados endistintas afecciones del Sistema Nervioso Central como HHV-6 oMSRV, relacionados con el desencadenamiento de la múltiple es-clerosis, y el BDV causante de la enfermedad de Borna.

The second objective is the design and characterization of in-hibitory RNAs. On one side, we are carrying out a project whichintends to optimize the catalytic activity of the hairpin ribozyme,evaluating different variants of the natural model. We have identi-fied and kinetically characterized several structural modificationsthat increase the efficiency of this catalytic motif. In addition, wehave shown that some of these structural modifications have thesame effect when included in other catalytic motifs that are beingextensively used as gene suppressers, like the hammerheadribozyme. Secondly, we are designing new specific antisense RNAsagainst viral sequences (HIV, HCV) based on the structural re-quirements of the well characterized natural antisense RNAs. Bothtypes of molecules (ribozymes and antisense RNAs) show limita-tions derived of their mode of action. In addition, we are interestedin developing and testing chimeric molecules (ribozyme/antisense)to establish whether these particular limitations could be compen-sated by the combined action of the two domains. We intend tooptimize the inhibitory action of these RNA molecules.

We have recently started a project aimed to the development ofinhibitory RNAs for the specific inactivation of viral RNAs. Virusresponsible of diseases against which the existent therapies are notefficient. We are working on the design of inhibitory RNAs againstHCV, HIV and virus involved in different affections of the CentralNervous System as HHV-6 and MSRV, related with the elicitationof multiple sclerosis, and BDV responsible of the Borna disease.

Inactivación génica mediada por RNAs inhibidores. Caracterización y optimización de RNAs catalíticos

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ORGANISMOS FINANCIADORES / FUNDING AGENCIES

- Para el desarrollo de inactivadores génicos a partir de moléculas RNA. Grupo de investigación Junta de Andalucía, CTS-376. (1999-2000).

- Desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas para el tratamiento de infecciones virales implicadas en la esclerosis múltiple y otrasafecciones del sistema nervioso central (SNC). Fundación la Caixa, 98/112-00. (1998-2001).

- Ribozimas Hairpin y RNAs antisense como base para el desarrollo de inactivadores génicos: diseño y caracterización in vitro deagentes antivirales. DGESIC, PB96-0825. (1997-2.000).

- Alpha 1-interferon gene as model for selection of hairpin ribozymes. NATO, HTECH. LG 961134. (1996-1998).

- Specific gene suppression mediated by catalytic RNA: Comparative analysis of different types of ribozymes and application strategies.European Commission. Copernicus, ERB CIPACT940142. (1995-1997).


- Perez-Ruiz, M., Torres, C., Garcia-Lopez, P.A., Ruiz-Extremera, A., Salmeron, J. and Berzal-Herranz, A. Determination of HCV-RNAconcentration by direct quantification of the products from a single RT-PCR. J. Virol. Methods. (1997). 69: 113-124.

- Perez-Ruiz, M., Sievers, D., Garcia-Lopez, P.A. and Berzal-Herranz, A. The antisense sequence of the HIV-1 TAR stem-loop structurecovalently linked to the hairpin ribozyme enhances its catalytic activity against two artificial substrates. Antisense & Nucleic Acid DrugDevelopment. (1999). 9:33-42.

- Barroso-del Jesus, A. Tabler, M and Berzal-Herranz, A. Comparative kinetic analysis of structural variants of the hairpin ribozymereveals further potential to optimize its catalytic performance. Antisense & Nucleic Acid Drug Development. (1999). 9: 433-440.

- Perez Ruiz, M., Barroso-del Jesus, A. and Berzal-Herranz, A. Specifity of the hairpin ribozyme: Sequence requirements surroundingthe cleavage site. J. Biol. Chem. (1999). 274: 29376-29380.

- Barroso-del Jesus, A. and Berzal-Herranz, A. Experimental strategies for hairpin ribozyme targetinf of long RNAs. Nucleic Acids Res.Symp. Series. (1999). 41: 63-65.

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CONTRIBUCIONES A LIBROS/CONTRIBUTIONS TO BOOKS

- Berzal-Herranz, A. and Burke, J.M. Ligation of RNA molecules by the hairpin ribozyme. In Methods in Molecular Biology, Vol 74:Ribozyme Protocols. Ed P.C. Turner. Humana Press Inc., Totowa, NJ. pp. (1997). 349-355.

- Banerjee, A. R., Berzal-Herranz, A., Bond, J., Butcher, S., Esteban, J.A., Heckman, J.E., Sargueil, B., Walter, N. and Burke, J.M.Hairpin ribozyme structure and dynamics. In Molecular modelling of nucleic acids. ACS Symposium Series. (1998). 682: 360- 368. Ed.N.B. Leontis and J. Santalucia, Jr. American Chemical Society, Washington, DC.

Inactivación génica mediada por RNAs inhibidores. Caracterización y optimización de RNAs catalíticos

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- Characterization of ESTs from Trypanosoma cruzi. UNDP/World Bank/WHO, 970424. (1998-2000).

- Caracterización de proteínas de Trypanosoma cruzi relacionadas antigénicamente con C9. DGESIC, PB98-0479. (1999-2002).


- Thomas, M. C. and Gonzalez, A. A transformation vector for stage-specific expression of heterologous genes in Trypanosoma cruzi.Parasitol. Res. (1997). 83:151-156.

- Lario, A., Gonzalez, A. and Dorado, G. Automated laser-induced fluorescence DNA sequencing: Equalizing signal-to-noise ratiossignificantly enhances overall performance. Anal. Biochem. (1997). 247:30-33.


BIOLOGÍA MOLECULAR Y CELULAR DE TRYPANOSOMA CRUZIMOLECULAR AND CELL BIOLOGY OF TRYPANOSOMA CRUZI

JEFE DE GRUPO

GROUP LEADERAntonio González Aguilar

BECARIOS

PREDOCTORALES

PREDOCTORAL FELLOWS

José M. Lage MartínElena González Rey

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- Ferrari, I., Lorenzi, H., Santos, M.R., Brandariz, S., Requena, J.M., Schijman, A., Vazquez, M., da Silveira, J.F., Ben-Dov, C.,Medrano, C., Ghio, S., Lopez Bergami, P., Cano, I., Zingales, B., Urmenyi, T.P., Rondinelli, E., Gonzalez, A., Cortes, A., Lopez, M.C.,Thomas, M.C., Alonso, C., Ramirez, J.L., Chiurillo, M.A., Rangel Aldao, R., Brandao, A., Degrave, W., Perrot, V., Saumier, M.,Billaut, A., Cohen, D., LePaslier, D. and Levin, M.J. Towards the physical map of the Trypanosoma cruzi nuclear genome: Constructionof YAC and BAC libraries of the reference clone T. cruzi CL-Brener. Mem. Inst. Oswaldo Cruz. (1997). 92␣ : 843-852.

- Brandao, A., Urmenyi, T., Rondinelli, E., Gonzalez, A., de Miranda, A.B. and Degrave, W. Identification of transcribed sequences(ESTs) in the Trypanosoma cruzi Genome Project. Mem. Inst. Oswaldo Cruz. (1997). 92␣ : 863-866.

- Beraun, Y., Nieto, A., Collado, M.D., Gonzalez, A. and Martin, J. Polymorphisms at tumor necrosis factor loci are not associatedwith Chagas’ disease. Tissue Antigen. (1998). 52␣ :81-83.

- Umezawa, E.S., Bastos, S., Camargo, M.E., Yamauchi, L.M., Santos, M.R., Gonzalez, A., Zingales, B., Levin, M., Sousa, O.,Rangel-Aldao, R., Franco da Silveira, J. Evaluation of recombinant antigens for serodiagnosis of Chagas’ disease in South andCentral America. J. Clin. Microbiol. (1999). 37: 1554-1560.

- Que, X., Kim, D., Alagon, A., Hirata, K., Shike, H., Shimizu, C., Gonzalez, A., Burns, J. C. and Reed, S. L. Pantropic retroviralvectors mediate gene transfer and expression in Entamoeba histolytica. Mol. Biochem. Parasitol. (1999). 99:237-245.

- Nieto, A., Beraun, Y., Collado, MD., Caballero, A., Alonso, A., Gonzalez, A., Martin, J. HLA haplotypes are associated with differentialsusceptibility to Trypanosoma cruzi infection. Tissue antigens. (1999). (In press).

Biología molecular y celular de Trypanosoma cruzi

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MP11 es una proteína de 11 kda presente y altamente conser-vada en la mayoría de los tripanosomátidos, para la cual se postulaun papel esencial en la biología de los referidos parásitos. Sin em-bargo, se desconoce su específica localización subcelular y meca-

he KMP11 protein is present in a wide range of trypanosomatids.Because of that and due to its very high sequence conservation it ismost likely that it must play an essential role in the life cycle of theparasites. However, the specific subcellular location, function and

CARACTERIZACIÓN MOLECULAR Y FUNCIONAL DE LA PROTEÍNA KMP11DE TRYPANOSOMA CRUZI.

K

MOLECULAR AND FUNCTIONAL CHARACTERIZATION OF KMP11 PROTEIN

FROM TRYPANOSOMA CRUZI.

T


ENFERMEDAD DE CHAGAS: IDENTIFICACIÓN DE ANTÍGENOS DEL PARÁSITO T.CRUZI Y MECANISMOS MOLECULARES DE REGULACIÓN DE LA EXPRESIÓN

GÉNICA, EN UN CONTEXTO DE INTERÉS BIOSANITARIOTHE CHAGA'S DISEASE: THE IDENTIFICATION OF ANTIGENS FROM T. CRUZI

PARASITES AND MOLECULAR MECHANISMS OF GENE REGULATION IN A BIO-HEALTHCONTEXT

JEFE DE GRUPO

GROUP LEADERManuel C. López López

BECARIOS

POSTDOCTORALES

POSTDOCTORAL FELLOWS

Mª. Carmen Thomas CarazoConcepción Marañón LizanaMónica Olivares Martín


PREDOCTORAL FELLOWS

Lourdes Planelles CarazoJosé L. García Pérez

PERSONAL TÉCNICO

TECHNICAL ASSISTANTS

Almudena López Barajas de la PuertaMª. Victoria Longobardo Polanco

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nismo de regulación. Recientemente hemos demostrado que el lo-cus génico de la proteína KMP11 de T. cruzi, localizado en un cro-mosoma de aproximadamente 1900 kb, está formado por una agru-pación de cuatro copias similares, organizadas en tándem cabeza-cola. Este locus génico da lugar a un transcrito maduro de 0,52 kb,poliadenilado y muy estable (vida media de 16 horas), cuyo nivelen el citoplasma es relativamente elevado y similar para todas lasformas del parásito. La abundancia en el citoplasma del referidomensajero está fuertemente regulada por el estadío del parásito,observándose bajos niveles del mismo en la fase estacionaria decrecimiento. Ensayos de run-on con núcleos aislados, en presenciay ausencia de inhibidores de polimerasas, evidencian la existenciade una baja tasa de transcripción, la cual está mediada por una po-limerasa tipo II. Análisis por Western blot y microscopía electróni-ca han permitido determinar que la proteína KMP11 se encuentraasociada al citoesqueleto del parásito. Interesántemente, la proteí-na KMP11 presenta una homología de secuencia biológicamentesignificativa con la región amino-terminal de la proteína CIP1 deArabidosis thaliana. Esta homología parece estar centrada en laexistencia en ambas proteínas de una estructura en alfa-hélice, lacual es fundamental para la unión de la proteína CIP1 al citoesque-leto. Se ha observado una fuerte inhibición en la síntesis de novode KMP11 en parásitos tratados con vinblastina, droga que actúadespolimerizando los microtúbulos. Dado que esta inhibición noestá acompañada por una caída en el nivel citoplasmático de men-sajeros KMP11 maduros, sugerimos la existencia de una regula-ción de la síntesis de KMP11 a nivel de traducción. El hecho deque la proteína KMP11 forme parte del singular citoesqueleto queposeen estos parásitos, estructura envuelta no sólo en la movilidadde los mismos, sino además en la estrecha relación parásito-hospe-dador, hace que la proteína KMP11 sea un potencial blanco de ac-ción para quimioterapia y/o inmunoterapia frente a la enfermedadde Chagas. Actualmente para esta parasitosis, que según datos dela OMS es padecida por al menos 18 millones de personas, no exis-te quimio- ni inmunoterapia eficaz.

regulation mechanism are not clear. Recently, we have demonstratedthat the T. cruzi KMP11 coding gene is organized in a cluster formedby four gene units arranged in a head-to-tail tandem manner lo-cated in a chromosome of about 1900 kb. Run-on assays show thatKMP11 transcription occurs at a low level achieved by RNA poly-merase II. Northern blot analyses indicated, moreover, that thesteady state level of the 0.52 kb mature KMP11 transcripts is highand similar in the three forms of the parasite. The KMP11 mRNAshave a half-life of about 16 hours. The steady state level is downregulated when the parasites reach the stationary growth phase.Since a strong down regulation was observed in the de novo syn-thesis of KMP11 protein in parasites treated with vinblatine andthat it was not accompanied by a significant fall in the steady-statelevel of KMP11 mRNAs, a regulation control of the protein at thetranslational level is suggested. Interestingly, KMP11 presents asignificant homology in sequence with the amino terminal thirddomain of the cytoskeleton-associated protein CIP1 from Arabidosisthaliana. Western blot and immunoelectron microscopy studies showthat KMP11 is located in the cytoskeleton structure of the parasite.The fact that the KMP11 protein belongs to a group of proteinswhich form the molecular architecture of the particular cytoskel-eton structure and that it is involved in the mobility of the parasite,mediating the attachment to the surface of the host cell, makesKMP11 a potential target for chemotherapy and/or immunotherapyagainst the Chagas' disease.

Enfermedad de Chagas: identificación de antígenos del parásito T. cruzi y mecanismos moleculares de regulación de la expresión génica,en un contexto de interés biosanitario

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DETERMINACIÓN DE LOS MECANISMOS DE REGULACIÓN DE LA EXPRESIÓN

GÉNICA DE LA PROTEÍNA H2A DE TRYPANOSOMA CRUZI

Los genes codifiantes para la proteína H2A de T. cruzi estánlocalizados en dos agrupaciones independientes localizadas en unsólo cromosoma por genoma haploide. Se ha observado que ambasagrupaciones transcriben activamente dos clases de mensajeros po-liadenilados los cuales se diferencian en las regiones 3’ no traduci-das, debido a la inserción de una secuencia repetida dispersa deltipo SINE "short interspersed nucleotide elements", la cual generauna unidad génica de mayor tamaño (1,2 kb relativa a la unidadestándar de 0,73 kb). Estudios de Southern, northern blots e hibri-dación cromosomal realizados sobre diferentes cepas de T. cruzi(Y brasil y seis cepas colombianas) nos han permitido demostrar laexistencia de un alto polimorfismo en el relativo número de lasunidades génicas codificantes para la proteína H2A de tamaño de1,2 kb y 0,73 kb, respectivamente; en la relativa abundancia de loscorrespondientes transcritos; y en su localización cromosomal. Es-tos resultados muestran la existencia de una organización dinámicaen el locus H2A entre cepas de T. cruzi originado por la transposi-ción cromosomal de un elemento SINE-like. Ello, estaría de acuer-do con el alto grado de plasticidad descrito para el genoma de T.cruzi sin que apenas se hayan descrito fenómenos de reordenamientocromosomal. La expresión de los genes H2A en las formas tripo-mastigotes no replicativas es sólo residual. En las formas replicati-vas hay una transcripción constitutiva de estos genes, y la abun-dancia citoplasmática de los mensajeros maduros está controlada anivel post-transcripcional. Esta regulación, asociada a la ausenciade replicación, ocurre a través del control de la estabilidad de losmensajeros citoplasmáticos mediada probablemente por la acciónde una nucleasa. Interesántemente, hemos observado que los men-sajeros de mayor tamaño (1,0 kb) originados por el elemento SINE-like insertado al generar un nuevo sitio de poliadenilación, se en-cuentran más eficientemente regulados que los mensajeros cortosde 0,7 kb. Asimismo, se ha demostrado la existencia de un controladicional asociado al estadío de crecimiento del parásito (entradaen fase estacionaria), mecanismo que actuaría a nivel del núcleo enla maduración de los transcritos. Por otra parte, otros datos obteni-dos ponen en evidencia que el balance de proteína H2A libre en elcitoplasma estaría directamente implicado en la regulación de lapropia síntesis de la proteína, controlando la traducción de los men-sajeros que la codifican. Estos estudios representan una alta contri-

DETERMINATION OF CONTROL MECHANISMS OF THE H2A GENES

EXPRESSIONS IN TRYPANOSOMA CRUZI.

The T. cruzi histone H2A gene is encoded in two independentgene clusters located in a single chromosome formed by differentnumbers of 1.2 kb and 0.73 kb gene units. We have observed thatboth gene cluster are actively transcribed as two sized classes ofpolyadenylated mRNAs which differ in the 3’UTRs due to the pres-ence of a SINE-like sequence "short interspersed nucleotide ele-ments" in the 3’ end of some of H2A gene units. This insertion in-troduces in the H2A RNA a new polyadenylation site generating anew messenger of 1.0 kb in length. Southern, northern and chro-mosomal blots analysis of a Brazilian Y strain and six Colombianstrains demonstrated the existence of polymorphism regarding therelative copy number of the H2A gene units, the relative abundanceof the H2A transcripts and their chromosomal location. These re-sults show the existence of a dynamic organization in the H2A lociamong T. cruzi strains originated by the chromosomal transcrip-tion of a SINE-like element. It also support the hypothesis that T.cruzi has a high degree of plasticity in its genome. The expressionof the H2A genes in the non replicative trypomastigote forms isonly residual although in the replicative forms there is constitutivetranscription of these genes, not associated to DNA replication.Our results show, moreover, that in the replicative forms the steadystate levels of the H2A mRNAs is controlled at a post-transcrip-tional level associated to DNA replication by controlling the sta-bility of the messengers in the cytoplasm. This control is, most likely,mediated by a nuclease attack. Interestingly, the 1.0 kb mRNA ismore efficiently regulated than the 0.7 kb mRNA. We suggest thatthere must be an additional control, associated to the parasitegrowth phase, which may act at the maturation step of the tran-scripts. The data also suggest, that the cytoplasmic level of the H2Aprotein might be involved in the regulation of its own synthesis bycontrolling translation of existing messengers. This results repre-sents a high contribution to the understanding of histone transcrip-tion regulation in Trypanosomatidae.


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bución al conocimiento del complejo mecanismo de regulacióngénica de las histonas en tripanosomátidos.

CARACTERIZACIÓN MOLECULAR Y PAPEL FUNCIONAL DE DETERMINADAS

SECUENCIAS DE ADN REPETIDAS DISPERSAS DE TRYPANOSOMA CRUZI

Las secuencias repetidas dispersas de ADN tipo SINE, repre-sentan un porcentaje alto del genoma de mamíferos y otros orga-nismos eucariotas. Así, más del 15% del genoma de T. cruzi estáconstituido por secuencias repetidas dispersas del tipo de elemen-tos SINE-like. El hecho de que estas secuencias repetidas se en-cuentren en T. cruzi especialmente localizadas en zonas intergéni-cas de genes agrupados en tándem y/o en el entorno de los mimas,favorece la idea de que estos elementos puedan estar directamenteimplicados en la generación y mantenimiento de esta peculiar or-ganización génica. Además, tal como hemos referido anteriormen-te, existen resultados que soportan la hipótesis de que estas secuen-cias SINE-like jueguen en T. cruzi un papel fundamental en la re-gulación de la expresión génica y en la generación de la plasticidadde su genoma. Dado que las secuencias SINE carecen de la maqui-naria necesaria para su transposición, se postula que serían los ele-mentos LINE los encargados de aportar la misma, a través de lasactividades enzimáticas propias para su transposición. Recientemente, describimos la presencia en T. cruzi del mensa-jero correspondiente a un elemento retrotransponible del tipo no-LTR (LINE - "long interspersed nucleotide elements"), denomina-do L1Tc, el cual posee tres marcos abiertos de lectura (ORF). Inte-resántemente, el extremo 5’ del elemento L1Tc muestra homologíade secuencia significativa con el elemento RIME, el cual ha mos-trado en T. brucei capacidad de activar la expresión de genes espe-cíficos. El segundo marco abierto de lectura de L1Tc contiene lossiete dominios consenso presentes en las proteínas con actividadtranscriptasa inversa. Mediante el uso de homopolímeros sintéti-cos de ARN en ensayos de extensión de cebador, se ha evidenciadola existencia de actividad transcriptasa inversa en extractos T. cruziy proteína recombinante codificada por el ORF2, con la formaciónde híbridos ARN-ADN. La actividad enzimática detectada no esinhibida por ddTTP y si lo es por novobiocina, rifamicina y AZT,inhibidores clásicos de la actividad enzimática transcriptasa inver-sa.

MOLECULAR CHARACTERIZATION AND FUNCTIONAL ROLE OF SPECIFIC

REPETITIVE AND INTERSPERSED NUCLEOTIDE ELEMENTS FROM

TRYPANOSOMA CRUZI

Repetitive DNA sequence are interspersed throughout the ge-nomes of mammals and other higher eukaryotes, and represent asubstantial portion of their genome. The T. cruzi genome containsseveral families of interspersed repetitive DNA sequences showingfeatures of the eukaryotic SINE sequences which represent morethan of 15% of the total parasite DNA. The finding that T. cruziSINE-like sequences are located in the intergenic regions of tan-dem gene arrays and also bordering the tandems favors the ideathat these elements may be implicated in the generation and main-tenance of this peculiar gene organization. The SINE-like sequences,on the other hand, may also be implicated in the regulation of geneexpression and in the generation of genome plasticity. It has beensuggested that the enzymatic machinery of the LINE is responsiblefor the genome integration of the SINE sequences. Recently, our Group has identified the presence of a non-LTRretrotransposon element or LINE "long interspersed nucleotide el-ements", named L1Tc, which is actively transcribed in the parasiteT. cruzi. The L1Tc transcript has three putative open reading frames(ORF) in different frames having at its 5' end a sequence with sig-nificative homologies with T. brucei RIME element which is ca-pable of activating the expression of certain genes. The deducedamino acid sequence from ORF2 shows the presence of the char-acteristic seven domains of the LINE retrotranscriptasas and thecatalytic site present in all the retrotranscriptase proteins. In addi-tion, by the use of specific synthetic RNA homopolymers as tem-plates and short oligonucleotides as primers we have shown that inT. cruzi and in the recombinant protein codify by ORF2 of the L1Tc,there is reverse transcriptase activity. The enzymatic activity de-tected is not affected by aphidicolin and ddTTP but is inhibited bynovobiocin, rifamycin SV and AZT. The deduced amino acid sequence of the ORF1 of the L1Tc ex-hibits a significant homology to the consensus sequence of the classII family of the endonuclease AP proteins. In fact, this homology isa common general feature to all of the LINE. Interestingly, we alsodetected homologies between this sequence presents in all LINEand particular domains involved in DNase I acid-base catalysis.The presence of the exonuclease III active residues and the con-served amino acids involved in DNase I acid-base catalisis, in simi-lar parts of LINE elements, provides an even stronger argument in

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La secuencia deducida de aminoácidos correspondiente al pri-mer marco abierto de lectura muestra una significativa homologíacon la secuencia consenso de las proteínas AP de clase II con acti-vidad endonucleasa, tal como la exonucleasa III. De hecho, estahomología es extensiva a todos los retrotransposones LINE descri-tos. Interesántemente, también detectamos homología significati-va entre las referidas secuencias presentes en los elementos LINEy la mayoría de los dominios implicados en la actividad de catálisisácido-base de la DNasa I. Esta presencia de los dominios activosde las enzimas AP y DNasa I en similares regiones de los elemen-tos LINE proporciona un fuerte soporte en favor de la existencia deuna potencial actividad nucleasa codificada por referidos elemen-tos. Si ello fuese así, esta actividad nucleasa podría ser la responsa-ble de generar los extremos 3’OH libres necesarios para que la trans-criptasa inversa inicie la transcripción de ARN intermediario. Deesta manera se explicaría el primer paso del mecanismo de integra-ción de un elemento LINE en el genoma, sin necesidad de requerirla existencia en el ADN de roturas previas creadas al azar. Por otraparte, y dado que los dominios activos de las DNasa I parecen man-tenerse en dichas regiones de los elementos LINE, es posible quela proteína codificada por estos elementos sea capaz de reconocerespecíficas estructuras conformacionales del ADN, de forma simi-lar a la DNasa I, y así igualmente generar los 3’ OH libres necesa-rios para que se inicie la transposición. Análisis de actividad enzimática con la proteína recombinantede 40 kda, denominada NL1Tc, obtenida por expresión "in vitro"del ORF1 de L1Tc en un sistema E. coli, reveló que la referidaproteína presentaba actividad endonucleasa con afinidad por sitiosabásicos. La proteína NL1Tc mostró capacidad para crear roturasen una de las cadenas de ADN de plásmidos superenrollados y par-cialmente depurinados. También se ha demostrado que la expre-sión "in vivo" de la proteína NL1Tc confiere viabilidad a bacteriasE. coli doble mutantes letales (BW286) por complementación de laactividad exonucleasa III cuyo gen está deleccionado. Por tanto,proponemos que esta actividad AP endonucleasa asociada a la pro-teína NL1Tc sería la encargada de introducir en el ADN los extre-mos 3’ libres que serían usados como iniciadores de la integraciónen el genoma de T. cruzi del elemento L1Tc y de forma genéricainducir las roturas en el ADN necesarias para la integración de estetipo de retrotransposones. Recientemente hemos demostrado queNL1Tc es capaz de eliminar grupos 3’ bloqueantes (3’ fosfatos y 3’fosfoglicolatos) de substratos de ADN dañados. Así, NL1Tc poseeactividades 3’ fosfatasa y 3’-fosfodiesterasa, y ello permitiría queextremos 3’ bloqueantes pudieran ser también dianas de inserción

favor of a potential nuclease activity of these elements. Within thisframework, the potential endonuclease activity could be respon-sible for the generation of the 3'OH sites necessary as primers forits reverse transcription (first step in the integration mechanism).Since the LINE share DNase I conserved domains it is also attrac-tive to think that these elements may also be able to recognize se-quence-dependent structural variations similar to those recognizedby DNase I and to generate the 3'OH needed for transposition. The analysis of the activity of the 40 Kd recombinant protein,named NL1Tc, obtained from the expression of the L1Tc ORF1 inan E. coli "in vitro" expression system, revealed that the sequencecodes for a protein with an apurinic-apyrimidinic (AP) endonu-clease activity. The NL1Tc protein was shown to make single-strandbreaks at partially depurinated supercoiled plasmids. We also haveobserved that in vivo expression of the NL1Tc protein conferredviability by complementation to E. coli exonuclease III deletionmutants (BW286 strain). We propose that the AP endonucleaseactivity associated to the N1Tc protein may introduce into the DNAfree 3' ends that could be used as primers for the integration alongthe T. cruzi genome of the L1Tc element and that the induced nick-ing could be used for retrotransposition of this type of elements. Wehave recently demonstrated that NL1Tc effectively removes 3’-block-ing (3’phosphate and 3’ phophoglycolate) groups from damagedDNA substrates. Thus, both 3’ phosphatase and 3’phosphodiestearase activities are present in NL1Tc. We proposethat these enzymatic activities would allow the 3’-blocking ends tofunction as targets for the insertion of L1Tc element, in addition tothe AP sites previously described. The potential biological func-tion of the NL1Tc protein has also been evidenced by its ability torepair by complementation the DNA damage induced by the MMSalkylating agent or oxidative agents such as H2O2 and t-BuO2H inE. coli (xth and xth, nfo) mutants.


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del elemento L1Tc. La actividad biológica 3’ fosfatasa y 3’-fosfodiesterasa de la proteína NL1Tc, se ha puesto también de ma-nifiesto por la capacidad de NL1Tc de reparar por complementa-ción el daño producido en el ADN por el agente alquilante (metilmetanosulfonato) y los agentes oxidantes (peróxido de hidrógenoy ter-butil hidroxi-peróxido) en mutantes dobles y simples de E.coli deleccionados en los genes codificantes para las enzima exo-nucleasa III y/o endonucleasa IV.


- Caracterización de antígenos de T. cruzi involucrados en infección e inmunopatología de la enfermedad de Chagas. CICYT, BIO96-0468. (1996-1999).

- Multiprimer PCR para el diagnóstico de micobacterias en muestras clínicas. Validación y adaptación para su uso rutinario en laborato-rios de diagnostico bacteriológico. CICYT-PETRI, 96-0119-OP. (1996-1997).

- Estudio del mecanismo de integración y control de transposición del elemento móvil L1Tc. Análisis de su capacidad de alterar laexpresión de genes específicos. DGESIC, PB96-0829. (1997-1999).

- Caracterización Molecular y funcional de antígenos de T. cruzi involucrados en infección. Identificación de epítopes T. y B. FIS, 98/0914. (1998-2000).

- Aislamiento y caracterización de los genes codificantes para la histona H2A de Trypanosoma rangeli. Programa Cooperación Científicacon Iberoamérica. (1999-2001).

- Determinación de la capacidad inmunoestimuladora y protectiva de determinados antígenos (de membrana, flagelares y citoplasmáti-cos) de Trypanosoma cruzi y Leishmania infantum frente a la infección por estos parásitos. CICYT- Fondos FEDER, IFD97-0630-C02-01. (1999-2001).


- José A. García García. Diagnóstico de tuberculosis: Aplicación del sistema PCR multiprimer y micobiograma en Middlebrook 7H10.Universidad de Granada. 1997

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- Concepción Marañón Lizana. Proteínas conservadas en Trypanosoma cruzi: estudio de la regulación de la expresión de los genesH2A y de la inmunogenicidad de la HSP70. Universidad de Granada. 1998.

- Clara I. González Rugeles. Análisis funcional de un elemento no LTR retrotransposon de Trypanosoma cruzi: L1Tc. Universidad deGranada. 1998.

- Mónica Olivares Martín. Organización del elemento móvil L1Tc en el genoma de Trypanosoma cruzi. Establecimiento del mecanis-mo de integración de los elementos LINE. Universidad de Granada. 1999.


Trabajos originales de Investigacion, publicados en revistas incluidas en el SCI

- Martin, F., Puerta, C, Thomas, M.C., Marañon, C., Martin, J., Patarroyo, M.E., Alonso, C. and Lopez, M.C. Identification of a Trypa-nosoma cruzi membrane epitope implicated in infectivity of the host cell by parasite. Parasitol Res. (1997). 83: 226-232.

- Ferrari, I., Lorenzi, H., Santos, MR., Brandariz, S., Requena, JM., Schijma, A., Vazquez, M., Gonzalez, A., Cortes, A., Lopez, M.C.,Thomas, M.C., Alonso, A., Ramirez, JL., Cohen, D., Le Paslier, D., Levin, MJ. Towards the Physical Map of the Trypanosoma cruziNulear Genoma: Construction of YAC and BAC Libraies of the Reference Clones T. cruzi CL-Brener. Mem. Inst. Oswaldo Cruz. (1997).92(6): 843-852.

- Gonzalez C.I., Martin, F., Thomas, M.C., Alcami, J., Alonso, C. and Lopez, M.C. Reverse Transcriptase activity in Trypanosoma cruziparasites. Acta Tropica. (1997). 63: 117-126.

- Olivares M., Alonso C. and Lopez M.C. The first ORF of the L1Tc retrotransposon of T. cruzi codes for a protein with apurinic-apyrimidinic activity. J. Biol. Chem. (1997). 272(44): 25224-25228.

- Gonzalez M.L., Tercero J.M., Matilla A., Niclos-Gutierrez J., Fernandez M.T., Lopez M.C., Alonso C. and Gonzalez S. Cis-Dichloro (a,w -diamino carboxylate ethyl ester) palladium (II) as Palladium (II) versus Platinum (II) Model Anticancer. Drugs: Synthesis, SolutionEquilibria of Their Aqua, Hydroxo, and/or Chloro Species, and in vitro/in vivo DNA-Binding Properties. Inorg. Chem. (1997). 36(9):1806-1812.


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- Alonso, P.L., Lopez, M.C., Bordmann, G, Smith, T.A., Aponte, J.J., Weiss, N.A., Urassa, H., Armstrong-Schellenberg, J.R.M., Kitua,A.Y., Masanja, H., Thomas, M.C., Oettli, A., Hurt, N., Hayes, R., Kilama, W.L. and Tanner, M. Humoral responses to P. falciparumantigens and its relation to protection during a malaria vaccine trial in Tanzanian children. Parasite Immunol. (1998). 20: 63-71.

- Marañon, C., Puerta C., Alonso C. and Lopez M.C. Control mechanisms of the H2A genes expression in Trypanosoma cruzi. Mol.Biochem. Parasitol. (1998). 92(2): 313-324.

- Planelles, L., Marañon C., Requena J.M. and Lopez M.C. Phage recovery by electroporation of naked DNA into host cells avoids theuse of packaging extracts. Anal. Biochem. (1999). 267: 234-235.

- Olivares M., Thomas, M.C., Alonso C., Lopez M.C. The L1Tc, Long Interpersed Nucleotide Elements from Trypanosoma cruzi encodesa protein with 3’ phosphatase and 3’ phosphodiesterase enzymatic activities. J. Biol. Chem. (1999). 274: 23883-23886.

- Marañon, C., Thomas, M.C., Puerta C., Alonso C. and Lopez M.C. The satability and maturation of the H2A histone mRNAs fromTrypanosoma cruzi are implicated in their post-transcriptiona regulation. Biochim. Biophys. Acta. (1999). (In press).

- Thomas, M.C., Garcia-Perez, J.L. Alonso C. and Lopez M.C. Molecular Characterization of KMP11 from Trypanosoma cruzi. Acytoskeleton associated protein regulated at a translational level. DNA and Cell Biol. (1999). (In press).

Revisiones y trabajos originales de investigacion, publicados en revistas no incluidas en el SCI

- Olivares, M, Martin, F., Marañon, C., Lopez, A. and Lopez, M.C. Caracterizacion molecular de un retrotransposon no-LTR. Organiza-cion genomica y modelo de integracion. Ars Pharmaceutica. (1997). 38(2-3): 209-220.

- Gonzalez, C.I., Thomas, C. and Lopez, M.C. Actividad RT-like asociada al elemento movil L1Tc. Ars Pharmaceutica. (1997). 38(2-3):221-227.

- Marañon, C., Puerta. C. and Lopez, M.C. Doble regulacion de la expresion genica de la histona H2A de Trypanosoma cruzi. ArsPharmaceutica. (1997). 38(2-3): 229-235.

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- Lopez, M.C., Olivares, M, Gonzales, C.I., Martin, F., Garcia-Perez, J.L. and Thomas, M.C. Elementos moviles: ¿Ventaja evolutiva oparasitismo molecular?. Ars Pharmaceutica, Articulo de revisión. (1999). 40:1, 5-25.


- Olivares, M., Gonzalez, CI., Thomas, MC., Porras, R., Marañon, C., Garcia-Perez, JL., Martin, F. and Lopez M.C. Mecanismo deintegracion en el genoma de los elementos moviles tipo LINE: su implicacion en la activacion tumoral. En: Jornadas sobre investigacionen Medicina,: Avances en Cancer. Ed: Unidad Mixta de Investigaciones Medicas. (1998).␣ pp. 86-97.

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l interés del laboratorio se centra en el estudio de los mecanis-mos genéticos y moleculares que permiten el desarrollo correctodel embrión de Drosophila, un organismo altamente polarizado tantoa lo largo del eje anterior-posterior, como del dorsal-ventral. Hoyen día se sabe que la madre, durante oogénesis, deposita en el hue-vo la información necesaria para que el embrión adquiera las dis-tintas partes que conforman su cuerpo. Por ejemplo, mRNAs depo-sitados en la parte anterior del oocito (huevo o gameto femenino enformación) son requeridos para el desarrollo de estructuras ante-riores como la cabeza y tronco, mientras que la localización deotros mRNAs y proteínas en el polo posterior de esta célula sonresponsables de la formación del abdomen. Esta distribución espa-cial de distintos determinantes dentro del oocito significa que estacélula posee una polaridad subcelular responsable, en última ins-tancia, del crecimiento programado del embrión. Por ello, entendercómo se desarrolla el oocito — y, por tanto, cómo adquiere su asi-metría — implica conocer cuál es el origen de la polaridad del em-brión.

Durante oogénesis se producen gametos de forma constante.El desarrollo adecuado de estos oocitos requiere, al menos, dospasos bien diferenciados. Primero, la existencia de células inmor-tales que se dividen continuamente de forma asimétrica, dando lu-gar a otra célula inmortal que renovaría el linaje, y a una célula hijaque entraría en diferenciación y que es capaz de desarrollarse como

E O ur main goal is to understand the genetic and molecularmechanisms underlying the correct development of the Drosophilaembryo, a highly polarised organism along both the anterior-pos-terior and dorsal-ventral axes. It is well known that during oogen-esis the female directs the localisation of several mRNAs and pro-teins to different places within the oocyte, the maturing egg. As aconsequence, the embryo acquires a polarity which allows, for in-stance, the development of anterior structures such as the headand thorax, or more posterior ones like the abdomen. Thelocalisation of these determinants to different subcellular targetsin the oocyte indicates that the oocyte itself is polarised. Thus, sincethe axial patterning of the embryo relies upon the correctlocalisation of maternal determinants within the oocyte, decipher-ing how the oocyte acquires its asymmetries implies understandingthe origin of polarity in Drosophila.

The regular production of functional oocytes during oogenesisrequires, in the first place, the existence of germline stem cells whichdivide asymmetrically to give rise to another stem cell and to adifferentiating cystoblast. Like in vertebrates, Drosophila germlinecells need for their development the activity of adjacent somaticcells. More importantly, a specialised group of somatic cells pre-sumably act upon the germline during the initial development andposterior maintenance of stem cell characteristics. These somatic

CÉLULAS INMORTALES Y FORMACIÓN DE PATRÓN DURANTE OOGÉNESIS ENDROSOPHILA

STEM CELLS AND PATTERN FORMATION IN DROSOPHILA OOGENESIS

JEFE DE GRUPO

GROUP LEADERAcaimo González Reyes

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oocito. Al igual que en vertebrados, las células germinales de Dro-sophila se asocian con varios tipos celulares de origen somáticodurante la maduración del oocito. Más concretamente, las célulasinmortales de la línea germinal necesitan de la función de distintascélulas somáticas que actúan presumiblemente tanto durante el de-sarrollo inicial de la inmortalidad como en su mantenimiento. Es-tas células somáticas proveerían a las células de la línea germinalcon un ‘nicho’ donde están presentes los factores de crecimientonecesarios para el mantenimiento de la inmortalidad.

En segundo lugar, la polarización del oocito requiere que ésteprogrese en meiosis. Durante meiosis se producen daños en el DNAconsecuencia del proceso de recombinación y, sorprendentemente,la reparación de estos daños requiere de la actividad de una serie degenes que fueron originalmente identificados por ser necesariospara el correcto desarrollo del embrión. En nuestro modelo, la faltade reparación de las lesiones en el DNA durante recombinaciónprovocaría la polarización anormal del oocito. Utilizando técnicasgenéticas, de biología del desarrollo, y de biología molecular, en ellaboratorio estamos analizando en profundidad el papel de las cé-lulas somáticas en el desarrollo de la inmortalidad en la línea ger-minal. Asimismo, nuestro estudio se centra en una serie de mutan-tes que son requeridos para el proceso de reparación del DNA du-rante meiosis, y para la polarización de los ejes de desarrollo delembrión.

cells would provide the germline stem cells a developmental ‘niche’with all the growth factors needed to maintain functional stem cells.

In second place, oocyte polarisation requires progressionthrough meiosis. During the process of meiotic recombination dam-age in the DNA is produced. Surprisingly, some of the genes in-volved in the repair of these DNA lesions were initially isolatedbecause of their role in the axial patterning of the embryo. In ourmodel, failure to repair the DNA lesions during recombination trig-gers the abnormal polarisation of the oocyte. Using a combinationof genetic and molecular approaches, we are analysing the role ofthe somatic cells in the development of germline stem cells. Ourinterest also focuses in the study of several mutants required forDNA repair during meiosis and for the polarisation of the embryo.

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- Micklem, D. R., Dasgupta, R., Elliott, H., Gergely, F., Davies, C., Brand, A., Gonzalez-Reyes, A. and St Johnston, D. The mago nashigene is required for the polarisation of the oocyte and the formation of perpendicular axes in Drosophila. Current Biology. (1997). 7,468-478.

- Gonzalez-Reyes, A.., Elliott, H. and St Johnston, D. Oocyte determination and the origin of polarity in Drosophila. the role of thespindle genes. Development. (1997). 124, 4927-4937.

- Gonzalez-Reyes, A. and St Johnston, D. Patterning of the follicle cell epithelium along the anterior-posterior axis during Drosophilaoogenesis. Development. (1998). 125, 2837-2846.

- Gonzalez-Reyes, A. and St Johnston, D. The Drosophila AP axis is polarised by the Cadherin-mediated positioning of the oocyte.Development. (1998). 125, 3635-3644.

- Gonzalez-Reyes, A. Pattern formation and DNA repair come together. Nature Cell Biology. (1999). 1, E150-E152.

Células inmortales y formación de patrón durante oogénesis en Drosophila

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Dpto. de Biología Celular e Inmunología


Jaime Sancho López

INVESTIGADORES DE PLANTILLA/STAFF RESEARCHS SCIENTISTS

Antonio Alcina MadueñoAbelardo López RivasJavier Martín Ibáñez

INVESTIGADORES CONTRATADOS/RESEARCHS ASSOCIATES

Fuencisla Matesanz del BarrioMª Dolores Collado EscobarMercedes Zubiaur Marcos

BECARIOS POSTDOCTORALES/POSTDOCTORAL FELLOWS

M. Carmen Ruiz RuizAntonio Nieto Díaz


María M. Téllez SeguraMaría I. Fedetz

Cristina Muñoz PinedoMalabika Sarkar

José Eduardo Calzada LombanaMaría Pascual MartínezMaría Guirado Torres

Teresa Orta García


M. Gemma Robledo Pérez

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BÚSQUEDA Y CARACTERIZACIÓN DE PROTEÍNAS DE PLASMODIUM

FALCIPARUM QUE PUEDAN SER DIANAS DE ACCIÓN CONTRA EL PARÁSITO.

n este proyecto llevamos a cabo un estudio a nivel celular ymolecular de las proteínas de P. falciparum que pueden estar impli-cadas en el desarrollo del parásito y, por lo tanto, que puedan ser deinterés como posibles diana de acción inmunológico o quimioterá-pico. Hemos puesto gran interés en la búsqueda de epítopos mimé-ticos entre secuencias de proteínas del parásito y del hospedadorhumano. La gran mayoría de los 2,5 millones de niños que muerenanualmente infectados por Plasmodium falciparum están afectosde complicaciones graves como la malaria cerebral y la anemiasevera. El proyecto se ha enfocado considerando la posibilidad deque alguna de estas patologías estén causadas por autoinmunidad

E

SEARCHING AND CHARACTERIZATION OF PLASMODIUM FALCIPARUM

PROTEINS THAT CAN BE ACTION TARGETS AGAINST THE PARASITE.

n this project we carry out un study at cellular and molecularlevel of the P. falciparum proteins that may be involved in the para-site development and, therefore, that can be of interest as possibleimmunological and chemotherapeutical action targets. We havestressed the search for mimetics epitopes between parasite sequenceproteins and sequence proteins from the human host. Most of the2.5 millions children who annually die infected by P. falciparumare affected of severe complications as the cerebral malaria andsevere anaemia. This project considers the possibility that some ofthese pathologies are caused by autoimmunity against erythrocytesand bone marrow precursor cells. Fist, we look for P. falciparum

I

INMUNOPATOLOGÍA EN LA MALARIA, MIMETISMO MOLECULAR, EINTERLEUQUINA-2

IMMUNOPATHOLOGY IN MALARIA, MOLECULAR MIMETICS AND INTERLEUKIN-2

JEFE DE GRUPOGROUP LEADER

Antonio Alcina Madueño

INVESTIGADOR

CONTRATADO

RESEARCH ASSOCIATE

Fuencisla Matesanz del Barrio


PREDOCTORAL FELLOWS

María M. Téllez SeguraMaría I. Fedetz

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dirigida contra eritrocitos y células precursoras de médula ósea. Enuna primera etapa, buscamos proteínas de P. falciparum que con-tienen epítopos comunes con los de proteínas del eritrocito huma-no, para lo cual, se ha hecho mediante screening diferencial de li-brerías expresión de antígenos del parásito con autoanticuerpos con-tra eritrocitos humanos. Estamos caracterizando varias de estas pro-teínas y los genes que las codifican. Mediante la producción deanticuerpos policlonales y monoclonales para tales antígenos re-combinantes determinaremos la proteína del hospedador y epítopocrosreactivo. Finalmente, para averiguar la relación que puedan tenerestos epítopos crosreactivos con la anemia severa, ensayaremosanticuerpos y linfocitos de pacientes infectados con P. falciparumque sufran esta patología, y analizaremos su reactividad y las linfo-quinas inducidas como la IL-1, IL-2, IL-3 IL-5, IL-6, IL-12, EPO,GM-CSF, y TNF.

AISLAMIENTO, ESTUDIO Y APLICABILIDAD TERAPÉUTICA DE NUEVAS

MOLÉCULAS DE INTERLEUQUINA-2 (IL-2).

La interleuquina-2 juega un papel fundamental en la regula-ción de la respuesta inmune ya que es el principal producto de lacélulas T después de la estimulaci6n del receptor de antígeno dellinfocito (TCR) .A diferencia de la IL-4 o el IFN-g producidos nosolamente por la célula T sino también por las células mastocíticasy células NK, respectivamente, la IL-2 está restringida a las célulasT activadas. Estos hechos sugieren que la IL-2 puede servir comomarcador de las fases tempranas de la activaci6n de la célula T. LaIL-2 está implicada en el control de la respuesta a lo propio y sudesregulación puede resultar en procesos de autoinmunidad.

El objetivo general de este proyecto es el determinar las carac-terísticas funcionales, estructurales y la utilidad potencial de cinconuevas moléculas de IL-2 que hemos encontrado en diferentes ce-pas de ratón. Se estudiarán las interacciones entre el ligando (IL-2)y su receptor (IL-2R), de la misma o distinta cepa, mediante análi-sis de Scatchard y ensayos de crecimiento y activación celular. Apar-te de los estudios básicos, moléculas quiméricas de IL-2 se ensaya-rán en células humanas in vitro. Vamos a determinar el potencialterapéutico de las diferentes IL-2 y las moléculas quiméricas que

proteins containing common epitopes to epitopes from human eryth-rocytes proteins, for which, a differential screening of expressionlibraries of P. falciparum antigens with specific autoantibodiesagainst human erythrocyte proteins has been done. We are charac-terizing several of these parasite proteins and the genes that en-code them. By obtention of monoclonal and policlonal antibodiesto such recombinant antigens we will determine the host proteinand the crossreactive epitope. Finally, to find out the relashionshipof these epitopes with malarial severe anaemia, we will assayedsera and limphocytes from infected patients suffering the pathol-ogy to analyse the reactivity and the limphokines induced as theIL1, IL-2, IL-3, IL-6, IL-12, EPO, GM-CSF, and TNF.

ISOLATION, STUDY, AND THERAPEUTIC APPLICABILITY OF NEW INTERLEUKIN-2 (IL-2) MOLECULES

IL-2 plays a critical role in the regulation of inmune responsesince is a principal product of native resting T cells upon primaryTCR stimulation. Unlike IL-4 or IFN-g that can be produced notonly by T cells but also by mast cells or NK cells, respectively, IL-2 production is restricted to activated T cells. These facts suggestthat IL-2 production can serve as a marker to monitor the earlyphases of T cell activation. IL-2 is involved in the control of theinmune response against the self and its deregulation can result inautoinmunity process.

The general goal of this project is to determine the functionaland structural characteristics, and the potential usefulness of fivenew IL-2 molecules that we have found in different mouse strains.The interactions between the ligand (IL-2) and its receptor (IL-2R), either from the same strain or from different strain, will bestudy by Scatchard analysis, growth and activation assays. Apartof the basic studies, quimeric molecules will be assayed in humancells in culture. In addition, the therapeutic potential of the differ-ent IL-2 will be determine in susceptible or resistant mouse strainsinfected with Plasmodium, Schistosoma mansoni, Trypanosomabrucei brucei, Trypanosoma cruzi, Vaccinia o different tumoral cells.For this study amounts of each IL-2 will be produced and purifiedfrom bacteria. Polyclonal and monoclonal antibodies will be ob-tained against the polymorphic regions.

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ORGANISMOS FINANCIADORES/Funding Agencies

- Caracterización de proteínas de Plasmodium falciparum, el agente causante de la malaria, Implicación en inmunopatología depolimorphismos de citoquinas (IL-2). Junta de Andalucia, CTS 369

- Estudio funcional y propiedades antitumorales de diferentes moléculas de IL-2. CICYT, PN-SAF 97/0043. (1997-2000).

- Implicación de la IL-2, alotipos de IL-2, dímeros de IL-2 y autoanticuerpos contra la IL-2 en la inmunopatología de la esclerosismúltiple: desarrollo de sistemas de detección y diagnóstico. CICYT-Fondos Feder, 1FD97-0596. (1999-2001).


- Matesanz, F. and Alcina, A. High expression in bacteria and purification of polymorphic mouse interleukin 2 molecules. Cytokine(1998). 10: 249-253.

- Bonay, P., Duran-Chica I, Fresno, M., Alarcon, B. and Alcina, A. Anti-parasitic effects of the intra-Golgi transport inhibitor Megalomicin.Antimicrob. Agent Chemother. (1998). 42: 2668-2673.

- Matesanz, F. and Alcina, A. Induction of autoantibodies to different interleukin-2 allotypes. J. Autoimmun. (1999). 12: 221-227.

- Matesanz, F. , Duran-Chica, I. and Alcina, A. The cloning and expression of PfACS1, a Plasmodium falciparum fatty acyl CoenzymeA synthetase-1 targeted to the host erythrocyte cytoplasm. J. Mol. Biol. (1999). 291(1), 59-70.

construyamos, en ratones de diferentes cepas, susceptibles o resis-tentes, infectados con Plasmodium, Schistosoma mansoni, Trypa-nosoma brucei brucei, Trypanosoma cruzi, Vaccinia, o diversascélulas tumorales. Para este estudio se producirá ciertas cantidadesde las diversas moléculas de IL-2 en bacterias y células eucarióti-cas y se obtendrán anticuerpos específicos policlonales y monoclo-nales. Además, se estudiará la implicación de la IL-2 humana y defactores relacionados con la IL-2 como son posibles alotipos, dí-meros moleculares de IL-2, y autoanticuerpos contra IL-2 en en-fermedades autoinmunes como la esclerosis múltiple.

In addition, we will study the implication of the human IL-2and IL-2 related factors as possible IL-2 alotypes, IL-2 dimers,and autoantibodies against IL-2 in auto inmune diseases asmultiple.sclerosis.

Inmunopatología en la malaria, mimetismo molecular, e Interleuquina-2

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- Matesanz, F. and Alcina, A. Nuevas moleculas de interleuquina-2: propiedades y posibles aplicaciones. En Jornadas Sobre Investigacionen Medicina. Unidad Mixta de Investigaciones Medicas. (1998). pp. 171-182.

- Matesanz, F., Duran-Chica I., Gallego, MD., Delgado, C. and Alcina, A. Aislamiento y determinacion de proteinas antigenicas dePlasmodium falciparum que contienen determinantes mimeticos con proteinas de eritrocitos humanos. En Jornadas Sobre Investigacionen Medicina. Unidad Mixta de Investigaciones Medicas. (1998). pp 289-302.

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l tratamiento de las células hematopoyéticas BAF3 dependien-tes de interleuquina-3 (IL3) con MTX e HU, incluso en la presen-cia de IL3, induce rápidamente la muerte de las mismas por apop-tosis. Por otra parte, la pérdida de IL3 induce en estas células unrápido desbalance de los niveles de dNTP que precede a la activa-ción de la fragmentación de la cromatina. Estos resultados indicanque alteraciones en el balance de deoxinucleótidos pueden ser unfactor importante en el mecanismo de apoptosis en células hemato-

reatment of the murine hemopoietic IL3-dependent cell line,BAF-3, with methotrexate and hydroxyurea, drugs that inhibit dNTPsynthesis, leads to a rapid onset of apoptosis in the presence of IL3.IL3 withdrawal also causes a decrease and imbalance in dNTPpools. The activity of thymidine kinase, a key enzyme in the salvagepathway of dNTP synthesis, is down-regulated following IL3 re-moval. Readdition of IL3 results in the rapid restoration of normaldNTP pools and a protein synthesis-independent increase in thy-midine kinase activity. Over-expression of a heterologous thymi-

TRATAMIENTOS GENOTÓXICOS Y FACTORES DE SUPERVIVENCIA EN

CÉLULAS HEMATOPOYÉTICAS: REGULACIÓN DE LA APOPTOSIS.

E

GENOTOXIC TREATMENTS AND SURVIVAL FACTORS IN HAEMOPOIETIC CELLS:REGULATION OF APOPTOSIS.

T

Regulación de la apoptosis en células normales y tumorales

REGULACIÓN DE LA APOPTOSIS EN CÉLULAS NORMALES Y TUMORALESREGULATION OF APOPTOSIS IN NORMAL AND TUMOR CELLS

JEFES DE GRUPO

GROUP LEADERSAbelardo López Rivas

BECARIA POSTDOCTORAL

POSTDOCTORAL FELLOWM. Carmen Ruiz Ruiz

BECARIOS PREDOCTORAL

PREDOCTORAL FELLOWS

Cristina Muñoz PinedoMalabika Sarkar

PERSONAL TÉCNICO

TECHNICAL ASSISTANTSM. Gemma Robledo Pérez

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poyéticas. Basándonos en estos resultados, hemos analizado elmetabolismo de dNTP en células BAF3 inducidas a apoptosis porla pérdida del factor de supervivencia IL3. Nuestros resultados in-dican que la actividad timidina kinasa (TK) desempeña un papelcentral en el control de los niveles de dNTP en células BAF3 y estáregulada por la IL3. Además, tanto en transfecciones transitoriascomo en células que expresan establemente la actividad TK delvirus herpes, existe una inhibición clara del proceso de apoptosis,lo que sugiere que la regulación de la actividad TK por factores desupervivencia puede ser una etapa importante en el mecanismo decontrol de la apoptosis.

En la actualidad estamos analizando el papel de la proteína su-presora de tumores p53 en la apoptosis de célula hematopoyéticassometidas a daño genotóxico. Para ello se han generado clones decélulas BAF3 que expresan constitutivamente una forma termo-sensible de p53 (p53Val135), una forma truncada inhibidora de p53(p53-DD) o la proteína E6 del virus papiloma humano 16 que fa-vorece la degradación de p53.

CARACTERIZACIÓN Y PURIFICACIÓN DE LA ACTIVIDAD ENDONUCLEASA

RESPONSABLE DE LA FRAGMENTACIÓN DEL DNA EN CÉLULAS EN

APOPTOSIS.

En nuestro grupo estamos también tratando de caracterizar al-gunas actividades efectoras en el proceso de apoptosis, principal-mente la actividad endonucleasa(s) responsable de la fragmenta-ción temprana del DNA en células hematopoyéticas BAF3. Losdatos obtenidos indican que la actividad endonucleasa mayoritariaen estas células depende de calcio fisiológico (10-7-10-6 M), es acti-vable a pH ácido y es inhibible por magnesio e iones monovalen-tes, zinc y ácido aurintricarboxílico. La apoptosis puede ser tam-bién inducida en estas células mediante los ionóforos valinomicinay nigericina que producen una disminución del pH intracelular. Laapoptosis inducida por los ionóforos de pH no es bloqueada por lainterleuquina-3 o el protooncogen bcl-2, lo que sugiere que la esti-mulación de la endonucleasa por pH ácido es un proceso final en eldesarrollo de la apoptosis. Es importante indicar que esta nucleasase haya presente en células que no están en apoptosis y que no seobserva incremento de actividad "in vitro" durante la apoptosis, lo

dine kinase, HSV-1 TK, protects cells from apoptotic death whenIL3 is removed. This demonstrates that IL3 regulates dNTP poolbalance and apoptosis by maintaining the salvage pathway of DNAprecursors synthesis.

We are currently studying the role of the tumor suppressor pro-tein p53 on the apoptotic response of hemopoietic cells to genotoxicdamage. To this end we have generated by gene transfection differ-ent clones expressing a temperature sensitive p53 (p53Val135), atruncated dominant negative p53 (DD) or the human papillomavirustype 16 E6 protein which induces the degradation of p53.

CHARACTERIZATION AND PURIFICATION OF THE ENDONUCLEASE ACTIVITY

RESPONSIBLE FOR DNA FRAGMENTATION DURING APOPTOSIS:

Fragmentation of chromatin in isolated nuclei, from the mu-rine IL-3-dependent cell line BAF3, could be stimulated either by adecrease in pH to 6.5, or by the presence of sub-mM calcium at pH7.0. An endonuclease was purified from nuclear extract of BAF3cells which retained these dual signals for activation. Both frag-mentation of chromatin in nuclei and activity of purified endonu-clease was inhibited by mM magnesium and potassium at concen-trations above 50mM. These characteristics are distinct from thosedescribed for other mammalian endonucleases. Apoptosis couldbe induced in BAF3 cells by using the ionophores valinomycin ornigericin to lower intracellular pH. Cell death induced by the iono-phores could not be inhibited by IL-3 or by over-expressing bcl-2.This is consistent with the ionophores activating a late step in theapoptotic pathway, such as the endonuclease itself.

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que sugiere que posiblemente lo que se altera durante la apoptosisson los moduladores (pH, calcio, otros iones, factores proteicos) dela actividad, pero no la actividad misma.

MECANISMOS DE LA INDUCCIÓN DE APOPTOSIS EN LINFOCITOS THUMANOS.

El objetivo de esta línea de investigación es el análisis de lasseñales tempranas implicadas en la inducción de apoptosis tras laactivación de los linfocitos T. Para ello hemos analizado el meca-nismo de la apoptosis en células de una línea leucémica Jurkat delinfocitos T que expresan el receptor heterólogo muscarínico detipo 1 (J- HM1-2.2), el cual está acoplado al metabolismo de fos-folípidos de inositol (PtdIns) mediante proteínas de unión a GTP, eindependientemente de la activación de proteínas tirosin-quinasas.

En células J-HM1-2.2, la activación del receptor muscarínicocon el agonista carbacol es suficiente para inducir apoptosis. Igual-mente, la activación en estas células del receptor para el antígeno(TCR) o la adición de drogas (ionóforos de calcio y thapsigargina)que incrementan el calcio intracelular, activan el proceso de la apop-tosis. Estudios llevados a cabo en nuestro grupo han demostradoque la entrada de calcio desde el medio extracelular, la subida de laconcentración de calcio intracelular, la estimulación de la fosfatasacalcineurina y la síntesis "de novo" de proteínas, son etapas nece-sarias en la inducción de la apoptosis mediada por la activación dereceptores (TCR y HM1), pero no en la apoptosis inducida por lasdrogas. El mecanismo de la apoptosis inducida por la activación delos receptores TCR y HM1 implica al menos parcialmente, la par-ticipación del sistema Fas/Fas-L, ya que es bloqueada en la presen-cia de un anticuerpo anti-Fas antagonista. En cambio, la activaciónde apoptosis por ionóforo de calcio o thapsigargina no requiere laestimulación de Fas. Todos estos resultados indican que en linfoci-tos T existen al menos dos mecanismos de inducción de apoptosis:uno, a través de receptores acoplados al metabolismo del calcio,que implica la estimulación del par Fas/Ligando de Fas, y otro,activado por compuestos que provocan la movilización del calciode depósitos intracelulares y que aparentemente sólo requiere elvaciado permanente de estos depósitos.

MECHANISM OF ACTIVATION-INDUCED CELL DEATH IN HUMAN TLYMPHOCYTES:

We have analysed the requirements for activation-inducedapoptosis in Jurkat T cells expressing the heterologous human mus-carinic type 1 receptor (HM1R) (J-HM1-2.2 cells) which is coupledto phosphatidylinositol turnover through a protein tyrosine kinase-independent, G protein-regulated mechanism. Triggering of HM1Rwith agonist carbachol is sufficient to induce apoptosis in J-HM1-2.2 cells. Apoptosis is also induced in J-HM1-2.2 cells by trigger-ing of the T cell receptor (TCR) or by addition of drugs which in-crease intracellular [Ca2+]. Calcium influx, intracellular [Ca2+]increase, calcineurin function and "de novo" protein synthesis arenecessary for receptor-controlled, activation-induced apoptosis butnot for calcium mobilising agent-induced apoptosis. However,blocking protein kinase C with a specific inhibitor does not abro-gate receptor or drug-induced apoptosis. Furthermore, HM1R, butnot drug-induced apoptosis was inhibited by blocking Fas ligand/Fas interaction with an antagonist anti-Fas antibody and Fas ligandmRNA was expressed in J-HM1-2.2 cells stimulated through theHM1R but not by calcium-mobilising agents. Taken together, theresults demonstrate the existence of at least two apoptotic path-ways regulated by calcium in J-HM1-2.2 cells: one of them, whichinvolves stimulation of phosphatidylinositol turnover, couples HM1Rand TCR to apoptosis through a Fas-dependent mechanism andrequires calcineurin stimulation but not protein kinase C activa-tion. The other one apparently only requires the permanent deple-tion of the intracellular calcium stores, but neither requires cal-cium influx and [Ca2+] increase nor calcineurin function.

We are currently studying the regulation at the transcriptionallevel of the genes for Fas and Fas ligand. To this end we haveobtained several fragments of the 5' promoter region of both genes.We intend to elucidate the regulation of these promoters upon theactivation of T lymphocytes.


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En la actualidad estamos analizando, a nivel transcripcional, laexpresión de los genes Fas y su ligando FasL. Para ello hemos clo-nado diversos fragmentos de la región 5' de ambos genes en el vec-tor de expresión pXP2-luc. Con estos plásmidos estamos llevandoa cabo experimentos de transfección y de activación del promotoren células Jurkat.

OBTENCIÓN DE ANTICUERPOS MONOCLONALES ESPECÍFICOS DE

MOLÉCULAS DE LA SUPERFICIE DE CÉLULAS EN APOPTOSIS.

La línea de células humanas leucémicas T Jurkat ha sido muyutilizada como modelo celular para analizar los mecanismos detransmisión de señales implicados en la activación de linfocitos T através del complejo receptor para el antígeno (TcR/CD3). Nuestrogrupo está estudiando en este sistema modelo las señales implica-das en la muerte por apoptosis de células T. Uno de nuestros obje-tivos ha sido obtener anticuerpos monoclonales capaces de recono-cer antígenos expresados en la membrana celular durante la induc-ción de apoptosis en células Jurkat. Para ello inmunizamos ratonescon células Jurkat tratadas durante 10h con ionóforo de calcio (po-tente inductor de apoptosis en esta línea celular), y seguimos unprotocolo ya establecido de obtención de anticuerpos monoclona-les. Ensayamos los sobrenadantes de cultivo de los hibridomasobtenidos sobre células Jurkat inducidas o no con ionóforo de cal-cio, mediante citometría de flujo y seleccionamos únicamente aque-llos sobrenadantes que reconocían antígenos en células inducidas aapoptosis pero no en células control. De este modo hemos obteni-do un hibridoma ("5E6") productor del tipo de anticuerpos desea-do. Hemos realizado ensayos induciendo apoptosis con otros agen-tes como etopósido (inhibidor de la topoisomerasa II) o ciclohexi-mida (inhibidor de síntesis de proteínas) y en ambos casos vemosque hay una cierta expresión de esa molécula reconocida por elanticuerpo 5E6. Haciendo un doble marcaje con fluoresceina y conioduro de propidio (permite determinar el ciclo celular) comproba-mos que efectivamente son las células en apoptosis (pico subG1)las que expresan dicho antígeno. También se están llevando a caboestudios mediante western blot para intentar detectar la proteínareconocida por este anticuerpo. Así mismo se están realizando aná-lisis de la expresión de esta molécula en otros tipos celulares enapoptosis.

PREPARATION OF MONOCLONAL ANTIBODIES SPECIFIC FOR CELL SURFACE

MOLECULES FROM APOPTOTIC CELLS.

The human leukemic T cell line Jurkat has been widely used asan in vitro model system to analyse T cell activation through teCD3/TcR complex as these cells express most of the molecules in-volved in receptor signalling. In this cellular model we are study-ing the signals implicated in T cell death. One of our main objec-tives has been to obtain monoclonal antibodies which are able tospecifically recognize antigens expressed in the membrane of Jurkatcells induced to apoptosis. To this end, mice were immunized withJurkat cells induced to apoptosis with calcium ionophore (a potentinducer of cell death in this cell line) for 10 hours. Splenocytesfrom these mice were fused to myeloma cells and the resulting hy-bridomas were screened by flow cytometry for the secretion of an-tibodies specific for apoptotic Jurkat cells. In this way, we haveobtained a hybridoma, 5E6, which produces an antibody that rec-ognizes Jurkat cells induced to apoptosis upon activation with cal-cium ionophore, anti-CD3 monoclonal antibody, cycloheximide andetoposide.

By double staining, we have been able to characterize the sub-G1 apoptotic cells as the ones which are recognized by this anti-body. On the other hand, permeabilized non-apoptotic Jurkat cellswere also recognized by the antibody which suggests that the anti-gen is present originally in the cells in an intracellular compart-ment. Induction of apoptosis makes this antigen accessible to themonoclonal antibody. Experiments are in progress to identify theantigen recognized by this antibody and to determine the expres-sion of this molecule in other cells and tissues.

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REGULACIÓN POR PROTEÍNA QUINASA C DE LA RESISTENCIA A LA

APOPTOSIS MEDIADA POR CD95/FAS/APO-1.

Nuestro grupo ha descrito recientemente que la estimulaciónen células Jurkat de proteína quinasa C (PKC) previene la apopto-sis mediada por activación de CD95/Fas/APO-1. Esta inhibicióntiene lugar en las etapas mas tempranas del mecanismo de apopto-sis. Mas recientemente, se ha descrito que la irradiación de célulascon luz ultravioleta (UV) induce la apoptosis de las mismas porcausar el entrecruzamiento de los receptores CD95/Fas/APO- 1 enlas células diana. Nuestros estudios mas recientes han demostradoque la activación de PKC también retrasa la apoptosis inducida porirradiación UV en linfocitos T de la línea Jurkat. Otros datos denuestro laboratorio indican que esta inhibición de apoptosis porPKC implica, al menos en parte, a la ruta de quinasas activablespor mitógenos (MAPK). Sin embargo, nuestros datos demuestranque existe un mecanismo independiente de MAPK, que es el res-ponsable principal de la resistencia a apoptosis inducida por PKC.Nuestros resultados mas recientes demuestran que este mecanismopuede ser la inhibición por PKC de la oligomerización de recepto-res CD95, necesaria para la iniciación de la cascada de cistein-proteasas (caspasas) implicadas en la apoptosis.

APOPTOSIS Y CÁNCER DE MAMA: ESTUDIO CLÍNICO-EXPERIMENTAL DE

MOLÉCULAS RELACIONADAS CON LOS MECANISMOS DE RESISTENCIA A

LA TERAPÉUTICA.

Al analizar el efecto de diversos tratamientos genotóxicos en laapoptosis de células de cáncer de mama, hemos observado un clarosinergismo entre las drogas antitumorales y anticuerpos monoclo-nales anti-CD95 (Fas/APO-1). Se ha estudiado el nivel de expre-sión de CD95 en la membrana de las células tumorales y su posibleregulación por los agentes genotóxicos. Los resultados obtenidosindican que tras el tratamiento con doxorubicina, metotrexato oirradiación-gamma, se observa una clara elevación de los nivelesde CD95 en la membrana de células MCF-7 y T47D pero no en lascélulas de las líneas MDA-MB231 y EVSA-T. Dada la participa-ción de la proteína supresora de tumores p53 en respuestas queresultan del daño al DNA, hemos determinado la expresión y fun-

REGULATION BY PROTEIN KINASE C OF FAS RECEPTOR AGGREGATION AND

APOPTOSIS INDUCED UPON TREATMENT WITH ANTI-FAS ANTIBODIES OR

ULTRAVIOLET RADIATION .

We have recently described that activation of protein kinase C(PKC) plays a negative role in Fas-mediated apoptosis counter-acting at an early stage the signals generated upon cross-linkingof this receptor by anti-Fas monoclonal antibodies. More recently,it has been reported that ultraviolet radiation (UV) inducesapoptosis by the activation of the Fas pathway. We have demontratedthat activation of PKC also attenuates UV radiation-inducedapoptosis in Jurkat cells. We have data indicating that althoughthe PKC-induced mitogen-activated protein kinase (MAPK) path-way could be partially implicated in the abrogation of Fas-medi-ated apoptosis by phorbol esters, the major inhibitory effect is ex-erted through a PKC-dependent, MAPK-independent signalingpathway. Furthermore, we demonstrate that activation of PKC pre-vents Fas receptor aggregation elicited either by anti-Fas antibod-ies or UV radiation. These results reveal a novel mechanism bywhich cells may regulate their sensitivity to Fas-mediated cell deaththrough agonist-induced activation of PKC and suggest a possibleexplanation for the resistance to apoptosis of cells expressing highlevels of Fas receptors in their membranes.

APOPTOSIS AND BREAST CANCER: CLINICAL/EXPERIMENTAL STUDY OF

MOLECULES RELATED TO THE MECHANISMS OF RESISTANCE TO THERAPY.

We have analyzed the expression of Fas/CD95 receptor upontreatment with genotoxic drugs in several breast tumor cells, as ithas been recently described that DNA damage-induced apoptosiscan be mediated by the Fas/FasL ligand system in some tumor cells.We determined by flow cytometry the expression of CD95 in thebreast tumor cell lines MCF-7, T47D and EVSA-T before and aftertreatment with doxorubicin, methotrexate or gamma-irradiation,at doses frecuently used in cancer therapy. These treatments in-duced an up-regulation of CD95 expression in MCF-7 and T47Dcells, while EVSA-T failed to express this receptor under the sameconditions. We also analyzed the expression of Fas ligand proteinin all these breast tumor cells in response to DNA damage. How-


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cionalidad de esta proteína en las diversas líneas de cáncer de mamautilizadas e igualmente hemos analizado su posible participaciónen la regulación de la expresión de CD95. Las líneas MCF-7 yT47D mostraban niveles basales reducidos de p53 y respondían alos tratamientos antitumorales con una marcada elevación del con-tenido de esta proteína. En cambio, las células de las líneas EVSA-T y MDA-MB231 tenían niveles basales elevados de p53 y no seobservaba aumento de la misma tras los tratamientos. Estos resul-tados sugerían la presencia de p53 normal en las células MCF-7 yT47D y mutante en las células EVSA-T y MDA-MB231. Esta po-sibilidad se confirmó al analizar la expresión de proteínas cuyosgenes están regulados a nivel transcripcional por p53. Los nivelesde WAF1/p21 y MDM-2, dos de estas proteínas, se elevaban consi-derablemente en células MCF-7 y T47D incubadas en presencia dedoxorubicina o metotrexato, pero no en células MDA-MB231 yEVSA-T.

Para demostrar el requerimiento de p53 normal en la respuestacelular a drogas antitumorales hemos generado por transfecciónlíneas celulares que expresan constitutivamente la proteína E6 delpapilomavirus humano HPV-16. Esta proteína promueve la degra-dación de p53 por el proteosoma y por lo tanto impide su acumula-ción tras el daño al DNA. En los diferentes clones se estudió larespuesta a las drogas en cuanto a la capacidad de inducir la expre-sión de proteínas reguladas transcripcionalmente por p53. Los re-sultados obtenidos demostraban el requerimiento estricto de la acu-mulación de p53 en la regulación de la expresión de estas proteí-nas. Particularmente interesante es la inhibición de la expresión deCD95/Fas/APO-1 en los clones E6.

Finalmente, hemos generado clones de células de cáncer demama que expresan constitutivamente una forma mutada de p53de ratón (p53-Val135) con características de termosensibilidad. Estemutante adquiere características de proteína transcripcionalmenteinactiva a 37ºC y activa a 32ºC. El estudio de estos clones ha de-mostrado que la incubación de las células a 32ºC es suficiente paraaumentar la expresión de proteínas reguladas transcripcionalmentepor p53 y, concretamente, CD95/Fas/APO-1.

Estos resultados implican a p53 en la regulación de la expre-sión de CD95/Fas/APO-1, posiblemente a nivel transcripcional,como ha sido descrito en células eritroleucémicas. En la actualidad

ever no induction of Fas ligand was observed under conditionswhich up-regulated CD95 expression. Furthermore, apoptosis in-duced by the genotoxic drugs was not blocked by an antagonisticFas mAb (DX2) suggesting that in breast carcinomas, DNA dam-age-induced apoptosis does not require the Fas/Fas ligand system.

To determine the role of p53 in the expression of CD95 in breastcancer cells, we initially studied the p53 response to chemothera-peutic drugs in the tumor cell lines MCF-7, T47D and EVSA-T. Weobserved that in MCF-7 and T47D cells the basal level of p53 waslow and there was a marked accumulation after treatment with ei-ther doxorubicin or methotrexate. In contrast, untreated EVSA-Tcells showed a greatly elevated level of p53 and there was only asmall increase in p53 after treatments. An elevated level of p53 isfrequenly indicative of reduced degradation by cellular proteasesand has been observed in tumor cells with mutated p53, which isoften devoided of transcriptional activity. To determine whetherEVSA-T cells contained an inactive p53 we compared the expres-sion of p21/WAF and MDM-2 proteins, whose genes are regulatedat the transcriptional level by p53, in MCF-7, T47D and EVSA-Tcells after incubation with the drugs. Both proteins were up-regu-lated in MCF-7 and T47D cells following genotoxic treatment whileEVSA-T failed to express these proteins. It is interesting to notethat p53 protein in T47D cells contains a point mutation. Howeverthe accumulation of p53 protein and the up-regulation of p21/WAFand MDM-2 proteins indicate that p53 protein has transcriptionalacitivity in this cell line. These results suggest that p53 play animportant role in regulating CD95 expression in breast tumor cellsin response to DNA-damage. To further demonstrate the role ofp53 in drug-induced CD95 up-regulation, we generated MCF-7cells expressing the human papillomavirus type 16 E6 protein whichinduces the degradation of p53. The clones transfected with E6exhibited a marked reduction in the accumulation of p53 and theup-regulation of p21/WAF and CD95 in response to doxorubicinwhen compared to the pCMV-neo transfected cells. These resultsdemonstrate that induction of CD95 protein by DNA-damagingdrugs require the presence of elevated levels of p53. Furthermore,overexpression of mutant p53ts (Val135) is sufficient to induce p21/WAF and CD95 in MCF-7 cells at the permissive temperature (32ºC). These results indicate that accumulation of wild type p53 issufficient to elevate CD95 receptor expression in breast tumor cells.

57

estamos analizando la regulación de la expresión del mRNA deCD95/Fas/APO-1 y la capacidad promotora de varios fragmentosde la región 5' del gen CD95/Fas/APO-1, algunos de ellos conte-niendo un sitio consenso para p53.


- Regulación de apoptosis en el sistema hematopoyético: Señales implicadas y caracterización de endonucleasas. CICYT, SAF94-0768.(1994-1997).

- Apoptosis en el sistema hematopoyético. Regulación por factores solubles, daño al DNA y adhesión celular. CICYT, SAF97-0064-C03-01. (1997-2000).

- Apoptosis y cancer de mama. Estudio clínico-experimental de moléculas relacionadas con los mecanismos de la resistencia a la terapéu-tica. Fundación Ramón Areces. (1997-2000).

- Aplicación de estrategias biotecnológicas al estudio de los mecanismos de la apoptosis en células tumorales. FEDER, 1FD97-0514-CO2-01. (1999-2001).


- María C. Ruiz Ruiz. Identificación y estudio de moléculas de la superficie de células T con capacidad de inducir apoptosis. Universi-dad de Granada. 1997.


The up-regulation of CD95 receptor upon genotoxic treatmentin the membrane of breast cancer cells could be important in theelimination of the tumor cells by Fas ligand-expressing cells suchas cytotoxic T lymphocytes which infiltrate the tumor. In order todetermine whether the exposure to the drugs can sensitize breasttumor cells to CD95-mediated apoptosis, we analyzed CD95 ex-pression in MCF-7 and T47D cells following treatment with lowdoses of doxorubicin or methotrexate, which did not cause apoptosisin a short-term. At these doses, the drugs were able to induce CD95expression and sensitize the cells to CD95 antibody-inducedapoptosis.

58



- Furlong, I.J., Ascaso, R., Lopez-Rivas, A. and Collins, M.K.L. Intracellular acidification induces apoptosis by stimulating ICE-likeprotease activity. J.Cell Sci. (1997). 110, 653-661 .

- Oliver, J., Collins, M.K.L. and Lopez-Rivas, A. Overexpression of a heterologous thymidine kinase delays apoptosis induced by factordeprivation and inhibitors of deoxynucleotide metabolism. J. Biol. Chem. (1997). 272, 10624-10630.

- Ruiz-Ruiz, M.C., Izquierdo, M., de Murcia, G. and Lopez-Rivas, A. Activation of protein kinase C attenuates early signals in FAS-mediated apoptosis. Eur.J. Immunol. (1997). 27,1442-1450.

- Furlong, I.J., Lopez-Mediavilla, C., Ascaso, R., Lopez-Rivas, A. and Collins, M.K.L. Induction of apoptosis by valynomycin:mitochondrial permeability transition causes intracellular acidification. Cell Death and Differentiation. (1998). 5, 214 - 221.

- Ruiz-Ruiz, M.C. and Lopez-Rivas, A. p53-mediated up-regulation of CD95 is not involved in genotoxic drug-induced aopotosis ofhuman breast tumor cells. Cell Death and Differentiation. (1999). 6, 271-280.

- Ruiz-Ruiz, M.C., Robledo, G., Font, J., Izquierdo, M. and Lopez- Rivas, A. Activation of protein kinase C prevents Fas receptoraggregation and apoptosis induced upon treatment with anti-Fas antibodies or ultraviolet radiation. J. Immunol. (1999). 163: 4737-4746.

Contribuciones a Libros/Contributions to Books

- Collins, M.K.L. and Lopez-Rivas, A. Cytokines and Apoptosis: The Mechanism of Regulation of Cell Death. Colony StimulatingFactors. Molecular and Cellular Biology. (1997). Marcel Dekker. Ed. John M. Garland, Peter J. Quesenberry and Douglas J. Hilton.

59

MARCADORES GENÉTICOS DE SUSCEPTIBILIDAD/SEVERIDAD EN ARTRITIS

REUMATOIDE Y ESPONDILITIS ANQUILOSANTE.

INMUNOGENÉTICA DE LA ENFERMEDAD DE CHAGAS.

GENETIC MARKERS OF SUSCEPTIBILITY/SEVERITY IN RHEUMATOID

ARTHRITIS AND ANKYLOSING SPONDYLITIS.

IMMUNOGENETICS OF CHAGA'S DISEASE.


BASES MOLECULARES DE LAS ENFERMEDADES AUTOINMUNESMOLECULAR BASIS OF AUTOIMMUNE DISEASES

JEFE DE GRUPO

GROUP LEADERJavier Martín Ibañez

INVESTIGADORA

CONTRATADA

RESEARCH ASSOCIATE

Mª Dolores Collado Escobar

BECARIO POSTDOCTORAL

POSTDOCTORAL FELLOWAntonio Nieto Díaz

PERSONAL PREDOCTORAL

PREDOCTORAL FELLOWS

José Eduardo Calzada LombanaMaría Pascual Martínez

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- Análisis del polimorfismo en genes involucrados en la presentación antigénica: su influencia en la inmunopatología de la espondilitisanquilosante. Fundación Ramón Areces. (1995-1997).

- Estudio de la influencia del factor de necrosis tumoral (TNF) en la inmunopatogenia de la artritis reumatoide. SAS (1997).

- Estudio de las bases moleculares de la susceptibilidad y/o progresión de la artritis reumatoide. CICYT, SAF97-0046. (1997-2000).

- Caracterización de proteínas inmunogénicas. Grupo de Investigación, Junta de Andalucía. CTS180.


- Antonio Nieto Díaz. Diseño y desarrollo de un nuevo sistema de tipaje HLA genómico: "Paseo Alélico". Universidad de Granada.1997.

- Alberto Fraile Ramos. Polimorfismo de genes del MHC en la espondilitis anquilosante. Universidad de Granada. 1997.

- Yasmina Beraún Milla. Análisis del polimorfismo de genes del complejo mayor de histocompatibilidad en la infección por Trypano-soma cruzi. Universidad de Granada. 1998.


- Vinasco, J., Beraun, Y., Nieto, A., Fraile, A., Mataran, L., Pareja, E. and Martin, J. Polymorphism at the TNF loci in rheumatoid arthritis.Tissue Antigens. (1997). 49: 74-78.

- Nieto, A., Tobes, R., Martin, J. and Pareja, E. Allele Walking: a new and highly accurate approach to HLA-DRB1 typing. Applicationto HLA- DRB1*04 alleles. Tissue Antigens. (1997). 49: 141-151.

- Nieto, A., Fraile, A., Vinasco, J. and Martin, J. HLA-B*27 typing by PCR-restriction fragment length polymorphism. Tissue Antigens.(1997). 49: 283-286.

61

- Vinasco, J., Beraun, Y., Nieto, A., Fraile, A., Pareja, E., Mataran, L. and Martin, J. Heat shock protein 70 gene polymorphisms inrheumatoid arthritis. Tissue Antigens. (1997). 50: 71-73.

- Pareja, E., Tobes, R., Martin, J. and Nieto, A. The tetramer model: a new view of class II MHC molecules in antigenic presentation toT cells. Tissue Antigens. (1997). 50: 421-428.

- Pareja, E., Tobes, R., Nieto, A. and Martin, J. Two classes of class II interactions with TCR. Immunol Today. (1998). 19: 193-194.

- Vinasco, J., Fraile, A., Nieto, A., Beraun, Y., Pareja, E., Mataran, L. and Martin, J. Analysis of LMP and TAP polymorphism by PCR-RFLP in rheumatoid arthritis. Ann Rheum Dis. (1998). 57: 33-37.

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- Fraile, A., Nieto, A., Mataran, L. and Martin, J. HSP70 gene polymorphisms in ankylosing spondylitis. Tissue Antigens. (1998). 51:382-385.

- Fraile, A., Nieto, A., Beraun, Y., Vinasco, J., Mataran, L. and Martin, J. Tumor necrosis factor gene polymorphisms in ankylosingspondylitis. Tissue Antigens. (1998). 51: 386-390.

- Beraun, Y., Nieto, A., Collado, MD., Gonzalez, A. and Martin, J. Polymorphisms at tumor necrosis factor (TNF) loci are not associatedwith Chagas´ disease. Tissue Antigens. (1998). 52: 81-83.

- Fraile A, Martin J, Lopez-Nevot MA, Mataran L and Nieto A. HLA-B*27 subtyping by PCR-RFLP in Spanish patients with ankylosingspondylitis. Tissue Antigens. (1998). 52: 492-496.

- Martin J, Calzada JE and Nieto A. Inducible Nitric Oxide Synthase (NOS2) gene polymorphism and parasitic diseases. Lancet. (1999).353: 72.

- Sanz, L., Beraun, Y., Nieto, A., Martin, J., Vilches, C., de Pablo, R. A new HLA-Cw*15 allele, Cw*1508, identified in the Peruvianpopulation. Tissue Antigens. (1999). 53: 391-393.

- Nieto, A., Beraun, Y., Collado, MD., Caballero, A., Alonso, A., Gonzalez, A. and Martin, J. HLA haplotypes are associated withdifferential susceptibility to Trypanosoma cruzi infection. Tissue Antigens (1999). (In press).

Bases moleculares de las enfermedades autoinmunes

62


- Nieto, A., Caliz, R., Pascual, M., Mataran, L., Garcia, S. and Martin, J.Involment of FcgRIIIA genotypes in the susceptibility to rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum (1999). (In press).

- Fraile, A., Collado, MD., Mataran, L., Martin, J. and Nieto, A. TAP1 and TAP2 polymorphism in Spanish patients with ankylosingspondylitis. Exp. Clin. Immunogenetics (1999). (In press).

- Collado, M.D., Nieto, A., Mataran, L., Raya, E. and Martin, J. Interleukin 6 gene promoter polymorphism is not associated with ankylosing spondylitis. J. Rheum. (1999). (In press).

- Pascual M, Nieto, A., Mataran, L., Balsa A, Pascual-Salcedo D, Martín J. IL-6 promoter polymorphism in rheumatoid arthritis. GenesImmun (in press).

63

a línea principal de investigación del laboratorio es el estudiode la transducción de señales y la utilización de las moléculas se-ñalizadoras como posibles dianas terapéuticas, con especial énfa-sis en el papel de la fosforilación en tirosina en las interaccionesproteína/proteína y en la transmisión de señales activadoras al inte-rior de las células. En nuestro laboratorio se han caracterizado al-gunas de las rutas señalizadoras que se activan tras la estimulaciónde CD38 o CD3 en linfocitos T. En la actualidad nuestro principalinterés es comprender cómo estas moléculas se asocian con otrosreceptores de membrana, tirosina-quinasas, u otras moléculas se-ñalizadoras. Para ello, se utilizan diversas técnicas, tanto de Biolo-gía Celular como de Bioquímica de Proteínas y de Biología Mole-cular. Entre ellas, el cultivo de líneas celulares, inmunoprecipita-ciones, técnicas de Western-blot, ensayos in vitro de actividad

L ur current research interest is in signal transduction and sig-naling molecules as drug targets with special emphasis on the roleof tyrosine phosphorylation in protein/protein interactions andtransmission of activating signals into the cells. We have charac-terized some of the early signaling events triggered by CD38 orCD3 engagement in Jurkat T cells. Now our focus is to understandhow these molecules are associated with other cell surface recep-tors and intracellular protein tyrosine kinases (PTKs), or other sig-naling molecules. To study this, we use a variety of techniques,among them: Tissue Culture of T, B and myeloid cells, Western blot-ting, Immunoprecipitation, and In Vitro Kinase Assays. Further-more, reconstitution experiments in COS and T cells (transient orstable transfection of cDNAs encoding cell membrane receptors asCD38, TCR subunits, PTKs, or other signaling molecules), expres-

O

MECANISMOS DE TRANSMISIÓN DE SEÑALES DE ACTIVACIÓN POR RECEPTORESDE MEMBRANA

RECEPTOR-MEDIATED SIGNAL TRANSDUCTION

JEFE DE GRUPO

GROUP LEADERJaime Sancho López

INVESTIGADORACONTRATADA

RESEARCH ASSOCIATE

Mercedes Zubiaur Marcos

BECARIOS


María Guirado TorresTeresa Orta García

64


quinasa, sistemas de reconstitución in vivo en células COS o linfo-citos T (mediante transfecciones transitorias o estables de cDNAsque codifican moléculas señalizadoras y/o receptores de membra-na), expresión de proteínas de fusión en bacterias, sistema de losdos híbridos, sistemas de genes reporteros y animales transgéni-cos.

ESTRATEGIA PARA BLOQUEAR LA ASOCIACIÓN DE PROTEÍNAS QUE

CONTIENEN DOMINIOS SH2 EN TÁNDEM CON UN MOTIVO DE ACTIVACIÓN

PRESENTE EN LOS LINFOCITOS T.

La transducción de señales mediadas por el receptor para elantígeno de los linfocitos T (TCR) está mediado por unos motivosde 17 aminoácidos denominados ITAMs (por ImmunoreceptorTyrosine Activation Motifs). Este motivo está presente en la regióncitoplásmica de las subunidades de CD3 (epsilon, gamma y delta)y zeta. La estimulación del TCR provoca la fosforilación en tirosi-na de los ITAM creándose sitios de unión de alta afinidad para losdominios SH2 en tándem de ZAP-70. En el presente proyecto sepretende analizar con detalle estas interacciones y extender el aná-lisis a otras moléculas importantes en el control de la proliferacióncelular como la fosfatidilinositol-3 kinasa (PI-3K). La subunidadp85 de la PI-3K contiene dos dominios SH2 en tándem y es poten-cialmente un candidato a interaccionar con ITAM fosforilados. Lainhibición de esa interacción in vivo con análogos de ITAMs puedeser útil para diseccionar vías de señalización complejas y puedeservir de modelo para diseñar drogas para el tratamiento de enfer-medades autoinmunes o procesos neoplásicos.

RELACIÓN FUNCIONAL ENTRE LAS SEÑALES DE TRANSDUCCIÓN MEDIADAS

POR EL RECEPTOR PARA EL ANTÍGENO (COMPLEJO TCR/CD3) Y CD38EN LOS LINFOCITOS T QUE CONTROLAN LA ENFERMEDAD INFLAMATORIA

DEL INTESTINO

El proyecto analizará una subpoblación de linfocitos T supre-sores en modelos experimentales de colitis desarrollados mediantetécnicas de ingeniería genética. La expansión selectiva de dichasubpoblación, presumiblemente productora de citoquinas inmuno-

sion of fusion proteins in bacteria, the Two-Hybrid System, ReporterGene Systems and the use of transgenic animals.

STRATEGY FOR BLOCKING THE ASSOCIATION OF SIGNALING PROTEINS

CONTAINING TANDEM SH2 DOMAINS WITH AN ACTIVATION MOTIF PRESENT

IN T CELLS.

Signaling by the T cell antigen receptor (TCR) is mediated by17-residue immunoreceptor tyrosine activation motifs (ITAMs)present in the cytoplasmic tails of the CD3 chains (epsilon, gammaand delta) and zeta. ITAMs become tyrosine-phosphorylated uponTCR stimulation, creating a high affinity binding site for the tan-dem SH2 domains of ZAP-70. The aim of this project is to extendthese observations to other signaling molecules involved in con-trolling cell proliferation. In some systems phosphatidilinositol-3kinase (PI-3K) constitutes the major link in the control of DNAsynthesis. PI-3K comprised a p85 regulatory subunit coupled to ap110 catalytic subunit. p85 contains two SH2 domains in tandemand constitutes a putative candidate for interacting with doublyphosphorylated ITAMs. The use of ITAM analogs capable of dis-rupting SH2 domain-mediated protein-protein interactions, shouldprove useful in further dissection of multiple signaling pathwaysand may serve as models for rationally designed chemotherapeu-tic agents for the treatment of autoimmune and neoplastic disor-ders.

FUNCTIONAL INTERPLAY BETWEEN CD38 AND T CELL RECEPTOR

PATHWAYS IN T LYMPHOCYTES THAT CONTROL INFLAMMATORY BOWEL

DISEASE

Ulcerative colitis and Crohn’s disease, collectively referred toas inflammatory bowel disease (IBD), are chronic, spontaneouslyrelapsing disorders, which appear to be immunologically mediatedand to have genetic and environmental components. We propose toexamine the role of CD38 bearing T cells in this disease. The resultsobtained should enable us to determine the contributions of CD38+T cells in experimental colitis and will hopefully lead to newtherapies. The project will also provide final proof of the

65

supresoras como TFG-beta, IL-4 y IL-10, podría conducir a medioplazo al desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas basadas en lainducción de tolerancia, y supondría un gran avance en el conoci-miento de la enfermedad inflamatoria del intestino.

mechanisms that govern CD38 mediated control of T cell receptorfunction.


- Estructura y función de los receptores para la fracción Fc de la IgA. FIS, 94/0666. (1994-1997).

- Estudio de los antígenos HLA en tumores humanos y del complejo CD3-TCR en TIL y linfocitos autólogos. FIS, 95/1505. (1995-1998).

- Estrategia para bloquear la asociación de proteínas que contienen dominios SH2 en tandem con un motivo de activación presente en loslinfocitos T. CICYT, SAF96-0117. (1996-1999).

- Requerimientos moleculares para la inducción de proliferación y activación celular mediados por CD38. Posible asociación con otrosreceptores y consecuencias funcionales. SAS, 96/49. (1997).

- Relación funcional entre las señales de transducción mediadas por el receptor para el antígeno (complejo TCR/CD3) y CD38 en loslinfocitos T que controlan la enfermedad inflamatoria del intestino. CICYT, SAF99-0024. (1999-2002).

- Fármacos y receptores de membranas. Grupo de investigación, Junta de Andalucía, CVI226 (1994-2000).


- Isabel de Aós Scherpenseel. Estudio e identificación de moléculas que se asocian a la subunidad CD3-e del receptor para el antígenode los linfocitos T. Universidad de Granada. 1997.

Mecanismos de transmisión de señales de activación por receptores de membrana

66


- Zubiaur, M., Izquierdo, M., Terhorst, C., Malavasi, F., and Sancho, J. CD38 ligation results in activation of the Raf-1/MAP kinase andthe CD3-zeta/ZAP-70 signaling pathways in Jurkat T lymphocytes. J. Immunol. (1997) 159, 193-205.

- Lopez-Rodriguez, C., Zubiaur, M., Sancho, J., Concha, A., and Corbi, A. L. An octamer element functions as a regulatory element inthe differentiation-responsive CD11c integrin gene promoter: OCT-2 inducibility during myelomonocytic differentiation. J. Immunol.(1997) 158, 5833-5840.

- Arnaud, J., Huchenq, A., Vernhes, M.C., Caspar-Bauguil, S., Lenfant, F., Sancho, J., Terhorst, C., and Rubin, B. The interchaindisulfide bond between TCR alpha beta heterodimers on human T cells is not required for TCR-CD3 membrane expression and signaltransduction. Int. Immunol. (1997) 9, 615-626.

- de Aos, Y., Metzger, M., Exley, M., Dahl, C. E., Misra, S., Zheng, D., Varticovski, L., T erhorst, C., and Sancho, J. Tyrosine phosphorylationof the CD3-epsilon subunit of the T cell antigen receptor mediates enhanced association with phosphatidylinositol 3-kinase in Jurkat Tcells. J. Biol. Chem. (1997) 272, 25310-25318.

- Morra, M., Zubiaur, M., Terhorst, C., Sancho, J., and Malavasi, F. CD38 is functionally dependent on the TCR/CD3 complex in humanT cells. FASEB J. (1998) 12, 581-592.

- Cabrera, T., Collado, A., Fernandez, M. A., Ferron, A., Sancho, J., Ruiz-Cabello, F., Garrido, F. High frecuency of altered HLA Class Iphenotypes in invasive colorectal carcinomas. Tissue Antigens (1998) 52, 114-123.

- Zubiaur, M., Guirado, M.,Terhorst, C., Malavasi, F., and Sancho, J. The CD3-gamma-delta-epsilon transducing module mediatesCD38-induced protein tyrosine kinase and Mitogen-Activated Protein kinase activation in Jurkat T cells. J. Biol. Chem. (1999) 274,20633-20642.

- She, J., Ruzek, M. C., Velupillai, P., de Aos, Y., Wang, B., Harn, D. H., Sancho, J., Biron, C. A., and Terhorst, C. Generation of antigen-specific cytotoxic T lymphocytes and regulation of cytokine production takes place in the absence of CD3-zeta. Int. Immunol. (1999) 11,845-857.


67


- de Aos, I., Metzger, M., Exley, M., Dahl, C. E., Misra, S., Zhen, D., Varticovski, L., Terhorst, C., and Sancho J. Transduccion de señalespor el receptor para el antigeno de los linfocitos T. En: Jornadas sobre Investigacion en Biomedicina. Unidad Mixta de InvestigacionesMedicas. Granada. Imprenta-Editorial "Ave Maria". (1998). pp. 207-225.

- Zubiaur, M., Izquierdo, M., Terhorst, C., Malavasi, M., and Sancho, J. Transduccion de señales tras activacion del receptor CD38 encelulas Jurkat. En: Jornadas sobre Investigacion en Biomedicina. Unidad Mixta de Investigaciones Medicas. Granada. Imprenta-Edito-rial "Ave Maria". (1998). pp. 239-248.

- Deaglio, S., Mallone, R., Baj, G., Arnulfo, A., Ortolan, E., Calosso, L., Ausiello, C., Saccucci, F., Gregorini, A., Cinti, C., Horenstein,A., Zubiaur, M., Sancho, J., Dianzani, U., Ferrero, E., Funaro, A., Katada, T., Mehta, K., and Malavasi, F. Signaling and activation,calcium and cytokine release, receptorial activities of the human CD38 family of NAD+-converting enzymes. En: Current Trends inImmunology. (1999). (In press).

Mecanismos de transmisión de señales de activación por receptores de membrana

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AULA DE SEMINARIOSSEMINARS

1997

Dr. Antonio TorresUniversidad de Sevilla, Sevilla"Actina y tubulina en ciliados"

Dr. Antonio ColomaInstituto de Investigaciones Biomédicas(CSIC)/Universidad Autónoma de MadridMadrid"Identificación y cartografiado cromosómico de nuevos genes humanos. Estudio de su implicación en patologías hereditarias"

Dr. Basilio ValladaresDepartamento de Genética, Parasitología y Ecología, Universidad de La Laguna, Tenerife"Utilización de RAPD para el diagnóstico de enfermedades infecciosas"

Dra. Dolores RodríguezCentro Nacional de Biotecnología, CSIC, Madrid"Morfogénesis del virus de Vaccinia"

Dra. Almudena SampaloServicio de Inmunología, Hospital Universitario Puerto del Mar, Cádiz"Efecto de los linfocitos B CD5 positivos sobre la producción de inmunoglobulinas "

Dr. Bernard MalissenCentre d’Immunologie Marseille-Luminy, Marseille, Francia"Genetic analysis of lymphocyte antigen receptor"

Dr. Bernard MalissenCentre d’Immunologie Marseille-Luminy, Marseille, Francia"Crystal structure of a T cell antigen receptor"

Aula de Seminarios

69

Dr. Carlos Gómez NietoDepartamento de Parasitología, Universidad de Extremadura"Nuevos aspectos de la patogenia en Leishmaniosis"

Dra. Carmela CalésDto de Bioquímica, Facultad de Medicina, Universidad Autónoma de Madrid, Madrid"Regulación del ciclo celular en la diferenciación megacariocítica"

Mr. Christian OsteBeckman"Aplicaciones del robot Biomek 2000"

Dr. Goerg HoheiselDKFZ, Heidelberg, Alemania"DNA chip technologoy"

Dr. Hernando del PortilloUniversidad de Sao Paulo, Brasil"Organización genómica e inmunización genética en Plasmodium vivax"

Dr. Isidro Sánchez GarcíaInstituto de Microbiología Bioquímica, CSIC/Universidad de Salamanca, Salamanca"Consecuencias de las anomalias cromsómicas en el desarrollo tumoral: desde los genes hacia los mecanismos terapéuticos"

Dr. Juan Miguel RedondoCBM-UAM. Servicio de Inmunología. Hospital de la Princesa, Madrid"Factores de transcripción en la activación de las células T: Mecanismos de acción de agentes inmunosupresores y antioxidantes"

Dr. John SwindleWashington Seatle Biomedical Research Institute, Seattle. Washington, Estados Unidos de América“Mutational analysis of mRNA processing and gene expression in Trypanosoma cruzi”

Dr. José Antonio PintorInstituto de Recursos Naturales y Agrobiología, C.S.I.C., Sevilla"Desarrollo de nuevos sistemas de protección de las plantas contra infecciones fungicas"

Aula de Seminarios

70

Dr. José Antonio BrievaServicio de Inmunología, Hospital Universitario Puerto del Mar, Cádiz"Regulación por apoptosis de linfocitos B periféricos humanos"

Dr. Manuel Alfonso PatarroyoInstituto de Inmunología, Bogotá, Colombia"Biología Molecular de Plasmodium vivax"

Dra. Monserrat PortúsDpto de Microbiología y Parasitología Sanitaria, Facultad de Farmacia, Universidad de Barcelona, Barcelona"Estudio epidemiológico de la leishmaniosis canina en España: algunos interrogantes que plantea"

Dr. Pedro M. AlzariUnité d’Immunologie Structurale, Institut Pasteur, Paris"Estructura tridimensional y mecanismos, Catalíticos de glicosil-hidrolasas "

Dr. Ronald PearlmanDepartment of Biology, University of York, Toronto, Ontario, Canada"Studies on dUTPases: Functional Gene Replacement in Yeast and Structural Studies"

D. Sebastián TorresTécnico del Instituto Municipal de Formación de Empleo (IMFE), Proyecto ADAPT, Campus de la Salud"El Proyecto Campus de la Salud y el Desarrollo de I+D"

Dr. Anne-Marie Schmitt-VerhulstCentre d’Immunologie de Marseille-Luminy, Marseille, Francia"Influence of intra-thymic selection on peripheral T cell activation"

Dr. Cox TerhorstBeth Israel Deaconess Medical Center, Harvard Medical School, Boston"Pathways to inflammatory bowel diseases"

Dr. Francisco RojoDepartamento de Parasitología, Universidad de León"Problemas del control antiparasitario: la resistencia a los anti-helmínticos"

Aula de Seminarios

71

Dr. Guillermo Giménez GallegoProfesor de Investigación, Centro de Investigaciones Biológicas (CIB), CSIC, Madrid"El factor de crecimiento para fibroblastos a los catorce años de su descubrimiento: función, estructura e ingeniería de proteínas convistas a posibles usos terapéuticos"

Dr. Julian DaviesDepartment of Microbilogy and Immunology, University of British Columbia, Vancouver, Canada"The origin and evolution of antibiotics resistance genes"

Dr. Lee LesermanCentre d’Immunologie de Marseille-Luminy, Marseille, Francia"The antigen presenting functions of surface immunoglobulins on B cells and Fc receptors on dendritic cells are analogous"

Dr. Manuel SegoviaUniversidad de Murcia"Amplificaciones LD1 en Leishmania"

Dr. Vicente RubioInstituto de Investigaciones Citológicas, Fundación Valenciana de Investigaciones Biomédicas (FVIB), CSIC, Valencia"Estructura de una diana molecular microbiana: carbamato-quinasa"

SEMINARIO ESPECIAL DE NAVIDAD

Prof. Fermín Sánchez de Medina ContrerasDepartamento de Bioquímica y Biología Molecular, Facultad de Farmacia, Universidad de Granada, Granada"Dieta y ateroesclerosis"

1998

Dra. Amparo CanoDepartamento de Bioquímica, Instituto de Investigaciones Biomédicas (CSIC) y Facultad de Medicina (UAM), Madrid"Papel de la molécula de adhesión célula-célula cadherina E en la progresión tumoral. Mecanismos de regulación de su expresión yfunción"

Aula de Seminarios

72

Dr. Julio A. UrbinaInstituto Venezolano de Investigaciones Científicas, Caracas, Venezuela"El pirofosfato inorgánico es el compuesto fosforilado de alta energía más abundante en Trypanosoma cruzi y Leishmania: Unanueva perspectiva sobre la bioenergética de los Tripanosomatideos"

Dr. Aurelio SerranoInstituto de Bioquímica Vegetal y Fotosíntesis, CSIC, Sevilla"Heterogeneidad molecular de la pirofosfatasa de los microorganismos fotosintéticos y su relevancia para la filogenia de losplástidos"

Dra. Barbara PapadopoulouLaboratoire et Centre de Recherche en Infectologie, Centre Hospitalier Universitaire de Québec, Canada"From Leishmania genetics to Leishmania pathogenesis"

Dr. Gerhart H. WagnerDept. of Microbiology, Uppsala Genetic Center, SLU (Swedish University of Agricultural Sciences) Uppsala, Suecia"Antisense RNA control in plasmids: things are not as we thought they were"

Dra. Eila CedergrenUniversity of Lund Suecia"Structural features of the trimeric family of dUTPases"

Dr. José Hernandez QueroUnidad de Enfermedades Infecciosas, Hospital Clínico “San Cecilio”, Granada"Perspectivas actuales del tratamiento de la infección por VIH y de las infecciones oportunistas asociadas"

Dr. Juan Carlos LacalInstituto de Investigaciones Biomédicas, CSIC, Madrid"Proteinas Rho en transformación y apoptosis"

Dr. José AlmendralCBM/UAM, CSIC, Madrid"Análisis molecular de la interacción virus-célula en parvovirus"

Aula de Seminarios

73

Dr. José Luis RodríguezHospital Sant Pau, Barcelona"Reacción del injerto frente al huesped como modelo de autoinmunidad"

Dr. Carlos López OtínDepartamento de Bioquímica y Biología Molecular, Facultad de Medicina, Universidad de Oviedo, Oviedo"Diversidad funcional de proteasas asociadas a tumores"

Dr. Manuel FresnoCentro de Biología Molecular. Universidad Autónoma de Madrid, Madrid"Inmunopatología en la infección por Trypanosoma cruzi"

Dr. Marc OuelletteLaboratoire et Centre de Recherche en Infectologie, Centre Hospitalier Universitaire de Québec, Canada"ABC transporter and thiol metabolism in drug resistant Leishmania"

Dra. Margarita BehrensNeurology Department, School of Medicine, Washington University, St. Louis, MO, USA"Isquemia cerebral: prevención de la muerte neuronal por necrosis y apoptosis"

Dr. Pedro Aparicio AlonsoDepartamento de Bioquímica e Inmunología, Universidad de Murcia"Activación de linfocitos T a/b por vías independientes del receptor antigénico"

Dra. Predestinación García RuizCBM/UAM, CSIC, Madrid"Señalización celular del receptor de prolactina"

Dr. Rafael GaresseDepartamento de Bioquímica, Instituto de Investigaciones Biomédicas, CSIC, Madrid"Fisiopatología de la biogénesis de mitocondrias animales"

Dr. Raif GehaChildren’s Hospital. Harvard Univ. Medical School, Boston, USA"WIP, a novel protein that links WASP (Wiskott-Aldrich Syndrome Protein) to the cytoskeleton"

Aula de Seminarios

74

Dr. Vicente LarragaCentro de Investigaciones Biológicas, CSIC, Madrid"El antígeno p36/lack de Leishmania infantum presenta afinidad por proteinas de regulación de DNA"

Dra. Dolores Pérez-SalaCentro de Investigaciones Biológicas (CIB), CSIC, Madrid"Interacciones entre las vias de regulación de la expresión de iNOS y COX-2 en células mesangiales"

Dr. Eduardo ParejaHospital Virgen de las Nieves, Granada"Una nueva visión de las moléculas HLA de clase II: modelo del tetrámero"

Dr. Friedrich A. HaagDepartment of Immunology, Medical Clinic, Hamburg University, Hamburg, Alemania"ADP-Ribosylation: A new mechanism for modulation of signal transduction in T cells"

Dr. Jesús VazquezCentro de Biología Molecular “Severo Ochoa”, CSIC/UAM, Madrid"Estrategias modernas para el análisis y secuenciación de proteínas. Aplicación al estudio del proteoma"

Dr. Michael HahneDepartment of Biochemistry, Ludwig Institute for Cancer Research, University of, Lausanne, Epalinges, Suiza"The role of the Fas system in disease"

Dra. Montserrat BachCentro de Investigación y Desarrollo (CID), CSIC, Barcelona"Como reducir la actividad del proto-oncogen c-H-ras mediante una regulación del cis-splicing o actuaciones dirigidas por trans-splicing"

Dr. Oscar NoyaDra. Berkisiolé Alarcón, Instituto de Medicina Tropical, Facultad de Medicina, Universidad Central de Venezuela, Caracas"El uso de péptidos sintéticos en el diagnóstico de enfermedades parasitarias"

Aula de Seminarios

75

Dr. Ramón ManguesHospital Sant Pau, Barcelona"Modelo transgénico de sobreexpresión de N-Ras y su utilización en terapia antineoplásica"


Dr. Enrique Cerdá OlmedoDepartamento de Genética, Universidad de Sevilla"Biología molecular de la conducta mora y penal"

1999

Dr. Amalio TelentiDivisión de Enfermedades Infecciosas, Hospital Universitario de Vaud, Universidad de Lausanne, Suiza"Tuberculosis: resistencia, genoma, genética"

Dr. Bernard MalissenCentre d’Immunologie INSERM-CNRS de Marseille-Luminy, France"Genetic dissection of the T cell antigen receptor"

Dr. Emilio Fernández ReyesDepartamento de Bioquímica y Biología Molecular, Facultad de Ciencias, Universidad de Córdoba, Córdoba"Sistema de transporte y señalización para la asimilación de nitratos en plantas"

Dr. Elías CampoLaboratorio de Patología, Hospital Clinic, Universidad de Barcelona"Alteraciones de genes reguladores del ciclo celular en el desarrollo y progresión de neoplasias humanas"

Dr. Eric H. ZanelliDept. ImmunoHematology, Faculty of Medicine, Leiden University, Holland"Re-evaluating the role of HLA in rheumatoid arthritis. Some DRB1 alleles protect"

Dr. Ignacio PalmeroCentro Nacional de Biotecnología, Consejo Superior de Investigaciones Científicas, Madrid"Papel de p19ARF en respuestas celulares anti-oncogénicas mediadas por p53"

Aula de Seminarios

76

Dr. José Luis JorcanoCIEMAT, Madrid"Control de la proliferación y diferenciación en epidermis: Bases moleculares, modelos transgénicos y aplicación en terapia génica"

Dr. Manuel López CabreraUnidad de Biología Molecular, Hospital de la Princesa, Madrid"Implicación de la proteína Hbx del virus de la hepatitis B en hepatocarcinogénesis y procesos inflamatorios del hígado"

Dr. Manuel SantamaríaDpt. de Fisiología e Inmunología, Servicio de InmunologíaHospital Universitario “Reina Sofía”, Facultad de Medicina, Córdoba"Coestimulación de células T"

Dr. Miguel A. AlonsoCentro de Biología Molecular “Severo Ochoa”, CSIC/UAM, Madrid"Identificación de la proteína MAL como componente de la maquinaria de transporte apical de células epiteliales polarizadas"

Dr. Orlando TapiaDepartamento de Química-Física, Universidad de Uppsala, Suecia"Biomolecules in vacuum and gas phase. Is it possible biomolecular folding in vacuum?"

Dra. Susana AlemanyInstituto de Investigaciones Biomédicas, Consejo Superior de Investigaciones Científicas, Madrid"Expresión y función del proto-oncogen Cot/Est quinasa en el proceso de activación de linfocitos T"

Dr. Gilbert de MurciaEcole Superieure de Biotechnologie de Strasbourg, Centre National de la Recherche Scientifique, Strasbourg, Francia"Structure and function of poly(ADP-ribose) polymerase: a survival factor in mammalian cells under genotoxic stress"


Dr. Fernando ValdiviesoCBM/UAM, Madrid"De donde venimos, qué somos, a donde vamos"

Aula de Seminarios

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Publicaciones

EVOLUCIÓN DEL NÚMERO DE PUBLICACIONES

0

5

10

15

20

25

30

35

40

PUBLICACIONES SCI

32 22 38

AÑO 1997 AÑO 1998 AÑO 1999

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Datos económicos

RESUMEN DE DATOS ECONÓMICOS

0

10

20

30

40

50

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80

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100

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150

Millones

1997 1998 1999

CENTRO

PROYECTOSINF.CIENT.OBRAS

PERS. CSICPERS. PROY.FEDER

Desglose Presupuesto por Conceptos

0

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30

40

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60

70

80

Millones

1997 1998 1999

FEDER-CICYT

PN/PGCCEJA

FISOMS

OTROS

Desglose Proyectos por Entidades Financiadoras

79

Personal de Servicios

Nombre Puesto de Trabajo E-mail TeléfonoAlcina Madueño, Antonio Científico Titular [email protected] Ext: 20

Almarza Rodríguez, Jose Manuel Operador de Ordenadores Contratado [email protected] 958805195Arana Figueroa, Flora E. Becaria [email protected] Ext: 52

Aranda Pérez, Angeles Telefonista 958203802Atienza Heredia, Enrique Conserje 958203802

Augustín Vacas, Vicente Ayudante de Investigación Ext: 21Barrecheguren Martín, Concepción Gerente [email protected] 958805191

Barroso Del Jesus, Alicia Becaria [email protected] Ext: 21Beriso García, Mª Dolores Titulado Técnico Especializado [email protected] Ext: 61

Bernier Villamor, Victor Becario [email protected] Ext: 29Berzal Herranz, Alfredo Científico Titular [email protected] 958805187

Calzada Lombana, Jose Eduardo Becario [email protected] Ext: 47Castanys Cuello, Santiago Científico Titular [email protected] 958805185

Collado Escobar, Maria Dolores Investigadora Contratada [email protected] Ext: 47

Collado Romero, Melania Titulada Superior [email protected] Ext: 20Constán Gutiérrez, Aurora Auxiliar de Laboratorio [email protected] Ext: 29

Fárez Vidal, Mª Esther Investigadora Contratada [email protected] Ext: 29Fedetz, Maria I. Becaria [email protected] Ext: 20

Ferrer Gamarra, F. Jose Cuidador Especializado en Animalario Ext: 60Gallego García, Claribel Becaria [email protected] Ext: 29

Gamarro Conde, Francisco Científico Titular [email protected] 958805185García Pérez, Jose Luis Becario [email protected] Ext: 58

González Aguilar, Antonio Científico Titular [email protected] 958805058

González Pacanoswca, Dolores Directora [email protected] 958200403González Pacanowska, Dolores Científico Titular [email protected] 958805184

González Rey, Elena Becaria [email protected] Ext: 56González Reyes, Acaimo Científico Titular [email protected] 958805194

González Romero, Jose Encargado Mantenimiento Contratado [email protected] 958805087Guirado Torres, Mª Becaria [email protected] Ext: 50

Heredia Maldonado, Mª Jose Gestión de Compras [email protected] Ext: 11Hidalgo Fernández, Manuel Operador Periférico [email protected] 958805195

Hidalgo Zarco, Fernando Becario [email protected] Ext: 29Hurtado Guerrero, Ramón Becario [email protected] Ext: 29

Jiménez Jiménez, Carmen Becaria [email protected] Ext: 29Lage Martín, Jose Manuel Becario [email protected] Ext: 56

Lario Simón, Antonio Titulado Técnico Especializado [email protected] Ext: 27

Leal Cortijo, Isabel Becaria [email protected] Ext: 29Longobardo Polanco, Victoria Becaria [email protected] Ext: 58

80

Personal de Servicios

Nombre Puesto de Trabajo E-mail TeléfonoLópez López, Manuel Carlos Científico Titular [email protected] 958805190

López Rivas, Abelardo Investigador Científico [email protected] 958805188López-Barajas De La Puerta, Almudena Ayudante de Investigación [email protected] Ext: 58

Marañon Lizana, Concepción Becaria [email protected] Ext: 58Martín Ibañez, Javier Científico Titular [email protected] 958805056

Matesanz Del Barrio, Fuencisla Investigadora Contratada [email protected] Ext: 19

Medina Barbera, Fernando Cuidador de Animalario Ext: 60Merida Chaves, Antonio Ayudante de Investigación [email protected] 958805189

Muñoz Pinedo, Cristina Becaria [email protected] Ext: 53Navarro Cuesta, Pilar Ayudante de Investigación Ext: 52

Nieto Diaz, Antonio Becario [email protected] Ext: 47Olivares Martín, Mónica Becaria [email protected] Ext: 58

Orta García, Teresa Becaria [email protected] Ext: 50Parodi Talice, Adriana Becaria [email protected] Ext: 52

Pascual Martinez, Maria Becaria [email protected] Ext: 47Peña Díaz, Javier Becario [email protected] Ext: 29

Pérez Pérez, Jose Miguel Cuidador de Animalario Contratado [email protected] 958805057Pérez Pérez, Juan Manuel Titulado Técnico Especializado [email protected] 958805195

Pérez Victoria, Javier Becario [email protected] Ext: 52

Pérez Victoria, Jose Mª Becario [email protected] Ext: 52Planelles Carazo, Lourdes Becaria [email protected] Ext: 58

Ponce Fajardo, Jose A. Administrativo [email protected] Ext: 45Puerta Fernández, Elena Becaria [email protected] Ext: 21

Robledo Pérez, Mª Gemma Ayudante de Laboratorio Contratada [email protected] Ext: 53Ruiz Pérez, Luis Miguel Científico Titular [email protected] 958805184

Ruiz Ruiz, Mª Carmen Becaria [email protected] Ext: 53Ruiz-Andreu González, Carmen Titulada Técnica Contratada [email protected] Ext: 27

Sancho López, Jaime Científico Titular [email protected] 958805182Sarkar, Malabika Becaria [email protected] Ext: 53

Serrano González, Carmen Bibliotecaria Contratada [email protected] Ext: 28Spadafora Mejía, Carmenza Becaria [email protected] Ext: 52

Téllez Segura, María del Mar Becaria [email protected] Ext: 19Thomas Carazo, Mª Carmen Becaria [email protected] Ext: 58

Torres García, Cristina Becaria [email protected] Ext: 52Vera García, Alfonso Limpiador Especializado Contratado Ext: 51

Zafra Valverde, Mercedes Ayudante de Investigación [email protected] Ext: 28

Zarza Calvente, Amelia Habilitada Pagadora [email protected] Ext: 44Zubiaur Marcos , Mercedes Investigadora Contratada [email protected] Ext: 50

instituto de parasitología y biomedicina lópez-neyra · 2 finalmente quisiera mencionar que...

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