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El trabajo de tesis se desarrolló en el Departamento de biotecnología agrícola del
Centro Interdisciplinario de Investigación para el Desarrollo Integral Regional (CIIDIR)
Unidad Sinaloa del Instituto Politécnico Nacional (IPN). El presente trabajo fue
apoyado económicamente a través del proyecto de investigación “Diseño y
evaluación de formulaciones micro y nanoencapsuladas para el control de plagas de
hortalizas” (Con número de registro 20120464). La alumna Arely Archuleta Torres fue
apoyado con una beca CONACYT con clave 289264.
DEDICATORIA
Para mi hermana
Con todo mi amor, por ser la primera persona en la que pienso cuando
abro los ojos en la mañana y ser la última en venir a mi mente cuando
los cierro por la noche. Te amo Fanny.
Papás, los amo mucho.
AGRADECIMIENTOS
A mi mama Alma, por confiar en mí, por apoyarme y alentarme en cada decisión. Por
ser tan fuerte y no doblegarse ante ningún obstáculo. Pero sobre todo por quererme
y cuidarme como nadie más lo hace.
A mi papa Victor, por enseñarme a luchar por lo que se quiere y demostrar día a día
hasta donde podemos llegar si queremos y ponemos todo nuestro esfuerzo en ello.
A mi Hermana Fanny, por enseñarme a ser valiente, a enfrentar cada prueba que te
pone la vida y luchar hasta el último aliento. Por haberme enseñado que la vida pasa
en un suspiro y que cada día debe vivirse al máximo, con una sonrisa en los labios y
una actitud de ganadora. Gracias por creer en mí, por haber compartido tantas rizas
y lágrimas conmigo. Por haberme enseñado a ir por la vida con la única intención de
ser feliz, de ser yo. I love so much bad sister, miss you!!
Al doctor Cipriano García Gutiérrez, por haber depositado toda su confianza en mí y
apoyarme en cada momento indicarme el camino que había que seguir durante la
realización de este trabajo.
A mi comité tutorial, Dra. Melina, Dr. Cesar, Dra. Leticia y M.C. Chevy por las
aportaciones realizadas, por ser el apoyo que necesité y por sus consejos que
siempre fueron para mejorar.
A Rey David, Ayesha y Luz, por haberme mostrado que la biología molecular es de
este mundo, muchas gracias.
A Luis y Miguel, por haberse convertido en algo más que mis amigos, por ser mis
hermanos, por haber vivido tantos momentos felices, tantas peleas tontas y hasta
conversaciones inapropiadas. Los quiero mucho mucho!!
A mis amigo/compañeros de generación: Hector, Juan Carlos, Rogelio, Lorena,
Nacho, Ely, Alicia, Eymer, Libia, Karla, Fatima; por tantos momentos, porque sin
ustedes estos dos años hubieran sido aburridos y muy estresantes.
A mis compañeros de laboratorio: Arturito, Claudia, Gerardo, Mancillas, Mónica, J
Carlos, Ramón, Olimpia y Ricardo por la ayuda brindada durante la realización de
este trabajo y por cada momento agradable que compartimos. A Nadia por ayudarme
tanto en la parte administrativa, pero sobre todo por ser mi amiga.
A mis roomies: Abraham, Gerardo, Lalo, JC, LucyFer y Nancy. Por ser además mis
amigos y haber compartido días y noches de chistes, karaoke, comidas improvisadas
y sobre todo ayuda mutua.
I
ÍNDICE GENERAL
ÍNDICE GENERAL .............................................................................................. I
GLOSARIO ....................................................................................................... III
ÍNDICE DE FIGURAS ....................................................................................... VI
ÍNDICE DE CUADROS .................................................................................... VII
RESUMEN ...................................................................................................... VIII
ABSTRACT ....................................................................................................... IX
I. INTRODUCCIÓN ............................................................................................ 1
II. ANTECEDENTES .......................................................................................... 3
2.1. El suelo ........................................................................................................ 3
2.2. Microorganismos del suelo .......................................................................... 3
2.3. Hongos entomopatógenos en el suelo ........................................................ 4
2.4. Generalidades de los hongos entomopatógenos ........................................ 5
2.5. Mecanismo de acción .................................................................................. 6
2.6. Características de infección ........................................................................ 9
2.7. Beauveria bassiana (Bálsamo) Vuillemin .................................................. 10
2.8. Clasificación taxonómica ........................................................................... 11
2.9. Metarhizium anisopliae (Metsch.) Sorokin ................................................. 12
2.10. Clasificación taxonómica ......................................................................... 13
2.11. Control biológico ...................................................................................... 14
III. JUSTIFICACIÓN ......................................................................................... 15
IV. HIPÓTESIS ................................................................................................. 16
V. OBJETIVOS ................................................................................................ 16
V.I OBJETIVO GENERAL ..................................................................... 16
V.II OBJETIVOS ESPECÍFICOS ........................................................... 16
VI. MATERIALES Y MÉTODOS ...................................................................... 17
6.1. Área de estudio ......................................................................................... 17
6.2. Colecta de muestras de suelo ................................................................... 17
6.3. Determinación de pH, textura y materia orgánica del suelo ...................... 18
6.3.1. pH ................................................................................................ 18
6.3.2. Textura ......................................................................................... 18
II
6.3.3. Materia orgánica .......................................................................... 20
6.4. Aislamiento de hongos entomopatógenos ................................................. 20
6.4.1. Técnica de insecto trampa ........................................................... 20
6.4.2. Siembra directa de esporas ......................................................... 21
6.5. Cultivos monospóricos .............................................................................. 22
6.6. Identificación morfológica de los hongos entomopatógenos ..................... 23
6.6.1. Identificación macroscópica ......................................................... 23
6.6.2. Identificación microscópica .......................................................... 23
6.7. Relación del tipo de suelo con aislamientos encontrados ......................... 24
6.8. Conservación de aislamientos ................................................................... 25
6.8.1. Subcultivos .................................................................................. 25
6.8.2. Crioconservación ......................................................................... 25
6.9. Caracterización molecular ......................................................................... 25
6.9.1. Extracción de ADN ....................................................................... 26
6.9.2. Amplificación de ADN .................................................................. 26
6.9.3. Purificación de productos de PCR ............................................... 28
6.9.4. Secuenciación y análisis .............................................................. 28
6.9.5. Construcción de árboles filogenéticos ......................................... 29
VII. RESULTADOS Y DISCUSIÓN .................................................................. 30
7.1. Aislamiento de hongos entomopatógenos (HE) ........................................ 30
7.2. Identificación morfológica .......................................................................... 31
7.2.1. Identificación macroscópica ......................................................... 32
7.2.2. Identificación microscópica .......................................................... 34
7.3. Caracterización molecular ......................................................................... 36
7.4. Relación de los aislamientos de HE encontrados con el tipo de suelo
(cultivado y no impactado) y época del año de muestreo. ............................... 41
7.5. Relación de aislamientos encontrados con pH, textura y materia
orgánica del suelo ............................................................................................ 45
VIII. CONCLUSIONES ..................................................................................... 47
IX. BIBLIOGRAFÍA .......................................................................................... 48
X. ANEXOS ...................................................................................................... 57
III
GLOSARIO
ADN. Abreviatura de ácido desoxirribonucleico (en inglés deoxyribonucleic acid
o DNA). Es la molécula que contiene y transmite la información genética de los
organismos excepto en algunos tipos de virus (retrovirus). Está formada por
dos cadenas complementarias de nucleótidos que se enrollan entre sí
formando una doble hélice que se mantiene unida por enlaces de hidrógeno
entre bases complementarias. Los cuatro nucleótidos que forman el ADN
contienen las bases adenina (A), guanina (G), citosina (C) y timina (T). Dado
que en el ADN la adenina se empareja sólo con la timina y la citosina sólo con
la guanina, cada cadena del ADN puede ser empleada como molde para
fabricar su complementaria.
Agar. Sustancia de consistencia gelatinosa que se obtiene de algas marinas y
que se utiliza para preparar medios de cultivo sólidos, con el objeto de estudiar
y cultivar microorganismos.
Control biológico. Estrategia que utiliza organismos vivos (plantas, animales o
patógenos) para suprimir o repeler poblaciones de plagas.
Conidia. Espora asexual inmóvil formada directamente a partir de una hifa o
célula conidiógena o esporógena.
Cutícula. En los artrópodos es la capa exterior del tegumento, inmediatamente
por encima de la epidermis y segregada por ésta. Es una estructura rígida,
inerte, de estructura compleja y compuesta principalmente por quitina, además
de otras sustancias.
Ecosistema agrícola. Ecosistema sensiblemente modificado y cuya
estabilidad depende sustancialmente de subsidios energéticos.
IV
Electroforesis. Método de separación de moléculas. Consiste en someter una
mezcla a un campo eléctrico de manera que las moléculas migraran en un gel
de acuerdo a su tamaño y carga eléctrica. Se puede utilizar para separar o
purificar proteínas o moléculas de ARN o ADN.
Esporulación. Tipo de reproducción mediante la formación de esporas.
Heterótrofos. Organismos incapaces de sintetizar sus propios nutrientes y
necesitan adquirirlos (por ingestión o absorción) ya elaborados por otros
organismos vivos.
Hifa. Unidad vegetativa estructural en los hongos. Es un filamento tubular, con
pared celular que contiene citoplasma y organoides, pudiendo presentar
tabiques o no.
Hongos entomopatógenos. Organismos utilizados en el control biológico para
el control de insectos plaga. Actúan por medio de la infección de los insectos
para causar su muerte.
Hospedante. Es un organismo en el cual se aloja un parásito o patógeno.
Larvas. Formas juveniles que se presentan en todos los insectos con
metamorfosis completa para convertirse en adultos. Las larvas tienen poco
parecido a los insectos adultos; carecen de alas y ojos compuestos y suelen
tener forma de gusano.
Micelio. Parte vegetativa y fundamental de los hongos compuesta por una
masa de filamentos denominados hifas.
V
Oligonucleótido (“primer”). Secuencia corta de nucleótidos que proporciona
el punto de iniciación para que la ADN polimerasa copie una secuencia de
nucleótidos y elaboren una doble cadena.
Pares de bases (pb). Dos bases nitrogenadas unidas mediante enlaces
débiles en el ADN de cadena doble; el emparejamiento específico de estas
bases (adenina con timina y guanina con citosina) hace posible la replicación
exacta del ADN.
Patogenicidad. Capacidad de un patógeno para causar enfermedad.
PCR (“polymerase chain reaction”). Reacción en cadena de la polimerasa.
Sistema de amplificación genética que permite obtener millones de copias de
un determinado fragmento de ADN o ARN del que simplemente se conozcan
dos secuencias que lo flanqueen.
Plaga. Organismo (virus, bacteria, hongo, planta o animal) que mata, parásita,
causa enfermedad o daña plantas de cultivo, animales de interés para el
hombre o recursos almacenados como grano o madera.
Termociclador. Instrumento que permite ejecutar en forma automatizada la
técnica de PCR. Mediante la aplicación de ciclos térmicos secuenciales ocurre
la desnaturalización, hibridación y síntesis de ADN.
Virulencia. Grado de patogenicidad de un agente infeccioso
Vórtex. Aparato que sirve para agitar vigorosamente
VI
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1. Mecanismo de acción de hongos entomopatógenos. ................... 6
Figura 2. Estructuras morfológicas de Beauveria bassiana. ...................... 11
Figura 3. Estructuras morfológicas de Metarhizium anisopliea. ................. 13
Figura 4. Triángulo de texturas USDA (Departamento de Agricultura de
los Estados Unidos) .................................................................... 19
Figura 5. Larvas de Galleria mellonella L. en suelo humedecido. .............. 21
Figura 6. Colonia de HE crecida sobre medio de cultivo PDA, usada para
su identificación morfología. ........................................................ 23
Figura 7. Microcultivo de HE para la identificación microscópica. .............. 24
Figura 8. Regiones ITS1/5.8s/ITS4 flanqueadas por los oligonucleótidos
ITS 1-4 ....................................................................................... 26
Figura 9. Larvas de G. mellonella L. del último instar de desarrollo
micosadas por hongos entomopatógenos en suelo. ................... 31
Figura 10. Morfotipo 1 de Beauveria bassiana polvoroso.. .......................... 33
Figura 11. Morfotipo 2 de Beauveria bassiana algodonoso. ........................ 33
Figura 12. Morfotipo 1 de Metarhizium anisopliae polvoroso.. ..................... 34
Figura 13. Morfotipo 2 de Metarhizium anisopliae algodonoso.. .................. 34
Figura 14. ADN genómico total extraído de HE con el kit comercial
DNAzol. ....................................................................................... 36
Figura 15. Electroforesis de PCR de B. bassiana. ....................................... 37
Figura 16. Electroforesis de PCR de M. anisopliae. ..................................... 37
Figura 17. Rango de similitud de secuencias de la región ITS-rADN entre
los aislados de Beauveria bassiana y Metarhizium anisopliae. ... 39
Figura 18. Árbol filogenético de la región ITS de rADN de aislados de
Beauveria bassiana y Metarhizium anisopliae. ........................... 40
VII
ÍNDICE DE CUADROS
Cuadro 1. Condiciones de PCR (reacción en cadena de la polimerasa) ..... 27
Cuadro 2. Sitios de muestreo de suelo. ....................................................... 30
Cuadro 3. Aislamientos de B. bassiana y M. anisopliae. ............................. 32
Cuadro 4. Tamaño de las conidias. ............................................................. 35
Cuadro 5. Aislados de hongos identificados, por comparación de
secuencias amplificadas con los oligonucleótidos ITS1-ITS4
con secuencias reportadas en la base de datos del NCBI
(programa BLAST). ..................................................................... 38
Cuadro 6. Tipo de suelo y ecosistemas a partir de los cuales se aislaron
los hongos entomopatógenos. .................................................... 42
Cuadro 7. Diferencia de medias entre el número de aislamientos respecto
al tipo de suelo del que fueron aislados ...................................... 43
Cuadro 8. Temporada del año a partir del cual se realizaron los
aislamientos ................................................................................ 44
Cuadro 9. Parámetros físico químicos de las muestras de suelo ................ 46
VIII
RESUMEN
El Estado de Sinaloa cuenta con diversos tipos de ecosistemas destacando la
selva baja caducifolia y los agroecosistemas por ser estos los de mayor
extensión. Los hongos entomopatógenos (HE) son organismos que habitan el
suelo y son un componente importante en la mayoría de los ecosistemas
terrestres, ya que juegan un papel clave en la regulación de las poblaciones de
insectos. Las especies más importantes de este grupo de hongos son
Beauveria bassiana y Metarhizium anisopliae por su amplio rango de
hospederos y distribución. Es por esto que el objetivo de este estudio fue: aislar
a estos hongos de suelos cultivados y no impactados en la región norte de
Sinaloa, así como la identificación morfológica y caracterización molecular de
los aislamientos encontrados. Se realizaron dos muestreos de suelo en
diferente época del año, en 25 sitios, de los cuales 7 eran suelos no
impactados de la selva baja caducifolia y 18 cultivados. El aislamiento se
realizó con la técnica de insecto trampa usando Galleria mellonella, los hongos
obtenidos fueron identificados morfológicamente con las claves taxonómicas de
Humber (1998), se amplificó la región ITS1/5.8s/ITS2 de los 22 aislamientos
con los oligonucleótidos ITS1/ITS4, el fragmento obtenido fue secuenciado.
Con la finalidad de determinar si existe relación entre los aislamientos
encontrados con el tipo de suelo del que fueron aislados (cultivado o no
impactado) se realizó un análisis de varianza. Se obtuvieron 22 HE a partir de
larvas micosadas, de acuerdo a la identificación molecular 19 aislamientos
pertenecen a Beauveria bassiana y tres a Metarhizium anisopliae. En la
caracterización molecular se obtuvo un bandeo de aproximadamente 540 pb.
Todas las secuencias obtenidas de B. bassiana fueron 99% homólogas con las
publicadas en el NCBI, mientras que en el caso de M. anisopliae dos resultaron
con un 99% de homología y una con 98%. Se presentó diferencia significativa
entre el tipo de suelo (cultivado o no impactado) con el número de aislamientos
encontrados, obteniéndose 16 aislamientos en suelos no impactados, mientras
que en suelos cultivados se encontraron seis.
IX
ABSTRACT
In Sinaloa, Mexico there are different ecosystems, for example the tropical dry
forest and agroecosystem, both covering a large area. Entomopathogenic fungi
(HE) are organisms that live in the soil and are an important component in most
terrestrial ecosystems, because they play a key role regulating insect
populations. The most important species of this group of fungi are Beauveria
bassiana and Metarhizium anisopliae, due to the wide host range and
distribution. For these reason, the aim of this study was to isolate, identified
morphologically and molecularly characterize, fungi obtained from cultivated soil
and not impacted soil in the northern area of Sinaloa. There were taken 25
samples in different points, of which 7 were of not impacted soils of the tropical
dry forest and 18 cultivated. The isolation was obtained using the insect trap
(Galleria mellonella) technique obtaining 22 isolates from mycosed larvae,
which were identified morphologically using Humber (1998) taxonomic keys; 19
isolates were identified as Beauveria bassiana and three as Metarhizium
anisopliae. From DNA fractions ITS1/5.8s/ITS2 region were amplified to 22
isolates with the universal primers ITS1/ITS4 obtaining bande with
approximately 540 bp. The sequences obtained from B. bassiana were 99%
homologous with those published in the National Center for Biotechnology
Information (NCBI), while in the case of M. anisopliae two were found with 99%
and one with 98% homology. It showed a significant difference between the
type of soil (cultivated or not impacted) with the number of isolates found, 16
isolates obtained in not impacted soils, whereas in cultivated soils were six.
1
I. INTRODUCCIÓN
El suelo está entre los hábitats más variados y contiene algunas de las
colecciones más diversas de organismos vivos. Es uno de los ecosistemas más
complejos de la naturaleza, contiene miles de organismos diferentes los cuales
interactúan e intervienen en los ciclos globales que hacen posible toda forma de vida
(FAO, 2012). El Estado de Sinaloa cuenta con vegetación vinculada a diversos
factores ecológicos que interactúan entre sí, contando con ecosistemas agrícolas,
matorrales, selva baja caducifolia y bosque (INEGI, 2011).
Sinaloa es una de las entidades agrícolas más importantes del país. En el año
2010 tuvo una superficie sembrada de 1.1 millones de hectáreas en los ciclos otoño-
invierno y primavera-verano, en las dos modalidades: riego y temporal. En Sinaloa,
como en otras importantes zonas agrícolas, los rendimientos se ven severamente
reducidos cada año por un gran número de plagas de diferente naturaleza, entre las
que destacan los insectos (SIAP-SAGARPA, 2011).
Los hongos entomopatógenos (HE) son organismos que habitan el suelo y son
un importante componente en la mayoría de los ecosistemas terrestres, ya que
juegan un papel clave en la regulación de las poblaciones de insectos (Harrison y
Gardner, 1991; Bing y Lewis, 1993; Chandler et al., 1997; Bidochka et al., 1998;
Klingen et al., 2002; Shapiro et al., 2003).
Prácticamente todos los insectos son susceptibles a algunas de las
enfermedades causadas por hongos. Se conocen aproximadamente 100 géneros y
750 especies de hongos entomopatógenos. Entre los géneros más importantes
están: Metarhizium, Beauveria, Aschersonia, Entomophthora, Zoophthora, Erynia,
Eryniopsis, Akanthomyces, Fusarium, Hirsutella, Hymenostilbe, Paecilomyces y
Verticillium (López y Borje, 2001).
2
En todo el mundo se han realizado muchas investigaciones partiendo de
capturas de poblaciones nativas de estos organismos y estudiando su distribución,
encontrándose en una variedad de hábitats. Por lo anterior, los estudios de
aislamiento y caracterización de cepas nativas son importantes, ya que generan
información básica sobre el origen de las especies patógenas para los insectos plaga
y mantienen resguardados y disponibles los microorganismos (Quesada et al., 2007).
En el presente trabajo se realizó la búsqueda de aislamientos nativos de
Beauveria bassiana y Metarhizium anisopliae en suelos agrícolas y no impactados
del Norte de Sinaloa y su caracterización morfológica y molecular, para su
conservación en la colección nacional de cultivos microbianos así como su futura
aplicación como agentes de control biológico en agroecosistemas de la región.
3
II. ANTECEDENTES
2.1. El suelo
El suelo es un sistema complejo muy importante en los ecosistemas, ya que
en él se lleva a cabo una gran actividad de macro y microorganismos que
contribuyen a procesos importantes para la vida de plantas y animales terrestres,
tales como los ciclos de los nutrientes (Madigan et al., 2006).
El suelo es el producto de la acción del clima y de los organismos, se
compone de un material parental del sustrato geológico o mineral subyacente y de un
aumento en el componente orgánico en el que los organismos y sus productos están
entremezclados con las partículas finamente divididas del material en cuestión,
conteniendo gases y agua entre los espacios porosos de las partículas (Odum,
2001). El crecimiento microbiano más importante en el suelo tiene lugar en la
superficie de las partículas del suelo (Madigan et al., 2006).
Los diferentes tipos de suelos son producto de variaciones en diferentes
factores de formación como lo son el material parental, el clima y la topografía, los
cuales determinan en gran parte las propiedades físicas y químicas dominantes. Los
microorganismos del suelo modifican también su estructura mediante la producción
de exudados con propiedades adhesivas que permiten la agregación de minerales y
compuestos orgánicos (Kibblewhite et al., 2008).
2.2 . Microorganismos en el suelo
El suelo alberga una gran riqueza de especies vegetales, animales y microbianas.
Es un ambiente muy apropiado para el desarrollo de los microorganismos tanto
eucariotas (algas, hongos, protozoos), procariotas (bacterias y arqueas), virus y
bacteriófagos. Todos estos organismos establecen relaciones entre ellos en formas
muy variadas y complejas; también contribuyen a las características propias del
4
suelo por su papel en la modificación de este. Los microorganismos desempeñan
funciones de gran importancia en relación con procesos de edafogénesis; ciclos
biogeoquímicos de elementos como el carbono, el nitrógeno, oxígeno, el azufre, el
fósforo, el hierro y otros metales; fertilidad de las plantas y protección frente a
patógenos y degradación de compuestos xenobióticos. Los organismos del suelo no
se distribuyen al azar sino que siguen patrones espaciales de agregación, a escalas
diferentes que se superponen. Esta estructuración obedece al efecto causado por
diferentes factores de control y es totalmente dinámica (Ettema y Wardle, 2002).
2.3. Hongos entomopatógenos en el suelo
Los hongos entomopatógenos (HE) son un grupo de microorganismos que
emplean a diferentes órdenes de artrópodos como hospederos para desarrollar parte
de su ciclo de vida. Esta interacción generalmente conduce al desarrollo de
enfermedad en el hospedero terminando en la muerte del mismo (Butt et al., 2001;
Khachatourians y Uribe, 2004). El suelo se considera el entorno natural de los
hongos entomopatógenos debido a que en él se depositan sus estructuras
infecciosas y permanecen en él durante una gran parte de su ciclo de vida (Juraj y
Ludovit, 2011), donde se encuentran protegidos de la radiación UV y contra la
influencia extrema de factores bióticos y abióticos (Keller y Zimmerman, 1989).
Factores del suelo como pH, materia orgánica, tamaño de las partículas y
temperatura, pueden influir en la presencia y actividad de los HE (Charnley, 1997).
Los HE se encuentran extendidos en una gran variedad de hábitats. Beauveria
bassiana y Metarhizium anisopliae se encuentran presentes en los suelos de todo el
planeta, donde las condiciones permiten su supervivencia (Jaronski, 2007).
5
2.4. Generalidades de los hongos entomopatógenos
Los HE, son microorganismos que atacan arácnidos, ácaros e insectos, y
juegan un papel importante dentro de la biodiversidad, manteniendo controladas las
poblaciones de insectos en los ecosistemas naturales. Algunos HE no producen
crecimiento superficial o producen muy poco. La mayoría son patógenos obligados o
facultativos y algunos son simbióticos. Su crecimiento y desarrollo están limitados
principalmente por las condiciones ambientales externas, en particular alta humedad
y temperatura adecuada para la esporulación y germinación de esporas. Son
organismos heterótrofos, que poseen células quitinizadas, normalmente no móviles.
El inicio de la infección se realiza por germinación de las esporas del hongo sobre el
tegumento del hospedero. La dispersión de las esporas se realiza por contaminación
ambiental a través del viento, la lluvia e incluso individuos enfermos al entrar en
contacto con otros sanos. Normalmente son especies específicas o de amplio
espectro de hospedantes (insectos y ácaros). El hongo sale del insecto enfermo a
través de las aperturas (boca, ano, orificios de unión de los tegumentos y artejos) y
en el exterior forma sus estructuras fructíferas y produce esporas. Los insectos
enfermos no se alimentan, presentan debilidad y desorientación y cambian de color,
presentando manchas oscuras sobre el tegumento que corresponden con las
esporas germinadas del hongo (Tanada y Kaya, 1993).
Los HE han sido utilizados en los ecosistemas agrícolas para el control de
insectos plaga en los cultivos por tener una gran variedad de especies y amplio
rango de hospederos, así como el crecimiento de micelio sobre su cutícula. Las
especies más importantes por su distribución cosmopolita y la gran cantidad de
insectos a los que afectan son Beauveria bassiana y Metarhizium anisopliae (Cañedo
y Ames, 2004).
2.5.
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7
Adhesión de la espora a la cutícula del hospedero y germinación de la
espora. El primer contacto entre el hongo entomopatógeno y el insecto sucede
cuando la espora del primero es depositada en la superficie de este último. El
proceso de adhesión ocurre en tres etapas sucesivas: adsorción de la espora a la
superficie mediante el reconocimiento de receptores específicos de naturaleza
glicoprotéica en el insecto, la adhesión o consolidación de la interfase entre la espora
pregerminada y la epicutícula y finalmente, la germinación y desarrollo hasta la
formación del apresorio para comenzar la fase de penetración (Tanada y Kaya, 1993;
Pedrini et al., 2007). El proceso de adhesión de la espora a la cutícula del insecto,
está mediado por la presencia de moléculas sintetizadas por el hongo denominadas
adhesinas (Wang y Leger, 2007). Por otro lado se ha demostrado que los iones
divalentes como el Ca2+ y el Mg2+ reducen las fuerzas de repulsión electrostáticas
promoviendo la adhesión de las esporas (Pucheta et al., 2006).
Penetración en el hemocele. La forma en la que los hongos
entomopatógenos penetran en el insecto depende de las propiedades de la cutícula
tales como el grosor, la esclerotización y la presencia de sustancias antifúngicas y
nutricionales (Charnley, 1992). Una vez establecido el proceso de adhesión, continua
la penetración la cual es posible gracias a la acción combinada de dos mecanismos
uno físico y uno químico, el primero consiste en la presión ejercida por una estructura
fúngica denominada haustorio, el cual deforma primeramente la capa cuticular
rompiendo luego las áreas esclerosadas y membranosas de la cutícula. El
mecanismo químico consiste en la acción enzimática, principalmente de actividades
hidrolíticas tales como proteasas, lipasas y quitinasas, las cuales degradan el tejido
en la zona de penetración, facilitando la entrada del hongo (Monzón, 2001). Estudios
in vitro indican que en la digestión del integumento sigue una secuencia de lipasa-
proteasa-quitinasa (Tanada y Kaya, 1993). Se ha observado que la acción
enzimática puede ser coadyuvada por la secreción de ácidos orgánicos, como el
ácido oxálico (Bidochka y Kachatourians, 1991).
8
Otro mecanismo que utilizan los hongos para penetrar al hemocele es a través
de la cavidad bucal, espiráculos y otras aberturas externas del insecto. Puesto que la
humedad no es un problema en el tracto alimenticio, la espora puede germinar
rápidamente en este ambiente; aunque los fluidos digestivos pudieran destruirla o
degradar la hifa germinativa. En algunos casos, la digestión de estructuras fúngicas
puede causar la muerte por toxicidad más que por micosis (Charnley, 1992).
Replicación en el hemocele. Después de llegar al hemocele, la mayoría de
los hongos realizan transición dimórfica de micelio a levadura y una vez que han
evadido el sistema inmune del insecto, se produce una septicemia. La micosis induce
a síntomas fisiológicos anormales en el insecto tales como convulsiones, carencia de
coordinación, comportamientos alterados y parálisis. La muerte sobreviene por una
combinación de efectos que comprenden el daño físico de tejidos, toxicosis,
deshidratación de las células por pérdida de fluido y consumo de nutrientes (Bustillo,
2001).
Ya en el interior del insecto, los hongos deben enfrentarse con los
mecanismos de respuesta del sistema inmune para lo cual han desarrollado
estrategias defensivas e inmunosupresoras, como la producción de toxinas o
cambios estructurales en su pared celular. Existe un considerable número de
metabolitos secundarios de bajo peso molecular que han sido aislados de patógenos
de insectos, muchos de los cuales han demostrado poseer actividad insecticida
marginal. En muchos casos suelen ser la causa directa de la muerte del insecto,
actuando sobre las células especializadas del sistema inmune para evitar su ataque
a las estructuras invasivas de los hongos (Gillespie y Claydon, 1989).
También se ha observado que para evitar el ataque del sistema inmune del
insecto, los hongos suelen prescindir de la formación de pared celular y se
desarrollan como protoplastos, evadiendo su reconocimiento por los hemocitos
circulantes en el hemocele (Vinson, 1991). Cuando los nutrientes provenientes del
9
insecto, particularmente las fuentes de nitrógeno se van agotando, las fases
levaduriformes retoman su crecimiento micelial (Freimoser et al., 2003).
Por último, cuando las condiciones de humedad y temperatura son las
adecuadas, las hifas del hongo emergen nuevamente al exterior del cadáver del
insecto, donde esporula. La esporulación ocurre generalmente en cadáveres pero
puede también ocurrir en insectos vivos (Tanada y Kaya, 1993).
Finalmente la dispersión de la espora puede ser un proceso activo o pasivo y
depende de las características de la espora y el esporangio. Cada espora puede
adherirse o pasar de un invertebrado a otro por dispersión (Tanada y Kaya, 1993).
2.6. Características de Infección
Como un estado temprano de la infección del hongo, el insecto muestra pocos
o ningún síntoma excepto por pocas manchas necróticas las cuales se pueden
desarrollar en el sitio de invasión. Como un estado tardío de infección, los insectos
generalmente se muestran inquietos, menos activos, presentan debilidad y
desorientación y cambian de color, su apetito se reduce, pierden coordinación y
presentan manchas oscuras sobre el tegumento, que corresponde a las esporas
germinadas del hongo y pueden morir en unos cuantos días. Los insectos muertos
por hongos varían en su apariencia, pueden estar cubiertos totalmente por el micelio
del hongo, o en algunas ocasiones se les observa emergiendo de las articulaciones y
segmentos del cuerpo. Poco después de la muerte, el insecto se endurece, se vuelve
quebradizo y se momifica. El tiempo de desintegración del tejido puede diferir según
la especie del hongo, modo de invasión y la especie del hospedero. Después de la
completa invasión del cadáver, el desarrollo posterior del hongo sobre el insecto
momificado depende de la humedad relativa y la temperatura; solamente cuando la
atmósfera está saturada el micelio emerge a través del integumento y desarrolla
10
conidióforos, si no el cadáver permanece momificado, compacto y frágil (Tanada y
Kaya, 1993).
2.7. Beauveria bassiana (Bálsamo) Vuillemin
Beauveria bassiana es un hongo filamentoso de la división Ascomycota. En
1835 Agostino Bassi descubrió que este hongo era el agente causal de la
muscardina blanca en el gusano de seda. Fue descrito por primera vez por Jean
Beauverie en 1911 con el nombre de Botrytis bassiana. Un año más tarde, Vuillemin
la estableció en su clase actual. B. bassiana es uno de los HE más usados a nivel
mundial para el control de insectos plaga en la industria agrícola y forestal, la razón
de esto es su amplio rango de hospederos de cerca de 750 especies de insectos y
su distribución cosmopolita (Inglis et al., 2001).
Morfológicamente, B. bassiana formada hifas septadas de 2,5 a 25 μm de
diámetro, de donde se forman conidióforos simples raramente agrupados, con
apariencia de botella (más ancho en el centro que en los extremos), los cuales
sostienen los conidios, originados de forma simpodial o acrópeta, dando una
apariencia en zigzag al raquis. Las esporas son esféricas y levemente ovaladas en
medios aerobios, pero más ovaladas en medios anaerobios, llamadas blastosporas
(Figura 2) (Kouassi, 2001). Sin embargo, independientemente de su morfología,
presentan igual capacidad de infección. Tanto las esporas como las hifas, son
hialinas, por lo que su apariencia es blancuzca (Barron, 2001).
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12
2.9. Metarhizium anisopliae (METSCH.) SOROKIN
Metarhizium anisopliae es un hongo filamentoso de la división Ascomycota. La
enfermedad causada por este hongo es conocida como muscardina verde y fue
descubierta por Metschnikoff en 1879. Fue el primer HE producido en masa para ser
utilizado como bioinsecticida. Infecta alrededor de 200 especies de insectos (Tanada
y Kaya, 1993).
Presenta micelio septado, conidióforos característicos sobre los cuales surgen
los conidios en columnas compactas, los conidios son generalmente unicelulares y
cilíndricos de dimensiones variadas. Se caracteriza por tener fiálides cilíndricas,
sosteniendo cadenas de conidios cilíndricos que se adhieren lateralmente formando
columnas conidiales (Figura 3). Posee fiálides clavadas sosteniendo cadenas de
conidios cilíndricos u ovoides que se adhieren típicamente en masas paralelas,
además las dimensiones de los conidios se caracterizan por tener 7 μm de largo y
2.3 a 3.7 μm de ancho (Humber, 1998).
Existe variación en la dimensión de los conidios de 2 a 10.6 μm de largo y 3.5
a 8 μm de ancho. Las conidias de esta especie son blancas cuando son jóvenes,
pero conforme maduran el color se torna verde oscuro (Tanada y Kaya, 1993).
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14
2.11. Control biológico
El control biológico consiste en la aplicación de técnicas compatibles con la
conservación del ambiente mediante el uso de los enemigos naturales de las plagas,
las cuales, actuando de un modo natural, controlan el nivel poblacional de las
especies plaga sin ocasionar problemas de contaminación ni de residuos (Badii et al.,
2000).
El desarrollo y aplicación de agentes de control biológico de plagas adquiere
una importancia relevante como una alternativa en el desarrollo de una agricultura
sostenible que preserve los recursos naturales y el medio ambiente para las futuras
generaciones. La aplicación controlada en agroecosistemas de organismos vivos o
sus metabolitos para el control de plagas y enfermedades, resulta en el mejoramiento
de los cultivos, al proteger las plantas del deterioro producido por agentes
fitopatógenos (Gómez et al., 2002). En el control biológico de plagas se utilizan
parasitoides, depredadores (entomófagos) y organismos entomopatógenos que
pueden ser hongos, bacterias, virus, nematodos y protozoarios. Los hongos
entomopatógenos son los que han recibido mayor atención por la gran variedad de
especies y amplio rango de hospedantes así como por su crecimiento microscópico
sobre la superficie de su huésped (Cañedo y Ames, 2004).
15
III. JUSTIFICACIÓN
En el norte de Sinaloa una gran parte de los suelos se dedica a actividades
agrícolas y otra parte corresponde a zonas con diferentes tipos de vegetación
natural; el suelo es un recurso importante por la diversidad de organismos que
alberga, encontrándose amenazado por la presión desmedida de la actividad
antropogénica que ha originado una reducción de biodiversidad.
En México existen pocos estudios relacionados sobre hongos
entomopatógenos en el suelo; por lo que este estudio resulta importante en el
Estado, debido a que nos permite conocer a los hongos que están presentes en la
región, ya que estos organismos son un componente importante del suelo, donde
juegan un papel clave en la regulación de las poblaciones naturales de insectos.
Además, al incluirse a una colección de microorganismos entomopatógenos,
debidamente identificados y caracterizados, se logra la preservación de
microorganismos nativos para su uso posterior en otros estudios y diferentes
aplicaciones agrícolas y biotecnológicas.
16
IV. HIPÓTESIS
Las especies Beauveria bassiana y Metarhizium anisopliae, se encuentran presentes
en suelos agrícolas y en suelos no impactados del norte de Sinaloa.
V. OBJETIVOS
V.I. Objetivo general
Aislar y caracterizar morfológica y molecularmente a Beauveria bassiana y
Metarhizium anisopliae de suelos cultivados y no impactados en el norte de
Sinaloa.
V.II. Objetivos específicos
• Aislar Beauveria bassiana y Metarhizium anisopliae en la región norte de
Sinaloa.
• Identificar morfológicamente los aislamientos encontrados.
• Identificar molecularmente los aislamientos obtenidos.
17
VI. MATERIALES Y MÉTODOS
6.1. Área de estudio
El área de estudio se localizó en la zona norte del Estado de Sinaloa (Ahome,
el Fuerte, Choix, Guasave y Sinaloa de Leyva), el cual está ubicado en el Noroeste
del país a los 22° 31' y 26° 56' de Latitud norte y los 105° 24' y 109° 27' de longitud
oeste del meridiano de Greenwich. Limita al norte con los estados de Sonora y
Chihuahua; al sur con Nayarit; al este con Durango y al oeste con el Océano
Pacífico. Presenta una precipitación media anual de 790 mm en los valles. En las
partes altas de la sierra la precipitación media anual es de 1188 mm. La temperatura
media anual del estado es alrededor de 25 °C, las temperaturas mínimas promedio
son alrededor de 10.5 °C en el mes de enero y las máximas promedio pueden ser
mayores a 36 °C durante los meses de mayo a julio (INEGI, 2011).
6.2. Colecta de muestras de suelo
Se realizaron dos muestreos, uno en el mes de febrero y el segundo en
septiembre de 2011. Se hicieron muestreos de cinco municipios del norte de Sinaloa
(Ahome, El Fuerte, Choix, Guasave y Sinaloa de Leyva) tomando cinco puntos por
cada uno de los municipios de sistemas agrícolas y sin impactar.
Se colectó suelo usando la técnica de zig-zag recomendada por Cline (1944);
el suelo se tomó de los primeros 30 cm después de haber quitado la parte superficial,
obteniéndose al final aproximadamente 1 kg. Las muestras fueron almacenadas en
bolsas de plástico negro de 2 kg de capacidad, debidamente etiquetadas y se
trasladaron al laboratorio de bioinsecticidas de CIIDIR-SINALOA, colocándose en un
sitio fresco.
18
En el laboratorio las muestras de suelo fueron secadas a la sombra, se
tamizaron a 2 mm para eliminar tierra muy compactada y residuos de desperdicios,
clasificándose por sitio, mismos que fueron previamente georreferenciados.
Una parte de las muestras de suelo fueron llevadas al laboratorio de nutrición
vegetal para determinar los parámetros físico-químicos (pH, materia orgánica y
textura).
6.3. Determinación de pH, textura y materia orgánica del suelo
6.3.1 pH
Se pesaron 10 g de suelo fino tamizado a 2 mm y se colocó en un vaso
precipitado de 200 ml, al cual se agregaron 20 ml de agua destilada agitándose con
una varilla de vidrio. Se dejó reposar durante 20 minutos, después de este tiempo, se
tomó el pH con un potenciómetro marca Hanna, modelo H19813-6.
6.3.2. Textura
La textura se define como la proporción relativa de grupos dimensionales de
partículas. Para determinar la textura del suelo se utilizó el método de Bouyoucos
(1962).
Se pesaron 50 g de suelo de textura tamizada a 2 mm de cada una de las
muestras y se pusieron en vasos de precipitado de 250 ml, a las cuales se agregó
agua purificada hasta dos centímetros arriba del nivel del suelo agitándose con una
varilla de vidrio. Se agregaron 25 ml de hexametafosfato de sodio agitándose de
nuevo con una varilla de vidrio y se dejó reposar por 5 min. Se pasó todo el material
a un vaso metálico de un agitador mecánico con ayuda de una piceta y se activó el
agitador durante 5 min. Se vació el contenido a una probeta de 1000 ml, enjuagando
el vaso con ayuda de una piceta con agua purificada hasta completar 1000 ml con un
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6.3.3. Materia orgánica
La determinación de materia orgánica del suelo se realizó a través del
contenido de carbono orgánico con el método de Walkley y Black (1934).
Se pesaron 0.5 g de suelo seco tamizado con una malla de 0.5 mm y se
colocó en un matraz Erlenmeyer de 500 ml. Se adicionaron 10 ml de dicromato de
potasio 1N girando el matraz cuidadosamente para que entrara en contacto con todo
el suelo. Se agregaron 20 ml de ácido sulfúrico (H2SO4) concentrado a la suspensión
y se giró nuevamente el matraz durante un minuto dejándose reposar durante 30
min. Pasado este tiempo se añadieron 200 ml de agua destilada, después se
agregaron 5 ml de ácido fosfórico (H3PO4) concentrado y por último se añadieron de
5 a 10 gotas de indicador de difenilamina para después titular con una dilución de
sulfato ferroso (FeSO4) gota a gota hasta un punto final verde brillante.
Cálculos.
% de C orgánico = [ ( B – T ) / g ] ( N ) ( 0.39 ) mcf
Dónde:
B = Volumen de sulfato ferroso gastado para valorar el testigo (ml). T = Volumen de sulfato ferroso gastado para valorar la muestra (ml). N = Normalidad exacta del sulfato ferroso (valorar por separado al momento de analizar las muestras). g = Peso de la muestra empleada (g). mcf= factor de corrección de humedad. % Materia orgánica = % C Orgánico x 1.724
6.4. Aislamiento de hongos entomopatógenos
6.4.1. Técnica de insecto trampa
Esta técnica fue propuesta por Zimmermann (1986). El suelo de las 25
muestras fue colocado en cajas Petri humedeciéndose a capacidad de campo donde
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contaminación bacteriana. El medio PDA se incubó a 28 °C durante el tiempo
necesario hasta observar crecimiento del hongo, lo cual osciló entre 7 a 18 días.
6.5. Cultivos monospóricos
Para establecer una colección confiable, es necesario partir de aislamientos
monospóricos, es decir aislamientos que provengan de una sola espora, lo cual
garanticen la autenticidad y pureza de los mismos y de los datos que se consigan.
Se sembraron los aislamientos en cajas de Petri y se incubaron a 28°C
durante 15 días hasta obtener la esporulación del hongo. En un tubo Eppendorf con
1 ml de una solución de Tween 80 al 0.1% se colocó una pequeña porción del hongo
y se agitó ligeramente en un vortex por espacio de 15 segundos para que se
separaran las esporas. Se tomaron 100 μL de la suspensión y se hizo un conteo de
esporas en una cámara de Neubauer con un microscopio a 40X (400 aumentos).
Para realizar una segunda dilución, se tomaron 100 μL de la suspensión
anterior y se agregaron 900 μL de solución de Tween 80 al 0.1% y se agitó en el
vórtex.
Se realizaron las diluciones necesarias para tener una suspensión a una
concentración de 50 a 100 esporas por mililitro. Se sembraron 100 μL de la
concentración deseada en una placa con medio PDA dentro de la campana de flujo
laminar. Se incubó a 28 °C por una semana, se cortó con una hoja de bisturí estéril
una colonia en formación y se transfirió a otra placa con PDA con el objetivo de que
la colonia seleccionada provenga de una sola conidia (Cañedo y Ames, 2004).
6.6.1.
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25
6.8. Conservación de aislamientos
6.8.1. Subcultivos
Para la conservación de las cepas se utilizó el método de transferencia en
medio de cultivo, por ser económico y de fácil manejo. Éste se conservó en
refrigeración (4 °C) después de su crecimiento en tubos en posición inclinada con un
medio de cultivo selectivo para hongos que contiene: extracto de malta, extracto de
levadura, agar bacteriológico y caldo dextrosa sabouraud. Este método puede
presentar algunas desventajas como: pérdida de patogenicidad o contaminación por
la manipulación que pudiese tener, a través del tiempo.
6.8.2. Crioconservación
Los aislamientos fueron sembrados en placa en medio de cultivo agar papa
dextrosa (PDA), los cuales una vez esporulados, se cosecharon en crioviales de 2 ml
con 1 ml de medio líquido papa dextrosa (PD) (85%) con glicerol (15%) y mantenidos
en un ultracongelador a -70 °C.
6.9. Caracterización Molecular de los HE
La caracterización molecular de los 22 aislados de HE obtenidos se realizó en
el Laboratorio de Genómica Funcional de CIIDIR-SINALOA. Para lo cual se crecieron
micelios de los hongos en 5 ml de caldo Dextrose Sabouraud con extracto de
levadura (Alves, 1986) en tubos Falcon de 50 ml. Se agitaron a 250 rpm a 28 °C en
una incubadora con agitación durante 48 hr. Pasado este tiempo el contenido de
cada tubo Falcon se transfirió a tubos Eppendorf y se centrifugaron 5 min a 10, 000
rpm para separar el micelio del medio. El micelio se lavó con agua destilada estéril
para eliminar el exceso de medio de cultivo para el análisis molecular.
6.9.1.
DNAz
μL de
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por 8
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y se
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6.9.2.
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26
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ntidad
zados
28
6.9.3. Purificación de los productos de PCR
Los productos que se amplificaron se purificaron con el kit comercial Wizard
(Promega). Al total volumen de PCR se le añadió un volumen igual de solución
“Membrane Binding”, se insertó una columna a un tubo colector y se transfirió a ésta
el producto de PCR, donde se incubó por 1 minuto, se centrifugó a 14,000 rpm
durante un minuto, se desechó el sobrenadante que quedó en el tubo colector y se
reinsertó la columna en este. Se añadieron 700 μL de la solución “Membrane Wash”
y se centrifugó a 14,000 rpm durante un minuto, nuevamente se desechó el
sobrenadante y se reinsertó la minicolumna en el tubo colector. Después se
agregaron 500 μL de solución “Membrane Wash” centrifugándose a 14,000 rpm
durante 5 minutos. Se vació lo colectado en el tubo para volver a centrifugar la
columna ensamblada por 1 minuto, y se dejó evaporar totalmente la solución
“Membrane Wash”. Se transfirió la minicolumna a un tubo eppendorf nuevo de 1.5 ml
y se añadieron 20 μL de agua libre de nucleasas a la minicolumna. Se incubó a
temperatura ambiente por 1 minuto para después centrifugar a 14,000 rpm durante
un minuto, y se recuperó el eluído. El DNA recuperado fue cuantificado en un
Nanodrop y enviado secuenciar a CINVESTAV en Irapuato.
6.9.4. Secuenciación y análisis
La secuenciación se realizó utilizando el kit Dye Terminator Cycle Sequencing,
Ready Reaction (Applied Biosystems®), en un secuenciador ABI PRISM 377
PERKINELMER (Cetus, Norwalk, CT) en el Laboratorio de Ingeniería Genética de
CINVESTAV-IPN, Unidad Irapuato.
Las secuencias obtenidas fueron sometidas a comparación con secuencias
reportadas en el Banco de Genes (Gen Bank), del Centro Internacional para la
Información en Biotecnología (NCBI, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) con el programa
BLAST.
29
6.9.5. Construcción de árboles filogenéticos
La secuencia de las regiones ITSI, 5.8S e ITS2 del rADN (generada con la
amplificación con los oligonucleotidos ITS1 e ITS4) de los aislados se utilizaron para
construir árboles filogenéticos con el método CLUSTAL con el software MegAlign del
DNASTAR. Se utilizaron las secuencias de tres diferentes aislamientos de HE de la
base de datos del NCBI, (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/), para establecer su posición
respecto a las secuencias generas en este trabajo.
30
VII. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
7.1. Aislamiento de hongos entomopatógenos
En total se muestrearon 25 sitios, cinco por cada municipio (Ahome, El Fuerte,
Choix, Guasave y Sinaloa de Leyva). Se muestrearon siete suelos no impactados del
ecosistema selva baja caducifolia y 18 suelos cultivados de los cuales 14
agroecosistemas son de riego y 4 de temporal (Cuadro 2).
Cuadro 2. Sitios de muestreo de suelo.
Municipio Sitio Localidad Tipo de Suelo Ubicación geográfica Altura
(msnm) N W
Ahome 1 El Carrizo Cultivado 26° 14.207’ 108° 56.767’ 33.22
2 El Carrizo Cultivado 26° 14.360’ 108° 56.767’ 31.39
3 Camayeca Cultivado 25° 57.303’ 109° 5.262’ 15.11
4 Ej. La arrocera Cultivado 25° 49.351’ 108° 52.597’ 15.24
5 Ej. Echeverria Cultivado 25° 48.352’ 108° 50.517’ 15.56
El Fuerte 6 Capomos No impactado 26° 26.551’ 108° 32.213’ 146.30
7 Jahuara Cultivado 26° 13.202’ 108° 57.025’ 28.43
8 Jahuara Cultivado 26° 11.269’ 108° 55.347’ 52.12
9 Charay Cultivado 26° 2.081’ 108° 49.208’ 40.47
10 Constancia Cultivado 25° 58.508’ 108° 54.724’ 13.13
Choix 11 El Vado No impactado 26° 43.707’ 108° 18.577’ 200.25
12 El Guayabito No impactado 26° 43.014’ 108° 24.260’ 289.86
13 Bajosori Cultivado 26° 40.17’ 108° 23.009’ 351.73
14 Colexio No impactado 26° 33.035’ 108° 26.486’ 164.60
15 Colexio Cultivado 26° 33.044’ 108° 26.515’ 162.15
Guasave 16 La Cofradia Cultivado 25° 30.468’ 108° 26. 193’ 19.53
17 Buenos A. Cultivado 25° 24.234’ 108° 25. 341’ 17.92
18 Cortines Cultivado 25° 41.352’ 108° 40.829’ 39.80
19 Calle II Cultivado 25° 39.139’ 108° 37.186’ 22.28
20 La uva No impactado 25° 29.324’ 108° 27.870’ 9.14
Sinaloa de
Leyva
21 Cubiri de la L Cultivado 25° 46.098’ 108° 15.732’ 54.86
22 El Opochi Cultivado 25° 49.211’ 108° 10.713’ 96.01
23 Bacubirito No impactado 25° 48.675’ 107° 54.909’ 191.71
24 Burague Cultivado 25° 49.401’ 107° 57.810’ 138.68
25 Porohui No impactado 25° 53.182’ 107° 59.061’ 114.60
7.2.
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anisop
bassia
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A
B
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s por
izium
uveria
32
Cuadro 3. Aislamientos de B. bassiana y M. anisopliae.
Clave Aislamiento Localidad y municipio Suelo cultivado/no impactado
B1 B. bassiana El vado, Choix No impactado
B2 B. bassiana El vado, Choix No impactado
B3 B. bassiana El vado, Choix No impactado
B4 B. bassiana El vado, Choix No impactado
B5 B. bassiana El Guayabito, Choix No impactado
B6 B. bassiana Colexio, Choix No impactado
B7 B. bassiana Colexio, Choix No impactado
B8 B. bassiana Colexio, Choix No impactado
B9 B. bassiana Colexio, Choix No impactado
B10 B. bassiana Bacubirito, Sinaloa de Leyva No impactado
B11 B. bassiana Porohui, Sinaloa de Leyva No impactado
B12 B. bassiana Bajosori, Choix Cultivado T°
B13 B. bassiana Bajosori, Choix Cultivado T°
B14 B. bassiana El Guayabito, Choix No impactado B15 B. bassiana El Guayabito, Choix No impactado
B16 B. bassiana Colexio, Choix No impactado
B17 B. bassiana La Cofradia, Guasave Cultivado
B18 B. bassiana La Cofradia, Guasave Cultivado
B19 B. bassiana Porohui, Sinaloa de Leyva No impactado
M1 M. anisopliae Cubiri de la loma, Sinaloa de L. Cultivado
M2 M. anisopliae Cubiri de la loma, Sinaloa de L. Cultivado
M3 M. anisopliae La Uva, Guasave No impactado ° Temporal.
7.2.1. Identificación macroscópica
Beauveria bassiana. Se obtuvo un total de 19 colonias blancas las cuales
fueron separadas en dos morfotipos una vez esporuladas: morfotipo 1 con colonias
polvorosas (B1, B2, B4, B6, B7, B8, B9, B10, B14 y B17) y morfotipo 2 (B3, B5, B11,
B12, B13, B15, B16, B18 y B19) con colonias algodonosas, a los 15 días de
sembradas (Figuras 10 y 11), lo que coincide con los reportes de Barnett y Hunter
(1998), quienes describen a B. bassiana como una especie con colonias polvorosas
o algo
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34
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7.3.
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ADN Genómico
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36
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de la
ómico
utilizó
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e los
tir de
en el
38
GenBank del NCBI. Los aislados B1 a B19 obtuvieron homologías del 99 % con B.
bassiana, el aislado M1 un 98 % de homología con M. anisopliae mientras que los
aislados M2 y M3 un 99% (Cuadro 5, Anexo 1). El haber encontrado sólo la especie
B. bassiana concuerda con el estudio de Rejner et. al. (2005) quienes mencionan
que esta especie tiene una distribución geográfica mundial, mientras que especies
como: B. brongniartii, B. caledonica, B. verniconia y B. amorpha han sido aisladas
solo en Euroasia y Sudamérica.
Cuadro 5. Aislados de hongos identificados, por comparación de secuencias
amplificadas con los oligonucleótidos ITS1-ITS4 con secuencias reportadas en la
base de datos del NCBI (programa BLAST).
A pesar de que las secuencias de este estudio no presentan un 100% de
homología se considera que pertenecen a las especies B. bassiana y M. anisopliae
ya que son a las que tienen mayor proximidad en cuanto a su secuencia nucleotídica.
Los porcentajes de similitud entre secuencias de una misma especie encontradas en
este estudio fue alto de 94.7 a 100% en el caso de los aislados de B. bassiana, con
una divergencia de 0 a 3.2%. En el caso de M. anisopliae los porcentajes de similitud
variaron de 90.8 a 93.9% y una divergencia de 3.1 a 5.0% (Figura 17).
Aislado Organismo Porcentaje de identidad B1 Beauveria bassiana 99% B2 Beauveria bassiana 99% B3 Beauveria bassiana 99% B4 Beauveria bassiana 99% B5 Beauveria bassiana 99% B6 Beauveria bassiana 99% B7 Beauveria bassiana 99% B8 Beauveria bassiana 99% B9 Beauveria bassiana 99%
B10 Beauveria bassiana 99% B11 Beauveria bassiana 99% B12 Beauveria bassiana 99% B13 Beauveria bassiana 99% B14 Beauveria bassiana 99% B15 Beauveria bassiana 99% B16 Beauveria bassiana 99% B17 Beauveria bassiana 99% B18 Beauveria bassiana 99% B19 Beauveria bassiana 99% M1 Metarhizium anisopliae 98% M2 Metarhizium anisopliae 99% M3 Metarhizium anisopliae 99%
FM
Figura 17. RanMetarhizium an
ngo de similitudnisopliae.
d de secuenciaas de la región
39
n ITS-rDNA enntre los aisladoos de Beauveriia bassiana y
bassia
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de aislado
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mayor dista
e M. anisop
cia genética
s de Beau
de B.
ancia
pliae.
a.
uveria
41
Para realizar la identificación molecular de los aislados obtenidos se tomó en
cuenta primeramente la identidad de secuencias de rDNA de las regiones ITS que
incluye la región codificante 5.8s ADNr y las regiones intergénicas ITS1 e ITS2. Las
cuales poseen zonas muy conservadas y otras muy variables de unas especies a
otras de hongos. Esta variabilidad permite distinguir las especies. Gracias a ésto fue
posible identificar las dos especies de hongos entomopatógenos encontradas en
suelo del norte de Sinaloa.
Han sido muchos los trabajos de caracterización molecular utilizando las
regiones ITS, pero estas regiones no brindan demasiada información sobre la
diversidad genética los aislamientos (Rejner et al., 2005).
7.4. Relación de los aislamientos de HE encontrados con el tipo de
suelo (cultivado/no impactado) y época del año de muestreo.
Los HE fueron obtenidos de un total de 40.9% de los 25 suelos muestreados,
lo que fue similar a reportes de otros lugares, como en Finlandia donde la tasa de
recuperación fue de 44.6% (Vanninen et al., 1989) y 32.0% en Tasmania (Rath et al.,
1992), pero resultaron diferentes con respecto a un trabajo realizado en Ontario con
un 91.0% (Bidochka et al., 1998) y otro en Suiza con 96.0% (Keller et al., 2003). Sin
embargo, las comparaciones deben hacerse con cuidado porque los protocolos de
ensayo fueron diferentes, y aunque en todos los trabajos se utilizó la técnica de
insecto trampa, se utilizaron diferente número de larvas de G. mellonella para realizar
los aislamientos.
De los 22 aislamientos, 16 se obtuvieron de suelos no impactados (72.72%) y
6 aislamientos de suelos cultivados (27.27%) (Cuadro 6).
42
Cuadro 6. Tipo de suelo y ecosistemas a partir de los cuales se aislaron los hongos entomopatógenos.
Clave Aislamiento Ecosistema Tipo de suelo
B1 B. bassiana Selva* No impactado
B2 B. bassiana Selva* No impactado
B3 B. bassiana Selva* No impactado
B4 B. bassiana Selva* No impactado
B5 B. bassiana Selva* No impactado
B6 B. bassiana Selva* No impactado
B7 B. bassiana Selva* No impactado
B8 B. bassiana Selva* No impactado
B9 B. bassiana Selva* No impactado
B10 B. bassiana Selva* No impactado
B11 B. bassiana Selva* No impactado
B12 B. bassiana Agroecosistema T° Cultivado
B13 B. bassiana Agroecosistema T° Cultivado
B14 B. bassiana Selva* No impactado
B15 B. bassiana Selva* No impactado B16 B. bassiana Selva* No impactado
B17 B. bassiana Agroecosistema Cultivado
B18 B. bassiana Agroecosistema Cultivado
B19 B. bassiana Selva* No impactado
M1 M. anisopliae Agroecosistema Cultivado
M2 M. anisopliae Agroecosistema Cultivado
M3 M. anisopliae Selva* No impactado
*Selva baja caducifolia ° Temporal
Se presentó diferencia significativa entre el tipo de suelo (cultivado o no
impactado) con el número de aislamientos encontrados (Cuadro 7). Obteniéndose 16
aislamientos en suelos no impactados, mientras que en suelos cultivados se
encontraron seis. Esta diferencia indica que la presencia de los HE en los suelos
agrícolas se ve posiblemente afectada por la reducción en el número de hospederos
debido a la aplicación de insecticidas generalistas (Klingen et al., 2002), por la
compactación del suelo, aplicación de fertilizantes y cambios de pH, así como
aplicación de otros pesticidas, principalmente fungicidas (Quesada et al., 2007). La
principal actividad económica de Sinaloa es la agricultura contando con una
43
superficie agrícola de 1.1 millones de has, lo cual representa el 25% de su superficie.
De éstas 848, 839 has son de riego (SAGARPA, 2010), en las que se desarrolla una
agricultura tecnificada, con el uso de gran cantidad de agroquímicos, principalmente
fertilizantes como el amonio y plaguicidas que incluyen herbicidas, insecticidas y
fungicidas (Cifuentes y Gaxiola, 2003). Nuestros resultados sugieren que la
diversidad de los HE del estado ha sido disminuida por la actividad agrícola, pero
también que las zonas no impactadas representan una fuente muy valiosa de HE.
Cuadro 7. Diferencia de medias entre el número de aislamientos respecto al tipo de
suelo del que fueron aislados.
Tukey Media Tipo de suelo
2.2857A 7 No impactado
0.3333B 18 cultivado
Medias con letra diferente son significativamente diferentes.
De los 19 aislamientos de B. bassiana, 15 (78.94%) fueron aislados de suelos
no impactados y solo cuatro (21.05%) de suelos cultivados. En el caso de M.
anisopliae el número de aislamientos fue tres, de los cuales dos fueron aislados de
suelo cultivado y uno de suelo no impactado. Resultados similares fueron obtenidos
por Quesada et al. (2007) y Sánchez et al. (2009), quienes encontraron una mayor
cantidad de aislamientos B. bassiana en suelos no impactados y de M. anisopliae en
suelos agrícolas. Fargues y Robert (1985) y Vanninen (1996) han sugerido que ésto
es debido a que los conidios de M. anisopliae pueden persistir durante más tiempo
sin estar en un huésped que B. bassiana, al cual, la falta de huéspedes susceptibles
en suelos cultivados por el uso de insecticidas reducen su persistencia en estos
suelos. Aparte de esto, los pesticidas también puede tener efectos sobre los HE en el
suelo (Mietkiewski et al., 1997). Estudios sugieren que algunos especies de hongos
son más tolerantes a los plaguicidas que otros y se considera que M. anisopliae es
más tolerante a los pesticidas que B. bassiana, lo cual también podría explicar por
qué el primero es más común en hábitats cultivados. Ésta hipótesis, sin embargo,
requieren de mayor investigación (Quesada et al., 2007).
44
Del total de 22 aislamientos, 16 (72.72%) fueron obtenidos a partir de suelo
muestreado en invierno. Mientras que 6 (27.27%) fueron obtenidos a partir de suelo
muestreado en verano (Cuadro 8). De acuerdo a reportes de la INEGI (2011) Sinaloa
registra una temperatura media anual de 25 °C, pero en verano las temperaturas
máximas promedio pueden superar los 36 °C. Dicha temperatura podría estar
afectando las estructuras de resistencia de los hongos entomopatógenos, lo cual
posiblemente explica por qué se encontró mayor cantidad de HE en invierno donde
las temperaturas mínimas promedio son de 10.5 °C.
Cuadro 8. Temporada del año a partir del cual se realizaron los aislamientos.
Clave Aislamiento Muestreo 1.
Invierno 2011
Muestreo 2.
Verano 2011
B1 B. bassiana X
B2 B. bassiana X
B3 B. bassiana X
B4 B. bassiana X
B5 B. bassiana X
B6 B. bassiana X
B7 B. bassiana X
B8 B. bassiana X
B9 B. bassiana X
B10 B. bassiana X
B11 B. bassiana X
B12 B. bassiana X
B13 B. bassiana X
B14 B. bassiana X
B15 B. bassiana X
B16 B. bassiana X
B17 B. bassiana X
B18 B. bassiana X
B19 B. bassiana X
M1 M. anisopliae X
M2 M. anisopliae X
M3 M. anisopliae X
45
7.5. Relación entre aislamientos encontrados y pH, textura y M.O.
El intervalo de pH de los suelos muestreados varió de 5.8 a 7.4, mientras que
el valor de porcentaje de materia orgánica más bajo fue de 0.53 y el más alto de
2.82. La textura predominante fue arcillosa (Cuadro 9).
Los HE fueron aislados en suelo con un intervalo de pH de 5.8 a 6.9, es decir,
ligeramente ácidos. Este resultado concuerda con la premisa de que, en general, los
hongos son más tolerantes a la acidez que a la alcalinidad (Foth, 1984).
Respecto a materia orgánica los HE se encontraron en un intervalo variado de
0.94 a 2.63%, sin embargo el 72.72% se encontró en suelos con M.O. arriba del 2%.
Esto concuerda con lo reportado por Quesada et al. (2007), Milner (1989) y
Mietkiewski et al. (1997) quienes encontraron mayor número de aislamientos en
suelo con mayor contenido de M.O.; esto debido posiblemente a la alta capacidad de
intercambio catiónico en suelos con mayor contenido de materia orgánica lo que
mejora la adsorción de conidios fúngicos y a que en suelos con mayor contenido de
M.O. existe más diversidad y abundancia de artrópodos, los cuales son hospederos
de estos hongos (Ignoffo et al., 1977; Inglis et al., 2001; Klingen y Haukeland, 2006).
El 81.81% de los HE fueron aislados en suelo franco-arenoso, 9.09% en suelo
franco-arenoso-arcilloso y 9.09% en suelo arcilloso. Los suelos francos son
considerados los mejores suelos ya que contienen cantidades equilibradas de las
diferentes partículas (arena, limo y arcilla) lo que le da una mejor estructura al suelo
donde estos hongos pueden adherirse a los conglomerados de partículas evitándose
su lixiviación y daño de las estructuras (Storey y Gardner, 1987).
46
Cuadro 9. Parámetros físico químicos del suelo.
Municipio
Sitio
Localidad
Ecosistema
Análisis de suelo
pH M.O. Textura
Ahome 1 El Carrizo Agroecosistema 7.0 1.21 Arcilloso
2 El Carrizo Agroecosistema 7.1 1.34 Arcilloso
3 Camayeca Agroecosistema 7.1 1.07 Arcilloso
4 Ej. La arrocera Agroecosistema 6.6 1.34 Arcilloso
5 Ej. Echeverria Agroecosistema 6.4 0.94 Arcilloso
El Fuerte 6 Capomos Selva* 6.7 1.34 Franco-arenoso
7 Jahuara Agroecosistema 7.3 1.07 Arcilloso
8 Jahuara Agroecosistema 7.4 1.21 Arcilloso
9 Charay Agroecosistema 7.2 1.21 Franco-arena-arcilloso
10 Constancia Agroecosistema 5.7 1.61 Franco-limo-arcilloso
Choix 11 El Vado Selva* 6.6 2.15 Franco-arenoso
12 El Guayabito Selva* 6.4 2.63 Franco-arenoso
13 Bajosori Agroecosistema 6.3 1.88 Franco-arenoso
14 Colexio Selva* 6.5 2.09 Franco-arenoso
15 Colexio Agroecosistema 6.4 2.82 Franco-arenoso
Guasave 16 La Cofradia Agroecosistema 6.3 0.94 Franco-arenoso
17 Buenos A. Agroecosistema 6.5 1.34 Arcillo-limoso
18 Cortines Agroecosistema 6.9 1.34 Arcilloso
19 Calle II Agroecosistema 7.2 1.88 Arcilloso
20 La uva Selva* 6.9 2.36 Franco-arenoso
Sinaloa de
Leyva
21 Cubiri de la L Agroecosistema 6.5 1.34 Arcilloso
22 El Opochi Agroecosistema 7 2.22 Franco-arcilloso
23 Bacubirito Selva* 6.6 2.37 Franco-arenoso
24 Burague Agroecosistema 6.3 0.53 Franco
25 Porohui Selva* 5.8 2.22 Franco-arenoso-arcilloso
*Selva baja caducifolia.
47
VIII. CONCLUSIONES
Las especies Beauveria bassiana y Metarhizium anisopliae se encuentran
presentes en el norte del Estado de Sinaloa.
Se obtuvieron 22 aislamientos de hongos entomopatógenos, de los cuales 19
pertenecen a la especie B. bassiana y tres a M. anisopliae de acuerdo a la
identificación morfológica la cual concuerda con la caracterización molecular a
partir de las regiones ITS.
Hubo mayor presencia de HE en suelos no impactados que en suelos
cultivados en la región norte del Estado de Sinaloa.
El hongo entomopatógeno B. bassiana se encontró en mayor proporción en
suelos no impactados que en suelos cultivados.
M. anisopliae fue encontrado en mayor cantidad en suelos agrícolas, pero el
número de aislamientos fue insuficiente (tres) para concluir acerca de su
presencia en los tipos de suelo estudiados.
48
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57
X. ANEXOS
Anexo 1. Secuencias obtenidas de los 22 aislamientos de hongos entomopatógenos. B1: 545 pb
TCCGTAGGTGTGACCTGCGGAGGGATCATTACCGAGTTTTCAACTCCCTAACCC
TTCTGTGAACCTACCTATCGTTGCTTCGGCGGACTCGCCCCAGCCCGGACGCG
GACTGGACCAGCGGCCCGCCGGGGACCTCAAACTCTTGTATTCCAGCATCTTCT
GAATACGCCGCAAGGCAAAACAAATGAATCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTG
GCTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAACGCGATAAGTAATGTGAATTGCAG
AATCCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGCCAGCATTCTGG
CGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTCAACCCTCGACCTCCCCTTGGGGGGGT
CGGCGTTGGGGACCGGCAGCACACCGCCGGCCCTGAAATGGAGTGGCGGCCC
GTCCGCGGCGACCTCTGCGCAGTAATACAGCTCGCACCGGAACCCCGACGCGG
CCACGCCGTAAAACACCCAACTTCTGAACGTGACCTCGAATCAGGTATACAGTA
CCGTTGAAT
B2: 545 pb
TCCGTAGGTGTGACCTGCGGAGGGATCATTACCGAGTTTTCAACTCCCTAACCC
TTCTGTGAACCTACCTATCGTTGCTTCGGCGGACTCGCCCCAGCCCGGACGCG
GACTGGACCAGCGGCCCGCCGGGGACCTCAAACTCTTGTATTCCAGCATCTTCT
GAATACGCCGCAAGGCAAAACAAATGAATCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTG
GCTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAACGCGATAAGTAATGTGAATTGCAG
AATCCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGCCAGCATTCTGG
CGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTCAACCCTCGACCTCCCCTTGGGGGGGT
CGGCGTTGGGGACCGGCAGCACACCGCCGGCCCTGAAATGGAGTGGCGGCCC
GTCCGCGGCGACCTCTGCGCAGTAATACAGCTCGCACCGGAACCCCGACGCGG
CCACGCCGTAAAACACCCAACTTCTGAACGTGACCTCGAATCAGGTATACAGTA
CCGTTGAAT
58
B3: 542 pb
TCCGTAGGTGAACCTGCGGAGGGATCATTACCGAGTTTTCAACTCCCTAACCCT
TCTGTGAACCTACCTATCGTTGCTTCGGCGGACTCGCCCCAGCCCGGACGCGG
ACTGGACCAGCGGCCCGCCGGGGACCTCAAACTCTTGTATTCCAGCATCTTCTG
AATACGCCGCAAGGCAAAACAAATGAATCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGG
CTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAACGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGA
ATCCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGCCAGCATTCTGGC
GGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTCAACCCTCGACCTCCCCTTGGGGGGGTC
GGCGTTGGGGACCGGCAGCACACCGCCGGCCCTGAAATGGAGTGGCGGCCCG
TCCGCGGCGACCTCTGCGCAGTAATACAGCTCGCACCGGAACCCCGACGCGGC
CACGCCGTAAAACACCCAACTTCTGAACGTGACCTCGAATCTGAGACGCTTATA
GCATGC
B4: 546 pb
TCCGTAGGTGGTGACCTGCGGAGGGATCATTACCGAGTTTTCAACTCCCTAACC
CTTCTGTGAACCTACCTATCGTTGCTTCGGCGGACTCGCCCCAGCCCGGACGC
GGACTGGACCAGCGGCCCGCCGGGGACCTCAAACTCTTGTATTCCAGCATCTTC
TGAATACGCCGCAAGGCAAAACAAATGAATCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTT
GGCTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAACGCGATAAGTAATGTGAATTGCA
GAATCCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGCCAGCATTCTG
GCGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTCAACCCTCGACCTCCCCTTGGGGGGG
TCGGCGTTGGGGACCGGCAGCACACCGCCGGCCCTGAAATGGAGTGGCGGCC
CGTCCGCGGCGACCTCTGCGCAGTAATACAGCTCGCACCGGAACCCCGACGCG
GCCACGCCGTAAAACACCCAACTTCTGAACGTGACCTCGAATCAGGTATACAGT
ACCTAGAAAT
B5: 548 pb
TCCGTAGGGTGAACCTGCGGAGGGATCATTACCGAGTTTTCAACTCCCTAACCC
TTCTGTGAACCTACCTATCGTTGCTTCGGCGGACTCGCCCCAGCCCGGACGCG
GACTGGACCAGCGGCCCGCCGGGGACCTCAAACTCTTGTATTCCAGCATCTTCT
GAATACGCCGCAAGGCAAAACAAATGAATTAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTG
59
GCTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAACGCGATAAGTAATGTGAATTGCAG
AATCCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGCCAGCATTCTGG
CGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTCAACCCTCGACCTCCCCTTGGGGGGGT
CGGCGTTGGGGACCGGCAGCACACCGCCGGCCCTGAAATGGAGTGGCGGCCC
GTCCGCGGCGACCTCTGCGCAGTAATACAGCTCGCACCGGAACCCCGACGCGG
CCACGCCGTAAAACACCCAACTTCTGAACGTGACCTCGAATCAGTCGGACAGTC
CTATATTTTAGC
B6: 547 pb
TCCGTAGGGTGACCTGCGGAGGGATCATTACCGAGTTTTCAACTCCCTAACCCT
TCTGTGAACCTACCTATCGTTGCTTCGGCGGACTCGCCCCAGCCCGGACGCGG
ACTGGACCAGCGGCCCGCCGGGGACCTCAAACTCTTGTATTCCAGCATCTTCTG
AATACGCCGCAAGGCAAAACAAATGAATCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGG
CTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAACGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGA
ATCCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGCCAGCATTCTGGC
GGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTCAACCCTCGACCTCCCCTTGGGGGGGTC
GGCGTTGGGGACCGGCAGCACACCGCCGGCCCTGAAATGGAGTGGCGGCCCG
TCCGCGGCGACCTCTGCGCAGTAATACAGCTCGCACCGGAACCCCGACGCGGC
CACGCCGTAAAACACCCAACTTCTGAACGTGACCTCGAATCAGGTAGACAGTCT
GTCAATGCCCC
B7: 545 pb
TCCGTAGGTGAACCTGCGGAGGGATCATTACCGAGTTTTCAACTCCCTAACCCT
TCTGTGAACCTACCTATCGTTGCTTCGGCGGACTCGCCCCAGCCCGGACGCGG
ACTGGACCAGCGGCCCGCCGGGGACCTCAAACTCTTGTATTCCAGCATCTTCTG
AATACGCCGCAAGGCAAAACAAATGAATCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGG
CTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAACGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGA
ATCCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGCCAGCATTCTGGC
GGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTCAACCCTCGACCTCCCCTTGGGGGGGTC
GGCGTTGGGGACCGGCAGCACACCGCCGGCCCTGAAATGGAGTGGCGGCCCG
TCCGCGGCGACCTCTGCGCAGTAATACAGCTCGCACCGGAACCCCGACGCGGC
60
CACGCCGTAAAACACCCAACTTCTGAACGTGACCTCGAATCAGAGATATTGTATA
ATATAAGG
B8: 545 pb
TCCGTAGGTGAACCTGCGGAGGGATCATTACCGAGTTTTCAACTCCCTAACCCT
TCTGTGAACCTACCTATCGTTGCTTCGGCGGACTCGCCCCAGCCCGGACGCGG
ACTGGACCAGCGGCCCGCCGGGGACCTCAAACTCTTGTATTCCAGCATCTTCTG
AATACGCCGCAAGGCAAAACAAATGAATCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGG
CTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAACGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGA
ATCCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGCCAGCATTCTGGC
GGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTCAACCCTCGACCTCCCCTTGGGGGGGTC
GGCGTTGGGGACCGGCAGCACACCGCCGGCCCTGAAATGGAGTGGCGGCCCG
TCCGCGGCGACCTCTGCGCAGTAATACAGCTCGCACCGGAACCCCGACGCGGC
CACGCCGTAAAACACCCAACTTCTGAACGTGACCTCGAATCAGAGATATTGTATA
ATATAAGG
B9: 548 pb
TCCGTAGGGGGTGACTGCGGAGGGATCATTACCGAGTTTTCAACTCCCTAACCC
TTCTGTGAACCTACCTATCGTTGCTTCGGCGGACTCGCCCCAGCCCGGACGCG
GACTGGACCAGCGGCCCGCCGGGGACCTCAAACTCTTGTATTCCAGCATCTTCT
GAATACGCCGCAAGGCAAAACAAATGAATCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTG
GCTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAACGCGATAAGTAATGTGAATTGCAG
AATCCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGCCAGCATTCTGG
CGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTCAACCCTCGACCTCCCCTTGGGGGGGT
CGGCGTTGGGGACCGGCAGCACACCGCCGGCCCTGAAATGGAGTGGCGGCCC
GTCCGCGGCGACCTCTGCGCAGTAATACAGCTCGCACCGGAACCCCGACGCGG
CCACGCCGTAAAACACCCAACTTCTGAACGTGACCTCGAATCAGGTATACAGTA
CTTGATGCTTGC
61
B10: 548 pb
TCCGTAGGGGGTGACTGCGGAGGGATCATTACCGAGTTTTCAACTCCCTAACCC
TTCTGTGAACCTACCTATCGTTGCTTCGGCGGACTCGCCCCAGCCCGGACGCG
GACTGGACCAGCGGCCCGCCGGGGACCTCAAACTCTTGTATTCCAGCATCTTCT
GAATACGCCGCAAGGCAAAACAAATGAATCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTG
GCTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAACGCGATAAGTAATGTGAATTGCAG
AATCCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGCCAGCATTCTGG
CGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTCAACCCTCGACCTCCCCTTGGGGGGGT
CGGCGTTGGGGACCGGCAGCACACCGCCGGCCCTGAAATGGAGTGGCGGCCC
GTCCGCGGCGACCTCTGCGCAGTAATACAGCTCGCACCGGAACCCCGACGCGG
CCACGCCGTAAAACACCCAACTTCTGAACGTGACCTCGAATCAGGTATACAGTA
CTTGATGCTTGC
B11: 548 pb
TCCGTAGGGGGTGACTGCGGAGGGATCATTACCGAGTTTTCAACTCCCTAACCC
TTCTGTGAACCTACCTATCGTTGCTTCGGCGGACTCGCCCCAGCCCGGACGCG
GACTGGACCAGCGGCCCGCCGGGGACCTCAAACTCTTGTATTCCAGCATCTTCT
GAATACGCCGCAAGGCAAAACAAATGAATCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTG
GCTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAACGCGATAAGTAATGTGAATTGCAG
AATCCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGCCAGCATTCTGG
CGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTCAACCCTCGACCTCCCCTTGGGGGGGT
CGGCGTTGGGGACCGGCAGCACACCGCCGGCCCTGAAATGGAGTGGCGGCCC
GTCCGCGGCGACCTCTGCGCAGTAATACAGCTCGCACCGGAACCCCGACGCGG
CCACGCCGTAAAACACCCAACTTCTGAACGTGACCTCGAATCAGGTATACAGTA
CTTGATGCTTGC
B12: 548 pb
TCCGTAGGGGGTGACTGCGGAGGGATCATTACCGAGTTTTCAACTCCCTAACCC
TTCTGTGAACCTACCTATCGTTGCTTCGGCGGACTCGCCCCAGCCCGGACGCG
GACTGGACCAGCGGCCCGCCGGGGACCTCAAACTCTTGTATTCCAGCATCTTCT
GAATACGCCGCAAGGCAAAACAAATGAATCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTG
62
GCTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAACGCGATAAGTAATGTGAATTGCAG
AATCCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGCCAGCATTCTGG
CGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTCAACCCTCGACCTCCCCTTGGGGGGGT
CGGCGTTGGGGACCGGCAGCACACCGCCGGCCCTGAAATGGAGTGGCGGCCC
GTCCGCGGCGACCTCTGCGCAGTAATACAGCTCGCACCGGAACCCCGACGCGG
CCACGCCGTAAAACACCCAACTTCTGAACGTGACCTCGAATCAGGTATACAGTA
CTTGATGCTTGC
B13: 548 pb
TCCGTAGGGGGTGACTGCGGAGGGATCATTACCGAGTTTTCAACTCCCTAACCC
TTCTGTGAACCTACCTATCGTTGCTTCGGCGGACTCGCCCCAGCCCGGACGCG
GACTGGACCAGCGGCCCGCCGGGGACCTCAAACTCTTGTATTCCAGCATCTTCT
GAATACGCCGCAAGGCAAAACAAATGAATCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTG
GCTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAACGCGATAAGTAATGTGAATTGCAG
AATCCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGCCAGCATTCTGG
CGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTCAACCCTCGACCTCCCCTTGGGGGGGT
CGGCGTTGGGGACCGGCAGCACACCGCCGGCCCTGAAATGGAGTGGCGGCCC
GTCCGCGGCGACCTCTGCGCAGTAATACAGCTCGCACCGGAACCCCGACGCGG
CCACGCCGTAAAACACCCAACTTCTGAACGTGACCTCGAATCAGGTATACAGTA
CTTGATGCTTGC
B14: 544 pb
TCCGTAGGGGGTGTCCTGCGGAGGGATCATTACCGAGTTTTCAACTCCCTAACC
CTTCTGTGAACCTACCTATCGTTGCTTCGGCGGACTCGCCCCAGCCCGGACGC
GGACTGGACCAGCGGCCCGCCGGGGACCTCAAACTCTTGTATTCCAGCATCTTC
TGAATACGCCGCAAGGCAAAACAAATGAATTAAAACTTTCAACAACGGATCTCTT
GGCTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAACGCGATAAGTAATGTGAATTGCA
GAATCCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGCCAGCATTCTG
GCGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTCAACCCTCGACCTCCCCTTGGGGGGG
TCGGCGTTGGGGACCGGCAGCACACCGCCGGCCCTGAAATGGAGTGGCGGCC
CGTCCGCGGCGACCTCTGCGCAGTAATACAGCTCGCACCGGAACCCCGACGCG
63
GCCACGCCGTAAAACACCCAACTTCTGAACGTGACCTCGAATCATGTCTACAGA
ATCTTAAC
B15: 545 pb
TCCCGTAGGTGTTGACCTGCGGAGGGATCATTACCGAGTTTTCAACTCCCTAAC
CCTTCTGTGAACCTACCTATCGTTGCTTCGGCGGACTCGCCCCAGCCCGGACGC
GGACTGGACCAGCGGCCCGCCGGGGACCTCAAACTCTTGTATTCCAGCATCTTC
TGAATACGCCGCAAGGCAAAACAAATGAATTAAAACTTTCAACAACGGATCTCTT
GGCTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAACGCGATAAGTAATGTGAATTGCA
GAATCCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGCCAGCATTCTG
GCGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTCAACCCTCGACCTCCCCTTGGGGGGG
TCGGCGTTGGGGACCGGCAGCACACCGCCGGCCCTGAAATGGAGTGGCGGCC
CGTCCGCGGCGACCTCTGCGCAGTAATACAGCTCGCACCGGAACCCCGACGCG
GCCACGCCGTAAAACACCCAACTTCTGAACGTGACCTCGAATCAGTATACAGTC
ACGAGCAC
B16: 545 pb
TCCCGTAGGTGTTGACCTGCGGAGGGATCATTACCGAGTTTTCAACTCCCTAAC
CCTTCTGTGAACCTACCTATCGTTGCTTCGGCGGACTCGCCCCAGCCCGGACGC
GGACTGGACCAGCGGCCCGCCGGGGACCTCAAACTCTTGTATTCCAGCATCTTC
TGAATACGCCGCAAGGCAAAACAAATGAATTAAAACTTTCAACAACGGATCTCTT
GGCTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAACGCGATAAGTAATGTGAATTGCA
GAATCCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGCCAGCATTCTG
GCGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTCAACCCTCGACCTCCCCTTGGGGGGG
TCGGCGTTGGGGACCGGCAGCACACCGCCGGCCCTGAAATGGAGTGGCGGCC
CGTCCGCGGCGACCTCTGCGCAGTAATACAGCTCGCACCGGAACCCCGACGCG
GCCACGCCGTAAAACACCCAACTTCTGAACGTGACCTCGAATCAGTATACAGTC
ACGAGCAC
64
B17: 546 pb
TCCGTAGGGTGAACCTGCGGAGGGATCATTACCGAGTTTTCAACTCCCTAACCC
TTCTGTGAACCTACCTATCGTTGCTTCGGCGGACTCGCCCCAGCCCGGACGCG
GACTGGACCAGCGGCCCGCCGGGGACCTCAAACTCTTGTATTCCAGCATCTTCT
GAATACGCCGCAAGGCAAAACAAATGAATCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTG
GCTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAACGCGATAAGTAATGTGAATTGCAG
AATCCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGCCAGCATTCTGG
CGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTCAACCCTCGACCTCCCCTTGGGGGGGT
CGGCGTTGGGGACCGGCAGCACACCGCCGGCCCTGAAATGGAGTGGCGGCCC
GTCCGCGGCGACCTCTGCGCAGTAATACAGCTCGCACCGGAACCCCGACGCGG
CCACGCCGTAAAACACCCAACTTCTGAACGTGACCTCGAATCAGCGACAGTATA
TGATTAGCAG
B18: 546 pb
TCCGTAGGTGAACCTGCGGAGGGATCATTACCGAGTTTTCAACTCCCTAACCCT
TCTGTGAACCTACCTATCGTTGCTTCGGCGGACTCGCCCCAGCCCGGACGCGG
ACTGGACCAGCGGCCCGCCGGGGACCTCAAACTCTTGTATTCCAGCATCTTCTG
AATACGCCGCAAGGCAAAACAAATGAATCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGG
CTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAACGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGA
ATCCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGCCAGCATTCTGGC
GGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTCAACCCTCGACCTCCCCTTGGGGGGGTC
GGCGTTGGGGACCGGCAGCACACCGCCGGCCCTGAAATGGAGTGGCGGCCCG
TCCGCGGCGACCTCTGCGCAGTAATACAGCTCGCACCGGAACCCCGACGCGGC
CACGCCGTAAAACACCCAACTTCTGAACGTGACCTCGAATCAGAGACAGATAAT
ATTTAGCAAG
B19: 546 pb
TCCGTAGGTGAACCTGCGGAGGGATCATTACCGAGTTTTCAACTCCCTAACCCT
TCTGTGAACCTACCTATCGTTGCTTCGGCGGACTCGCCCCAGCCCGGACGCGG
ACTGGACCAGCGGCCCGCCGGGGACCTCAAACTCTTGTATTCCAGCATCTTCTG
AATACGCCGCAAGGCAAAACAAATGAATCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGG
65
CTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAACGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGA
ATCCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGCCAGCATTCTGGC
GGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTCAACCCTCGACCTCCCCTTGGGGGGGTC
GGCGTTGGGGACCGGCAGCACACCGCCGGCCCTGAAATGGAGTGGCGGCCCG
TCCGCGGCGACCTCTGCGCAGTAATACAGCTCGCACCGGAACCCCGACGCGGC
CACGCCGTAAAACACCCAACTTCTGAACGTGACCTCGAATCAGAGACAGATAAT
ATTTAGCAAG
M1: 543 pb
TCGTAATGATCTCTCTATGGTGATCTGCTGCGGGAACTTAACCGAGTTATCCAAC
TCACAACACGTGTGAATCATACATTTAATTGTTGTTTCGGCGGGAGTTCGCGCCC
GCCGGGGACCCAAACCTTCTGAATTTTTTAATAAGTATCTTCTGAGTGGTTAAAA
AAAATGAATCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAA
CGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGCGAATCATCGAATC
TTTGAACGCACATTGCGCCCGTCAGTATTCTGGCGGGCATGCCTGTTCGAGCGT
CATTACGCCCCTCAAGTCCCCTGTGGACTTGGTGTTGGGGATCGGCGAGGCTG
GTTTTCCAGCACAGCCGTCCCTTAAATTAATTGGCGGTCTCGCCGTGGCCCTCC
TCTGCGCAGTAGTAAAGCACTCGCAACAGGAGCCCGGCGCGGTCCACTGCCGT
AAAACCCCCCAACTTTTTATAGTGACCTCGAATCAGTAGACAGTGGAGCTGCAC
M2: 548 pb
TCCGGTAATGATTTTTCGTAGGGGGGTGCTGCGGAGGGATCATTACCGAGTTAT
CCAACTCCCAACCCCTGTGAATCATACCTTTAATTGTTGCTTCGGCGGGACTTCG
CGCCCGCCGGGGACCCAAACCTTCTGAATTTTTTAATAAGTATCTTCTGAGTGGT
TAAAAAAAATGAATCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATG
AAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATC
GAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGTCAGTATTCTGGCGGGCATGCCTGTTCG
AGCGTCATTACGCCCCTCAAGTCCCCTGTGGACTTGGTGTTGGGGATCGGCGA
GGCTGGTTTTCCAGCACAGCCGTCCCTTAAATTAATTGGCGGTCTCGCCGTGGC
CCTCCTCTGCGCAGTAGTAAAGCACTCGCAACAGGAGCCCGGCGCGGTCCACT
66
GCCGTAAAACCCCCCAACTTTTTATAGTGACCTCGAATCAGGTAGGACAGTATTT
TTCAT
M3: 540 pb
TCCGTAGGTGACCTGCGGAGGGATCATTACCGAGTTATCCAACTCCCAACCCCT
GTGAATCATACCTTTAATTGTTGCTTCGGCGGGACTTCGCGCCCGCCGGGGACC
CAAACCTTCTGAATTTTTTAATAAGTATCTTCTGAGTGGTTAAAAAAAATGAATCA
AAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAAT
GCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCAC
ATTGCGCCCGTCAGTATTCTGGCGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTACGCCCC
TCAAGTCCCCTGTGGACTTGGTGTTGGGGATCGGCGAGGCTGGTTTTCCAGCAC
AGCCGTCCCTTAAATTAATTGGCGGTCTCGCCGTGGCCCTCCTCTGCGCAGTAG
TAAAGCACTCGCAACAGGAGCCCGGCGCGGTCCACTGCCGTAAAACCCCCCAA
CTTTTTATAGTGACCTCGAATCAGTCGACAGATATCTTACAATGTGCAGAG