Inmunohistoquímica: cómo se hace, en qué tipo de muestra y qué

podemos detectar

María D. Lozano Departamento de Anatomía Patológica. CUN

Diagnóstico anatomopatológico del cáncer de pulmón.

Morfología

Inmunohistoquímica: Expresión de proteínas por las células tumorales

Análisis molecular: alteraciones genéticas relacionadas con respuesta a determinados fármacos

Retos actuales en el diagnóstico del cáncer de pulmón

- Rápidos avances (diagnóstico y tratamientos)- 70% diagnóstico avanzado- Diagnósticos mas completos y complejos- Técnicas minimammente invasivas.- Optimización del material

- Muestras de citología/biopsia pequeña para diagnóstico y biomarcadores

Vías de abordaje para PAAF/Bx pulmón y mediastino

EUS-FNA EBUS-TBNA

EUS-FNA o EBUS-TBNA

CT-FNA

EMN-TBNA

Un porcentaje importante del cáncer de pulmón ( y otros tipos) se diagnostican mediante procedimientos mínimamente invasivos de los que obtenemos “muestras pequeñas”

“Cytopathology; doing more with less……”

Tamura et al Clin Endosc 2017Schacht et al Cytopathology 2016Mfokazi et al Diagn Cytopathol 2016Jain et al Virchows Archives 2018

Primer biomarcador: correcto diagnóstico morfológico

NSCLC-NOS

¿Cómo hacer que TODOS los pacientes con CPNM se

puedan beneficiar de las terapias efectivas?

Muestra adecuada

➢ Diagnóstico morfológico preciso.

➢ Determinación de biomarcadores

¿Cómo podemos mejorar la precisión en el diagnóstico del cáncer de pulmón con pequeñas muestras?

“ROSE” : Rapid On Site Evaluation

“Cytopathology; doing more with less……”

Importancia de la PreanalÍtica

Tamura et al Clin Endosc 2017Schacht et al Cytopathology 2016Mfokazi et al Diagn Cytopathol 2016

Podemos preservar la arquitectura de las muestras?

NGN: “Next Generation Needles”

1- Paaf con control in situ2- Obtención de microcilindro3- Control in situ de los restos de la aguja

PAAF con aspiración húmeda (wet suction)

1- PAAF con control in situ2- PAAF húmeda y Obtención de microcilindro

NGP: “Next Generation Procedures”

Ejemplos:

✓ Combinar la información de citología (alcohol) y parafina (Formol)

✓ Elegir la muestra más adecuada para cada técnica, ej: IHQ-cilindro / FISH-extensión citológica

✓ Ensayos clínicos✓ Estudios moleculares complejos ✓ Microambiente inmune✓ ………

PAS stain

IHQ en cancer de pulmón:- Ayuda en el dco.

morfológico (tipificación de subtipos morfológicos)

- Biomarcadores

Adenocarcinoma Squamous cell carcinoma

TTF-1CK7CK19

P63/p40CK5/634BE12 CD44v6Thrombomodulin

Useful immunocytochemical markers in the differentiation of NSCLC

▪ Immunocytochemistry: Tumor cells express some proteins that help to characterize those tumors

TTF-1 CK-7

p40

TTF-1

Adenocarcinoma

SqCC

•Woman 72 years old, non-smoker

•Disseminated disease (unknown origin )

•Brain Metastases

•He had been offered only palliative treatment

TTF-1

CK-7

Superficial FNA of a supraclavicular lymph node

Metastatic AC of lung origin

TTF-1 + / p40 -TTF-1

JI Echeveste, T Labiano, E Tejerina, A Argueta, C De Andrea, MD Lozano

J. Mol. Pathol. 2021, 2(2), 55-65; https://doi.org/10.3390/jmp2020006

ALKAnaplastic lymphoma kinase (ALK) rearrangements are present in 2–5% of advanced NSCLCs

▪ IHC is an equivalent alternative to FISH. ▪ Can be applied to different biological specimens, such as biopsies or cytological samples. Its use in

cytology smears is quite controversial, although recent studies have proven the suitability of the method.

▪ The most commonly used antibodies are D5F3 (Ventana ALK [D5F3] CDx Assay, Tucson, Arizona, USA)

and 5A4 (Novocastra, Leica Biosystems, Buffalo Grove, Illinois, USA),

Garrido et al. Clin Translational Oncol 2019 Lozano et al. Arch Pathol Lab Med 2018

Case 1.ALK (D5F3)Cellblock

Dpto. Anatomía Patológica. CUN. Pamplona

Case 2 ALK (D5F3). Papanicopau stained smear.

Dpto. Anatomía Patológica. CUN. Pamplona

Citología y PDL-1• Más del 50% de todos los carcinomas pulmonares avanzados se diagnostican sólo

por citología

• El uso de muestras citológicas sólo para determinación de PD-L1 no ha sidocontemplado– Sin embargo, no hay nada desde el punto de vista técnico en contra

– Otros ACs están validados………………………

• Existen datos en la literatura acerca de la utilidad de la citología para el diagnóstico de PD-L1

1. Estado Actual

Dpto. Anatomía Patológica. CUN. Pamplona

Problemas preanalíticos y analíticos con PDL-1

✓Múltiples anticuerpos y plataformas. Variables preanalíticas

✓Definición de puntos de corte para resultados positivos y negativos / alta expresión versus baja expresión

✓Heterogeneidad intratumoral

✓ Tipos de muestras. Variables preanalíticas

Llie et al, Virchows Arch 2016Laurence et al, Biomark res 2017Kerr and Hirsch, Arch Pathol Lab Med 2016

Como se interpreta?: inmunorreactividad de membrana citoplasmática parcial o total de cualquier intensidad. (Tener en cuenta la tridimensionalidad de las extensions citológicas)

Determinación de PDL-1 mediante inmunocitoquímica: Criterios de interpretación

Lozano et al. Cancer Cytopathol 2019Lozano et al. Virchows Archives 2019Echeveste et al. J Mol Pathol 2021

Peculiaridades de PDL-1

• Detallar tipo de muestra citológica (citología-bloque, extension), el clon usado y los controles utilizados

• Al menos 100 células tumorales evaluables

• Importantísimo: Preanalítica

Lozano et al. Cancer Cytopathol 2019Lozano et al. Virchows Archives 2019Echeveste et al. J Mol Pathol 2021

Bloque celular

Extensiones citológicas

Preanalytical Factors

Fixatives

Preparations

Coverslipping and mounting media

Stains

Antigen retrieval

Antigen retrievalIn contrast to formalin, which is a cross‐linking fixative that masks most epitopes, alcohol‐based fixatives work by causing tissue dehydration and protein coagulation. Thus, the majority of cytoplasmic and membranous antigens do not require any form of antigen retrieval for ICC.

StainsPapanicolaou

Jain et al Cancer Cytopathol 2019

Coverslipping and mounting mediathe prestained slides of non‐CB cytology need to be soaked in xylene to dissolve the nonaqueous permanent mounting media and remove the coverslip.

Plastic coverslipping

Pre-analytical variables for IHC

➢ Ischemia type,➢ Fixative type nd fixative time, ➢ Archive conditions➢ Age of archival material➢ Antigen retrieval and detection systems➢ Time from sample procurement to the inititation of fixation (as short as possible)➢ Neutral buffered formalin (6-48 h)

❑ Rigorous validation and protocol optimization should be performed in each laboratory that performs IHC on cytology specimens (e.g., alcohol-fixed cell blocks, air-dried smears, formalin-post fixed specimens)

Fitzgibbons et al 2014Mino-Kenudson 2017

Conclusions✓ Cytology specimens are undoubtedly underutilized for predictive ICC testing.✓ With most laboratories (especially in the United States) restricting ICC to only CB

preparations, a significant proportion of non‐CB preparations that are more versatile and easily available remain unused.

✓ One of the main factors discouraging ICC on these preparations is due to practical difficulties in standardization.

✓ Based on our experience and a review of the literature, it is clear that with proper optimization and rigorous quality control, high‐quality staining can be achieved on non‐CB preparations.

Gracias !!