inmunohistoquímica parte1

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TÉCNICAS INMUNOHISTOQUÍMICAS

Author: macarena-aguilera

Post on 04-Nov-2015

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Resumen

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celulares, a través de anticuerpos  especícos + sistema de detección
en!im"tico
INMUNOHISTOQUÍ MICA
#enta$as% Conserva las relaciones entre los componentes de estudio Permite la identifcación ceuar En el "m&ito 'nmunocitoquímico, permiten precisar el dia(n)stico en un *+ de los casos
 
A#ANCE '45 %
&' (isponi$iidad de %ran n) de Ac *ue uncionan en parafna'
,' (esarroo de t-cnicas de recuperación A%# as. se o$tienen resutados fa$es en te/ido f/ados e incrementó a sensi$iidad'
0' Aparecen sistemas de detección mu1 sensi$es'
 
ANT67ENO
Se denomina así a a sustancia *ue se *uiere detectar en una secci)n tisular o -rotis/ Act8a como sustancia e9tra:a
cuando es in;ectado a un animal de e9perimento
67ÍTO76 O (6T68MINANT6
ANTI9ÉNICO2 <proteicos= induce a respuesta inmune, por lo que es
 
,' (iscontinuos2 :conormacionaes; secuencias aminoacídicas distante, puestas en contacto por el ple(amiento con-ormacional
HA7T6NOS2 moléculas de pe*ue5o tama5o <@3a=# incapaces de inducir una respuesta inmune' Para adquirir car"cter
 
ANT67ENO
7eneralmente proteínas que son los inmun)(enos m"s potentes, pero tam&ién pueden ser lípidos, polisac"ridos e
incluso "cidos nucleicos/ Es reconocido por un paratopo 
ES5UEA 3E EP6TOPE CONT'NUO
ES5UEA 3E EP6TOPE 3'SCONT'NUO
 
 Tam&ién denominados 'nmuno(lo&ulinas, son (licoproteínas sinteti!adas por las células plasm"ticas
F pares de cadenas polipeptídicas
idénticas
épsilon, mu= <MM
 
E
olécula de '( con e9tremo car&o9ilo <re%ión
constante; ; amino terminal <re%ión varia$e=
 
en!ima proteolítica papa.na (enera% F
-ra(mentos especícos de uni)n al antí(eno%
&' <a$ :anti%en $indin%; ,' <c :ra%mento cristai4a$e;% com8n
en todos os individuos de a misma especie'
 
-ra(mento 1c un ra%mento $ivaente de
uni)n al A( 2 <:a$=;, el cual se emplea en ve! del
anticuerpo completo cuando se quiere evitar 1c en la
cadena de detecci)n
ANT'CUE2PO
Los Ac empleados en '45 son (eneralmente '(7 <3a= ; pocas veces '( <3a=/
'(A% -orma dímeros '(% -orma pent"meros (randes <se unen moléculas de '(=
Las '(s pueden actuar como A( mediante el -ra(mento 1c, de esta
-orma permiten la uni)n de un anticuerpo 
secundario
')nica s
Ac ; ne(ativas en el A(
Puentes de Didr)(eno 'nteracciones Didro-)&icas
1uer!as de van der Qaals
 
reversi&le, por lo que puede disociarse durante los lavados/
Se (enera una reacci)n de equili&rio%
A( R Ac A(Ac
Afnidad2 (rado de complementariedad entre paratopo ; epítope ; su -uer!a de uni)n/
 
 T'POS 3E ANT'CUE2POS
MONOC>ONA>6S2
 Técnica de 3i$ridoma  <Dler ; ilstein=/ O&$% o&tener Ac de especicidad denida ilimitado/
7O>IC>ONA>6S2
 
 
@enta/as2 la me!cla de varias '(s Dar" que el Ac policlonal presente (ran avide4 por el A(/ Alta sensi$iidad poco pro&a&le que ocurra un -also ne(ativo= 
(esventa/as2 presentan un amplio ran(o de especifcidad, pueden dar ori(en a reacciones cru!adas/ Pro&lemas de reproduci$iidad/ (isponi$iidad limitada/
Lue(o de aislar la célula Di&ridada, se de$ar" en cultivo celular para compro&ar especicidad ; anidad del Ac/
Cultivo% in vitro <a partir del so&renadante= o in vivo <e9traer del mismo
animal=/
 
comerciales de&ería incluir la
si(uiente in-ormaci)n%
con peque:o ; (ran aumento=
esperado en Qestern Blot
3esaparici)n de tinci)n tras
 
décit e la proteína
Patr)n de tinci)n idénticos para Ac contra di-erentes
epítope de la misma proteína
 
3'LUC'GN
Ac comerciales% presentaci)n como iofi4ado :orma .*uida &u o &m;# de&en reconstituirse con 4FO destilada ' 7eneralmente est"n diluidos en tamp)n con p4 pr)9imo al siol)(ico <no se recomienda PBS, puesto que incrementa tinci)n inespecíca=/
Tampón% "cida s)dica <NaN0=% evita el crecimiento &acteriano deter(ente <Teen=% -acilita la penetraci)n del Ac al&8mina sérica &ovina <=% evita reactividad inespecíca e inDi&e Ac anti.al&umina
 Título% <concentraci)n a&soluta de Ac monoclonal= se mide en u( o m( por mL, para Ac policlonal se utili!a u( de A( precipitado por mL de antisuero/
 
Anticuerpos la se:al disminu;e o incluso puede ser
inDi&ida
 
La cantidad de ANT'CUE2POS a tomar para una determinada diluci)n nal de tra&a$o se o&tiene%
#ol/ Ac% diluci)n inicial 9 vol/ 1inal
 WWWWWWWWWWWWWWWWWWWWWWWW    diluci)n nal
 
'nXu;e en la reacci)n A(.Ac <temperatura ; tiempo=
/  Tiempo% se puede de$ar incu&ando toda la nocDe <+Drs/= ; así aumentar la diluci)n ; economi!ar Ac/ 4a&itualmente se incu&a por Dora/
F/  Temperatura% a 0*>C permite acelerar la reacci)n ; aumentar la se:al usando c"mara D8meda/ Se suele incu&ar a T> am&iente
Lue(o de cada etapa se de&e lavar para remover moléculas que se Dan unido inespecícamente
CBmara 3meda2 se usa para incu$aciones ar%as'
 
ALACENA'ENT O
Anticuerpos iofi4ados2 no 3a1 pro$ema de conservación' Amacenamiento2 )C :meses; o con%eados E,)CEJ)C :a5os;'
6vitar proceso de con%eaciónE descon%eación# puesto *ue pueden aterar a estructura de Ac' 7roceso2
&' (iuir en a.cuota e Ac
,' Me4car e Ac con %icero :disminu1e punto de con%eación;
7ara comprar Ac considerar2 resutados# mBs recuente empeado# *ue
uedan ser usados en a
 
 Tipo de Ac, especie que se o&tuvo
2eactividad interespecie
 
 T'PO 3E UEST2AS
CULT'#O CELULA2 •onocapa cultivado so&re porta o cu&reo&$eto
12OT'S
C'TOLO76A EN ONOCAPA EN E3'O L65U'3O
BLO5UES CELULA2ES
'NCLUS'GN EN PA2A1'NA
O&$etivo% detener meta&olismo celular, inactivar en!imas lisos)micas ; eliminar microor(anismos/ Proceso irreversi&le/
Par"metros a considerar% p4
muestra  Tama:o de la muestra
 
do. 7lutaraldeDído
• Carno; • etacarn
<metanol. carno;=
P2OTOCOLO 3E 1'ZAC'GN
&' MU6ST8AS CITO>K9ICAS2 etano G) por , min' a temperatura am$iente' Se pueden de/ar as muestras en aco3o'
 
CON96>ACIKN • 1i$aci)n -ísica/ Aumenta la sensi&ilidad, pero disminu;e la mor-olo(ía • 78INCI7IO2 El -río provoca la detenci)n de procesos &iol)(icos
A96NT6S C8IO9ÉNICOS • Nitr)(eno líquido <.+>C=% no usar (uantes, ni recipientes Derméticos/ • 'sopentano <F.metil&utano= en-riado en nitr)(eno líquido a .+>C o &a:o isotérmico .>C/ Es inXama&le
78OTOCO>O (6 CON96>ACIKN • Con(elaci)n en isopentano por min <evitar contacto
directo de las muestras=
A>MAC6NAMI6NTO (6 MU6ST8AS • .+>C <nitr)(eno líquido=/ • .F o .?>C <con(elador=
S6CCIKN • Cortes a micras ; portao&$etos con polilisina <car(a=/
Los cortes se (uardan a .F o .?>C
 
3ES4'32ATAC'GN •AlcoDoles crecientes
ACLA2A'ENTO •3isolvente del medio de inclusi)n que se me!cle con el alcoDol
'NCLUS'GN •Parar de material semilíquido a s)lido <punto de -usi)n +>C=
SECC'GN •Cortes de M micras, evitar cualquier plie(ue/
•Se secan a +>C Dora o M>C toda la nocDe
3ESPA2A1'NA3O [ 4'32ATAC'GN
•Pasos por 9ilol •AlcoDoles decrecientes
 
Almacenar los cortes a .F>C
 
SECC'GN PO2 #'B2_TOO
Cortes o&tenidos por vi&raci)n transversal de la cucDilla/ <utili!ado m"s en% cere&ro=/
Necesita &uena $aci)n ; muestras no mu; (ruesas
El portamuestras con la pie!a adDerida se sumer(e en tamp)n -os-ato, las secciones individuales se reco(en con pincel ; se procesa por Xotaci)n/
@6NTAAS2
,' No empea atas t)# ni *u.micos a%resivos
0' Menor arteacos
,' Secciones mBs %ruesas# menor ad3esión a portao$/etos
0' Incu$aciones mBs ar%as