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i 

 

ii 

iii  

Este trabajo se realizó en el Laboratorio de Biotecnología Vegetal del

Centro de Biotecnología Genómica del Instituto Politécnico Nacional

bajo la dirección del Dr. Juan Manuel González Prieto.

iv  

AGRADECIMIENTOS

Al Instituto Politécnico Nacional por abrirme sus puertas, por darme la oportunidad de conocer el maravilloso mundo de la ciencia y brindarme lo necesario para realizar mis estudios de Maestría.

Al Centro de Biotecnología Genómica y a todo el personal que en el labora por el apoyo y facilidades brindadas en el desarrollo del programa académico y del presente trabajo de investigación.

Al Programa Institucional de Formación de Investigadores (PIFI-IPN), por los apoyos económicos brindados durante los dos años de Maestría.

Al CONACYT por los apoyos económicos brindados durante todo este período, ya que sin estos me hubiera sido imposible culminar esta etapa.

Al fondo mixto CONACYT-Gobierno del estado de Durango por el financiamiento de este proyecto con Clave de registro: DGO-2007-C01-68006.

Al programa de movilidad ECOES-SANTANDER por la beca otorgada en semestre Agosto-Diciembre del 2008.

Al Dr. Juan Manuel González Prieto, por su invaluable labor directiva, por compartir su experiencia científica y sobre todo por la valiosa orientación no solo en el ámbito académico, también por sus enseñanzas de vida.

A mi comité de revisión de Tesis: Dra. Claudia Patricia Larralde Corona, Dr. José Luis Hernández Mendoza, Dr. Netzahualcoyotl Mayek Pérez, M.C. Víctor R. Moreno Medina por sus aportaciones y sugerencias en la realización de este trabajo.

Al Dr. Netzahualcoyotl Mayek Pérez por su valioso apoyo en el desarrollo agronómico y estadístico de este trabajo.

A la plantilla de Profesores investigadores del CBG, por compartir sus conocimientos en el área de la genómica.

A la QFB Krystal Lira Méndez, Carolina Martínez Mascorro y María Dolores Hernández Ramos, por su valioso apoyo en diversas etapas de este trabajo, sobre todo en el aspecto microbiológico.

A la M. C. San Juana Hernández Delgado por su valioso apoyo en las diferentes prácticas de laboratorio.

Al Club Rotario Reynosa por el apoyo económico de préstamo-beca en los inicios del posgrado.

En general a toda la gran familia de Vegetal por aceptarme y apoyarme como un integrante más de ella.

v  

DEDICATORIA A MI COMPAÑERA Y ESPOSA

CONCHITA: Gracias por tu valioso apoyo, comprensión y paciencia para permitirme alcanzar esta meta de la que también tomas parte. Con todo mi amor, respeto y gratitud. A MI HIJO

HUGO QUETZALCOATL: Por tu amor, apoyo, por ser mi motivo y fortaleza de seguir adelante y por el tiempo que te robé para realizar esta etapa, realmente espero ser un ejemplo digno a seguir.

A MIS PADRES TERESA Y ARTURO: Por sus esfuerzos y sacrificios para brindarme una profesión

que es la mejor herencia, por su cariño y apoyo incondicional para mi desarrollo personal y profesional. A MIS HERMANOS

Por su confianza, comprensión, apoyo y cariño que siempre me han demostrado.

vi  

ÍNDICE DE CONTENIDO

AGRADECIMIENTOS .......................................................................................................... ii DEDICATORIA ................................................................................................................... iii INDICE DE CONTENIDO ................................................................................................... iv LISTA DE CLAVES Y ABREVIATURAS ........................................................................ vii INDICE DE CUADROS ....................................................................................................... ix INDICE DE FIGURAS .......................................................................................................... x RESUMEN ........................................................................................................................... xii ABSTRACT ....................................................................................................................... xiii

1. INTRODUCCIÓN .............................................................................................................. 1 2. ANTECEDENTES ............................................................................................................. 3 2.1 El Frijol ............................................................................................................................. 3 2.1.1 Importancia del frijol ..................................................................................................... 3 2.1.2 Situación del frijol en México y Durango ..................................................................... 4 2.2 Enfermedades del frijol ..................................................................................................... 4 2.3 La pudrición de raíz del frijol ........................................................................................... 5 2.3.1 Etiología ......................................................................................................................... 5 2.3.2 Epifitología .................................................................................................................... 6 2.3.3 Signos y síntomas .......................................................................................................... 7 2.3.4 Prevención y control de la pudrición de la raíz ............................................................. 7 2.4. El control biológico, sus generalidades y uso de hongos como biocontroladores ........... 8 2.5 El género Trichoderma spp. ............................................................................................. 9 2.5.1 Mecanismos que emplea Trichoderma spp. para el biocontrol ................................... 10 2.5.1.1 Los Antibióticos ....................................................................................................... 10 2.5.1.2 El micoparasitismo ................................................................................................... 12 2.5.1.2.1 Enzimas degradadoras de la pared celular ............................................................. 13 2.5.1.2.2 Estructuras especializadas ..................................................................................... 16 2.5.2 Trichoderma como agente de control biológico .......................................................... 17 3. Justificación ...................................................................................................................... 19 4. Objetivos ........................................................................................................................... 20 4.1. Objetivo general ............................................................................................................. 20 4.2. Objetivos específicos ..................................................................................................... 20 5. Hipótesis ........................................................................................................................... 21

vii  

6. Materiales y Métodos ....................................................................................................... 22 6.1. Muestreo ........................................................................................................................ 22 6.2. Análisis de suelos .......................................................................................................... 22 6.3. Aislamiento de fitopatógenos a partir de raíces ............................................................. 22 6.4. Aislamientos monospóricos de Trichoderma spp. a partir de muestras de suelo .......... 23

6.5. Caracterización macroscópica y celular de hongos fitopatógenos y de aislamientos Trichoderma spp. .............................................................................................................. 23

6.6. Caracterización molecular ............................................................................................. 24 6.6.1. Obtención de DNA genómico .................................................................................... 24 6.6.2. Amplificación de la región ITS de los genes RNAr ................................................... 25 6.6.3. Purificación de los productos de PCR ........................................................................ 25 6.6.4. Secuenciación de los fragmentos amplificados .......................................................... 25 6.6.5. Análisis bioinformático de las secuencias .................................................................. 25 6.7. Determinación de tasas de crecimiento de las especies de Trichoderma spp. y

patógenos ........................................................................................................................... 26 6.8. Pruebas de patogenicidad de los aislamientos obtenidos de raíces con síntomas de

pudrición ........................................................................................................................... 26 6.9. Pruebas de antagonismo in vitro .................................................................................... 27 6.10. Pruebas de antagonismo en la planta. .......................................................................... 28 6.11. Análisis estadístico. ..................................................................................................... 28 7. Resultados ......................................................................................................................... 30 7.1. Muestreo ........................................................................................................................ 30 7.2. Análisis de suelo ............................................................................................................ 30 7.3. Aislamientos de fitopatógenos a partir de raíces ........................................................... 31 7.4. Aislamientos monospóricos de Trichoderma spp. a partir de muestras de suelo .......... 31 7.5. Caracterización molecular ............................................................................................. 32 7.5.1. Obtención de DNA genómico y amplificación de la región ITS de los genes RNAr 32 7.5.2. Secuenciación de los productos amplificados ............................................................ 32 7.5.3. Análisis bioinformático de las secuencias .................................................................. 33 7.6. Determinación de las tasas de crecimiento de las especies de Trichoderma y

fitopatógenos. .................................................................................................................... 35 7.7. Pruebas de patogenicidad de los aislamientos de fitopatógenos ................................... 37 7.8 Pruebas de antagonismo in vitro ..................................................................................... 39 7.9 Pruebas de antagonismo y promoción del crecimiento en la planta ............................... 46 8. Discusión .......................................................................................................................... 56 9. CONCLUSIONES ............................................................................................................ 65 10. RECOMENDACIONES ................................................................................................. 66

viii  

11. BIBLIOGRAFÍA ............................................................................................................ 67 APÉNDICE ........................................................................................................................... 74 GLOSARIO .......................................................................................................................... 82

 

ix  

LISTA DE CLAVES Y ABREVIATURAS

% = porciento

° C = grados centígrados

A = Adenina

ADNc = Ácido Desoxiribonucleico complementario.

ANVA= Análisis de Varianza

ARN = Ácido Ribonucleíco

bp = pares de bases (pb en español)

C = Citosina

cm = centímetro

CV = Coeficiente de variación

DNA = Ácido Desoxirribonucleico

DNAr = DNA ribosomal

dNTPs = mezcla de trifosfatos de desoxinucleótidos (dATP + dGTP + dCTP + dTTP)

EDTA = Ácido etilendiaminotetraacético

g = gramo

G = Guanina

h = horas

ha = hectárea

ITS = Regiones espaciadoras internas de transcripción del DNA ribosomal (por sus siglas

en inglés Internal Transcribed Spacer)

L = litro

M = molar

min = minuto

ml = mililitro

mM = mili molar

mm = milímetros

ng = nanogramo

ng /μL-1 = nanogramos por microlitro

PCR = Reacción en Cadena de la Polimerasa

x  

PDA = Medio de cultivo Papa + Dextrosa + Agar

PDB = Caldo Papa + Dextrosa

pH = Potencial de hidrógeno

pmol = picomoles

rpm = revoluciones por minuto

s = segundos

T = Timina

Taq ADN = polimerasa de Thermus aquaticus

TBE = trizma/ácido bórico/sal disódica del ácido etilendiaminotetraacético

TE = trizma-ácido clorhídrico/ sal disódica del ácido etilendiaminotetraacético

Tris-HCl = trizma/ácido clorhídrico

U μL-1 = unidades por microlitro

V = voltios

v/v = volumen a volumen

X = veces de la concentración

μg = Microgramo

μL = microlitro

μM= micrómetro

xi  

ÍNDICE DE CUADROS

Cuadro 1. Escala para la evaluación de la patogenicidad de Fusarium spp. y M. phaseolina en semillas de frijol común (Manici et al., 1995). .............................................. 27

Cuadro 2. Escala para la evaluación in vitro de la actividad antagonista de Trichoderma spp. ....................................................................................................................... 27

Cuadro 3. Análisis de correlación entre los factores del suelo analizados y el número de aislamientos de Trichoderma spp. obtenidos. ...................................................... 31

Cuadro 4. Comparación de medias de los valores de patogenicidad con base en la escala de Manici et al. (1995) sobre semillas de frijol de la variedad Pinto Villa. ............. 38

Cuadro 5. ANVA de las pruebas de antagonismo in vitro. ................................................... 43 Cuadro 6. Comparación de medias por diferencia mínima significativa (DMS) de las

pruebas de antagonismo in vitro. .......................................................................... 43 Cuadro 7. Análisis de correlación entre las tasas de crecimiento y la capacidad antagónica.

.............................................................................................................................. 43 Cuadro 8. Escala de incidencia y/o severidad para evaluar pudriciones de raíz (Abawi y

Pastor-Corrales, 1990). ......................................................................................... 46 Cuadro 9. Cuadrados medios y coeficientes de variación de los ANVA correspondientes a

los experimentos realizados en invernadero. ........................................................ 48  

Apéndice A. Enzimas degradadoras de polímeros y genes que las codifican. ..................... 74 Apéndice B. Lista de diferentes especies de Trichoderma, hongos fitopatógenos que

controlan, enfermedad y cultivo. .......................................................................... 75 Apéndice C. Localidades donde se realizaron los muestreos de suelo y raíces con síntomas

de pudrición. ......................................................................................................... 76 Apéndice D. Aislamientos de fitopatógenos identificados mediante el análisis tipo BLAST

con su número de accesión en el GenBank. ......................................................... 77 Apéndice E. Aislamientos de Trichoderma spp. identificados mediante el programa

TrichOKEY con sus números de accesión en el Gen Bank. ................................ 79 Apéndice F. Análisis de suelo de las localidades muestreadas y número de aislamientos de

Trichoderma spp. obtenidos. ................................................................................ 80

xii  

ÍNDICE DE FIGURAS

Figura 1. Mecanismo de acción de antibióticos y quitinasas de Trichoderma sobre la pared celular del hongo hospedero ............................................................................................ 11

Figura 2. Fases de precontacto de la interacción micoparasítica Trichoderma-hospedero. 13 Figura 3. Raíces de frijol con signos de pudrición. .............................................................. 31 Figura 4. Aislamientos de Trichoderma spp. y fitopatógenos caracterizados

molecularmente. ................................................................................................................ 32 Figura 5. Tamaño de los productos de PCR obtenidos a partir de DNA genómico de

Trichoderma spp. y fitopatógenos con los iniciadores ITS1 e ITS4. ................................ 33 Figura 6. Especies identificadas mediante el análisis bioinformático de las secuencias. ..... 34 Figura 7. Dendrograma de los aislamientos de Trichoderma spp. realizado con base en las

secuencias ITS del RNA ribosomal. ................................................................................. 35 Figura 8. Dendrograma de los aislamientos de patógenos realizado con base en las

secuencias ITS del RNA ribosomal. ................................................................................. 36 Figura 9. Tasas de crecimiento de los aislamientos de Trichoderma spp. ............................ 36 Figura 10. Tasas de crecimiento de los aislamientos de fitopatógenos. ............................... 37 Figura 11. Daños causados a los 5 días por aislamientos de M. phaseolina, F. oxysporum y

F. solani a semillas de frijol de la variedad Pinto Villa. ................................................... 38 Figura 12. Ensayos de patogenicidad de aislamientos de M. phaseolina y F. oxysporum

sobre semillas de frijol Pinto Saltillo y Pinto UI-114. ...................................................... 41 Figura 13. Valores asignados según el grado de antagonismo con base en la escala de Ávila,

Herrera y Peña (2001). ...................................................................................................... 42 Figura 14. Interacción Trichoderma sp. (T) y M. phaseolina (M). ...................................... 43 Figura 15. Pruebas de antagonismo in vitro. ........................................................................ 45 Figura 16. Escala para evaluación de severidad de daño causado por Macrophomina

phaseolina (Tassi) Goid. en frijol. .................................................................................... 46 Figura 17. Severidad de daños de las cepas de Trichoderma spp. en plantas de frijol. ........ 47 Figura 18. Establecimiento de plantas a los 30 días expresado en porcentaje, los patógenos

confrontados son a) M. phaseolina, b) F. solani y c) F. oxysporum. ................................ 48 Figura 19. Relación entre peso seco total y peso seco de raíz de tratamientos sin patógeno.

........................................................................................................................................... 50 Figura 20. Relación de peso seco total y peso seco de raíz en plantas inoculadas con a) M.

phaseolina, b) F. oxysporum y c) F. solani. ...................................................................... 51 Figura 21. Relación de área foliar y altura a los 30 días de plantas inoculadas con: a) sin

patógeno, b) M. phaseolina, c) F. oxysporum y d) F. solani. .......................................... 52 Figura 22. Severidad de daños de a) F. oxysporum, b) F. solani y c) M. phaseolina en

plantas de frijol. ................................................................................................................. 53

xiii  

Figura 23. Relación del peso seco total de las plantas de frijol con los tratamientos de aislamientos de Trichoderma. ........................................................................................... 53

Figura 24. Relación del peso seco de raíz de las plantas de frijol con los tratamientos de aislamientos de Trichoderma. ........................................................................................... 54

Figura 25. Relación de la altura de la planta de frijol con los tratamientos de aislados de Trichoderma spp. .............................................................................................................. 54

Figura 26. Relación del área foliar de la planta de frijol con los tratamientos de aislados de Trichoderma spp. .............................................................................................................. 55

Figura 27. Relación del número de vainas en la planta de frijol por tratamiento con los aislamientos de Trichoderma spp. ..................................................................................... 55

xiv  

RESUMEN

El frijol común (Phaseolus vulgaris L.) es parte fundamental de la dieta del pueblo

mexicano y uno de los principales cultivos en el estado de Durango, donde los rendimientos

son menores a la media nacional debido a factores sociales, abióticos y bióticos; dentro de

estos últimos figuran las enfermedades causadas por hongos, destacando la pudrición de la

raíz. Esta enfermedad puede estar causada por hongos de diferentes especies, entre los

cuales identificamos a F. solani, F. oxysporum y M. phaseolina como los más importantes.

Especies del género Trichoderma han sido utilizadas para el control biológico de

enfermedades fúngicas, principalmente por su capacidad micoparasítica, por ello en el

presente trabajo se identificaron y caracterizaron molecularmente mediante análisis de la

región ITSs del DNAr, cepas de Trichoderma spp. nativas del estado de Durango para

controlar a los hongos fitopatógenos involucrados en la pudrición de raíz del frijol. Las

especies de Trichoderma identificadas fueron T. harzianum, T. virens, T. gamsii y T.

asperellum. A partir de cultivos monoconidiales se determinaron las tasas de crecimiento

de los hongos y mediante cultivos duales en placas de PDA se evaluó la capacidad in vitro

de las especies de Trichoderma para antagonizar a los fitopatógenos descritos; para ello se

seleccionaron aislamientos de Trichoderma spp. con índices de crecimiento contrastante.

Aislamientos de las especies T. gamsii, T. asperellum y T. virens mostraron un control

eficiente sobre la mayoría los fitopatógenos en los ensayos in vitro. Se encontró correlación

baja negativa entre las tasas de crecimiento y la capacidad antagónica in vitro de los

aislamientos de Trichoderma. En los ensayos de antagonismo y promoción del crecimiento

vegetal en invernadero se evaluó establecimiento de plantas, numero de vainas por planta,

altura de la planta, área foliar, peso seco total, peso seco de la raíz y severidad de daños.

Las plantas inoculadas con T. asperellum mostraron mejores desempeños para los

parámetros medidos al ser confrontadas contra M. phaseolina y F. oxysporum, en el caso de

F. solani las plantas inoculadas con T. virens se comportaron mejor. Los aislamientos 12-

10T y 1-14T correspondientes a las especies de T. asperellum y T. virens se ofrecen como

una alternativa viable para el biocontrol de la pudrición de raíz del frijol en el estado de

Durango por lo que se sugiere escalar los ensayos a campo.

xv  

ABSTRACT

The common bean (Phaseolus vulgaris L.) is a fundamental part of the Mexican people

diet and a major crop in the Durango state, where yields are lower than the national average

due to social, abiotic and biotic factors; diseases caused by fungi are the main and the root

rot are the most important. This disease can be caused by different fungal species, we

identified to F. solani, F. oxysporum and M. phaseolina, as the most important.

Trichoderma species have been used for biological control of various fungal diseases,

mainly for their mycoparasitism, for that reason, in the present work we identified and

subsequently characterized molecularly through the approach of the rDNA ITSs, native

Trichoderma strains of Durango state to control fungal pathogens involved in the common

bean root rot. T. harzianum, T. virens, T. gamsii and T. asperellum, were identified. From a

fungal single spore cultures were determined growth rates and dual cultures on PDA plates

in order to evaluate in vitro the ability of Trichoderma species to antagonize the pathogens.

Trichoderma isolates were selected with contrasting growth rates. T. gamsii, T. asperellum

and T. virens showed an efficient control over most phytopathogens in vitro assays. Low

negative correlation was found between growth rates and in vitro antagonistic ability of

Trichoderma isolates. Antagonism and plant growth promotion tests was to carry out to

evaluate in greenhouse percent of establishment of plants, number of pods per plant, plant

height, leaf area, total dry weight, root dry weight and severity of damage. Plants

inoculated with T. asperellum showed better results for the measured parameters when to

be compared against M. phaseolina and F. oxysporum; similar case ocurrs in plants

inoculated with T. virens versus F. solani. T. asperellum and T. virens are offered as a

viable alternative for the biocontrol of common bean root rot in the Durango state; in this

point, we suggest perform field trials.

1  

1. INTRODUCCIÓN

El frijol común (Phaseolus vulgaris L.) es la leguminosa alimenticia más importante

para consumo directo en el mundo. Entre los principales cultivos alimenticios, este tiene

uno de los más altos niveles de variación en cuanto a hábitos de crecimiento, características

de la semilla (tamaño, forma y color), madurez y adaptación (FAO, 2008). En la actualidad,

la importancia del frijol en la dieta alimentaria del pueblo mexicano sigue siendo

fundamental, debido básicamente a sus cualidades nutritivas, caracterizadas por el gran

contenido de materias proteicas. El frijol en estado seco tiene mayor cantidad de materia

albuminoidea que la carne. Sin embargo, al ser sometido al proceso de cocción, que es la

forma en que se consume, pierde ciertas características nutritivas. Nuestro pueblo no cuenta

con otro sustituto de frijol, como lo hay en otros, y se considera que si no se consumiera

esta leguminosa, le faltaría en su alimentación materias grasas, proteicas o albuminoideas,

que otros pueblos obtienen de la carne, jamón, queso, mantequilla y otros productos

alimenticios manufacturados; y que no son consumidos por el precio tan alto en el mercado

y por la reducción del poder adquisitivo de las familias mexicanas ocasionado por la crisis,

que ha impactado la dieta alimentaria (Fanghanel, 1997).

El frijol es uno de los principales cultivos en el estado de Durango; en el 2007 ocupó

una superficie de siembra de 223,454.77 has de las cuales se cosecharon 202,175.27 has

con una producción de 109,4032.58 ton lo que arroja un rendimiento promedio de 0.54

ton/ha (SAGARPA, 2009). Pese a los grandes esfuerzos de investigación que se han

realizado, el frijol sigue siendo un cultivo vulnerable a las sequías, las heladas tempranas, al

ataque de plagas y enfermedades, o bien, al exceso de lluvia fuera de tiempo. Estos

factores, cobran importancia cuando consideramos que en los últimos años el 70% de la

producción de frijol se obtuvo de superficies de temporal (SAGARPA, 2009).

La producción de frijol se ve afectada por múltiples factores que se pueden clasificar

como abióticos y bióticos, entre los abióticos se incluyen las condiciones climáticas y

edáficas, además de las prácticas culturales y de fertilización; en cuanto a los factores

bióticos, estos involucran una gran diversidad de organismos tanto macroscópicos como

microscópicos, donde los hongos fitopatógenos juegan un papel importante ya que son

2  

causantes de las principales enfermedades que limitan el desarrollo de este cultivo; entre las

más importantes podemos mencionar la pudrición de la raíz, puesto que produce daños

considerables y grandes pérdidas a los agricultores (Abawi y Pastor-Corrales, 1990). La

incidencia y severidad de las pudriciones de raíz, y los daños que ocasiona, varían

considerablemente entre variedades y también de una temporada a otra. Esta variabilidad en

la severidad de la pudrición de raíz, sintomatología y daños, resulta de los efectos directos o

indirectos de las condiciones del suelo, del ambiente, del número y tipo de patógenos de la

pudrición que están presentes y activos durante la enfermedad bajo condiciones específicas

(Abawi y Pastor-Corrales, 1990).

En los últimos años se han utilizado organismos vivos para el control de plagas y

enfermedades, uno de estos organismos de control biológico es el hongo Trichoderma spp.

el cual tiene la habilidad de parasitar a hongos fitopatógenos (Harman et al., 2004) y por

más de 40 años se ha utilizado como agente promotor de crecimiento vegetal y como

biocontrolador (Carsolio et al., 1994).

3  

2. ANTECEDENTES

2.1 El Frijol

El género Phaseolus comprende alrededor de 70 especies y ha contribuido al desarrollo

de la humanidad con cinco especies domesticadas durante la época precolombina, las

cuales son: el frijol común (Phaseolus vulgaris L.), el frijol anual (P. dumosus Macfad.), el

frijol ayocote (P. coccineus L.), el frijol tepary (P. acutifolius A. Gray) y el frijol lima (P.

lunatus L.). Este género es originario del continente Americano y un gran número de

especies se encuentran distribuidas en el área de Mesoamérica (Freytag y Debouck, 2002).

La domesticación del frijol común (Phaseolus vulgaris L.) se remonta a 3800 años a. de C.

según restos encontrados en Tehuacán, Puebla y es la evidencia más antigua en México

(Smith, 2005).

2.1.1 Importancia del frijol

El frijol común es la leguminosa más importante para consumo directo en el mundo

(Singh, 2001). En México ha sustentado la alimentación popular desde épocas

precolombinas, en donde se le conocía bajo distintos nombres: Etl (náhuatl), Tatsunitl

(purépecha), X-kalil-bul (maya), Bi-zaahul (zapoteco). Varios cronistas españoles

documentaron la importancia del frijol en la alimentación de los indígenas, como Fray

Bernardino de Sahagún, al describir la alimentación de los otomíes basada en el maíz,

frijol, chile, sal y tomates. Motolinia relata cómo, en los tianguis, se vendía el maíz en

granos y mazorcas al lado de semillas de frijol (Fanghanel, 1997).

La importancia del frijol en la dieta alimentaria del pueblo mexicano se fundamenta

básicamente en sus cualidades nutritivas, ya que es una fuente importante de proteínas,

minerales (Ca, Cu, Fe, Mg, Mn, y Zn) y vitaminas (ácido fólico) (Bressani, 1983). El

contenido de aminoácidos en semillas de frijol es complementario al de los cereales y se ha

estimado que el maíz y el frijol deben ser consumidos en una proporción de 2:1 para

obtener un óptimo balance en la dieta (Bressani, 1983). El frijol en estado seco tiene mayor

cantidad de materia albuminoidea que la carne, sin embargo, al ser sometido al proceso de

4  

cocción, que es la forma en que se consume, pierde ciertas características nutritivas

(Fanghanel, 1997).

2.1.2 Situación del frijol en México y Durango

En México los rendimientos del cultivo de frijol van desde 0.36 ton/ha en el estado de

San Luis Potosí, como el estado con más bajo rendimiento, hasta 1.81 ton/ha en el estado

de Colima, como el estado con mayores rendimientos (SAGARPA, 2009). Por otro lado, en

1995 se sembraron 2,353,800 ha y en el 2007 se redujo a 1,688,476.88 ha, en cuanto a la

producción en los mismos periodos fue de la siguiente manera; en 1995 se cosecharon

1,270,900 ton y en el 2007 se obtuvieron 993, 952.76 ton de frijol, en este mismo año el

rendimiento nacional fue de 0.67 ton/ha (SAGARPA, 2009). Esto nos muestra una clara

tendencia negativa en cuanto a la superficie sembrada y a la producción de frijol en nuestro

país debido a factores biológicos, climáticos, económicos y sociales. Durante el 2008 en

Durango el frijol ocupó una superficie de siembra de 223,454.77 has, de las cuales se

cosecharon 202,175.27 has con una producción de 109,432.58 ton arrojando un

rendimiento promedio de 0.54 ton/ha ubicando al estado por debajo de la media nacional,

pero en producción se ubica en tercer lugar después de Zacatecas y Sinaloa (SAGARPA,

2009).

La producción de frijol se ve afectada por múltiples factores que se pueden clasificar

como bióticos y abióticos. Los bióticos involucran una gran diversidad de organismos tanto

macroscópicos como microscópicos, donde los hongos fitopatógenos poseen un papel

importante ya que son causantes de las principales enfermedades que limitan el desarrollo

de este cultivo; en cuanto a los factores abióticos se incluyen las condiciones climáticas y

edáficas, además de las prácticas culturales y la fertilización.

2.2 Enfermedades del frijol

El concepto de enfermedad en las plantas, se refiere a la condición en la cual una o

varias de las funciones normales son alteradas por organismos patógenos o por

determinadas condiciones del medio (Agrios, 1998).

5  

Los patógenos penetran en las plantas a través de las aberturas naturales (estomas,

lenticelas, hidátodos y nectarios), de heridas causadas por granizadas, vientos fuertes,

aperos de labranza, o atravesando la epidermis, como lo hacen algunos hongos. Dentro del

tejido se multiplican causando necrosis y marchitamiento al taponar los haces vasculares,

esto conlleva un retraso en el crecimientos y en casos muy severos la muerte de la planta, lo

que reduce hasta en un 50% los rendimientos de los cultivo (Campos, 1987).

Las enfermedades que afectan al frijol son causadas por virus, bacterias, nematodos y

hongos, dentro de las que destacan el mosaico común de frijol (VMC), tizón de halo

(Pseudomonas syringae pv phaseolicola), tizón común del frijol (Xanthomonas campestris

pv phaseoli), antracnosis (Colletotrichum lindemuthianum), cenicilla polvorienta del frijol

(Erysiphe polygoni Dc ex Merat), roya o chahuixtle (Uromyces phaseoli typica), pudrición

de la raíz del frijol (Rhizoctonia spp., Fusarium spp., Pythium spp. y Macrophomina

phaseolina.) (Campos, 1987). Sin embargo las enfermedades ocasionadas por hongos

revisten mayor importancia ya que en México se han observado severos daños y pérdidas

económicas por pudrición de raíz de frijol causadas por hongos (Abawi y Pastor-Corrales,

1990).

2.3 La pudrición de raíz del frijol

La pudrición de la raíz del frijol es una enfermedad que afecta a este cultivo en

diferentes etapas del crecimiento y puede ser favorecida por diversos factores, así mismo

puede ser causada por diferentes especies de hongos, retrasando el crecimiento,

disminuyendo el establecimiento de plántulas y afectando los rendimientos de la

producción de grano.

2.3.1 Etiología

La pudrición de raíz es causada por diferentes hongos entre los cuales encontramos a

Fusarium oxysporum Snyder & Hansen, F. solani (Mart.) Sacc., Macrophomina phaseolina

6  

(Tassi) Goid, Rhizoctonia solani Kuhn, Sclerotium rolfsii Sacc., Pythium spp., entre otros;

además, también puede ser causada por algunos nemátodos. Los hongos mencionados

pueden atacar individualmente y causar daño a las plantas de frijol las cuales muestran

síntomas distintivos de la enfermedad. Sin embargo, también se observan infecciones

mixtas, incluso con organismos no patogénicos, dando como resultado enfermedades

radicales complejas. Ocasionalmente estos patógenos pueden actuar sinérgicamente,

incrementando el daño al frijol (Abawi y Pastor-Corrales, 1990). Acosta y col. (2003)

realizaron estudios de muestras de suelo del estado de Durango con alta incidencia de

pudrición de raíz, verificando la presencia de Fusarium spp.

2.3.2 Epifitología

La incidencia, severidad de la pudrición de raíz y los daños que ocasiona, son muy

diferentes entre variedades de frijol y también de una temporada a otra. Esta variabilidad en

la severidad, sintomatología y daños, resulta de los efectos directos o indirectos de las

condiciones del suelo, del ambiente, del número y tipo de patógenos presentes y activos

durante la enfermedad bajo condiciones específicas (Abawi y Pastor-Corrales, 1990).

La severidad y los daños de la pudrición de raíz del frijol son mayores cuando

prevalecen ciertas condiciones ambientales y del suelo, como drenaje inadecuado, mala

estructura, bajos contenidos de materia orgánica y una alta compactación del suelo, que son

favorables a la infección durante la primera etapa de crecimiento (Abawi y Pastor-Corrales,

1990). Además se ha documentado que esta enfermedad ataca al frijol común en

condiciones de deficiencia hídrica y por altas temperaturas durante ciertas etapas del

desarrollo del cultivo (Mayek-Pérez et al., 2001).

Las pudriciones de raíz son más prevalecientes cuando el frijol se siembra

continuamente en la misma parcela, es decir cuando la rotación de cultivos es inadecuada;

además, cuando se siembran consecutivamente cultivos susceptibles se permite la

acumulación poblaciones densas de patógenos de esta enfermedad (Abawi y Pastor-

Corrales, 1990).

7  

2.3.3 Signos y síntomas

La enfermedad se caracteriza por un cambio de coloración, obstrucción vascular y

destrucción de tejidos. Cuando es causada por R. solani, las lesiones son secas y con

hundimiento del tejido, en forma de uso café rojizo y bien delimitadas, a la altura de la

superficie del suelo. En tanto que Fusarium spp. ocasiona raíces con lesiones lineales,

puntiformes de color rojizo o café rojizo; también pueden presentar manchas café rojizas

sin forma definida; los haces vasculares de la raíz presentan manchas rojas y sufren

obstrucción al flujo de nutrientes y agua, ocasionando que las raíces se agrieten (Campos,

1987; Abawi y Pastor-Corrales, 1990; Pérez-Moreno et al., 1995).

Cuando la enfermedad es causada por M. phaseolina en el interior de la raíz se observa

una coloración café claro; la planta se puede arrancar fácilmente del suelo; al abrir la raíz se

observa en su interior una coloración oscura y micelio de color gris; también se encuentran

numerosos microesclerocios de color negro. En la parte aérea de la planta, inicialmente

sobre los tallos, aparecen manchas rojizas longitudinales que abarcan gran parte del tallo.

Son típicas, la defoliación prematura y la poca o nula turgencia de las vainas. Cuando la

planta se seca adquiere un color pajizo y las manchas se tornan de color negro debido a la

formación de miles de microesclerocios. La enfermedad avanza de la base del tallo hacia

arriba y puede transmitirse por medio de la semilla (Campos, 1987).

2.3.4 Prevención y control de la pudrición de la raíz

El uso de variedades de frijol resistentes, es la mejor estrategia para disminuir el efecto

de las pudriciones de raíz. Cuando no es posible utilizar estas variedades, el manejo

adecuado de las pudriciones de raíz incluye control químico aplicado al suelo o en la

semilla, control cultural como la rotación de cultivos, siembra en bordos levantados, y el

control biológico por medio de microorganismo benéficos del suelo (Abawi y Pastor-

Corrales, 1990; Campos, 1987).

8  

2.4. El control biológico, sus generalidades y uso de hongos como biocontroladores

Baker y Cook (1974) citados por Barrera (2006) definieron el control biológico como “la

reducción de la densidad de inóculo de las fuentes productoras de enfermedad, en

cualquiera de sus etapas biológicas, mediante uno o más organismos, lograda de manera

natural, a través de la manipulación del ambiente, del hospedero, del antagonista e incluso

por la introducción masiva de uno o más antagonistas”. Por su parte la Academia de

Ciencias de los Estados Unidos, definen al control biológico como “la utilización de

organismos naturales o modificados, sus genes o sus productos génicos, para reducir los

efectos no deseados ocasionados por plagas y enfermedades o para favorecer organismos

útiles para el hombre, tales como plantas, animales o microorganismos benéficos”.

A partir del uso de insectos entomófagos para el control de insectos plaga, el control

biológico se ha extendido al uso de una amplia gama de organismos para el control de

insectos, ácaros, caracoles, algunos vertebrados y plantas tan diversas como algas, hongos,

hierbas, arbustos y árboles. Entre los organismos usados como agentes de control se

incluyen virus, bacterias y sus toxinas, hongos y otros microorganismos patógenos,

nematodos, caracoles, insectos, ácaros, y vertebrados de varias clases. Cuando se utilizan

organismos como agentes de control generalmente tienen como efecto la muerte directa del

organismo al que atacan, a veces pueden operar de otras formas, como el caso de los

hongos antagonistas que inhiben el desarrollo de otros microorganismos mediante

sustancias que secretan (antibióticos), o nematodos que esterilizan a las hembras de los

organismos afectados o como aquellos que reducen la capacidad reproductiva o competitiva

de plantas (Rodríguez-del-Bosque y Arredondo-Bernal, 2007).

Los insectos plaga son altamente vulnerables a las infecciones con hongos, y pueden

causar alta mortalidad en poblaciones de hospederos, ocasionando epizootias

espectaculares, esto ha motivado al desarrollo de “micoinsecticidas” (Alatorre, 2006). En el

caso de las enfermedades fúngicas existen hongos capaces de parasitar a hongos

fitopatógenos, dentro de los que destacan los del género Trichoderma, los cuales han sido

9  

utilizados ampliamente como agentes de biocontrol por sus propiedades micoparasíticas y

su capacidad promotora de crecimiento (Howell, 2003; Harman, 2006).

2.5 El género Trichoderma spp.

El grupo de los hongos está constituido por una amplia diversidad de microorganismos

que son heterotróficos, eucariontes, unicelulares o hifales y se reproducen sexual o

asexualmente. Trichoderma spp. pertenece a la clase Deuteromycota (Hyphomycetes),

caracterizados por formas miceliales que poseen esporas asexuales o conidias, que nacen de

células conidiogénicas especializadas y no directamente de la hifa, por ejemplo de

conidióforos, esterigmas ó vesículas, algunas de éstas libres o en forma miceliar (Bonifaz,

1991; Harman y Kubicek, 1998; Alatorre, 2006.).

Las especies del género Trichoderma son consideradas organismos cosmopolita de

suelos, madera en descomposición y materia vegetal, están asociados con raíces de plantas

y muchas veces son componentes dominantes de la microflora del suelo en una amplia

variedad de hábitats. Esto puede ser atribuido a su diversa capacidad metabólica y

naturaleza competitiva, además de capacidad adaptativa (Harman et al., 2004).

Por alrededor de 70 años, especies del género Trichoderma (T. harzianum, T.

atroviride, T. asperellum, etc.) han sido conocidas por su capacidad de atacar a otros

hongos, por producir antibióticos que afectan a otros microorganismos (Weedling, 1934

citado por Harman, 2006; Hjeljord y Tronsmo, 1998), se ha comprobado que especies de

este género promueven el crecimiento de la planta y mejoran la productividad, ya sea en

presencia o ausencia de otros microorganismos; también se sabe que Trichoderma spp.

puede inducir la supresión de enfermedades en el suelo (Harman et al., 2004; Harman,

2006; Vinale et al., 2007). Algunas otras especies de este género son importantes por

producir enzimas de importancia industrial (Trichoderma reesei) (Kubicek y Penttilä, 1998)

y más recientemente especies de la sección Longibrachiatum han sido observadas como

patógenos oportunistas de mamíferos inmunocomprometidos incluyendo a humanos.

10  

También podemos encontrar frecuentemente a varias especies de Trichoderma como

contaminantes de ambientes cerrados (Druzhinina et al., 2005).

2.5.1 Mecanismos que emplea Trichoderma spp. para el biocontrol

La competencia por espacio y nutrientes es uno de los principales mecanismos que

Trichoderma spp. emplea para el biocontrol, por su rápido crecimiento y producción

eficiente de esporas. Se ha observado la competencia efectiva por nutrientes en la superficie

de semillas de algodón entre Trichoderma y R. solani, donde el antagonista termina por

desplazar al fitopatógeno (Howell, 2003; Inbar et al., 1996).

2.5.1.1 Los antibióticos

Los hongos del género Trichoderma son capaces de producir antibióticos que afectan a

otros microorganismos, entre los cuales destacan los peptaiboles ó peptaibióticos que son

polipéptidos lineares y anfipáticos. Estos compuestos son generalmente producidos en

mezclas micro-heterogéneas, poseen de 5 a 20 residuos de aminoácidos y son

característicamente ricos en ácido α-aminoisobutírico (Aib), poseen un extremo N-acil

(usualmente acetil) y un alcohol en el extremo carboxilo, ese alcohol puede ser

fenilalaninol o leucinol. Estos antibióticos tienen propiedades físico-químicas y biológicas

que les permiten formar poros en membranas de bicapas lipídicas, así como poseer

actividades antibacteriales, antifúngicas y ocasionalmente antivirales; adicionalmente

también pueden inducir resistencia a enfermedades en plantas (Neuhof et al., 2007;

Szekeres et al., 2005; Ghisalberti y Sivasithamparam, 1991).

La estructura química de los antibióticos de Trichoderma spp. sugiere dos mecanismos

de acción diferentes. La producción de compuestos de bajo peso molecular, no polares,

volátiles, resulta en una alta concentración de antibióticos en el suelo, que tienen influencia

sobre la comunidad microbiana, en un rango de distancia relativamente grande. Y en un

rango corto de distancia el efecto puede ser causado por los antibióticos polares y

peptaiboles actuando en una estrecha proximidad de la hifa productora (Vinale et al., 2007).

11  

Lorito et al. (1996) demostraron que los peptaiboles inhiben la actividad β-Glucana

sintasa en el hongo hospedero, mientras que actúan sinérgicamente con las β-Glucanasa de

T. harzianum. La inhibición de la glucana sintasa previene la reconstrucción de la pared

celular del patógeno, facilitando de este modo la acción lítica de las β-Glucanasas. El

sinergismo existente entre enzimas y antibióticos polares esta estrictamente relacionado a

su mecanismo de acción (Figura1).

Figura 1. Mecanismo de acción de antibióticos y quitinasas de Trichoderma sobre la pared celular del hongo hospedero (http://www.vt.tuwicen.ac.at/project/project.php?project_id=6). 

Los antibióticos han sido clasificados de acuerdo a su naturaleza de la siguiente

manera:

A. Antibióticos volátiles, 6-pentil-α-pirona (6PP) y muchos de los derivados de la

isocianida.

B. Compuestos solubles en agua, p. ej. ácido heptadílico o ácido koníngico.

C. Peptaiboles, los cuales son oligopéptidos lineares de 12-22 aminoácidos ricos en

ácido α-aminoisobutírico, N-acetilado en el extremo amino y con un alcohol en el

extremo carboxilo.

12  

(Szekeres et al., 2005; Sivasithamparam et al., 1998; Ghisalberti y Sivasithamparam,

1991).

Con base en el metabolito secundario producido, Howell et al. (1993), dividen las

cepas de T. virens en dos grupos: las cepas “P”, producen gliovirina; potente inhibidor

especifico de oomicetos y las cepas “Q”, que producen antibióticos gliotoxinas; los cuales

tienen un amplio espectro de actividad antibiótica.

2.5.1.2 El micoparasitismo

El micoparasitismo es definido como el principal proceso mediante el cual el

antagonista ejerce una mayor competencia por espacio y nutrientes e interacciona

directamente con el patógeno, dando como resultado la reducción y destrucción del

patógeno. Este es un proceso complejo que incluye la liberación de enzimas líticas por

parte de Trichoderma spp., degradación de la pared celular y posteriormente la penetración

de la hifa del hospedero utilizando estructuras especializadas para el ataque directo (De

Marco et al., 2007; Harman et al., 2004; Harman, et al., 2003; Inbar et al., 1996)).

Trichoderma spp. detecta a su hospedante y crece hacia él, posteriormente activa la

expresión secuencial de enzimas degradadoras de la pared celular (CWDEs) (Harman et al.,

2004). La difusión de estas enzimas catalizan la lisis de oligómeros de la pared celular del

hongo hospedero, estos a su vez inducen la expresión de endoquitinasas fungitóxicas

(Brunner et al., 2003), iniciando el ataque antes de que se realice el contacto con el

hospedero (Viterbo et al., 2002), paralelamente se producen antibióticos como los

peptaiboles, que actúan a nivel de pared celular del hospedero, inhibiendo la actividad de la

glucana sintasa y otras enzimas regeneradoras de la pared celular (Lorito et al., 1996)

(Figura 2).

 

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14  

celulasas son una herramienta importante para el micoparasitismo especialmente contra

oomicetos que causan pudriciones a las plantas (Lorito et al., 1993).

Algunas cepas de Trichoderma spp. producen proteasas que participan en el

micoparasitismo degradando las proteínas de la estructura de la pared de la célula,

desestabilizando al hospedero para predisponerlo a la penetración y ataque. Estas enzimas

también actúan inactivando las enzimas que el patógeno produce durante la infección a la

planta (Suárez et al., 2007).

Como se ha mencionado, las quitinasas de Trichoderma spp. tienen una función

importante en el proceso de micoparasitismo y han sido muy estudiadas; éstas se clasifican

en exo y endoquitinasas, las primeras rompen los enlaces entre moléculas de quitina

liberando oligómeros al medio, mientras que las segundas degradan de una manera más

fina a la molécula de quitina hidrolizándola en su estructura interna. Uno de los trabajos

pioneros en el estudio molecular de estas enzimas es el que Carsolio y colaboradores

realizaron en 1994, ellos clonaron el gen ech-42 y lo expresaron en E. coli, obteniendo una

bacteria con actividad quitinolítica. Análisis de northern blot de RNA total de T. harzianum

inducido por crecimiento en medio mínimo (MM), usando quitina como única fuente de

carbono, mostró altos de niveles del mensajero ech-42 a las 12 horas después de la

inducción, la expresión máxima fue a las 24 horas. Por el contrario en cultivos con glucosa

como única fuente de carbono los niveles de expresión de RNAm de ech-42 no fueron

detectables, esto indica claramente una alta relación entre la quitina y este gen, pero esto no

excluye la posibilidad de que Trichoderma secrete en bajos niveles esta enzima en

presencia de glucosa.

Brunner et al. (2003) realizaron un trabajo que complementa al de Carsolio et al.

(1993), ellos crearon una cepa mutante defectiva en el gen nag1 que codifica para una

quitobiosidasa, los resultados mostraron que la proteína producida por este gen tiene un

mayor impacto sobre la inducción de quitinasas por quitina en T. atroviride, esa mutación

bloqueó la expresión de otras quitinasas, incluyendo ech42. Este aporte es interesante ya

que amplía la visión sobre el mecanismo de inducción de las quitinasas en este género de

hongos. Este grupo sugiere que la importancia de la proteína Nag1p radica en que actúa

15  

sobre la quitina de la pared celular del hospedero formando de esta manera inductores

físicos que estimulan la producción de endoquitinasas en T. atroviride. Ellos encontraron

también, que a pesar de la ausencia completa de la actividad de nag1, aparentemente no se

redujo por completo la actividad de biocontrol de esta cepa. Una posible explicación a esto

es que posiblemente la cepa defectiva en nag1 pudo haber expresado otras enzimas o

proteínas relevantes para el biocontrol y así compensar la pérdida de la actividad quitinasa.

Esto se fundamenta en que ellos observaron un aumento en la actividad β-glucanasa en la

cepa mutante para nag1. En el medio natural la falta de esta enzima en Trichoderma spp.

podría ser compensada por la actividad de las glucanasas de las plantas.

Limón et al. (1995) aislaron y caracterizaron el gen chit33 de T. harzianum. El gen

chit33 se encuentra en una copia sencilla en el genoma de T. harzianum, y es fuertemente

reprimido en presencia de glucosa, y se interrumpe esa represión en condiciones de estrés

así como en presencia de micelio y paredes celulares de hongos. Esta quitinasa mostró ser

muy estable excepto en condiciones de estrés. También encontraron que es regulada de

manera independiente a otras quitinasas en T. harzianum, lo que sugiere una función

nutricional (saprofítica o micoparasítica) más que un papel morfogenético.

Viterbo et al. (2002) aislaron y secuenciaron la proteína CHIT36 de T. harzianum

CECT 2413 y encontraron que muestra una homología del 89% a nivel de aminoácidos con

CHIT37. Los análisis de Northern-Blot mostraron que en condiciones de estrés, la quitina

coloidal y N-Acetil-Glucosamina son inductores efectivos de este gen. El promotor de

chit36Y fue clonado y utilizado para la expresión directa del gen reportero gfp (codificante

para la proteína verde fluorescente) en transformantes de Trichoderma. En los

experimentos de confrontación con el fitopatógeno Rhizoctonia solani revelaron que el

contacto directo entre estos hongos no es necesario para la expresión de gfp. Una cepa de

Pichia pastoris recombinante en la proteína CHIT36 se mostró activa contra diferentes

fitopatógenos, confirmando la implicación de esta endoquitinasa en la actividad

micoparasítica de Trichoderma spp.

Trichoderma spp. también produce glucanasas dentro del grupo de las enzimas

degradadoras de pared celular, estas se dividen en exo y endoglucanasas, las primeras

16  

degradan al sustrato secuencialmente por el extremo no reducido, las segundas hidrolizan

las beta-ligandos de forma aleatoria a lo largo del polisacárido. De Marco et al. (2007)

midieron la producción de glucanasas de cepas de T. harzianum cultivado en un medio

líquido con presencia de quitina desde las cero a las 72 horas, observando un aumento en la

expresión de estas enzimas lo que indica una correlación entre dicho sustrato y su

expresión.

Como hemos visto, durante los últimos años los estudios moleculares de Trichoderma

spp. se han enfocado claramente a su habilidad para degradar polímeros, una parte

fundamental de la capacidad antifúngica de Trichoderma spp., que se compone de una serie

de genes que codifican una sorprendente variedad de enzimas líticas extracelulares

incluyendo, endoquitinasas, β-N-Acetilglucosaminidasa, quiti-1,4-β-qitobiosidasa,

proteasas, endo- y exo- β-1-3-Glucanasas, endo-β-1,6-Glucanasas, lipasas, xilanasas,

mananasas, pectinasas, pectinliasas, amilasas, fosfolipasas, RNAsas, DNAsas, etc. (Rey et

al., 2004). Las enzimas quitinolíticas y glucanolíticas son especialmente valiosas por su

actividad degradadora de pared celular sobre hongos patógenos de plantas, ya que

hidrolizan polímeros no presentes en tejidos de plantas, cada una de estas clases de enzimas

contiene diversos grupos de proteínas con diversa actividad enzimática, algunas han sido

purificadas y caracterizadas, sus genes han sido clonados y estudiados (Apéndice A).  

2.5.1.2.2 Estructuras especializadas

Indiscutiblemente una de las características más sobresalientes del género Trichoderma

es su habilidad para parasitar a otros hongos. Inbar et al. (1996) han descrito el

micoparasitismo ejercido por una hifa de este agente biocontrolador sobre una hifa de S.

sclerotiorum, involucrando enrollamiento, permitiendo la fijación y la penetración, y

consecuentemente la disolución del citoplasma. Una vez que Trichoderma spp. entra en

contacto con el fitopatógeno, se enrolla alrededor de la hifa del hospedero formando

apresorios en la superficie del hospedero, en este sitio se producen perforaciones por donde

la hifa de Trichoderma spp. puede entrar al lumen (Harman et al., 2004). La adhesión es

mediada por la unión de carbohidratos de la pared celular del hongo blanco a lectinas en la

17  

pared celular de Trichoderma spp. (Inbar et al., 1996). Por otra parte, Howell (2003)

sugiere que este fenómeno ocurre a pesar de adicionar nutrientes de manera externa al

micoparásito en presencia del hospedero; menciona que se considera la posibilidad de que

bajo ciertas condiciones Trichoderma spp. puede actuar como un competidor por nutrientes

con S. sclerotiorum, pero define al micoparasitismo como el principal mecanismo de

biocontrol.

2.5.2 Trichoderma spp. como agente de control biológico

Como menciona Harman (2006), el uso de Trichoderma spp. como agente de control

biológico se remonta alrededor de setenta años atrás, lo que ha permitido desarrollar

múltiples investigaciones para la aplicación de este organismo en el control de

enfermedades fúngicas en diversos cultivos entre ellos el frijol, sin embargo, también es

importante mencionar su aplicación como agente promotor del crecimiento vegetal,

propiedad que ha sido bien fundamentada, ya que se ha reportado la producción de auxinas

y ácido indolacético en aislamientos de T. virens y T. atroviride (Contreras-Cornejo et al.,

2009).

Algunas especies de Trichoderma han sido empleadas para controlar diferentes

patógenos fúngicos que afectan el sistema radical de diferentes cultivos, tal es el caso en el

que Dubey et al. (2006) utilizaron aislamientos nativos de T. viride, T. virens y T.

harzianum para controlar F. oxysporum que estaba ocasionando daños en garbanzo (Cicer

arietinum L.). Ellos encontraron que al tratar las semillas con una suspensión de esporas

(106 esporas/ml/10g semillas) en combinación con carboxina (2 g/kg semilla) la

germinación de las semillas se mejoró en 12%-14% y el rendimiento de grano entre 42.4%

y 72.9%, además se redujo la incidencia de la pudrición entre 44.1% y 60.3%. También se

han realizado estudios con T. harzianum para controlar a algunos agentes implicados en la

pudrición radical del frijol tales como F. oxysporum, F. solani, S. rolfsii y M. phaseolina;

en los ensayos in vitro, T. harzianum presentó una marcada actividad antagonista y

micoparasítica lo cual se confirmó en las pruebas de campo donde el antagonista redujo la

18  

colonización de los fitopatógenos en las raíces de frijol en más de un 50% (Sandoval y

López, 2000).

Por su parte Larralde-Corona et al. (2008) reportan haber obtenido aislamientos nativos

del noreste de México de T. koningiopsis y Trichoderma spp. con capacidad de antagonizar

a cepas de M. phaseolina aisladas de plantas de frijol y sorgo. También encontraron que

existe una correlación positiva entre la secreción de β-1,3-glucanasa y N-acetil-

hexosaminidasa y la capacidad biocontroladora de los aislamientos de Trichoderma spp.

Sin duda son varias las especies de hongos fitopatógenos contra las que se ha aplicado

Trichoderma spp. como agente de control biológico, en el apéndice B se resumen las

especies más utilizadas, fitopatógenos controlados, enfermedad y cultivos beneficiados.

19  

3. Justificación 

El frijol y el maíz forman un binomio de gran importancia socioeconómica en México.

El maíz proporciona la mayor parte de carbohidratos, y el frijol la mayor parte de las

proteínas de la dieta del pueblo mexicano (Kohashi-Shibata, 1990). El frijol representa en

nuestro país el segundo cultivo más importante, desde el punto de vista tanto nutricional

como cultural así como en superficie sembrada y a nivel de producción según datos de la

SAGARPA (2009).

El frijol como todos los cultivos, es atacado por distintas plagas y enfermedades que

limitan los rendimientos y la calidad de las cosechas. Una de estas enfermedades es la

pudrición de la raíz del frijol que puede provocar la muerte de las plantas antes de que estas

lleguen a su madurez fisiológica, disminuyendo drásticamente la densidad de población en

el área sembrada y por ende la producción.

Hasta el momento en el control de enfermedades se han utilizado predominantemente

productos químicos, aún con los inconvenientes ambientales y ecológicos que conlleva el

uso de estos, dejando de lado la alternativa de los agentes de control biológico. Es por eso

que en este trabajo se propone el uso de cepas nativas de Trichoderma spp. para el control

de los patógenos causantes de la pudrición de la raíz del frijol. Esto dará un beneficio

económico a los productores, aumentando la calidad de la producción y el rendimiento de

este grano, además se dará respuesta a la creciente demanda de herramientas de control

biológico aplicables a los cultivos más importantes de nuestro país.

20  

4. Objetivos

 

4.1. Objetivo general

Identificar y usar cepas de Trichoderma spp. nativas del estado de Durango para

controlar a hongos fitopatógenos involucrados en la pudrición de raíz del frijol.

4.2. Objetivos específicos

A. Identificación molecular de los aislamientos de Trichoderma spp. y de los agentes

causales de la pudrición de raíz del frijol.

B. Caracterización de aislamientos de Trichoderma spp. con capacidad antagónica in

vitro.

C. Determinar la capacidad de biocontrol de los aislamientos nativos de Trichoderma

spp. sobre los patógenos causantes de la pudrición de raíz en invernadero en plantas

de frijol.

21  

5. Hipótesis

Las cepas de Trichoderma spp. nativas del estado de Durango son capaces de ejercer

una acción biocontroladora contra los hongos causantes de la pudrición de la raíz del frijol

en el estado de Durango.

22  

6. Materiales y Métodos 

6.1. Muestreo

En agosto del 2007 se colectaron muestras de suelo y raíces de plantas de frijol con

síntomas de pudrición en la región productora de “Los llanos” del estado de Durango

(Apéndice C). Quince localidades fueron analizadas y de cada una se obtuvieron 15

muestras. Las muestras de suelo y plantas se realizaron de forma aleatoria en cada parcela.

Fueron colectados 20 g de suelo a una distancia de 5 a 10 cm de la planta, también se

obtuvieron muestras para realizar análisis de suelo consistiendo de 1 a 2 kg de muestra a 30

cm de profundidad.

6.2. Análisis de suelos

Las muestras de suelo fueron analizadas por el INIFAP de Río Bravo, Tamaulipas y se

midieron parámetros correspondientes a pH, textura, conductividad eléctrica, contenido de

materia orgánica, nitrógeno, fósforo y potasio.

6.3. Aislamiento de fitopatógenos a partir de raíces

Las raíces con síntomas de pudrición aparente se desinfestaron con hipoclorito de sodio

al 2% durante dos min, posteriormente se enjuagaron dos veces con agua destilada estéril.

La raíz seccionada fue secada y colocada en placas con medio de cultivo papa dextrosa

(PDA) acidificado (pH 4) con ácido láctico, las muestras fueron incubadas en oscuridad

durante 24 horas a 30 + 1°C. El experimento constó de cuatro repeticiones.

Una vez identificado el hongo, se realizó la purificación de las colonias en la campana

de flujo laminar mediante diluciones de esporas en agua desionizada estéril. Se agregaron 3

ml de agua desionizada estéril a cada aislamiento y con una varilla de vidrio doblada estéril

se removió el micelio con la finalidad de desprender la mayor cantidad de esporas. Se

obtuvieron diluciones 10-3 de cada aislamiento. Una muestra de 300 µL de dicha dilución se

cultivó en una caja petri con medio PDA a 30 + 1°C durante 120 horas en condiciones de

23  

oscuridad. Posteriormente se hicieron cultivos monospóricos como se indica en el siguiente

apartado.

6.4. Aislamientos monospóricos de Trichoderma spp. a partir de muestras de suelo 

Para obtener los aislamientos monospóricos de Trichoderma spp. se hicieron

diluciones de las muestras de suelo en proporción de 1:10 (1 g de suelo por 9 ml de agua

destilada estéril) en tubos falcón de 15 ml; posteriormente se sembró un ml de esta dilución

en cajas petri con medio de cultivo TSM adicionado con antibiótico o ácido láctico,

incubándose durante 4 días a 27±1ºC con 12 horas de luz.

Una vez que se observó crecimiento, se aislaron aquellas colonias que presentaban la

morfología macroscópica típica de Trichoderma spp., tienen un crecimiento rápido (4 días),

las colonias al principio son blancas y algodonosas, cuando se desarrollan bajo condiciones

de luz y oscuridad alternadas presentan una banda delgada e incolora con otra banda ancha

y de un color verde oscuro, en condiciones de luz continua, las colonias son de color verde

oscuro. Posteriormente se colectaron las esporas, se determinó la concentración de esporas

mediante conteo en la cámara de Neubauer y se hicieron diluciones seriadas en agua

destilada estéril hasta tener 1000 esporas/ml, se inoculó un ml de la dilución en cajas petri

con PDA adicionadas con ácido láctico, incubándose a 27±1ºC por 12 horas para obtener

microcolonias provenientes de una sola espora y posteriormente se transfirieron

individualmente a una nueva placa de PDA y se incubaron a 27±1ºC por 4 días para tener

cultivos monospóricos del hongo.

6.5. Caracterización macroscópica y celular de hongos fitopatógenos y de aislamientos

Trichoderma spp.

La identificación de los aislamientos se llevó a cabo mediante la observación de esporas

y micelio en microscopio óptico. La caracterización de los fitopatógenos se llevó a cabo

aplicando las claves para la identificación de hongos fitopatógenos que reportan Barnett y

Hunter (1998) y CAB Internacional (2001). Para el caso de los aislamientos de

24  

Trichoderma spp. la caracterización se basó en las características morfológicas reportadas

por Gams y Bissett (1998).

6.6. Caracterización molecular

6.6.1. Obtención de DNA genómico

Para la obtención de DNA se usó el método modificado de Hoffman y Wriston (1987).

Se inocularon 10 ml de medio rico caldo papa-dextrosa (24 g de PDB Merck® en 1 L de

agua destilada y se esterilizó a 15 lb por 15 min) con micelio fresco del hongo de interés en

tubos falcón de 50 ml y se incubó durante 72 horas en agitación constante a 175 rpm y a

temperatura ambiente. El cultivo se centrifugó para obtener la masa celular que se lavó con

0.5 ml de agua destilada estéril, posteriormente fue transferida a un tubo eppendorf de 1.5

ml, se centrifugó por 30 segundos y se descartó el sobrenadante. Las células se

resuspendieron en 0.2 ml de solución de lisis (tritón X-100, 2%; SDS, 1%; NaCl, 0.1 M;

Tris-HCl pH8, 10 mM y EDTA, 1mM, después se añadieron 0.2 ml de fenol-cloroformo

isoamílico (25:24:1) y 0.3 g de perlas de vidrio (ballotini) de 0.45 mm de diámetro. El tubo

se mezcló en agitador tipo “vortex” por 1 min, y se dejó reposar en hielo por 1 min (este

paso se repitió 3 veces), después se añadieron 0.2 ml de TE 10:1 (Tris 10 mM y EDTA 1

mM), y se centrifugó durante 10 min a 12000 rpm., posteriormente la fase acuosa se

transfirió a un tubo nuevo y se añadieron 30 µg de RNAsa. Luego de una incubación de 5

min a 37ºC, se agregaron 10 µl de acetato de amonio 4M y 1 ml de etanol al 100%. El

contenido del tubo se mezcló por inversión y se dejó reposar por 15 min a -20ºC. Después

se centrifugó por 5 minutos a 12000 rpm y el precipitado se lavó con 100 µl de etanol al

70%. Se eliminó el sobrenadante y se secó el precipitado a una temperatura de 55ºC en un

termobloque hasta que se evaporó el etanol. El DNA obtenido fue resuspendido en 30 µl de

TE 10:1 y finalmente se almacenó a -20ºC hasta ser usado. La calidad del DNA se evaluó

mediante una electroforesis en gel de agarosa al 1% teñido con SYBR® Gold y se

fotografió bajo luz UV.

25  

6.6.2. Amplificación de la región ITS de los genes RNAr

Mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se amplificó un fragmento

correspondiente a la región ITS1-5.8S-ITS2 RNAr con los iniciadores universales ITS1

(5´TCCGTAGGTGAACCTGCGG 3´) e ITS4 (5´TCCTCCGCTTATTGATATGC 3´)

(White, et al.,1990). Las reacciones de PCR con un volumen final de 50 μl contenían: 40.5

μl de agua mili Q estéril, 1 μl de DNA, 5 μl buffer de reacción con MgCl2 1.5 mM, una

mezcla de 1 μl de dNTPs a 10 mM y 1 μl de cada iniciador a 500 ng/μl y se añadió 0.5 μl

de Taq DNA polimerasa a una concentración de 5 U/μl. Se empleó la técnica Hot Start, que

consiste en agregar los iniciadores en el primer ciclo de desnaturalización de la PCR. Las

amplificaciones por PCR fueron realizadas en un termociclador (9800 Fast Applied

Biosystem®) con un periodo de desnaturalización de 3 min a 94ºC , seguido de 35 ciclos

(desnaturalización 94ºC durante 1min, alineación por 1min a 54ºC y una extensión de 1 min

a 72ºC), con una extensión final de 1 min a 72ºC.

Los productos amplificados se analizaron mediante electroforesis en gel de agarosa al

1%, teñidos con SYBR® Gold y las bandas se visualizaron en un transiluminador Kodak

digital ScienceTM 1D.

6.6.3. Purificación de los productos de PCR

Los productos de PCR se purificaron con el paquete Wizard® de la compañía Promega

Corporation de acuerdo a las especificaciones del fabricante. Posteriormente el DNA se

almacenó a -20ºC.

6.6.4. Secuenciación de los fragmentos amplificados

Los productos de PCR purificados se secuenciaron en ambas cadenas por el método de

terminadores en el CINVESTAV Irapuato, Guanajuato, México.

6.6.5. Análisis bioinformático de las secuencias

Las secuencias de Trichoderma spp. se analizaron con el software TrichOKEY 2.0 para

hacer la identificación a nivel de especie (ISTH, 2009). Para el caso de los fitopatógenos las

26  

secuencias fueron comparadas en la base de datos del NCBI mediante un análisis tipo

BLAST, tomando como referencia las de identidad mayor al 98%. Una vez identificados

cada uno de los aislamientos a nivel de especie se procedió a realizar alineamientos de

secuencias por el método ClustalW con el programa MegAlign del paquete DNASTAR y

se generaron dendrogramas para los aislamientos de Trichoderma spp. y los hongos

fitopatógenos.

6.7. Determinación de tasas de crecimiento de las especies de Trichoderma spp. y

patógenos

La determinación de tasas de crecimiento de Trichoderma spp. y de los patógenos se

realizó colocando discos de 5 mm de los cultivos monospóricos en el centro de una placa

de PDA, y se incubó a 27±1 ºC, con 12 horas de luz y 12 horas de oscuridad; las medidas se

tomaron en los cuatro puntos cardinales de la caja cada 12 horas; con los datos obtenidos se

calculó la pendiente de la curva generada por los datos de crecimiento (mm) sobre tiempo

(h).

6.8. Pruebas de patogenicidad de los aislamientos obtenidos de raíces con síntomas de pudrición  

Este experimento se realizó para corroborar que los hongos aislados de raíces con

síntomas de pudrición realmente fueran responsables de la enfermedad y verificar el grado

de susceptibilidad de las variedades de frijol hacia estos aislamientos. A partir de cultivos

en placas de PDA de los hongos fitopatógenos se colocaron 10 semillas de frijol de la

variedad Pinto Villa, Pinto Saltillo y pinto UI-114, esta última considerada como

susceptible a M. phaseolina. Las semillas previamente se desinfestaron con hipoclorito de

sodio al 2%, y se incubaron a 27±1 ºC, con 12 horas de luz y 12 horas de oscuridad. El

grado de patogenicidad se evaluó a los 5 días aplicando la escala de Manici et al. (1995)

que se muestra en el cuadro 1. Se utilizaron como referencia los aislamientos de M.

phaseolina HMP4 y HMP5 que se consideran de alta y baja patogenicidad respectivamente,

estas cepas pertenecen a la colección de hongos del laboratorio de Biotecnología Vegetal

del CBG-IPN.

27  

6.9. Pruebas de antagonismo in vitro

Para realizar las pruebas de antagonismo in vitro se hicieron cultivos duales en los que

se colocó un disco de 5 mm de un cultivo de Trichoderma spp. y otro igual de un patógeno

en los extremos del eje central de una placa con agar y 20% de jugo V8, se incubó a 27±1

ºC, con 12 horas de luz y 12 horas de oscuridad (Bell et al., 1982). La actividad antagonista

de cada aislamiento de Trichoderma spp. sobre cada fitopatógeno se midió a los 5 y 8 días

aplicando la escala reportada por Ávila et al. (2001) que se muestra en el cuadro 2.

Cuadro 1. Escala para la evaluación de la patogenicidad de Fusarium spp. y M. phaseolina en semillas de frijol común (Manici et al., 1995).

Grado de daño Síntomas en la semilla 0 Semilla no infectada. 1 Decoloración de la porción de la semilla que estuvo en contacto con el

micelio. 2 Tegumentos de la semilla cubiertos con micelio pero no infectada. 3 Tegumentos de la semilla libre de micelio pero infectada. 4 Los tegumentos y cotiledones de la semilla infectados. 5 Semilla infectada, sin germinación.

Cuadro 2. Escala para la evaluación in vitro de la actividad antagonista de Trichoderma spp.

Valor Descripción 1 El patógeno crece en toda la caja deteniendo a Trichoderma spp. 2 El patógeno crece más del 75% entremezclándose con Trichoderma

spp. e inhibiéndolo. 3 Patógeno y Trichoderma spp. crecen 50% deteniendo ambos su

crecimiento. 4 Trichoderma spp. sobrecrece al patógeno inhibiéndolo y ocupando el

75% de la caja. 5 Trichoderma spp. sobrecrece al patógeno ocupando el 100% de la caja.

(Ávila et al., 2001).

6.10. Pruebas de antagonismo en la planta

Se realizaron dos experimentos de antagonismo de Trichoderma spp. en planta en el

invernadero del CBG-IPN. Para la cama de siembra se preparó una mezcla con 75% de

suelo y 25% de vermiculita, el suelo agrícola era proveniente de un cultivo de sorgo del

ejido Alfredo V. Bonfil del municipio de Reynosa, la variedad de frijol correspondió a

28  

Pinto Saltillo. La semilla se inoculó con una suspensión de esporas del antagonista a una

concentración de 1x106 esporas/ml en el primer experimento y 5x106 esporas/ml en el

segundo experimento. Para el caso de los fitopatógenos en el primer experimento se

inoculó el suelo con 1x106 esporas de F. oxysporum y para M. phaseolina se aplicaron 4

discos de 5mm de diámetro de cultivo en PDA.

Cada unidad experimental consistió en una maceta con 4 semillas. Para el primer

experimento se utilizaron 2 kg de suelo con vermiculita y para el segundo 1 kg del cual ½

kg era estéril y formó el horizonte de siembra y donde se inoculó el patógeno.

Los tratamientos fueron: planta + patógeno, planta + Trichoderma spp., planta sola y

planta + Trichoderma spp.+ patógeno, con 6 repeticiones en el primer experimento y 4 en

el segundo.

Las variables medidas fueron: días a la germinación (etapa V1) y a desarrollo completo

de las hojas cotiledonales (etapa V2), establecimiento de plantas, biomasa expresada en

peso seco, peso seco del vástago, peso seco de la raíz, altura de la planta y área foliar la

cual se estimó multiplicando largo por ancho de la hoja por la constante 0.7. La severidad

de los daños causados por Fusarium y M. phaseolina se evaluaron considerando la escala

de Abawi y Pastor-Corrales (1990).

6.11. Análisis estadístico.

Para analizar las tasas de crecimiento de los aislamientos de Trichoderma spp. y

fitopatógenos se calculó la pendiente de la línea de regresión y con los datos obtenidos se

realizó un ANVA (análisis de varianza); para determinar la diferencia estadística

posteriormente se aplicó la separación de medias por DMS (Diferencia mínima

significativa), el mismo procedimiento se llevó a cabo para analizar los datos de las pruebas

de antagonismo in vitro y posteriormente se realizó un análisis de correlación entre las tasas

de crecimiento y las pruebas de antagonismo in vitro y en invernadero. Para analizar el

efecto de la acción antagónica en planta y la promoción de crecimiento vegetal se aplicó un

diseño completamente al azar, el cual consiste en la asignación de tratamientos en forma

29  

completamente aleatoria y para el cual las unidades experimentales estuvieron

representadas por macetas con cuatro plantas cada una y cuatro repeticiones. Este diseño es

apropiado para experimentos donde se tiene control tanto de las unidades experimentales

como de las condiciones ambientales que rodean el experimento. La DMS fue el método

empleado para la separación de medias.

30  

7. Resultados

7.1. Muestreo

Se obtuvieron raíces de frijol con infección aparente de hongos. Se obtuvieron 20g de

suelo para obtener los aislamientos de Trichoderma spp., en total se colectaron doscientas

veinticinco muestras de quince localidades (Apéndice C). Los cultivos de frijol estaban en

etapa de floración y las variedades muestreadas fueron Negro 80-25, Pinto Saltillo, Pinto

Zapata, Pinto Villa, Negro San Luis, Flor de junio y Canario. También se registró la altura

sobre el nivel del mar de las localidades muestreadas así como su geoposición.

7.2. Análisis de suelo

Todas las muestras de suelo por su contenido de arena, limo y arcilla se clasifican como

suelos francos, oscilando entre franco arenoso y arena franca. La totalidad de las

localidades mostraron un pH neutro con valores de 6.5 a 7.3. La conductividad eléctrica

indica que la mayoría de las muestras tienen efectos despreciables de salinidad y solo las

localidades 1 y 7 se encuentran ligeramente salinas. Para el contenido de materia orgánica

(M.O.) casi todas las localidades tienen bajos contenidos de esta y solo las localidades 14 y

15 se encuentran con un contenido de M.O. medio. La totalidad de las muestras contienen

niveles medios de nitrógeno inorgánico; para el fósforo disponible solo las localidades 4, 6,

9 y 12 tienen niveles altos de este mineral y el resto un contenido medio; en cuanto al

potasio todas las localidades exhibieron un contenido alto. De las localidades 1, 2 y 3 se

obtuvieron el mayor número de aislamientos de Trichoderma spp., mientras que en las

localidades 8, 11, 13 y 14 no se encontró ningún aislamiento de esta especie; en el apéndice

F se detallan los valores obtenidos para cada parámetro. En el análisis de correlación entre

los diferentes factores del suelo y el número de aislamientos de Trichoderma spp. del

cuadro 3 se puede observar que existe una baja correlación entre los valores de los distintos

factores del análisis físico y químico del suelo y el número de aislamientos de Trichoderma

spp. obtenidos, mostrando para el potasio una correlación totalmente nula.

31  

Cuadro 3. Análisis de correlación entre los factores del suelo analizados y el número de aislamientos de Trichoderma spp. obtenidos. Arena Limo Arcilla pH C.E. M.O. N P K Coef. Correl. -0.01 0.19 -0.21 -0.14 0.24 -0.36 0.33 -0.25 0.00

7.3. Aislamientos de fitopatógenos a partir de raíces

De las raíces con síntomas de pudrición aparente (Figura 3) se obtuvieron 75

aislamientos que fueron identificados por su morfología macroscópica y microscópica, de

los cuales el 54% se clasificaron dentro del género Fusarium, 10% como Macrophomina,

9% dentro del género Pythium y 26% no lograron identificarse por estos medios.

Figura 3. Raíces de frijol con signos de pudrición.

7.4. Aislamientos monospóricos de Trichoderma spp. a partir de muestras de suelo

De las muestras de suelo se obtuvieron 38 aislamientos con las características macro y

microscópicas típicas del género Trichoderma, las cuales son; rápido crecimiento,

abundante esporulación, colonias color verde, en algunos casos acidificación del medio.

En la figura 4 se muestran los aislamientos correspondientes a las especies de

Trichoderma obtenidas de las muestras de suelo y los principales aislamientos de

fitopatógenos obtenidos de las raíces con síntomas de pudrición.

 

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36  

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3‐2p

3‐2p 7p

25‐1p

31‐1p

2‐1p

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31‐1p

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6‐1p 31p

7‐2p 17p

14p 6

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32p

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32‐1p

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0.5

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2-4

1-12

R1-

72-

93-

72-

81-

92-

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1-11 5-

52-

10A 1-6

3-6

3-12

10-6

4-15

15-1

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12 7-7

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512

-10

1-10

15-7

4-11

1-11

6-10 3-

43-

412

-11

6-11 1-

43-

81-

131-

14

Figura 9. Tasas de crecimiento de los aislamientos de Trichoderma spp. Se resaltan en gris los aislamientos con tasas de crecimiento contrastantes

Los aislamientos de fitopatógenos 10-i-1p, 25-2p, 15-i-2p, 33p, 7-3p y 3-i-4p de M.

phaseolina mostraron los mayores índices de crecimiento, mientras que los aislamientos de

las especies correspondientes al género Fusarium crecieron a una rapidez intermedia y el

aislamiento 5-2p de F. equiseti tuvo el índice de crecimiento más bajo (Figura 10), estos

aislamientos se utilizaron para las pruebas de patogenicidad in vitro.

Figura 10. Tasas de crecimiento de los aislamientos de fitopatógenos.

37  

7.7. Pruebas de patogenicidad de los aislamientos de fitopatógenos

En estos ensayos se colocaron diez semillas por caja y se evaluaron de forma

individual aplicando la escala de Manici et al. (1995), se realizó un ANVA y comparación

de medias por DMS. En la figura 11 se muestran los ensayos de patogenicidad sobre

semillas de la variedad Pinto Villa. Se pueden observar los daños causados por el

aislamiento 3-i-4 de M. phaseolina que inhibió la germinación causando pudrición de la

semilla, se observó crecimiento de micelio sobre la cutícula y al seccionar la semilla por la

mitad se observó la formación de microesclerocios. El aislamiento 6-i-2p de F. oxysporum

no mostró crecimiento de micelio sobre la cutícula sin embargo alrededor del 30% de las

semillas mostraron pudrición y al seccionarlas por la mitad se observó crecimiento de

micelio en su interior. El aislamiento 11-i-1p de F. solani mostró efectos mínimos sobre la

germinación, no hubo crecimiento de micelio sobre la cutícula y al seccionar las semillas

no se observó ningún daño en el interior, sin embargo después de la germinación se

observaron daños en la radícula. En estos ensayos el aislamiento de F. annulatum alcanzó

4.7 en la escala de patogenicidad, seguida de los aislamientos de M. phaseolina

principalmente el aislamiento 3-i-4 que obtuvo 3.85, los aislamientos 11-i-1p de F. solani,

34p A. tenuissima y 6-i-2p de F. oxysporum obtuvieron un valor de 2 y el aislamiento 14p

de B. ochroleuca de 1.8, las cepas de referencia HMP4 y HMP5 obtuvieron valores de 4.5 y

3 respectivamente, el ANVA indicó que existe diferencia entre tratamientos (P<0.01) y se

obtuvo un coeficiente de variación de 29.34%, la comparación de medias se muestra en el

cuadro 4.

 

Figsolasola

CuaMa

gura 11. Dañani a semillaani a la radícu

adro 4. Comanici et al., (1

os causados as de frijol deula.

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TRATA10P F. aHMP4 M3-i-4 M.33p M. p7-3P M.10-i-1P 25-2P M15-i-2P HMP5 M11-i-1p F34P A. t6-i-2 p F14P B. oNIVEL Medias diferente

a los 5 días e la variedad

e medias de emillas de fri

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M. phaseolinaM. phaseolin

M. phaseolinaF. solani. tenuissima. F. oxysporumochroleuca. DE SIGNIFIcon la mis

es.

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M 4.7000 A

a. 4.5000 A 3.8500

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na. 3.4000 . 3.3500

na. 3.2500 a. 3.0000

2.0000 2.0000

. 2.0000 1.8000

CANCIA = 0sma letra no

entos de M. pa. La flecha in

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B B B BC BC BC C D D D D

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se en la esca

38 

m y F. por F.

ala de

39  

Los resultados de los ensayos con Pinto Saltillo y Pinto UI-114 se muestran en la

figura 12, M. phaseolina sobre Pinto Saltillo alcanzó un nivel de patogenicidad de 5 ya que

inhibió la germinación de la totalidad de semillas, además de que presentó crecimiento de

micelio y microesclerocios dentro y sobre las semillas; F. oxysporum mostró un nivel de

patogenicidad de 3.6 ya que las semillas tenían los tegumentos libres de micelio pero al

seccionarlas se observaron síntomas de infección. Con Pinto UI-114, variedad considerada

como susceptible; M. phaseolina alcanzó un valor de 4.6 y F. oxysporum un grado de

patogenicidad de 2.4.

7.8 Pruebas de antagonismo in vitro

En las pruebas de antagonismo in vitro que se ilustran en las figuras 13 y 15; se

confrontaron los aislamientos 3-10T y 3-9T de T. harzianum que presentaron las tasas de

crecimiento más altas y el aislamiento 3-8T de esta misma especie con crecimiento más

lento, así como los aislamientos 1-13T, 1-14T, 12-10T de las especies T. gamsii, T. virens,

T. asperellum respectivamente y el aislamiento 23p de Trichoderma sp. que fue obtenido de

raíz de frijol con síntomas de pudrición, contra los aislamientos de fitopatógenos de M.

phaseolina 3-i-4, 11-i-1p de F. solani, 6-i-2p de F. oxysporum, 10p de F. annulatum, 14p

de B. ochroleuca, 34p de A. tenuissima y la 5-1p de F. equiseti como referencia la cepa

HMP4 de M. phaseolina. El nivel de antagonismo se midió aplicando la escala de Ávila et

al. (2001) que va de 1 a 5, con el valor más alto para el aislamiento más antagónico, esta

escala se aplicó a los 8 días como lo indican los mismos autores, en la figura 13 se

muestran ejemplos de los valores asignados según el grado de antagonismo.

El aislamiento que antagonizó mejor a M. phaseolina fue el 1-13T de T. gamsii que

logró sobrecrecer al patógeno ocupando casi el 100% de la caja obteniendo un valor de 5

en la escala, seguido por el aislamiento 12-10T de T. asperellum y 3-8T de T. harzianum

con 4.5. Contra F. oxysporum y F. solani todos los aislamientos antagonistas se

comportaron de igual forma con un valor de 4 en la escala, es decir Trichoderma spp.

sobrecreció al patógeno inhibiéndolo y ocupando el 75% de la caja (Figura 13 y 14).

40  

Día 1 Día 5 Promedio

escala Manici

P. Saltillo M. phaseolina

5

P. Saltillo F. oxysporum 3.6

P. UI-114 M. phaseolina 4.6

P. UI-114 F. oxysporum 2.4

Figura 12. Ensayos de patogenicidad de aislamientos de M. phaseolina y F. oxysporum sobre semillas de frijol Pinto Saltillo y Pinto UI-114. El valor de patogenicidad corresponde a la evaluación realizada a los 5 días con base en la escala de Manici et al., (1995).

41  

El ANVA (cuadro 5) de estas pruebas mostró que existe diferencia (P<0.05) en la

capacidad antagónica de los diferentes aislamientos y un coeficiente de variación de

15.54%, así mismo la comparación de medias que se muestra en el cuadro 6 clasificó en el

grupo A los aislamientos 1-13T de T. gamsii, 1-14T de T. virens, 12-10T de T. asperellum,

23p de Trichoderma spp. y 3-8T de T. harzianum y en el grupo B el aislamiento de

referencia HTI, el aislamiento 3-10T y 3-9T de T. harzianum.

Figura 13. Valores asignados según el grado de antagonismo con base en la escala de Ávila, Herrera y Peña (2001). 5 cuando Trichoderma spp. sobrecrece al patógeno ocupando el 100% de la caja y 4 cuando Trichoderma spp. sobrecrece al patógeno inhibiéndolo y ocupando el 75% de la caja.

 

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42 

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derma ara en

nución nde se ón de 40X.

43  

Cuadro 5. ANVA de las pruebas de antagonismo in vitro.

Cuadro 6. Comparación de medias por diferencia mínima significativa (DMS) de las pruebas de antagonismo in vitro.

El análisis de correlación entre las tasas de crecimiento y la capacidad antagónica in

vitro se muestra en el cuadro 7 y este muestra un coeficiente de correlación de -0.58 que

indica una correlación negativa moderada.

Cuadro 7. Análisis de correlación entre las tasas de crecimiento y la capacidad antagónica.

CRECIMIENTO ANTAGONISMO 3-10T T. harzianum 2.211 3.5714 3-9T T. harzianum 2.161 3.5238 1-13T T. gamsii 1.654 4.1905 1-14T T. virens 1.552 4.1429 12-10T T. asperellum 1.698 4.1429 HTI (REF) 1.611 3.7143 3-8T T. harzianum 1.491 4.1429 23p Trichoderma spp. 2.154 4.1429 CORREL. -0.58158175

FV GL SC CM F P<0.05 TRATAMIENTOS 7 12.327393 1.761056 4.6813 *

ERROR 160 60.190430 0.376190

TOTAL 167 72.517822

C.V. = 15.54 % *= Significativo

AISLAMIENTO TRATAMIENTO MEDIA 1-13T T. gamsii 3 4.1905 A 1-14T T. virens 4 4.1429 A 12-10T T. asperellum 5 4.1429 A 23p Trichoderma spp. 6 4.1429 A 3-8T T. harzianum 8 4.1429 A HTI (ref) 7 3.7143 B 3-10T T. harzianum 1 3.5714 B 3-9T T. harzianum 2 3.5238 B NIVEL DE SIGNIFICANCIA = 0.05 Medias con la misma letra no son estadísticamente diferentes

 

Figa laaisl

gura 15. Pruea izquierda deamientos con

ebas de antage la caja contrn tasas antagó

gonismo in vra los fitopatónicas más alt

itro. Se muesógenos a la das.

stran los cultivderecha, los re

vos duales deecuadros en r

e Trichodermrojo engloban

44 

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7.9

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13T

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9, Figura 17

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46  

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

Cuadro 8. Escala de incidencia y/o severidad para evaluar pudriciones de raíz (Abawi y Pastor-Corrales, 1990). Grado Valores 1 Sin síntomas visibles de la enfermedad.

3 10 a 20% de plantas infectadas y/o cerca de 5% de la planta afectada por el patógeno.

5 40 a 50% de las plantas infectadas y/o 20% de la planta afectada.

7 60 a 70% de la plantas infectadas y/o 40% de la planta afectada.

9 > 80% de las plantas infectadas y/o >60% de la planta afectada. Nota: Incidencia (número de plantas infectadas) y severidad (área o proporción de la planta afectada por el patógeno).

Figura 17. Severidad de daños de las cepas de Trichoderma spp. en plantas de frijol. Un valor de uno en la escala indica que no hay síntomas visibles de enfermedad.

En cuanto a las variables de días a la germinación (etapa V1) y a desarrollo completo

de las hojas cotiledonales (etapa V2) no hubo diferencias entre tratamientos, para el

parámetro de establecimiento de plantas T. asperellum fue el aislamiento con mejores

resultados mostrando un establecimiento de 100%, igual al testigo. Cuando se confrontó

contra las especies de F. solani y F. oxysporum y del 70% contra M. phaseolina seguido

por T. virens con un 50% para este último caso (Figura 18).

47  

0

20

40

60

80

100%

est

able

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a)

0

20

40

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b)

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100

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c)

Figura 18. Establecimiento de plantas a los 30 días expresado en porcentaje, los patógenos confrontados son a) M. phaseolina, b) F. solani y c) F. oxysporum. Obsérvese T. asperellum en comparación con el testigo.

Para las variables de peso seco total y peso de raíz de las plantas inoculadas solamente

con el antagonista, el aislamiento de T. asperellum mostró un mejor efecto con respecto al

testigo y los demás tratamientos (Figura 19); el ANVA para peso seco total mostró

diferencia significativa (P<0.01) y un coeficiente de variación de 14.84% (cuadro 9); el

ANVA de peso seco de raíz también mostró diferencia significativa (P<0.01) y un

coeficiente de variación de 10.63% (cuadro 9). En los tratamientos donde el antagonista se

confrontó contra M. phaseolina y F. oxysporum; T. asperellum fue el aislamiento que más

se acercó a los resultados obtenidos por el testigo (Figura 20), los ANVA respectivos

también mostraron diferencia significativa (P<0.05) y coeficientes de variación menores de

48  

15% (cuadros 12, 13, 14 y 15). Cuando se confrontó contra F. solani las plantas inoculadas

con esporas del aislamiento de T. virens alcanzaron mejores rendimientos para peso seco de

raíz (Figura 20), el ANVA para peso seco total mostró diferencia significativa (P<0.05) y

un coeficiente de variación de 26.2% y para peso seco de raíz también hubo diferencia

significativa (P<0.05) y un coeficiente de variación de 32.85% (Cuadros 16 y 17).

Cuadro 9. Cuadrados medios y coeficientes de variación de los ANVA correspondientes a los experimentos realizados en invernadero.

Variable Tratamiento Coeficiente de variación (%)

M. phaseolina

Severidad de daño 25.827 ** 38.1 Peso Seco Total (g) 0.041 * 11.1 Peso Seco Raíz (g) 0.004 * 11.9 Altura (cm) 3.497 * 10.73 Área Foliar (cm2) 2.729 * 14.1

F. oxysporum

Severidad de daño 3.731 NS 128.42 Peso Seco Total (g) 0.066 * 12.59 Peso Seco Raíz (g) 0.007 * 15.9 Altura (cm) 10.931 ** 10.5 Área Foliar (cm2) 15.206 * 19.71

F. Solani

Severidad de daño 8.760 NS 114.9 Peso Seco Total (g) 0.120 * 26.21 Peso Seco Raíz (g) 0.036 * 32.85 Altura (cm) 13.264 * 14.08 Área Foliar (cm2) 43.402 ** 30.37

S/Patógeno

Severidad de daño 0.003 NS 5.05 Peso Seco Total (g) 0.183 ** 14.84 Peso Seco Raíz (g) 0.015 ** 10.63 Altura (cm) 5.331 * 6.97 Área Foliar (cm2) 8.284 ** 10.31

49  

T. asperellumTestigo

T. gamsii

T. harzianum

HTIT. virens

0.2

0.3

0.4

0.5

0.7 0.8 0.9

Peso

seco

de

raíz

(g)

Peso seco total (g)

Figura 19. Relación entre peso seco total y peso seco de raíz de tratamientos sin patógeno. Destaca el aislamiento de T. asperellum por ser el que mostró los mejores resultados.

Al medir las variables de altura de la planta y área foliar en la etapa V4, en los

tratamientos sin patógeno las plantas inoculadas con T. harzianum, T. asperellum y el

testigo fueron las que mostraron mejores rendimientos (Figura 21), el ANVA de altura de la

planta mostró diferencia significativa (P<0.05) y un coeficiente de variación de 6.97%

(cuadro 9), el ANVA para área foliar mostró diferencia (P<0.01) y un coeficiente de

variación de 10.31 (cuadro 9). Al confrontar M. phaseolina y F. oxysporum contra las

plantas inoculadas con T. asperellum, éstas mostraron los valores más altos para las

variables de altura de la planta y área foliar (Figura 21); los ANVA mostraron diferencia

significativa (P<0.05) y coeficientes de variación menores de 20% (cuadro 9). Al ser

confrontados con F. solani las plantas inoculadas con T. virens mostraron mejor desempeño

para los parámetros mencionados, seguidas de las plantas inoculadas con T. asperellum y

las correspondientes al testigo (Figura 21), aquí el ANVA mostró diferencia significativa

(P<0.05) para altura de la planta y (P<0.01) para área foliar y los coeficientes de variación

de 14.0% y 30.37% respectivamente (cuadro 9).

T. asperellum es capaz de disminuir los daños ocasionados a la planta por M.

phaseolina (comparar versus tratamiento sin cepa de Trichoderma spp.) y obtener

resultados similares al testigo en los casos confrontados contra las especies de Fusarium

(Figura 22).

50  

TESTIGOT. asperellum

S/TrichodermaT. virens

HTIT. gamsii

T. harzianum

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.40 0.50 0.60 0.70 0.80 0.90

Peso

seco

de

raíz

(g)

Peso seco total (g)

a)

T. asperellumT. gamsii

TestigoS/Trichoderma

HTI

T. virens

T. harzianum

0.2

0.3

0.4

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0.65 0.7 0.75 0.8 0.85 0.9 0.95

Peso

seco

de

raíz

(g)

Peso seco total (g)

b)

T. virensTestigo

T. asperellumT. gamsii

HTI

S/TrichodermaT. harzianum

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1

Peso

seco

de

raíz

(g)

Peso seco Total (g)

c)

Figura 20. Relación de peso seco total y peso seco de raíz en plantas inoculadas con a) M. phaseolina, b) F. oxysporum y c) F. solani.

51  

T. asperellumTestigo

T. gamsii

T. harzianum

T. virensHTI

17

18

19

20

11 12 13 14 15

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m)

Área foliar (cm2)

a)

T. asperellumTESTIGO

T. gamsiiT. virens

T. harzianum

S/TrichodermaHTI15

17

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Altu

ra (c

m)

Área foliar (cm2)

c)

T. virensTESTIGO

T. asperellumT. gamsiiHTIT. harzianum

S/Trichoderma

1517192123

5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

Altu

ra (c

m)

Área foliar (cm2)

d)

Figura 21. Relación de área foliar y altura a los 30 días de plantas inoculadas con: a) sin patógeno, b) M. phaseolina, c) F. oxysporum y d) F. solani.

TESTIGOT. asperellum

S/TrichodermaT. gamsii

T. virens

HTIT. harzianum13

15

17

19

2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

altu

ra (c

m)

Área foliar (cm2)

b)

52  

0123a

0

1

2

3

4b

-30-20-10

01020304050

Dife

rencia con

 el testigo

 (%)

Figura 22. Severidad de daños de a) F. oxysporum, b) F. solani y c) M. phaseolina en plantas de frijol.

En los ensayos de promoción del crecimiento vegetal por las cepas de Trichoderma

spp. sin patógenos, haciendo referencia al testigo (planta sin Trichoderma spp.), T.

asperellum promueve el crecimiento de la planta representado por el peso seco total de la

misma y peso seco de la raíz en más del 40% (Figura 23 y 24).

Figura 23. Relación del peso seco total de las plantas de frijol con los tratamientos de aislamientos de Trichoderma spp.

0

2

4

6

8c

53  

010203040506070

Dife

rencia con

 el testigo

 (%)

-5

0

5

10

15

20

25

Dife

rencia con

 el Testigo

 (%)

Figura 24. Relación del peso seco de raíz de las plantas de frijol con los tratamientos de aislamientos de Trichoderma spp.

Con respecto a la altura de la planta, T. asperellum promueve en más del 20% su

crecimiento con respecto al testigo (Figura 25).

Figura 25. Relación de la altura de la planta de frijol con los tratamientos de aislados de Trichoderma spp. a los 30 días.

El desarrollo de las hojas, representado como el área foliar, se ve favorecido en un 32%

con respecto al testigo cuando T. asperellum está presente (Figura 26).

54  

Figura 26. Relación del área foliar de la planta de frijol con los tratamientos de aislados de Trichoderma spp.

Cuando el experimento en invernadero se llevó hasta la formación de vainas, éstas se

cuantificaron, mostrando que las plantas inoculadas con esporas del aislamiento de T.

asperellum produjeron una mayor cantidad de vainas (Figura 27).

Figura 27. Relación del número de vainas en la planta de frijol por tratamiento con los aislamientos de Trichoderma spp.

-505

101520253035

Dife

rencia con

 el Testigo

 (%)

0

1

2

3

No. de vainas

55  

8. Discusión

La zona enfocada en el presente estudio es parte de la región central del estado de

Durango conocida como “los llanos de Durango”, caracterizada por ser una de las zonas del

estado con mayor siembra y producción de frijol, se estudiaron las localidades más

representativas cuyas altitudes oscilan entre los 1880 y 2194 msnm. Las condiciones del

cultivo del frijol en la mayoría de estas localidades son de temporal, como lo refleja la

situación a nivel nacional de este cultivo según datos de la SAGARPA (2009). En el estado

de Durango, como en muchas partes del país, la siembra del frijol es a finales de junio o

principios de julio. A pesar que el frijol es considerado un cultivo noble porque en México

se siembra en una gran variedad de suelos, generalmente éstos son pobres en materia

orgánica y nutrientes disponibles, como lo reflejan los resultados de los análisis de suelos

realizados para cada una de las localidades analizadas, a excepción de Flores Magón y

Venustiano Carranza. En “los llanos” predominan los suelos francos arenosos y poco

salinos, con pH cercanos a la neutralidad y que normalmente son fertilizados para su uso.

La zona de “los llanos” también es diversa en cuanto a las variedades de frijol que se

siembran, sin embargo la variedad Pinto Saltillo es la más representativa, puesto que ocupa

una mayor superficie de siembra en Durango, siendo la preferida por los agricultores; esta

variedad es de hábito de crecimiento de guía, con una altura promedio de 32 cm; alcanza la

floración y madurez fisiológica en condiciones de riego, respectivamente, entre los 62 y 70,

y 115 y 123 días después de la siembra, mientras que en temporal entre los 48 y 59 y 87 y

100 días, respectivamente. Su grano es de tipo pinto, de color crema claro con pintas café

claro; el tamaño del grano es mediano y es altamente resistente a la oxidación (Sánchez-

Valdez, 2001); más del 60% de la superficie cultivable de frijol en las regiones muestreadas

corresponde a esta variedad, por todo lo anterior, ésta se utilizó en el presente estudio.

Las plantas seleccionadas cuyas raíces presentaban síntomas de pudrición, mostraron

lesiones desde coloración rojiza y café, hasta oscuras en la raíz principal; de igual forma la

severidad de los daños ocasionados por los patógenos fue variable, la evidencia de estos

hallazgos durante la colecta, era indicativo probable de la participación de más de un

patógeno o infecciones mixtas, como lo menciona Abawy y Pastor-Corrales (1987). Los

56  

aislamientos de hongos fitopatógenos, así como de especies del género Trichoderma, que

se mencionan en el siguiente apartado, se procesaron para obtener cultivos monoconidiales

y trabajar a partir de ellos, dada la relevancia que esto implica.

Los aislamientos de hongos fitopatógenos causantes de la pudrición de raíz en frijol

que tuvieron mayor incidencia corresponden a las especies de F. oxysporum (56%) y F.

solani (25%), encontrándose en todas las localidades analizadas. Estos hallazgos

concuerdan con el estudio de Acosta et al. (1993) en el cual analizó muestras de suelo del

estado de Durango con alta ocurrencia de pudrición de raíz de frijol, en los que verificaron

la presencia de Fusarium spp., sin embargo reportan además la presencia de Pythium spp.,

género no identificado en este estudio, lo que sugiere que la etapa fenológica del cultivo al

momento del muestreo influye en el tipo de patógenos presentes, ya que en este trabajo los

patógenos se obtuvieron de raíces con síntomas de pudrición de raíz de plantas en etapa de

floración; adicionalmente, otra explicación puede ser que Pythium, y especies del género

Rhizoctonia, se han reportado principalmente como causantes de “Dumping-off” en etapa

de plántula (Campos, 1987 y Agrios, 1998).

La presencia de M. phaseolina no se había reportado en los suelos de Durango, sin

embargo en este estudio se encontró asociada a pudriciones de raíz en cuatro de las quince

zonas estudiadas, estas son: Madero, Antonio Amaro-Poanas, Pino Suárez-Mezquital y

Guadalupe Aguilera-Venustiano Carranza. Es interesante resaltar que en los sitios donde se

identificó a M. phaseolina, éste provenía de plantas de la variedad Pinto Saltillo. No se

encontró una relación entre las características fisicoquímicas o de textura de los suelos

donde está presente M. phaseolina. Por lo anterior, la presencia de M. phaseolina en el

estado de Durango no se puede relacionar directamente con algún factor biótico o abiótico

propio de la entidad; una posible explicación de la presencia de este hongo en el estado es

el flujo de germoplasma o material contaminado acarreado por el hombre.

En este trabajo se obtuvieron aislamientos correspondientes a las especies de T. virens,

T. asperellum, T. gamsii y T. harzianum, siendo esta última la especie con mayor presencia

(82.35%); estos resultados son semejantes a los que obtuvo Hoyos-Carvajal et al. (2009)

quienes realizaron estudios con muestras de suelo de México, Guatemala, Panamá,

57  

Ecuador, Perú, Brasil y Colombia, utilizando enfoques morfológicos y genómicos,

verificando la presencia de T. asperellum, T. gamsii, T. harzianum, y catorce especies más.

Antonio Amaro-Poanas, Nombre de Dios-Vicente Guerrero, Venustiano Carranza y Flores

Magón fueron localidades donde no se obtuvo ningún aislamiento de Trichoderma spp., sin

embargo esto no significa que no existan especies de este género en esos lugares, es

necesario analizar un número mayor de muestras. El número de aislamientos de

Trichoderma spp. por localidad muestreada no mostró correlación con las variables

medidas en el análisis de suelo, esto coincide con lo reportado por Michel-Aceves (2001)

en su tesis doctoral donde obtuvo aislamientos de Trichoderma spp. nativos de suelos

tropicales, y reporta la ausencia de correlación entre los factores del suelo y el número de

aislamientos obtenidos, sin embargo menciona la influencia del contenido de humedad del

suelo sobre la cantidad de unidades formadoras de colonias.

Cabe mencionar que el dendrograma generado con las secuencias de los aislamientos

de Trichoderma spp. los agrupó por especie y concuerda con lo reportado por Druzhinina et

al. (2005) donde se agrupa a T. harzianum y T. virens (clado 1 y 2, respectivamente) dentro

de la sección Pachybasium y a T. asperellum en la sección Trichoderma o hamatum (clado

13).

El software TrichOKEY 2.0 (ISTH, 2009), demostró ser una herramienta confiable

para la identificación a nivel especie de los aislamientos de Trichoderma, utilizando las

regiones intergénicas ITS1 e ITS2. Esta base de datos incluye 153 códigos de barras, que

contemplan 104 especies diferentes de éste género. Una opción más precisa para la

identificación molecular de aislamientos Trichoderma a nivel de especie, es el análisis de

las secuencias del intrón 4 y 5, así como el exón 6 del gen del factor de elongación tef, en

combinación con el programa TrichoMARK de la misma ISTH (Druzhinina et al., 2006);

adicionalmente la identificación molecular se puede complementar con la secuenciación del

gen rpb2 que codifica para la subunidad de la RNA polimerasa II; todo lo anterior puede

realizarse cuando la especie no se encuentra en la base de datos utilizada por el TrichOKEY

2.0. Una alternativa más, es hacer uso de otras herramientas como análisis tipo Blast en el

NCBI y/o FASTA, sugiriendo tomar los resultados que arrojen identidades mayores a un

98%.

58  

Con la finalidad de seguir los postulados de Koch, se realizaron ensayos de

patogenicidad en semillas de frijol, para verificar que los hongos aislados de las raíces con

síntomas de pudrición realmente fueran realmente los agentes causales de la misma, y no

como infección secundaria. Cervantes-García et al. (2003) realizaron estudios a nivel de

semilla para determinar la patogenicidad de aislamientos de M. phaseolina, los resultados

de estos ensayos pueden ser extrapolados a nivel de plántula (Com. Pers. Dr. N. Mayek-

Pérez)1. Aislamientos correspondientes a M. phaseolina mostraron las tasas de

patogenicidad más altas, y los aislamientos de las especies de Fusarium presentaron niveles

de patogenicidad menores. Al utilizar diferentes variedades de frijol en esta prueba, la

variedad Pinto Villa mostró ser más resistente que Pinto Saltillo y Pinto UI-114, variedad

conocida como susceptible, al ataque de los fitopatógenos ensayados (Mayek-Pérez et al.,

2001).

Bell et al. (1982) realizaron ensayos de antagonismo in vitro con 77 aislamientos de

Trichoderma spp., principalmente T. harzianum, contra aislamientos de Sclerotium rolfsii,

Phytophthora parasítica, Pythium aphanidermatum y Rhizoctonia solani entre otros, ellos

observaron que cada aislamiento de fitopatógeno era antagonizado por uno o más

aislamientos de Trichoderma spp., no obstante ellos mencionan que un mismo aislamiento

del antagonista puede funcionar efectivamente contra una especie de fitopatógeno pero

puede tener efectos mínimos sobre otra especie; este mismo fenómeno se observó con casi

todos nuestros aislamientos, en especial con los aislamientos de T. gamsii y T. virens que

antagonizaron efectivamente a M. phaseolina, similar a lo reportado por Larralde y col.

(2008), pero tuvieron efectos menores contra las especies de Fusarium, esto se puede

observar en la Fig. 13. En general los aislamientos 1-13T de T. gamsii, 1-14T de T. virens,

12-10T de T. asperellum y 3-8T de T. harzianum fueron los que tuvieron mejores

resultados de antagonismo (más de 4 en la escala de antagonismo), estos resultados son

mayores a los obtenidos por Arzate-Vega et al. (2006) quienes al realizar este tipo de

ensayos contra Micosphaerella fijiensis reportan niveles de inhibición de hasta 73.48%

(menos de 4 en la escala de antagonismo), Aquino-Martínez et al. (2007) reportaron haber

obtenido aislamientos nativos de T. lignorum y T. harzianum con capacidad antagónica

contra F. oxysporum.

1Dr. Netzahualcoyotl Mayek-Pérez. Profesor investigador del CBG-IPN, Reynosa, Tamaulipas, Mex. Febrero de 2009. 

59  

El valor encontrado (-0.58) en la correlación entre las tasas de crecimiento y el nivel de

antagonismo in vitro de los aislamientos de Trichoderma spp., nos indica una correlación

negativa moderada, esto es contario a lo que se creía, ya que según este resultado los

aislamientos con mayor tasa de crecimiento no son los que ejercen un control más efectivo,

esto sugiere que si bien la competencia por espacio y nutrientes es una herramienta

importante para el biocontrol, no es suficiente para detener el crecimiento del patógeno,

incluso Howell (2003) define al micoparasitismo como el principal mecanismo de

biocontrol y no a la competencia por espacio y nutrientes.

Las observaciones al microscopio de la zona de interacción entre Trichoderma spp. y

M. phaseolina, muestran una clara disminución en la cantidad de microesclerocios

presentes, cuando se compara con la sección de la colonia del patógeno que permanece

libre del agente biocontrolador. Observaciones más finas de la zona de confrontación,

permiten visualizar como Trichoderma spp. se enrolla sobre las hifas del patógeno y forma

estructuras similares a apresorios sobre el patógeno. Estas observaciones en su conjunto,

constituyen una posibilidad fuerte de que Trichoderma spp. puede estar empleando el

micoparasitismo como un mecanismo más en el proceso de control biológico de M.

phaseolina concordando con lo expuesto por Howell (2003).

En este trabajo se corroboró que las especies de Trichoderma aquí estudiadas son

totalmente inocuas para las plantas de frijol (cuadro 14 y figura 16), esto se sustenta al

encontrar que todas las plantas inoculadas solamente con los aislamientos del antagonista

mostraron un valor de 1 en la escala de severidad de daños de Abawi y Pastor-Corrales

(1990), este valor indica que no hay síntomas visibles de enfermedad, tal como Harman et

al. (2004) lo indican: “Trichoderma spp. es un simbionte, oportunista, no virulento de

plantas”.

La variedad de frijol utilizada en estos experimentos fue la Pinto Saltillo ya que es la

que ocupa más superficie de siembra en Durango, siendo por esto la preferida por los

agricultores. Esta variedad es de hábito de crecimiento de guía, con una altura promedio de

32 cm; alcanza la floración y madurez fisiológica, respectivamente, entre los 62 y 70 y 115

60  

y 123 días después de la siembra, en riego, y entre los 48 y 59 y 87 y 100 días en temporal

(Sánchez-Valdez, 2001). Sin embargo en estos experimentos realizados en invernadero

alcanzó la floración alrededor de los 21 días y a los 30 días inició la formación de vainas.

El aislamiento correspondiente a T. asperellum permitió el mayor establecimiento de

plantas a los 30 días, principalmente cuando se confrontó contra las especies de Fusarium

utilizadas en este experimento, donde al igual que el testigo permitió un establecimiento del

100%. Al ser confrontada contra M. phaseolina, T. asperellum también obtuvo el mayor

establecimiento de plantas, 70% comparado con el 100% que obtuvo el testigo y 20%

cuando la planta se expuso al patógeno únicamente. Estos resultados son importantes ya

que Abawi y Pastor-Corrales (1990) mencionan que la pudrición de raíz del frijol

disminuye el establecimiento de plántulas, afectando los rendimientos de la producción de

grano.

En cuanto a promoción de crecimiento y desarrollo de las plantas representado como

peso seco total y peso seco de raíz T. asperellum obtuvo rendimientos superiores al testigo

en más de un 40% estos resultados son similares a los reportados por Guigón-López et al.

(2003) quienes realizaron este tipo de ensayos con cepas nativas de Trichoderma spp. en

combinación con un cultivo de chile (Capsicum annum L.) obteniendo un incremento del

40% en la producción de materia seca aérea. Los ANVA correspondientes mostraron

diferencia significativa (P<0.01) y los coeficientes de variación fueron menores al 15%. El

papel de Trichoderma spp. en la regulación de crecimiento de la planta ha sido bien

documentado ya que trabajos como el realizado por Vinale et al. (2008) han demostrado

que este antagonista produce metabolitos con actividad similar a auxinas, ellos observaron

en sus trabajos la etiolación de tallos de chícharo (Pisum sativum) tratados con harzianolida

y 6-n-pentil-6H-piran-2-nona (6PP), los cuales también afectaron el crecimiento de

plántulas de tomate (Lycopersicum esculentum) y canola (Brassica napus).

Para la altura de la planta y área foliar las plantas inoculadas solamente con

aislamientos correspondientes a T. harzianum y T. asperellum tuvieron mejor desempeño,

los ANVA correspondientes indican que existe diferencia significativa (P<0.05) entre

61  

tratamientos y los coeficientes de variación de 6.9% y 10.3% respectivamente muestran que

el efecto de los aislamientos fue consistente y eficaz dentro de cada tratamiento, al ser

confrontados contra M. phaseolina y F. oxysporum las plantas inoculadas con T.

asperellum tuvieron mejores rendimientos para altura y área foliar el análisis estadístico

mostró diferencia significativa (P<0.05) y los coeficientes de variación menores a 20%

indican resultados consistentes dentro de los tratamientos, en el caso de F. solani las

plantas inoculadas con T. virens fueron las más favorecidas seguidas de las tratadas con T.

asperellum, el ANVA mostró diferencia significativa (P<0.05), los coeficientes de

variación de 14% para altura y 30.36% para área foliar son aceptables para experimentos

fuera de laboratorio. Contreras-Cornejo et-al. (2009) investigaron el papel de auxinas en la

regulación del crecimiento y desarrollo de plántulas de Arabidopsis thaliana inoculadas con

T. virens y T. atroviride, estas plántulas mostraron fenotipos característicos de actividad de

auxinas incluyendo incrementos en la producción de biomasa y estimulación del desarrollo

de raíces secundarias. Las mutaciones en genes involucrados en el transporte o señalización

de auxinas AUX1, BIG, EIR1 y AXR1 redujeron los efectos de la inoculación de T. virens

sobre la promoción de crecimiento y desarrollo de raíces. Ellos también encontraron que T.

virens produce compuestos relacionados a auxinas como son el indol-3-acido acético,

indol-3-acetaldehido e indol-3-ethanol. Esto ayuda a explicar porque nuestros aislamientos

de Trichoderma spp. promueven el crecimiento y desarrollo vegetal hasta en más del 40%

con respecto al testigo, como es el caso de T. asperellum en las variables de peso seco total

y peso seco de raíz, este mismo aislamiento promovió en más del 20% la altura de la planta

en comparación con el testigo sin Trichoderma spp. y un 32% más que el testigo en área

foliar.

Guigón-López et al. (2003) obtuvieron incrementos de hasta el 30% en altura de

planta, 30% más en área foliar, 60% y 38% más de biomasa de raíz y aérea respectivamente

y un 40% a 60% más de yemas y flores cuando inocularon plantas de chile (Capsicum

annum) con esporas de aislamientos nativos de Trichoderma spp., cabe mencionar que para

nuestro caso las plantas inoculadas con el aislamiento de T. asperellum llegaron a producir

casi 100% más vainas que el testigo.

62  

Al evaluar la severidad de daños con la escala de Abawi y Pastor-Corrales (1990), se

observó que las plantas inoculadas con esporas de T. asperellum presentaron menos daños

causados por los fitopatógenos en comparación con los demás tratamientos y en particular

con el tratamiento sin Trichoderma spp., es importante observar el comportamiento de las

plantas inoculadas con esporas del aislamiento de T. virens ya que frente a F. solani

también disminuyó el daño en comparación con el testigo sin Trichoderma spp. y tuvo

buenos rendimientos de los parámetros evaluados. Estudios similares realizó González-

Cárdenas et al. (2005) utilizando aislamientos de Trichoderma spp. para controlar a F.

oxysporum causante de la pudrición de plántulas de papaya logrando que las plantas

inoculadas con una suspensión de esporas del antagonista a una concentración de 1x106

continuaran su desarrollo normalmente, mientras que las plantas del testigo murieron a los

diez días a causa de la infección de F. oxysporum.

La capacidad antagónica de los aislamientos estudiados frente a M. phaseolina, en

especial T. asperellum, puede explicarse tomando en cuenta los estudios realizados por

Larralde-Corona et al. (2008) quienes reportan haber obtenido aislamientos nativos del

noreste de México de T. koningiopsis y Trichoderma spp. con capacidad de antagonizar a

cepas de M. phaseolina aisladas de plantas de frijol y sorgo. También encontraron que

existe una correlación positiva entre la secreción de β-1,3-glucanasa y N-acetil-

hexosaminidasa y la capacidad biocontroladora de los aislamientos de Trichoderma spp.

El buen desempeño de T. asperellum frente a los diferentes patógenos confrontados en

esta investigación puede explicarse en parte con los resultados obtenidos por Tondje et al.

(2007) quienes estudiaron filtrados de cultivos de esta especie, en confrontación con

Phytophthora megakarya, P. capsici, P. citrophthora, y P. palmivora, los cuales mostraron

actividad laminarinasa y carboximetilcelulasa que puede estar implicada en la degradación

de pared celular del oomiceto. Ezziyyani et al. (2004), realizaron estudios de antagonismo

de T. harzianum contra P. capsici, el antagonismo in vitro en medio PDA enriquecido con

laminarina-glucosa (3:1, v/v), mostró que T. harzianum aumenta los niveles de enzimas

hidrolíticas β-1,3-glucanasa (lisis enzimática), ejerce una mayor competencia por espacio y

nutrientes e interacciona directamente con el patógeno (micoparasitismo), lo cual juega un

63  

papel importante en la reducción y destrucción de la colonia del patógeno. En los ensayos

in vivo las plantas crecidas a partir de semillas tratadas mostraron un peso seco superior al

testigo, así mismo se logró reducir hasta un 65% la «tristeza» causada por el patógeno en

plantas de pimiento.

64  

9. CONCLUSIONES

Del total de los aislamientos de Trichoderma spp. identificados T. harzianum es la

especie de este género que predomina en el área muestreada, encontrándose también T.

virens, T. gamsii y T. asperellum. Las especies F. oxysporum, F. solani, F. annulatum y M.

phaseolina son los principales agentes causales de la pudrición de raíz de frijol cuando se

encuentra en la etapa de floración en Durango.

Aislamientos nativos del estado de Durango correspondientes a las especies T.

harzianum, T. gamsii, T. asperellum y T. virens muestran capacidad de biocontrol in vitro

contra los hongos fitopatógenos implicados en la pudrición de la raíz del frijol provenientes

del mismo estado.

Las plantas inoculadas con el aislamiento de T. asperellum frente a los diferentes

patógenos analizados, mostraron un rendimiento mayor en altura y en peso seco con

respecto del testigo y los demás tratamientos, de tal manera que es posible usar este

aislamiento como agente biocontrolador de los agentes causales de la pudrición de raíz de

frijol común en el en el estado de Durango.

65  

10. RECOMENDACIONES

TrichOKEY 2.0 es un programa confiable y eficaz para la identificación a nivel de

especie los aislamientos de Trichoderma, pero cuando esta no es capaz de llevarla a cabo se

recomienda utilizar el BLAST del Gen Bank o el software de FASTA.

En el caso de que las secuencias ITS del DNAr no sean capaces de proporcionar la

información necesaria para la identificación molecular de hongos filamentosos, las

secuenciación del gen del factor de elongación tef1 se ofrece como una alternativa

confiable.

Una vez que el aislamiento 12-10T de T. asperellum ha mostrado capacidad de

controlar a los patógenos implicados en la pudrición de raíz del frijol y promover el

crecimiento y desarrollo vegetal a nivel de invernadero, se sugiere realizar ensayos en

campo.

Una vez que el aislamiento 12-10T de T. asperellum ha mostrado capacidad de

controlar a los patógenos implicados en la pudrición de raíz del frijol y promover el

crecimiento y desarrollo vegetal a nivel de invernadero, se sugiere realizar estudios de tipo

proteómico, enzimáticos y de expresión diferencial para determinar el tipo de proteínas o

metabolitos que le confieren esas habilidades y las condiciones necesarias para que los

exprese.

66  

11. BIBLIOGRAFÍA

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74  

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

APÉNDICE

   

75  

Apéndice A. Enzimas de Trichoderma spp. degradadoras de polímeros y genes que las codifican. Polímero Gen Enzima Quitina chit42 Endoquitinasa

chit33 Endoquitinasa nag1 Quitobiosidasa nag2 Quitobiosidasa exc1 Exoquitinasa exc2 Exoquitinasa ech2 ech3 ech3B cht1 cht2 chit33 Endoquitinasa chit36Y chit-VIRI chit-P chit-HAM chit-HAR1 chit-HAR2 chit-HAR3 chit-G1 chit-G2

Glicanos Bgn1,2 y 3 Endo-β-1, 3-Glucanasa gluc78 Exo-β-1, 3-Glucanasa b16-1, 2 y 3 Endo-β-1, 6-Glucanasa

Celulosa cbh1 β-1-4-Glucan-celobiohidrolasa cbh2 β-1-4-Glucan-celobiohidrolasa cel2A β-1-4-Endoglucanasa eglI, II, III y IV β-1-4-Endoglucanasa

Xilano xyl1 β-Xilanasa xyn2 y 3 β-Xilanasa Endo-β-1, 4-Xilanasa α-Glucoronidasa α-L-Arabinofuranosidasa

Todas las enzimas tienen accesiones en bases de datos públicas. Modificado de Rey et al. (2004).

76  

Apéndice B. Lista de diferentes especies de Trichoderma, hongos fitopatógenos que controlan, enfermedad y cultivo. Especie de Trichoderma Organismo antagonizado Enfermedad y cultivo T. harzianum 1051, T. harzianum 39.1 Crinipellis perniciosa Escoba de bruja en Cacao. T. lignorum, T. virens, T. hamatum, T. harzianum y T. pseudokoningii (Rifai)

Rhizoctonia solani Damping-off en frijol.

T. viride y T. harzianum. Aspergillus flavus y Fusarium moniliforme

Hongos asociados a semilla.

T. harzianum, BAFC 742 Sclerotinia sclerotiorum, BAFC 2232 Fungosis en soya. T. spp. Sclerotium rolfsii Pudrición en vegetales. T. harzianum 25, T. viride Serpula lacrimans Fungosis en madera T. harzianum Alternaria alternata Fungosis de las plantas T. virens cepa “Q” Rhizopus oryzae/Pythium spp. Enfermedad de la plántula de

algodón T. viride, aislamiento T60 Coniophora puteana, Postia placenta

y Serpula lacrimans Decoloración de la savia del pino y el abeto.

T. virens, aislamientos GL3 y GL21; T. harzianum T-203

Rhizoctonia solani, Pythium ultimum y Meloidogine incognita

Damping-off de pepino

T. harzianum, T. aureoviride y T. Koningii Pyrenophora tritici-repentis (Dieds) Drechs

Mancha rojiza u hoja manchada del trigo

T. viride Colletotrichum truncatum Mancha café de cowpea T. aureoviride T122, T. harzianum T66 y T334 y T. viride T124 y T228

Cepas de Fusarium, Pythium y Rhizoctonia

Patógenos de la raíz de las plantas.

T. viride, T. pseudokoningii y T. koningii Sclerotium cepivorum Raíz blanca de plántulas de cebolla

T. harzianum Fusarium udum Marchitamiento de pigeonpea T. harzianum Penicillium expansum Moho gris y azul del manzano T. virens y T. harzianum Rhizoctonia solani Cáncer del tallo de la papa T. harzianum y T. koningii Fusarium culmorum, Botrytis cinerea

y Rhizoctonia solani Patógenos de plantas

T. koningii, T. aureoviride y T. longibrachiatum

Sclerotinia sclerotiorum Pudrición de la cabeza del girasol

T. harzianum Alternaria alternata Fungosis de hojas, tallos, flores y frutos de plantas anuales especialmente vegetales y ornamentales.

T. harzianum y T. viride Lasiodiplodia teobroma, Diplodia natalensis, Botryodiplodia theobromae, Fusarium moniliforme var. subglutinans, Penicillium oxalicum Currie, Penicillium sclerotienum Yamamoto, Aspergillus niger van Tiegh, Aspergillus tamarii Kita y Rhizoctonia spp.

Marchitamiento y pudrición del fruto del banano, pudrición del ápice del mango y pudrición post-cosecha del yams.

T. asperellum Fusarium oxysporum Marchitamiento del tomate T. harzianum Aphanomyces cochlioides,

Rhizoctonia solani, Phoma betae, Acremonium cucurbitacearum y Fusarium oxysporum F. sp. radicis-lycopersici

Hongos Fitopatógenos comunes

T. harzianum Botrytis cinerea y Mucor piriformis Pudrición post-cosecha de fresas. Modificado de Verma et al., 2007.

77  

Apéndice C. Localidades donde se realizaron los muestreos de suelo y raíces con síntomas de pudrición.

No Sitio de Muestreo Variedad Probable Altitud (msnm) Latitud Longitud

1 Campo Experimental Valle del Guadiana,

Dgo.

Negro 80-25 1880 23° 59' 104° 38'

2 Olegario Méndez-Pánuco de Coronado Pinto Saltillo (PS) 2051 24° 29' 104° 26'

Pinto Zapata (PZ) 2051 24° 29' 104° 26'

Negro 80-25 (8025) 2051 24° 29' 104° 26'

3 Campo Auxiliar Francisco I. Madero, Dgo. Pinto Saltillo (PS) 1966 24° 25' 104° 20'

Negro 80-25 (8025) 1966 24° 25' 104° 20'

4 Guadalupe Victoria, Dgo. Pinto Saltillo 1994 24° 27' 104° 05'

5 Alfredo Cabello Mezta-Cuauhtemoc, Dgo. Pinto Saltillo 2194 24° 17' 103° 51'

6 Cuauhtémoc-Antonio Amaro, Dgo. Negro San Luis 2186 24° 16' 103° 55'

7 Antonio Amaro-Poanas Pinto Saltillo 2111 24° 15' 104° 02'

8 Antonio Amaro-Poanas Flor de Junio 2122 24° 07' 104° 02'

9 Cieneguilla, Poanas, Dgo. Pinto Saltillo 1948 24° 02' 104° 03'

10 Pino Suárez-Mezquital, Dgo. Desc. Pinto Saltillo 1909 23° 53' 104° 30'

11 Nombre de Dios-Vicente Guerrero, Dgo. Flor de Junio (1-10) 1924 23° 47' 104° 06'

Negro San Luis

(11N)

1924 23° 47' 104° 06'

12 Nombre de Dios-Vicente Guerrero, Dgo. Flor de Junio 1887 23° 49' 104° 09'

13 Venustiano Carranza-Magón, Dgo. Pinto Saltillo-

Canario-Pinto Villa

1979 24° 28' 104° 37'

14 Flores Magón, Dgo. Pinto Saltillo-Canario 2026 24° 28' 104° 33'

15 J. Guadalupe Aguilera-V. Carranza, Dgo. Canario 1953 24° 28' 104° 38'

78  

Apéndice D. Aislamientos de fitopatógenos identificados mediante el análisis tipo BLAST con su número de accesión en el Gen Bank. No. Aislamiento SPP. Identificada No. De bases

Comparadas % de similitud No. de accesión

Gen Bank 1 34p Alternaria

tenuissima 505/505 100% FJ654671

2 14p Bionectria ochroleuca

507/510 99% FJ654672

3 10p F. annulatum 493/493 100% FJ627998 4 10-1p F. annulatum 500/500 100% FJ627997 5 5-2p F. equiseti 489/489 100% FJ643527 6 5-1P F. equiseti 471 99.8%FASTA FJ643526 7 5p F. equiseti 477/477 100% FJ643528 8 6-I-2p F. oxysporum 481/481 100% FJ643495 9 4-I-2p F. oxysporum 435/435 100% FJ643492 10 7p F. oxysporum 481/481 100% FJ643497 11 3pa F. oxysporum 435/436 99% FJ627995 12 3-1p F. oxysporum 481/481 100% FJ542331 13 2-1p F. oxysporum 350/351 99% FJ627994 14 4-I-3p F. oxysporum 230/233 99% No submit 15 6p F. oxysporum 480/480 100% FJ643496 16 13p F. oxysporum 489/489 100% FJ643501 17 21p F. oxysporum 473/473 100% FJ643507 18 20 F. oxysporum 486/486 100% FJ643506 19 25-1 F. oxysporum 469/474 98% FJ643508 20 4-1p F. oxysporum 485/485 100% FJ627996 21 19-1 F. oxysporum 486/486 100% FJ643504 22 19 F. oxysporum 485/485 100% FJ643505 23 6-1p F. oxysporum 477/477 100% FJ643494 24 13-2p F. oxysporum 472/472 100% FJ643500 25 30-1 F. oxysporum 480/482 99% FJ643509 26 30 F. oxysporum 485/485 100% FJ654698 27 31-1 F. oxysporum 485/485 100% FJ643510 28 24p F. oxysporum 486/486 100% FJ654694 29 31p F. oxysporum 486/486 100% FJ654693 30 31-1p F. oxysporum 486/486 100% FJ643511 31 5-i-1 F. oxysporum 486/486 100% FJ654692 32 2p F. oxysporum 482/482 100% FJ654691 33 7-2p F. oxysporum 487/487 100% FJ654690 34 12-i-2 F. oxysporum 485/485 100% FJ643498 35 4p F. oxysporum 478/478 100% FJ643493 36 3-2p F. oxysporum 485/485 100% FJ643491

79  

37 17p F. oxysporum 483/483 99% FJ643503 38 17-1p F. oxysporum 481/485 99% FJ643502 39 13-1p F. oxysporum 487/487 100% FJ643499 40 18p F. oxysporum 487/487 100% FJ611940

41 11-1p F. polyphialidicum

488/488 100% FJ654673

42 1p F. solani 505/505 100% FJ643514 43 11p F. solani 502/502 100% FJ643516 44 12-1p F. solani 132/133 99% FJ643517 45 12p F. solani 500/500 100% FJ643519 46 12-I-1p F. solani 503/503 100% FJ643518 47 11-I-1p F. solani 509/509 100% FJ643512 48 25-2-1 F. solani 510/510 100% FJ643522 49 25 F. solani 503/503 100% FJ643523 50 11-12 F. solani 500/500 100% FJ643515 51 27-1p F. solani 500/500 100% FJ643525 52 26-1 F. solani 509/509 100% FJ643524 53 22-1 F. solani 504/504 100% FJ643520 54 22-2 F. solani 504/504 100% FJ643521 55 1-2p F. solani 508/508 99% FJ643513 56 22P F. solani 406/426 95% S/N 57 25-2p M. phaseolina 471/471 100% FJ643531 58 10-I-1p M. phaseolina 414/414 100% FJ643530 59 7-3p M. phaseolina 460/460 100% FJ643529

80  

Apéndice E. Aislamientos de Trichoderma spp. identificados mediante el programa TrichOKEY con sus números de accesión en el Gen Bank.

Aislamiento SPP. IDENTIFICADA

No. DE BASES COMPARADAS

% DE SIMILITUD

TrichOKEY No. Accesión Gen Bank

12-10T T. asperellum 445/446 Alta Sí FJ654689 3-12T H. lixii

T. harzianum 461/462 Alta Sí FJ654685

3-7T H. lixii T. harzianum

462/463 Alta Sí FJ654681

1-11T H. lixii T. harzianum

392/395 Alta Sí FJ654676

3-9T H. lixii T. harzianum

462/462 Alta Sí FJ654683

3-10T H. lixii T. harzianum

462/462 Alta Sí FJ654684

5-7T H. lixii T. harzianum

461/462 Alta Sí FJ654687

1-12T H. lixii T. harzianum

423/424 Alta Sí FJ654677

1-9T H. lixii T. harzianum

462/463 Alta Sí FJ654675

3-4T H. lixii T. harzianum

463/464 Alta Sí FJ654679

3-8T H. lixii T. harzianum

463/464 Alta Sí FJ654682

11-11T H. lixii T. harzianum

463/464 Alta Sí FJ654674

3-4T H. lixii T. harzianum

463/464 Alta Sí FJ654680

4-11T T. harzianum 555/555 Alta Sí FJ654686 2-9T T. harzianum 556/556 Alta Sí FJ654678 1-13T T. gamsii 528/528 99% BLAST FJ790423 1-14T T. virens 531/532 99% BLAST FJ654688

81  

Apéndice F. Análisis de suelo de las localidades muestreadas y número de aislamientos de Trichoderma spp. obtenidos.

Localidad de muestreo Textura pH C. E. M.O. %

N ppm

P ppm

K ppm T

1. Campo experimental Valle del Guadiana, Dgo. FA 6.8 1.15 1.15 26.5 10 250 10

2. Olegario Méndez-Pánuco de Coronado FA 7.3 0.9 1.05 32.5 10.5 350 53. Campo Auxiliar Francisco I. Madero, Dgo AF 6.6 0.7 1.1 40 11 250 74. Guadalupe Victoria, Dgo. FA 6.7 0.8 1.25 39 17.5 380 25. Alfredo Cabello Mezta-Cuauhtémoc, Dgo. FA 7.2 0.9 1.05 33 9.8 250 36. Antonio Amaro-Cuahutemoc, Dgo. FA 7.2 0.5 1.05 32.5 15 280 27. Antonio Amaro-Poanas FA 7.1 1.3 1.15 40 10 200 18. Antonio Amaro-Poanas FA 6.8 0.8 2.01 24 11 320 09. Cieneguilla, Poanas, Dgo. AF 6.9 0.8 2.01 27 15 150 110. Pino Suárez-Mezquital, Dgo. FA 6.65 0.7 1.61 24 9.5 300 111. Nombre de Dios-Vicente Guerrero, Dgo. FAA 6.7 0.7 1.2 21.5 11 250 012. Nombre de Dios-Vicente Guerrero, Dgo. FA 7.1 0.7 1.2 20.5 14.5 450 213. Venustiano Carranza-Magón, Dgo. AF 7.2 0.8 1.1 13.5 11 200 014. Flores Magón, Dgo. F 7.2 1 3.48 30 13.5 350 015. J. Guadalupe Aguilera-V. Carranza, Dgo. F 6.5 0.8 2.95 21.5 12.5 170 2FA= Franco arenoso, AF= Arena franca, FAA= Franco arcillo arenoso, F= Franco, C.E.= Conductividad eléctrica (Milisiemens/cm a 25ºC), M.O.= Materia orgánica, N= Nitrógeno inorgánico, P= Fósforo disponible, K= Potasio, T= Número de aislamientos de Trichoderma spp. obtenidos.

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GLOSARIO Ácido nucleíco. Macromolécula compuesta de ácido fosfórico, azúcar pentosa y bases orgánicas; ácido ribonucleico (ARN) y ácido desoxirribonucleico (ADN).

DNA polimerasa. Enzimas encargadas de construir nuevas cadenas de ADN.

DNA complementario (DNAc). Molécula de ADN que es complementaria a una molécula de

ARNm, sintetizada in vitro por la transcriptasa inversa.

Antagonismo. Reducción de la enfermedad o el inóculo del patógeno debido a la actividad de una especie en particular o cepas de microorganismos.

Antagonista. Un organismo ejerciendo un efecto dañino a otro: por ejemplo, mediante la producción de enzimas líticas, antibióticos o por competición.

ARN Ribosomal (ARNr). Los ribosomas son estructuras celulares compuestas de RNA (rRNA) y proteínas ribosómicas, conocidas como ribonucleoproteínas.

Biotecnología. El uso y aplicación de organismos vivos o sus componentes para la obtención sistemática de productos con valor agregado.

Células eucariotas. Células que presentan una envoltura nuclear, orgánulos citoplasmáticos y un citoesqueleto.

Células procariotas. Células que carecen de envoltura celular nuclear, de orgánulos citoplasmáticos y de citoesqueleto (fundamentalmente bacterias).

Cepa. Es un grupo de aislamientos caracterizados de un microorganismo. Esencialmente esto se aplica a aislamientos del laboratorio, cultivos o selección, raza, variedad, forma specialis.

Competencia. Una interacción entre organismos dado que ambos necesitan una fuente limitada por ejemplo un suministro de alimentos, a fin de que el uso preferido por un organismo dañe al otro o le reduce la velocidad de crecimiento.

Control biológico de enfermedades de plantas. En un amplio sentido, “es el medio de controlar enfermedades o reducir la cantidad o el efecto de patógenos mediante mecanismos biológicos u organismos diferentes al humano”.

Control biológico. Baker y Cook (1974) definen el control biológico como la reducción de la densidad del inóculo o de las actividades de un patógeno que produce una enfermedad, por uno o más organismos, en forma natural o a través de la manipulación del medio ambiente, hospedero o antagonista, o por la introducción de una población de uno o más antagonistas.

Control integrado. Una combinación de practicas agriculturales, biológicas y químicas que en conjunto controlan una enfermedad.

Desnaturalización. Capacidad de la doble hélice del ADN de separarse en sus dos cadenas componentes.

Electroforesis. Migración de partículas suspendidas en un campo eléctrico.

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Electroforesis en geles de agarosa. Electroforesis que se lleva a cabo en un gel de agarosa y se emplea para separar moléculas de ADN de entre 100 y 50 kb en longitud.

Esclerocio. Estructura propagativa resistente de hongos, compuesto por una masa de hifas, usualmente rodeado por una capa impermeable como pared gruesa hifal.

Expresión (génica). Serie de eventos moleculares por los cuales la información contenida en un gen se manifiesta biológicamente.

Fenotipo. Las características observables de una célula u organismo.

Fungicida. Un químico que destruye o daña a los hongos.

Gen. Segmento de ADN que codifica una cadena polipeptídica o una molécula de ARN.

Genoma. Información genética completa y única para cada especie de organismo.

Genotipo. Composición genética de un organismo.

Hábitat. Lugar donde un organismo vive (nicho).

Hiperparasitismo (micoparasitismo). El parasitismo de un hongo por otro.

In vitro. Es una prueba o procedimiento que se lleva a cabo en condiciones de laboratorio: p. ej., al probar un antagonista en una caja petri contra un cultivo del patógeno.

In vivo. Es una prueba o procedimiento que se lleva a cabo con el material hospedador vivo: p.ej., probando un antagonista contra un patógeno que está creciendo o sobre el hospedador vivo.

Iniciador. Secuencia corta de nucleótidos que puede iniciar la síntesis de ADN a lo largo de un molde de ADN, también se le denomina primer u oligonucleótido.

Inóculo (inoculante). Un organismo introducido al medio ambiente, después de haber sido producido artificialmente en el laboratorio, para llevar a cabo alguna función especial: p.ej., control de la enfermedad, promoción del crecimiento de plantas, descomposición de paja, etc.

Intrón. Secuencia no codificante que interrumpe los exones en un gen.

Kilobase (kb). Mil nucleótidos o pares de bases de nucleótidos.

Medio ambiente. Todos los factores bióticos y abióticos que componen el alrededor de un organismo, desde micro-ambiente.

Micorriza. Relación simbiótica entre una raíz y un hongo.

Nucleótido. Unidad de moléculas de ADN y ARN que contienen un fosfato, un azúcar y una base orgánica.

Parámetros. Medidas de los atributos de una población.

Patogenicidad. La tendencia de un miembro de un grupo de organismos patógenos que causan enfermedad o virulencia.

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pH. Medida de la acidez o alcalinidad de una solución, definida como el logaritmo negativo de la concentración de iones hidrógeno en moles por litro: pH =- log [H+]. La neutralidad es equivalente a un pH de 7; valores inferiores a éste son ácidos y superiores son alcalinos.

Proteínas. Grupo diverso estructural y funcionalmente de polímeros construidos en base a aminoácidos monoméricos.

Reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Método para la amplificación de una región de ADN mediante repetidos ciclos de síntesis de ADN in vitro.

Saprófito. Un organismo (planta o microbio) que vive sobre material orgánico muerto.

Sentido (upstream). Hacia el extremo 5´ de un polinucleótido.

Sinergismo. Una forma de simbiosis en que los organismos recambian metabolitos o tienen un sistema de enzimas complementarios: p.ej., en la ruptura de varios polímeros de la pared celular y subsecuente utilización de los monómeros. Este tipo de relación no es obligatoria.

Templado. El polinucleótido que es copiado durante una reacción de síntesis de una cadena catalizada por una polimerasa de ADN ó ARN.