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III. HEMOSTASIA PRIMARIA
Alteraciones plaquetariasBioq. Esp. Claudia Patricia Serrano
Alteraciones plaquetariasEvaluación
Recuento de plaquetasRecuento de plaquetas-anticoagulante: EDTA -material adecuado: tubos de polipropileno, vidrio siliconado-toma de muestra adecuada: evitar ruptura de tejido
Métodos manuales-sangre entera: oxalato de amonio 1% (vn: 150-400x103/mm3)-plasma rico en plaquetas: EDTA 2% (vn: 300-800x103/mm3)
Contadores hematológicos
Es conveniente observar un frotis de sangre periférica dondese evaluará número, forma y tamaño plaquetario.
IMPEDANCIAEnfoque hidrodinámico
Recuento de plaquetas
Recuento de plaquetas
Alteraciones plaquetariasEvaluación
Recuento de plaquetas
Trombocitopenia TrombocitosisRecuento normal
Búsqueda de causasde trombocitopenia
Búsqueda de causas
de trombocitosis, y alteraciones cualitativas asociadas
Prueba global de la hemostasia primaria.
Es la única prueba que evalúa las interacciones plaquetas pared-vascular “in vivo”
Es función de la cantidad y calidad funcional de las plaquetas, de la cantidad y calidad funcional de vWF y de
la calidad del colágeno.
Duke vn < 2 min
Ivy vn < 4.5 min
Simplate vn < 9.5 minCohibir cuando t > 2 vn
METODOLOGIA DE ESTUDIO DE LA FUNCION PLAQUETARIA
Tiempo de sangría
Tiempo de sangría
TS:
sensibilidad - especificidad - reproducibilidad
Afectado por: frío, ejercicio, ansiedad, presión del corte, dirección de la incisión, “barrido” excesivo
ADHESIVIDAD
PLAQUETA SUPERFICIE
•In Vivo : Borchgrevink (Acta Med Scand 1960, 168:157)
•In Vitro : Mann (colágeno)
Hellem II (superficie de vidrio)Scand J Haemat 1970, 7: 37
vW
METODOLOGIA DE ESTUDIO DE LA FUNCION PLAQUETARIA
columna cp
•Sangre entera
•Columna: tubuladura de PVP 3mm diámetro, rellena con perlas de vidrio de 0.5mm diámetro, 1.3 g por columna.
•Bomba de flujo constante: velocidad 1ml/ 9seg.
bomba sp
EDTA 2%
EDTA 2%
%Adh = 100- SP- CPSP
ADHESIVIDAD: método de Hellen II
VN > 27%
Alteraciones plaquetariasEvaluación
Adhesividad plaquetaria disminuida
Enfermedad de von WillebrandAlteraciones de GP Ib-IX-V, IIb-IIIa
Déficit de pool de depósito severo
Alteraciones plaquetariasEvaluación
Recuento plaquetario normal
Tiempo de sangría prolongado ó normalAdhesividad plaquetaria disminuida
Enfermedad de von Willebrand
Estudio de trastornosplaquetarios cualitativosCongénitos ó adquiridos
Métodos “point of care”
Sangre entera (800 µL)
1
Comenzar el test
3
Insertar cassette
2
PFA-100
Agregación plaquetaria in vitro
IIHEMA-ANM
Método óptico (Born, 1980)
Método potenciométrico (Challen, 1982)
Condiciones del ensayo:
-Sangre obtenida por punción con agujas 20-18 G
-Tubos de polipropileno
-Anticoagulante: citrato de sodio 3.8% (1:9) sin azida sódica
-Preparación de plasma rico en plaquetas (PRP): 10-15 min a 150-200 g
-Preparación de plasma pobre en plaquetas (PPP): 15 min 1500 g
-Ajustar concentración del PRP con PPP: 250 – 300 109 / mm3
-Tapar tubos para evitar cambios de pH
- Realizar el ensayo luego de 30 minutos y hasta 4 hs posteriores a la extracción.
AGREGACION
Agonistas panel de rutina:ADR: 10 uM ( adrenérgicos)Col: 1 ug /ml ó 8 ug/ml (GP VI, Ia-IIa)AA: 0.5 mM (receptor de Tx)ADP: 2.5 uM, 5.0 uM (P2Y1, P2Y12)Ristosetina: 1.2 mg/ml (Ib-V-IX), 0.4 mg/ml (vW tipo II)
Agonistas especialesTRAP6 : PAR1, PAR4U46619: análogo de TXEndoperóxidos cíclicos: actividad Tx sintazaIonóforos (A23187): movilización de Calcio
AGREGACION
AGREGACION
Interpretación de la agregación
- Cualitativa (semicuantitativa)
- Cuantitativa
Reacción de liberación de ATP
Permite cuantificar la liberación plaquetariaa través de la medición del ATP liberado por el PRP del paciente en presencia de los diferentes agonistas.
Recuento de plaquetas:326.000/mm3Morfología normal
Glanzmann
RETRACCION DEL COAGULO(TG)
Recuento de plaquetas:92.000 / mm3 (en cámara)Macroplaquetas (frotis)
Bernard-Soulier
Alteración síntesis de tromboxanos
PGG 2PGH2
TROMBOXANO A2/B2
PLC
IP3 DAG
Ca 2+ PKC
TXasa
TP
?
?
RESPUESTA A TROMBOXANOS
100l
PRPn + AA PRPp + ASACO
- +
AA
T : 0 seg
T : 30 seg
T : 1min
T : 4 min
Agregación +Receptores de Tx presentes.
Sin agregaciónAlteración en los receptores de Tx
GENERACION DE TROMBOXANOS
100l
PRPp + AA PRPn + ASACO
- +
AA
T : 0 seg
T : 30 seg
T : 1min
T : 4 min
Agregación +Sin alteración en la formación de Tx
Agregación -Alteración en la formación de Tx. Ciclooxigenasa o Tx Sintetasa?
Estudio de la función plaquetariaEstudio de la vía de formación de Tromboxano A2Evaluación funcional de Ciclooxigenasa y de
Tromboxano A Sintasa
PRP del paciente
AcidoAraquidónico
PRP de normal+
Aspirina
AgregaciónAlteración en la Tromboxano A Sintetasa
Sin agregaciónAlteración en la Ciclooxigenasa
Alteración en la Ciclooxigenasa
Estudio de la función plaquetariaEstudio de Agregación y Secreción plaquetaria
Bernard-SoulierGlanzmann
Citometría de Flujo
Alteraciones de laactivación/secreción
Estudio de gránulos
DisminuidoDéficit de pool de depósito
Gránulos densos:Marcación con Mepacrina por Citometría de flujo
Gránulos : Fibrinógeno, FvW, Fn intraplaquetarios
TromboxanosSíntesisReceptores
DisminuidoSíndrome de las plaquetas grises
FUNCIÓN PLAQUETARIACITOMETRIA DE FLUJO
CITOMETRIA DE FLUJO
Gráfico de puntosde la dispersión frontal y lateral de una suspensión deplasma rico en plaquetas
Plaquetas sin estimular Plaquetas estimuladas
Histograma De fluorescencia
Ventajas
Mínima manipulación .
Detecta cambiossuperficiales.
Estudio de trobocitopenias.
Estudio de subpoblaciones.
Estudio de proteínas intraplaq.
Requiere 5L de SE,PRP,PL.
No usa material radioactivo.
Rapidez
Desventajas
Costo del equipo.
Costo de reactivos.
Semicuantitativo.
Análisis y expresión de resultados
Citometría de flujo
TOMA DE MUESTRA: 5 mL de sangre.
ANTICOAGULANTE (1:10): citrato de sodio3.8%, EDTA 2%, PFA 1%?
PANEL DE MONOCLONALES: ISOTIPO-FITC / PE
CD42b ( Ib ), CD41 ( IIb ), CD61 ( IIIa ), CD29 ( Ia ) , CD36 ( GPIV )
10000 eventos
CELL-QUEST
IIHEMA-ANM
MARCACION EN SUPERFICIE
ALTERACIONES DE LA GP IIb-IIIa • Ausencia del receptor en superficie• Disminución del número de receptores• Incapacidad de fijar Fibrinógeno• Retracción del Coagulo anómala
GLICOPROTEINA IIb-IIIa• Heterodimero calcio dependiente• Integrina mas abundante en superficie• Receptor de Fibrinogeno, vW, Fibronectina
TROMBOASTENIA DE GLANZMANN
IIHEMA-ANM
Agregación ADP 5 μM (TG)
Agregación y liberación con colágeno 8 ug/ml(TG)
TROMBOASTENIA DE GLAZMMAN MARCACION EN SUPERFICIE
MM MM
KG
KG
BERNARD SOULIER
•Ausencia del complejo GP Ib-IX-V
•Autosómico recesivo, infrecuente
•Con-sanguinidad, Cromosoma 17, 23 y 3
•Sangrado moderado a importante
•Trombocitopenia
•Plaquetas de mayor tamaño y deformables
•Sobrevida plaquetaria acortada
Dispersión frontal-Tamaño (FSH)P: 202Madre: 65Control: 47
P
P
P
CD 42-b (GP Ib)(IMF)P:25Madre: 171Control: 257
CD61 (GP IIIa)(IMF)P: 389Madre: 176Control: 167
Paciente
Madre
Sindrome de BERNARD SOULLIER
IIHEMA-ANM
Dispersión frontal-Tamaño (FSH)P: 152Control: 66
CD 42-b (GP Ib)(IMF)P: 145Control: 63
CD61 (GP IIIa)(IMF)P: 463Control: 168
P
P
P
MYH9 ?
IIHEMA-ANM
MYH9: cuerpos de Döhle
NormalPaciente
AGREGACION CON COLAGENO 1g/ml
IIHEMA-ANM
CUANTIFICACION DE GP DE MEMBRANA PLAQUETARIA. CytoQuantTMGp ( Stago)
Microesferas: gráfico de puntos FSCH vs SSCH
Histogramas de fluorescencia
A
B
C
D
Mol
écul
as
de G
p/pl
aq.
IMF
Marker Media Nº GP/esferasM1 (D) 1201 63000M2 (C) 466 19000M3 (B) 112 4500M4 (A) 8 350
MARCACION INTRAPLAQUETARIAGRANULOS DENSOS CON MEPACRINA
TOMA DE MUESTRA- PRP, SE (EXTRACCION CON EDTA 2% o CITRATO)
- MEPACRINA, (QUINACRINA MUSTARD, 0.2 mM CF)
PREPARACION DE LA MUESTRA
40L BUFFER, 5 L MEPA, 5 L PlQ.
40L BUFFER, 5 L BUFFER, 5 L PlQ.
INCUBACION-40min
LAVADO
CITOMETROIIHEMA-ANM
Rango normal ≥37 IFM
NORMAL ( 85 IFM )
NEGATIVO ( 3 IFM )
PACIENTE ( 8 IFM)
MARCACION INTRAPLAQUETARIAGRANULOS DENSOS CON MEPACRINA
IIHEMA-ANM
FIJACION PFA 1%10 min
MARCACION DE PROTEÍNAS INTRAPLAQUETARIAS
FgVw
ADPATP
GP FgVw
ADPATP
GP
PERMEABILIZACION SAPONINA 1%
Marcación:- Controles negativos adecuados- Controles de permeabilización
SuperficieIIb
SuperficieIIIa
TotalIIb
TotalIIIa
Control depermeabilización
CD63
IIHEMA-ANM
METODOLOGÍAPL en Buffer conCa2+ ( 1mM)Incubación con FURA-2Lavado, Resuspensión
Sin Estimulo
Col 1g/mL
Col 8g / mL
MOVILIZACION DE CALCIO
Marcadores de activación plaquetaria (hiperreactividad)
Interacción con matriz sub-endotelial
Interacción con endotelio activado
fisiológico
patológico
GP IIbIIIa inactiva
ADP/ATPCa2+/ Ser
vWf / Fg/ Fn
fibrinógeno
P-SELECTINA /CD62p
GP 53 / CD63
MARCADORES DE ACTIVACION
L
L
GP IIbIIIa activa
estado de reposo
estado activado
unión de fg
PAC-1
IIHEMA-ANM
- expresión de marcadores de activación en la superficie de la plaqueta (ex vivo)
CD62PP-selectina
golll
Condiciones analíticas de difícil estandarización:
- anticoagulantes- tiempo de ensayo- controles negativos adecuados- expresión de resultados(% de eventos positivos, intensidad media de fluorescencia)- escasas referencias de CV intra eInter ensayo
IMF
% positivos
Marcadores de activación plaquetaria:
REPOSO
ACTIVO
GP IIb-III a
RIBS9F9,F2a-Fg
LIBSPAC-1AP6
IIHEMA-ANM
CINETICA DE UNION A RECEPTORES
TOMA DE MUESTRAPRP, SE (EXTRACCION CON CITRATO)
MARCADO DE PLAQUETAS40 L buffer + 5 L Isotipo + estímulo40 L buffer + 5 L Monoclonal + estímulo
INCUBACIONTiempos: 1min, 5min….20min a 37ºC Cortar con PFA 1% (CF) a cada tiempoCompletar la incubación hasta 40min
CITOMETRO
IIHEMA-ANM
CINETICA DE UNION
AGONISTAS:ADP 20M, Thr 1 a 5 U/ml, TRAP
MARCADORES:
DE RECEPTORES: PAC-1, a-FG, a-VWF, GPs
DE ACTIVACION: CD62P, CD63
IIHEMA-ANM
0
20
40
60
80
100
0 5 10 15 20 25
IMF
ó %
IMF Bf 11
% Bf 11
IMFPAC-1 11
% PAC-1 11
CINETICA DE UNION A RECEPTORES
TIEMPO (min)
IIHEMA-ANM
Aplicaciónes de la citometría de flujo
Activación plaquetaria mediada por anticuerpos: “Trombocitopenia inducida por heparina,
anticuerpos anti Factor Plaquetario 4 – Heparina”
Tomer A, 1999
- Factor plaquetario 4- Anexina V
Tomer A, 1999
Activación plaquetaria mediada por anticuerpos: “Trombocitopenia inducida por heparina,
anticuerpos anti Factor Plaquetario 4 – Heparina”
Tomer A, 1999
CAUSA: Destrucción plaquetaria por anticuerposque reconocen glicoproteínas específicas de la menbrana plaquetaria:IIb-IIIa, Ib-IX, Ia-IIa
TROMBOCITOPENIA INMUNE
2Pool de superficie
(IgG asociada a sup. Plaq.), 100 moléculas,
unión de anticuerpos naturales que reconocen
estructuras modificadas sobre plaquetas
viejas.
IgGPLAQUETAS NORMALES
1Pool intraplaquetario
(IgG totales plaq.)20.000 moléculas
gránulos plaquetarios,adquiridas por pinocitosis
INMUNOGLOBULINASMETODOLOGIAS
•EVALUAN CANTIDAD DE ANTICUERPOS TOTALES
•EVALUAN CANTIDAD DE ANTICUERPOS ASOCIADOS A SUPERFICIE :inmuno-radiometría
inmuno-fluorescencia directa
MAIPA y PAICA (especifidad del anticuerpo)
IGG ASOCIADA A SUPERFICIE PLAQUETARIA
Expresión de resultados
1-IFM
2-INDICE: IFM / FSCH
M1
Media: 36
M1
Media: 92CD41+
Control normal
Paciente
Inmunoglobulinas asociadas a superficie plaquetaria:detección por citometría de flujo
M1
M1
Paciente
Control normal
Negativo3 IFM
IgG10 IFM
IgG34 IFM
IgM3 IFM
IgM31 IFMNegativo
3 IFM
Inmunoglobulinas asociadas a superficie plaquetaria:detección por citometría de flujo