guía labs b005 2-2012

Departamento de Ciencias Básicas

Guía Laboratorios Bioquímica

Última actualización: Julio, 2012

Laboratorios Bioquímica 2012

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REGLAS DE LABORATORIO DE BIOQUÍMICA GENERAL PRIMER SEMESTRE 2012.

Actividades prácticas: Se realizarán un total de 5 actividades por cada sección de práctico, según se indica: o Reforzamiento. La primera semana se realizará una actividad que consiste en un

reforzamiento de cálculos matemáticos aplicados a pH, ecuación de Henderson-Hasselbach, ecuación de la recta, gráfica de ecuaciones no lineales (hiperbólicas) y sus recíprocos. La actividad se realizará en sala con todos los alumnos, será de carácter obligatorio y con evaluación.

o Actividades prácticas. Se realizará un total de 4 actividades prácticas en modalidad

de dos módulos semana por medio. Asistencia:

La asistencia debe ser de un 100%. El estudiante que se ausente a un práctico, tendrá la oportunidad de realizar una actividad recuperativa, solo cuando su inasistencia sea plenamente justificada por causales médicos y previamente autorizado por el coordinador del ramo. En el caso más de una inasistencia, el alumno queda en situación de reprobar la asignatura. Los estudiantes NO pueden asistir a un grupo de laboratorio diferente al asignado

en su carga académica. Evaluaciones: Se realizarán 5 quizzes y 4 informes de laboratorio. Los promedios de quizzes e informes tendrán la misma ponderación (50% cada uno). Los alumnos tienen la posibilidad de borrar la peor nota de quiz e informe. Los quizzes se tomarán al comienzo de la actividad práctica y tendrán una duración aproximada de 10 min. El alumno que llegue tarde no podrá rendir el control, deberá esperar hasta que se inicien las actividades, y será evaluado con nota 1,0. Los quizzes contemplarán las materias de la guía y lo que sea deducible de ellas; además son acumulativos, es decir, se preguntará de prácticos anteriores. Los informes deberán ser entregados la semana siguiente al práctico por un alumno del grupo. El plazo de entrega es inamovible. El grupo que no entregue el informe, será evaluado con nota 1,0.



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Presentación personal y conducta de laboratorio: El estudiante debe presentarse: 1. Puntualmente a la actividad. En el caso de llegar atrasado, podrá ingresar al

laboratorio una vez terminado el quiz de entrada, y sólo en los cinco minutos siguientes de rendido éste. No se permitirá el ingreso de estudiantes a la actividad después de 15 minutos de iniciada ésta.

2. Con delantal, pelo tomado (si corresponde), zapato cerrado (no chalas ni

sandalias), pantalón cerrado (no bermudas ni faldas). Asimismo, debe evitarse el uso de accesorios (anillos, pulseras u otros) que puedan enredarse o limitar la manipulación de los instrumentos y material de laboratorio.

Cada estudiante debe ingresar al laboratorio con su Guía del Laboratorio, de modo que pueda desarrollar la actividad sin entorpecer el trabajo de los demás. La falta reiterada de este material puede ser motivo de una evaluación mínima (1,0).

En el laboratorio sólo se permitirá el uso de cuaderno, lápices, calculadora, guías y libros de apoyo. Las mochilas y bolsos deben guardarse en los casilleros destinados para tal fin.

El estudiante debe evitar situaciones de riesgo, como correr y jugar en el laboratorio.

Si el estudiante requiere salir del laboratorio, debe informarle al profesor. Una ausencia prolongada y sin informar puede ser considerada como inasistencia.

En el transcurso del práctico No está permitido el uso de aparatos de audio, teléfonos celulares, ni el consumo de ningún tipo de bebida o comida (incluido chicle). El profesor puede solicitar al estudiante que abandone el laboratorio si no cumple con esta norma, quedando ausente de la actividad. No existe la posibilidad de apelar a esta sanción, pues el estudiante debe aprender las normas mínimas de comportamiento en un laboratorio.



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Pauta para la elaboración de informes de laboratorio

Los informes:

Deberán tener hasta seis páginas (sin incluir la portada), numeradas en la parte inferior a la derecha, tamaño carta (21.59 x 27.94cm) y con tipo de margen normal (izquierda y derecha 3cm; arriba y abajo 2.5cm); sólo se corregirán las seis primera páginas de los informes. Lo anterior incluye esquemas, gráficos, literatura citada y otros, exceptuando la página portada. Además, deben ser escritos a espacio simple con letra arial de tamaño 12.

Se debe entregar en el plazo previamente fijado, es decir, una semana después de haber realizado la experiencia. Los atrasos en estas entregas serán considerados con nota 1.0.

Deben constituir relatos fluidos, impersonales y objetivos acerca de la actividad realizada. Serán escritos en tiempo pasado y en tercera persona singular, impersonal. Deberán ser escritos en correcto castellano, es decir, con la adecuada redacción, sintaxis, puntuación y ortografía.

Ejemplo : “Durante el desarrollo de este trabajo se utilizó DNA proveniente de tallo de la cactácea Copiapoa cinerea, disuelto (concentración) en tampón TE (composición, pH), mantenido a -20°C durante 90 días.” Las abreviaturas de unidades de medida (volumen, superficie y otras) NO son seguidas por punto; utilice solamente los sistemas convencionales tipo cgs o mKs. Los litros, por ejemplo, se pueden abreviar L o l; las abreviaturas “Lt” o “Lts” son incorrectas. En el caso de los segundos, serán s y no “seg” ni “segs”. Si tiene dudas al respecto, pregunte. Los informes deberán constar de las siguientes secciones: 1. En la primera página o portada:

- Título de la experiencia (y NO número del informe o trabajo práctico) - Autores, los alumnos, en orden alfabético de acuerdo a su apellido - Curso, carrera y sección - Nombre del Profesor(a) de práctico y del ayudante alumno(a)

En su contenido: 2. Introducción (1,0 punto) y objetivos (0,5 puntos) En esa sección, se hará una descripción del marco teórico relacionado con el tema abordado en la experiencia. Otro enfoque interesante dice relación con sistemas de diagnóstico y patologías asociadas al tema. En este curso particularmente, las diversas metodologías que se utilizarán tienen un fundamento que no es trivial a la hora de elegirlas y aplicarlas. Deben explicar, es decir fundamentar, la elección de cada una de



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ellas, para cada experiencia; aportar los elementos que permitan comprender en qué consisten las técnicas utilizadas, en qué se sustentan y cuál es su mecanismo básico de acción.

En su parte final, la Introducción deberá contener los objetivos de la experiencia. La introducción consta básicamente de una serie de afirmaciones y conceptos escritos de manera fluida, que sustentan o apoyan la realización de la experiencia. Toda afirmación que se plantee deberá ser apoyada por las referencias bibliográficas correspondientes, entre paréntesis, utilizando un número para cada una, o bien los apellidos de los autores y el año de la publicación. La misma referencia debe tener el mismo número, que será repetido tantas veces se utilice dicha referencia. Muchas veces, en la introducción se presenta la terminología a utilizar, con sus respectivas abreviaturas, que serán utilizadas en el resto del informe.

Se puede utilizar figuras, gráficos u otros disponibles en texto, en cuyo caso es necesario indicar la fuente al pie del esquema (ej: tomado de Meneses y Vidal 2005; NO olvidar detallar la referencia en la sección 6).

3. Materiales y Métodos (0,5 puntos)

Aquí se detallará el procedimiento utilizado, paso a paso, y se hará referencia a los materiales y a los fabricantes de los equipos e instrumentos utilizados, su marca y modelo entre paréntesis, con excepción de aquellos de uso rutinario (No se detallará el uso de micropipetas, ni su marca). Se trata de entregar el procedimiento o técnica realizados, los reactivos, soluciones o elementos utilizados en forma ordenada, precisa y lo más brevemente posible, de modo que la experiencia se comprenda paso a paso y pueda ser reproducida por otra persona. Recuerde que hay un límite en la extensión, no repita el protocolo de la guía. Se detallará entre paréntesis, la composición y concentración de reactivos y tampones utilizados (sólo la primera vez que se haga referencia a ellos, luego se mencionará solamente su nombre). La sección materiales y métodos NO ES una lista de materiales, instrumentos y reactivos a modo de lista de supermercado. Debe ser fluida de manera que al ir describiendo el procedimiento utilizado durante la experiencia, vayan apareciendo los diversos materiales e instrumentos que en ese momento deben ser caracterizados con su marca y modelo. Como el resto del informe, los Materiales y Métodos deben ser escritos en pasado y en tercera persona, aunque impersonal.

Ejemplo : Se agregó 20 ml de tampón PBS (10 mM Na2HPO4; 1.4 mM KH2PO4, pH = 7,4; 140 mM NaCl; 2,7 mM KCl) y se centrifugó durante 10 min a 300 rpm (marca y modelo de la centrífuga); no es necesario decir que centrifugó en una centrífuga, por razones obvias...

Si una solución de un reactivo determinado se agregó con una micropipeta de marca X y capacidad Y, eso NO DEBE ser detallado pues es obvio que dicho volumen se tomó con el instrumento apropiado. Tampoco es relevante mencionar si el tubo en el que se realizó un determinado ensayo era de plástico, vidrio, teflón, etc, o si su capacidad era tal o cual.



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En caso de haber efectuado experimentos, es fundamental detallar los controles positivos y negativos en esta sección. La abreviatura de microlitros, µl, (10–6 L o 10-3 mL) lleva la letra griega “µ” (= 10-6), la que no debe reemplazarse por la última vocal (“u”). En el procesador word usted encuentra la letra griega µ en la tabla del menú “Insertar”, “Símbolo”. 4. Resultados (1,5 puntos)

En esta parte del informe se describe los resultados y observaciones obtenidas, apoyándose en:

- Dibujos, fotografías, tablas, gráficos u otros. Cada uno de ellos debe llevar su TÍTULO y NÚMERO respectivo, asignado en forma consecutiva.

- Breves descripciones de lo observado. - Tablas, con una breve descripción en texto (con su número respectivo), que

señale las tendencias observadas - Gráficos, cuyo título NO DEBE SER “A versus B”. Los gráficos deben estar

correctamente construidos, se debe detallar el nombre de las variables independiente y dependiente con sus respectivas unidades entre paréntesis.

Cada figura debe llevar una breve leyenda explicativa. Sobre las figuras deberá ir indicado con flechas o letras detalles relevantes para su entendimiento Puesto que el espacio es limitado, NO DEBE REPETIRSE la información en tablas y gráficos; se optará por aquella expresión que sea más clara y contenga mayor información (generalmente ello corresponde a gráficos). SÓLO se debe incluir figuras, tablas y gráficos a los cuales se haga alusión en el texto. No se debe incluir figuras, gráficos ni tablas, sin hacer referencia a ellas en el texto. 5. Discusión (2,0 puntos)

Este es el capítulo MÁS IMPORTANTE del informe. La primera frase de la discusión es la verbalización del resultado o conclusión obtenida más relevante. Luego, se discutirá los resultados en detalle, de acuerdo con los antecedentes teóricos, fundamentación de la experiencia, objetivos e hipótesis planteados en la introducción. Aquí también se discutirá las eventuales discrepancias respecto de los resultados esperados, en caso que las hubiera. Se propondrá las razones, tanto de orden metodológico como conceptual, que podrían dar cuenta de tales discrepancias. Es fundamental utilizar bibliografía para encontrar una explicación lógica a los resultados observados. Recuerde que la discusión NO consiste en repetir los resultados obtenidos, si no que explicarlos a l luz del conocimiento teórico. La discusión puede finalizar con las CONCLUSIONES del práctico, las que son breves y puntuales., y generalmente van asociadas a los objetivos del trabajo.



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6. Referencias o Literatura Citada (0,5 puntos)

Aquí se debe transcribir un listado de las referencias utilizadas durante la elaboración del informe. No deben aparecer textos, páginas web o artículos científicos que no sean mencionados en el texto del informe. Asimismo, todas aquellas citas que se hagan en el informe deberán aparecer referidas en esta sección. Utilizar DE PREFERENCIA trabajos publicados en Revistas con Comité Editorial. Las páginas web no son utilizadas bajo ningún motivo.

Las citas en el texto, pueden hacerse a través de números consecutivos, de acuerdo al orden en que se vayan utilizando, poniendo los números entre paréntesis y, e la sección referencias y también de manera consecutiva, se debe escribir el número y la referencia correctamente. Si una misma referencia se utiliza varias veces, debe tener siempre el mismo número que se repetirá, en el texto, tantas veces se utilice esa referencia. Otra alternativa al respecto, es sin utilizar números sino, luego del texto que sostiene la afirmación, se coloca entre paréntesis el apellido del o los autores (si son hasta dos), seguido del año de la publicación. Si son más de dos autores, se coloca el apellido del primero y luego “y cols.” (por y colaboradores), seguido del año de la publicación. En la sección referencias o literatura citada, el listado de las referencias se hace en orden consecutivo, de acuerdo a la numeración que se les ha dado en el texto y dependiendo del orden de su citación, en caso que se haya utilizado esta alternativa. Si se ha optado por la segunda modalidad, es decir por el apellido de los autores, las referencias se harán en orden alfabético según el apellido del primer autor del trabajo. TODOS los autores de cada trabajo, libro o referencia consultada deben aparecer, figurando primero su apellido y luego las iniciales de su(s) nombre(s). Por favor consulte si tiene dudas al respecto, o directamente oriéntese poniendo atención en cualquier texto, y sobretodo artículo científico, a su disposición. Hay varias normas para escribir correctamente las referencias, sin embargo si Ud. escoge cualquiera de ellas, debe ser conservador (consistente) a lo largo de todo el texto, es decir, siempre utilizar la misma modalidad. Por ejemplo, el año de la publicación puede señalarse inmediatamente después de los autores, o bien al final de la referencia. La transcripción de los nombres propios completos de los autores es un error frecuentemente cometido por los estudiantes: trate de no repetirlo y sólo escriba las iniciales de estos nombres.

Ejemplos :

- Para un artículo científico:

(1) Fagan, T., D. Morse y J.W. Hastings. 1999. Circadian synthesis of a nuclear-encoded chloroplast glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase in the dinoflagellate Gonyaulax polyedra is translationally controlled. Biochemistry. 38: 7689-7695.

En el texto, se debiera citar, siempre entre paréntesis, con un número (que sería en 1 si es la primera cita) o si no, como (Fagan y cols., 1999) y en las referencias, de acuerdo al orden alfabético de los apellidos de los autores, iría en la “F” y NO tendría número. Este artículo, fue publicado en 1999, en el volumen 38 de la revista Biochemistry, entre las páginas 7689 y 7695.



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- Para un capítulo de libro:

Granéli, E. y P. Carlsson. 1998. The ecological significance of phagotrophy in photosyntetic flagellates. En: Physiological Ecology of Harmful Algal Blooms. D.M. Anderson, A.D. Cembella y G.M. Hallegraef (Eds.). NATO ASI Series. Vol G 41. Springer-Verlag Berlin Heidelberg Pubs. pp.539-557.

Lo anterior quiere decir que el texto que Ud. consultó fue escrito por Granéli y Carlsson (lo cual se puede citar en el texto de esa misma manera o con el número correspondiente), se titula “The ecological significance....”, aparece en el libro titulado “Physiological Ecology of Harmful Algal Blooms”, publicado en 1998. Los editores del libro son: D.M. Anderson, A.D. Cembella y G.M. Hallegraef; la publicación es de la NATO, la editorial es la Springer-Verlag de Berlin, Heidelberg Publicaciones y las páginas en las que aparece este capítulo son desde la 539 hasta la 557. - Para un libro completo:

Futuyma, DJ. 1986. Evolutionary Biology. 2ª Ed. Sinauer Associates Inc. Publishers (Sunderland, MA). 600 pp. - Para un resumen (“abstract”) de un trabajo, aparecido en las Actas de algún

congreso: Guillou, L., E. Nezan, P. Gentien and G. Barbier. 2000. Molecular study of the toxic algae Dinophysis spp. from the French coast. Resúmenes de la 54th Reunión Annual de la Sociedad Ficológica de América. D.F. Millie y P.Kugrens (Eds.). J. Phycol. 36 (3): 27.

Esta referencia, en el texto se citaría (si no se hace con número) como (Guillou y cols. 2000).

Si usted sigue estas simples instrucciones, tendrá la nota máxima en sus informes.



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Laboratorio Nº 1: Reforzamiento pH, ecuaciones lineales y gráficas.

Propiedades de los logaritmos

, pues

, pues

Importante:

Antilog ≠ -Log Si P = -log X, para despejar X se debe aplicar la función antilog (shift log) Por lo tanto –p = logX /antilog 10-p = X El pH El pH es una medida de la acidez o basicidad de una solución. El pH es la concentración de iones o cationes hidrógeno [H+] presentes en determinada sustancia. Por ejemplo, una concentración de [H+] = 1 × 10–7 M (0,0000001) es simplemente un pH de 7 ya que: pH = –log[10–7] = 7 Puesto que el agua está disociada en una pequeña extensión en iones OH– y H+, tenemos que: Kw = [H+][OH–]=10–14 en donde [H+] es la concentración de iones de hidrógeno, [OH-] la de iones hidróxido, y Kw es una constante conocida como producto iónico del agua. Por lo tanto,

log Kw = log [H+] + log [OH–]

–14 = log [H+] + log [OH–]

14 = –log [H+] – log [OH–]

pH + pOH = 14

http://es.wikipedia.org/wiki/%C3%81cido

http://es.wikipedia.org/wiki/Base_%28qu%C3%ADmica%29

http://es.wikipedia.org/wiki/Soluci%C3%B3n

http://es.wikipedia.org/wiki/Iones

http://es.wikipedia.org/wiki/Hidr%C3%B3geno

http://es.wikipedia.org/wiki/Agua



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Ecuación de Henderson-Hasselbalch Mientras un acido fuerte se disocia totalmente en solución acuosa, un ácido débil lo hace solo parciamente. Si representamos a un ácido débil por AH y su base conjugada por A-, su disociación será AH H+ + A-, el grado en que se disocia el ácido se representa por

su constante de disociación o de acidez Ka= [H+] x [A-] / [AH] Supóngase un ácido AH con disociación parcial. El equilibrio es: y la constante de disociación asociada será:

Despejando [H3O + ] de la constante de disociación:

Tomando logaritmos a ambos lados y aplicando la propiedad de los logaritmos para un producto se llega a:

E invirtiendo el cociente:



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Ejercicios

1. En una solución donde [H+

] es 1x 10-3

M calcule pH, y pOH. ¿La solución es ácida o básica?

2. Si el pH de una solución es por ejemplo 4,5 calcule [H+

], [OH-

]. ¿La solución es ácida o básica?

3. Calcular el pH y pOH de una solución de NaOH 0,001M

4. En una muestra de un lago contaminado, se determinó que el pOH del agua era de

6,59. ¿Cuál es el valor de [OH-

] y pH?

5. Determinar el pH 100 mL de buffer lactato, donde la concentración de ácido láctico es 0,050M, y la concentración del ión lactato es 0,32 M

6. En el problema anterior, ¿Cuál será el valor de pH si concentración de ácido

láctico y la del lactato son iguales?

7. Calcule la relación de concentraciones existente entre acetato y ácido acético en un sistema amortiguador a pH = 5,3

8. Los logaritmos se utilizan para medir la magnitud de los terremotos. En la escala

Richter, la magnitud R de un terremoto está dada por la formula R = log10 I, donde I representa el número de veces que es más intenso el terremoto respecto a la actividad sísmica más pequeña que se puede medir con un sismógrafo ¿Cuántas veces más intenso es un terremoto que mide grado 9,1 (terremoto de Japón, 2011) que un terremoto con grado 8,8 (terremoto de concepción, 2010)?



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Ecuación principal de una recta. Se llama ecuación principal de una recta a una expresión de forma:

y = mx + n o bien y = Ax + B

OJO: cuando usan la calculadora, ésta entrega el resultado como y = Bx + A

Donde m representa la pendiente de la recta y n es el coeficiente de posición y es el número donde la recta corta al eje de las ordenadas (Y) Concepto de Recta Una recta es la representación gráfica de una función de primer grado. Toda función de la forma y = mx + n representa una línea recta. La x y la y son las variables de la ecuación, siendo “x” la variable independiente ya que puede tomar cualquier valor, mientras que “y” se llama variable dependiente, ya que su valor está determinado por el valor que tome x. Cada punto (x,y) que pertenece a una recta se puede representar en un sistema de coordenadas, siendo x el valor de la abscisa e y el valor de la ordenada. (x,y) = (Abscisa , Ordenada) Ejemplo: El punto (-3,5) tiene por abscisa -3 y por ordenada 5.



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Pendiente de una Recta En la ecuación principal de la recta y = mx + n, el valor de m corresponde a la pendiente de la recta y n es el coeficiente de posición. La pendiente permite obtener el grado de inclinación que tiene una recta, mientras que el coeficiente de posición señala el punto en que la recta interceptará al eje de las ordenadas. Ejemplo: La ecuación y = 4x + 7 tiene pendiente 4 y coeficiente de posición 7, lo que indica que interceptará al eje y en el punto (0,7). Cuando se tienen dos puntos cualesquiera (x1,y1) y (x2,y2), la pendiente queda determinada por el cuociente entre la diferencia de las ordenadas de dos puntos de ella y la diferencia de las abscisas de los mismos puntos, o sea

12

12

xx

yym

Una recta que es paralela al eje x, tiene pendiente 0. Como usar la calculadora (modelos Casio fx-82MS/83MS/85MS/270MS/300MS/350MS



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Laboratorio Nº2: Soluciones Amortiguadoras y Capacidad Amortiguadora

OBJETIVOS GENERALES:

Conocer el funcionamiento y preparación de soluciones reguladoras.

Determinar la capacidad reguladora de una solución tampón.

Determinar gráficamente la curva de titulación de un aminoácido. INTRODUCCIÓN Una solución amortiguadora (Buffer o Tampón) es capaz de resistir cambios de pH cuando pequeñas cantidades de ácido o base son agregadas a la solución. Por ejemplo, cuando 0,01 moles de ácido fuerte y base fuerte son adicionadas a agua destilada, el pH desciende a 2 con el ácido y aumenta a 12 con la base. Si la misma cantidad de ácido o base son adicionados a una solución amortiguadora formada por ácido acético – acetato de sodio, el pH puede variar solamente en una fracción de unidad. La regulación del pH es importante en muchas reacciones químicas, como así también en el control de procesos metabólicos dentro de nuestro organismo, para la mantención de la homeostasis. Así encontramos que el pH de la sangre de nuestro organismo se encuentra regulado a un valor de 7,4. Pequeñas variaciones de dicho valor pueden causar enfermedades e incluso la muerte, debido a que afecta los procesos bioquímicos que ocurren en dicho fluido. Una solución amortiguadora requiere dos especies. Una es capaz de reaccionar exclusivamente con OH- y la otra con H3O

+. Estas soluciones se forman por la combinación de un ácido débil y una sal derivada de éste (ácido acético/acetato de sodio) o por una base débil y una sal derivada de ésta (amoniaco/cloruro de amonio). Debido a que las soluciones amortiguadoras presentan efecto de ión común, es posible aplicar la ecuación de Henderson – Hasselbalch con la finalidad de prepararlas:

débil ácido

sal)conjugada( baselog pKa pH

La Capacidad Amortiguadora ( ) es una medida de la resistencia a los cambios de pH de una solución amortiguadora cuando un ácido o una base son agregados a ésta. Este parámetro es expresado como los moles de ácido o base necesarios para cambiar el pH de un litro de una solución reguladora en una unidad. Mientras más grande el valor de

, mayor la resistencia de la solución amortiguadora a cambios de pH.

Len buffer devolumen pH de cambio

sadicionado OH o OH de moles 3

-



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En este laboratorio, la ecuación de Henderson – Hasselbalch será usada para determinar la cantidad del par base conjugada – ácido débil necesario para producir un una solución amortiguada a pH fisiológico. ACTIVIDADES Preparación de soluciones amortiguadoras. En esta experiencia se estudiará la capacidad amortiguadora del buffer acetato, cuyo comportamiento está dado por el equilibrio:

5

a33 1075,1K H COOCH COOHCH x

1. Mediante la ecuación de Henderson – Hasselbalch, calcular la cantidad de base conjugada necesaria para preparar 50 mL de buffer acetato a pH 5,0, conociendo la concentración del ácido débil:

Grupo I. 0,10 M de ácido acético.

Grupo II. 0,25 M de ácido acético

Grupo III. 0,50 M de ácido acético

2. Chequear resultados con el profesor. 3. Preparar solución amortiguadora.

Determinación de capacidad amortiguadora

1. Calibrar pH-metro. Seguir instrucciones del profesor para calibrar y limpiar pH-metro.

2. Medir pH de solución amortiguadora preparada. 3. Llenar una bureta de 50 mL con solución amortiguadora y otra bureta de 50

mL con solución estandarizada de NaOH (0,1 M) 4. Transferir 50 mL de solución amortiguadora en un vaso de precipitado de

250 mL. 5. Adicionar alícuotas de solución de NaOH (5 mL) a la solución reguladora.

Después de cada adición, anotar el volumen de NaOH adicionado y el pH de la solución.

6. Continuar hasta adicionar 100 mL de solución de NaOH. 7. Completar Tabla I 8. Graficar pH versus moles de NaOH adicionados. 9. Calcular el pH teórico de cada solución empleando la ecuación de

Henderson – Hasselbalch, y compararlos con los valores experimentales.



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Tabla I

V. Buffer (L) V. NaOH (L) Moles NaOH Cambio de pH (pH final – pH Inicial)

Capacidad

Reguladora,

Determinación de curva de titulación de la glicina.

La glicina es un aminoácido que en solución funciona como un ácido débil diprótico, siendo las ecuaciones de equilibrio:

5

a1

-

23

+

23

+ 1075,1K H -COOCH-NH -COOHCH-NH x

5

a2

-

22

-

23

+ 1075,1K H -COOCH-NH -COOCH-NH x

1. Transferir 50 mL de solución de glicina (0,05M) en dos vasos de

precipitado de 250 mL. 2. Medir pH de la solución. 3. Llenar una bureta de 50 mL con solución estandarizada de NaOH (0,1 M) y

otra con 50 mL de HCl (0,1M). 4. Adicionar alícuotas de solución de NaOH (5 mL) a la solución de glicina.

Después de cada adición, anotar el volumen de NaOH adicionado y el pH de la solución.



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5. Continuar hasta adicionar 100 mL de solución de NaOH. 6. Repita el procedimiento con el segundo vaso de precipitado con la solución

de glicina, esta vez, adicionando HCl. 7. Completar Tabla II 8. Graficar pH versus moles de OH- o H+ adicionados. 9. Explicar cada punpunto de inflexión de la curva obtenida.

Tabla II

V. Soln. Glicina (L)

V. NaOH (L) Moles OH- pH de la Solución

V. Soln. Glicina (L)

V. HCl (L) Moles H+ Cambio de pH (pH final – pH Inicial)



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Cuestionario

1.- a.- Defina los conceptos de Ka, Kb y Kw. b.- Demuestre matemáticamente (fundamente) cómo se obtiene el valor de Kw.

2.- ¿Cuál es el pH que tiene una solución amortiguadora formada por CH3COOH (0,2 M)/CH3COO-(0,7 M)? ¿Cuál es el pH final si a 50 mL de esta solución se le agregan 10 mL de NaOH 0,1 M? (Ka CH3COOH= 1,8 *10-5). 3.- Suponga que quiere conseguir un tampón de un pH exactamente 7.00 utilizando KH2PO4 y Na2HPO4. Si tiene una solución de KH2PO4 0.1 M, ¿qué concentración de Na2PO4 necesitaría? 4.- Describa la curva de titulación característica para los aminoácidos alanina e histidina.



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Laboratorio Nº 3: Reconocimiento y cuantificación de las proteínas

INTRODUCCIÓN

Todas las estructuras celulares están formadas por proteínas y prácticamente todas las funciones celulares son realizadas por proteínas. Las enzimas, los transportadores, los anticuerpos, los receptores, los elementos del citoesqueleto, etc, son proteínas. Aparte de sus funciones específicas, las proteínas participan en la regulación del equilibrio osmótico y tienen capacidad tamponante o reguladora del pH.

Existen variados métodos para reconocer y cuantificar proteínas, siendo los

métodos colorimétricos los más utilizados actualmente. La determinación colorimétrica cuantitativa de una sustancia se basa en la capacidad de ésta para absorber selectivamente ciertas longitudes de onda de la luz incidente. La cantidad de luz absorbida es directamente proporcional al espesor del medio y a la concentración de la sustancia presente. De esta manera, si se mantiene constante el espesor del medio, la absorción de luz por una sustancia disuelta en un medio transparente (Ej. agua) será proporcional a su concentración molar.

Estos principios están contenidos en las leyes de Lambert–Beer y están expresadas en la siguiente ecuación:

log Io/ I = E c l o DO = E c l,

donde DO es la Densidad Óptica o Absorbancia de la sustancia, E es el coeficiente

de extinción molar, c es la concentración e l es el espesor de la celda, siendo éste último igual a 1 cm. El coeficiente E se expresa en litros/M cm y es numéricamente igual a la DO de una solución 1M (1 Molar) de concentración.

Si la solución de un analito sigue la ley de Lambert-Beer, presenta una relación lineal entre DO y concentración. Por otro lado si la relación entre DO y concentración es lineal para dos soluciones de la misma sustancia a igual espesor y longitud de onda, entonces se puede usar una de ellas de concentración conocida (estándar) para determinar la concentración de la otra solución.

En la práctica para determinar espectrofotométricamente la concentración de una sustancia se requiere: a) una serie estándar de concentración conocida, en un rango de concentración que muestre absorción lineal y que permita expresar la concentración en DO por unidad de masa o concentración. b) un blanco que contiene todos los componentes del ensayo con excepción de la sustancia a medir y c) la muestra con la sustancia problema a una dilución tal que su lectura de DO este en el rango lineal de la curva de calibración



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OBJETIVOS

Una vez desarrollada esta actividad práctica los alumnos conocerán algunos métodos de reconocimiento y cuantificación colorimétrica de las proteínas y sus fundamentos teóricos.

ACTIVIDADES

1. Preparación una 50 mL de una solución de NaCl 0,9% p/v.

2. Reconocimiento de proteínas plasmáticas

El plasma sanguíneo tiene un contenido de proteínas de aproximadamente 7g/100 mL (g/dl), de los cuales aproximadamente 4g corresponden a albúmina y el resto está constituido por anticuerpos, factores de coagulación, apoproteínas de las lipoproteínas, enzimas proteicas, etc. Este contenido de proteínas puede variar de acuerdo a las condiciones nutricionales o el estado de salud del individuo.

a) Reconocimiento por absorbancia a 280 nm de luz ultravioleta (UV).

Las proteínas absorben luz ultravioleta a 280 nm, longitud de onda a la que absorben los aminoácidos aromáticos (triptofano, tirosina y fenilalanina) de las proteínas, especialmente el grupo indol de triptofano.

Esta propiedad se puede aprovechar para reconocer la presencia de proteínas En esta actividad se utilizará plasma (u ovoalbúmina) diluido 1: 20 con suero fisiológico (NaCl 0.9 % p/v), una solución de seroalbúmina de bovino (SAB) 5 mg/mL y una solución de NaCl 0.9 % p/v, según el cuadro siguiente

Tubos 1 2 3

Na Cl 0,9 % p/v - - 3 mL

SAB 5 mg/mL - 3 mL -

Plasma diluido 3 mL - -

Leer en el espectrofotómetro a 280 nm (UV) en cubetas de cuarzo. (El plástico detiene la luz UV). Comparar resultados y discutir la utilización de tubos con SAB y con la solución de NaCl. b.- Reconocimiento por absorbancia a 540 nm (reactivo de Biuret)

Este método se basa en la formación de un complejo coloreado entre el ión Cu+2 del reactivo y los nitrógenos amídicos del enlace peptídico. Por lo tanto este reactivo reconoce específicamente la presencia de enlaces peptídicos. Se utiliza como blanco el reactivo de Biuret a la misma concentración de los tubos muestra y estándar.



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En esta actividad se utilizará plasma diluido 1:20 con NaCl 0.9 % p/v y solución de SAB 5 mg/mL de acuerdo al siguiente cuadro

Tubos 1 2 3 4 5 6 7

NaCl 0.9% p/v - 1,8 1,5 1,0 0,5 - 2,0

SAB 5 mg/mL - 0,2 0,5 1,0 1,5 2,0 -

Plasma diluido 2,0 - - - - - -

Reactivo de Biuret 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0

Mezclar bien, sin agitar y leer después de 30 minutos a 540 nm en cubetas de plástico. Se puede calentar en baño a 50ºC por 5 minutos y leer después de enfriar en agua corriente. Calcule la concentración total de proteínas del plasma en mg/dl a partir de la curva estándar Compare y discuta sus resultados. Reactivos y Soluciones

1. Reactivo de Biuret 2. Solución NaCl 0.9 % p/v 3. Plasma diluido 1 : 20 v/v con NaCl 0.9 % p/v 4. Solución estándar de seroalbúmina de Bovino (SAB) 5 mg/mL en NaCl 0.9 % p/v

Equipo y materiales

1. Espectrofotómetro UV- Visible 2. Cubetas de cuarzo y de vidrio 3. Tubos de ensayo de 10 mL y gradillas 4. Matraces Erlermeyer de 100 mL 5. Pipetas de 1, 5 y 10 mL 6. Baño de agua a 50°C 7. Balanza analítica

Cuestionario

1.- Explique a lo menos tres métodos de aislamiento y purificación de proteínas. 2.- ¿Existe posibilidad de que otros compuesto sean reconocidos por el reactivo de Biuret?, de ser así, ¿Cómo se alterarían los resultados obtenidos? 3.- ¿Qué sucede si una muestra no puede ser leída por el espectrofotómetro debido a que se sale de escala de medición del espectrofotómetro? ¿Qué haría en ese caso?

4.- ¿Cómo determinaría usted la concentración de hemoglobina de una muestra de sangre?.



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Laboratorio Nº 4: Enzimología I

INTRODUCCIÓN

Las enzimas son biocatalizadores proteicos esenciales para mantener los

procesos metabólicos a velocidades compatibles con la vida, contribuyendo además a su regulación. Debido a su naturaleza proteica las enzimas pueden modificar su actividad por cambios de temperatura y pH, factores que pueden alterar su estructura molecular, provocando su desnaturalización. En general una reacción química aumenta su velocidad de reacción al aumentar la temperatura, pero en el caso de las reacciones catalizadas por enzimas (en Humanos), este efecto se observa sólo entre 35 y 40 ºC, ya que a temperaturas mayores la enzima se desnaturaliza debido a la ruptura de enlaces débiles, principalmente puentes de hidrógeno y la pérdida de su conformación nativa. Existen otros casos, por ejemplo las bacterias termófilas, en las cuales las enzimas pueden funcionar hasta 100° C

Debido también a su naturaleza proteica la enzima presenta numerosos grupos

ionizables, los que derivan de los radicales de sus aminoácidos constituyentes. Las alteraciones del pH pueden cambiar el grado de ionización de los grupos químicos involucrados en el sitio activo de la enzima, afectando su actividad catalítica.

Las enzimas son activas en un rango estrecho de pH, con una actividad máxima a

un valor de pH denominado pH óptimo. Por tal motivo la actividad enzimática se mide en presencia de tampones o amortiguadores de pH. OBJETIVOS Estas actividades prácticas tienen como objetivo que los alumnos

1. Se familiaricen con los procedimientos de laboratorio para manipular muestras biológicas.

2. Conozcan algunos procedimientos para determinar la actividad de una enzima en muestras biológicas.

3. Comprueben el efecto que tiene en la actividad de una enzima las variaciones de pH y temperatura.

ACTIVIDADES Objetivo: Estudiar el efecto de las variaciones de pH y temperatura sobre la actividad de la amilasa salival.

La amilasa salival es una enzima que rompe específicamente los enlaces glicosídicos α 1-4 de los polisacáridos. La hidrólisis del almidón por amilasa salival da como producto una mezcla de maltosa, maltotriosa (dextrinas) y glucosa. El almidón es un polisacárido formado por 2 tipos de cadena: amilasa (lineal), que presenta sólo enlaces α



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1-4 y amilopectina (ramificada), con enlaces α 1-4 y α 1-6. El almidón se reconoce químicamente por el color azul intenso que desarrolla en presencia de yodo, por lo que la hidrólisis enzimática del almidón se puede determinar por la pérdida del color azul de una mezcla de reacción.

PROCEDIMIENTO

A. Calcular la masa necesaria para preparar 500 ml de una solución de almidón a una concentración de 1%p/v

B. Efecto de la temperatura sobre la hidrólisis enzimática del almidón

Tubos 1 2 3 4 5

NaCl 0.9% p/v 1ml 1ml 1ml 1ml 3ml

Tampón fosfato pH 7.0 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml

Alimidon 1% p/v 2ml 2ml 2ml 2ml 2ml

Preparación enzimática 2ml 2ml 2ml 2ml -

Incubar a : 0°C 100°C 25°C 37°C 37°C

Al cabo de los 15 minutos agregue 1 gota de lugol, mezcle y observe. Anote y

discuta sus resultados.

C. Efecto del pH sobre la actividad de la amilasa salival

Tubos 1 2 3 4

NaCl 0.9% p/v 1ml 1ml 1ml 1ml

Tampón fosfato (1ml) pH5 pH7 pH9 pH9

Almidón 1% p/v 2ml 2ml 2ml 2ml

Preparación enzimática 2ml 2ml 2ml -

Mezcle y deje incubando a temperatura ambiente por 15 minutos. Al cabo de ese tiempo agregue una gota de lugol, mezcle y observe. Anote y discuta sus resultados. Reactivos y Materiales

1. Preparación enzimática: Lavado bucal con agua destilada, filtrado y mantenido en hielo.

2. Tampón fosfato 0.1 M, pH 5.0, pH 7.0 y pH 9 3. Solución de Cloruro de sodio 0.03 M 4. Solución de almidón 1% p/v 5. Solución de lugol 6. Baño termoregulado y de agua hirviendo



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Cuestionario 1.- Almidón y celulosa son dos polímeros de D-Glucosa, indique la razón por la cual la celulosa no puede ser degradada por los humanos durante la digestión y sí puede ser degrada por los rumiantes. 2.- A nivel teórico, explique el efecto de la temperatura sobre la actividad biológica de una enzima. 3.- Indique el nombre y modo de acción de 3 agentes químicos denaturantes de proteínas. (fundamente)



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Laboratorio Nº 5: Enzimología II

Determinación de las Propiedades Cinéticas de la Enzima Fosfatasa Acida de Germen de Trigo

INTRODUCCIÓN

Las enzimas son proteínas con un gran poder catalítico y un alto grado de especificidad por su sustrato. Estas proteínas poseen gran importancia en todos los procesos bioquímicos. Actuando en forma concertada, catalizan cientos de reacciones que llevan, entre otros, al metabolismo de nutrientes, la conservación o transformación de energía o la biosíntesis de macromoléculas. La reacción más simple que pueden catalizar las enzimas está representada por la ecuación:

Donde E, S y P, representan a la enzima, al sustrato y al producto, respectivamente, mientras que ES y EP representan los complejos transitorios enzima-sustrato y enzima-producto. Para caracterizar el funcionamiento de una enzima, es importante determinar el como las condiciones ambientales, el pH y la temperatura, afectan su capacidad catalítica. En este trabajo práctico se trabajará con la fosfatasa ácida de germen de trigo, la cual cataliza la hidrólisis de fosfatos monoésteres, con liberación de fosfato inorgánico, según la siguiente reacción:

Dentro de los objetivos a cumplir se encuentra el determinar los parámetros cinéticos de esta enzima. En este ensayo, se usará un sustrato artificial, el p-nitrofenil fosfato (NPP). El grado de hidrólisis de éste se determinará espectrofotométricamente cuantificando el p-nitrofenol liberado, que en solución alcalina, absorbe fuertemente a 405 nm.



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OBJETIVOS Estas actividades prácticas tienen como objetivo que los alumnos

1. Conozcan algunos procedimientos clásicos para determinar actividad enzimática.

2. Verifiquen el efecto de inhibidores sobre los parámetros cinéticos de una enzima.

3. Apliquen los conceptos de sustrato, inhibidores competitivos, inhibidores no

competitivo en la interpretación de sus resultados.

4. Observen la variación de la concentración de sustrato en el tiempo, determinen la

constante de velocidad de primer orden de la reacción catalizada y sean capaces

de expresar gráficamente sus resultados

PROCEDIMIENTO 1.- Elaboración de una curva de calibración de p-nitrofenol.

Prepare 6 tubos que contengan:

1 2 3 4 5 6

pNP 60 uM (mL) 0,0 0,5 1,0 2,0 3,0 4,0

NaOH 0,05 M (mL) 4,0 3,5 3,0 2,0 1,0 0,0

Para cada uno de los tubos lea la absorbancia a 405 nm. Verifique que su blanco sea el apropiado.

Graficar la curva obtenida. 2.- Determinación de los parámetros cinéticos de la fosfatasa ácida de germen de trigo y el efecto del fosfato en la reacción.

Prepare un serie de 10 tubos que contengan

1 2 3 4 5

pNPP 2,5 uM (mL) 0,00 0,25 0,50 0,75 1,00

Buffer pH 5 (mL) 2,00 1,75 1,50 1,25 1,00

INCUBAR 5 min. A 37°

Enzima 0,5 mg/mL (mL) 0,50 0,50 0,50 0,50 0,50

6 7 8 9 10

pNPP 2,5 uM (mL) 0,00 0,25 0,50 0,75 1,00

Buffer pH 5 (mL) 1,50 1,25 1,00 0,75 0,50

Fosfato 10 mM (mL) 0,50 0,50 0,50 0,50 0,50

INCUBAR 5 min. A 37°

Enzima 0,5 mg/mL (mL) 0,50 0,50 0,50 0,50 0,50



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Mezcle por inversion e incube 10 minutos a 37°. No olvide preparar inmediatamente 10 tubos que contengan 4,5 mL de NaOH 0,05 M.

Pasados los 10 minutos de incubación a 37°, retire una alícuota de 0,5 mL adicionándoselas a los respectivos tubos que contengan 4,5 mL de NaOH 0,05 M.

Determine la absorbancia a 405 nm de cada uno de los tubos.

Confeccione las curvas pertinentes tanto en presencia como en ausencia de fosfato y determine los valores de Km y Vmax.

Analizar y discutir los resultados según los objetivos planteados. Cuestionario 1.- Se estudia la cinética del estado estacionario de una enzima en ausencia y presencia de un inhibidor (inhibidor A). La velocidad inicial viene dad en función de la concentración de sustrato en la siguiente tabla:

V[(mmol/L)min]

[S] (mmol/L) Sin inhibidor Inhibidor A 1.25 1.72 0.98 1.67 2.04 1.17 2.50 2.63 1.47 5.00 3.33 1.96 10.00 4.17 2.38

a) ¿Qué tipo de inhibición (competitiva o no competitiva) se produce?

b) Determine Vmax y KM en ausencia y en presencia del inhibidor.

2.- El cianuro de potasio (KCN) es un inhibidor de la cadena transportadora de electrones. ¿Cómo podría afectar este compuesto al ciclo de Krebs?. Haga una descripción detallada. 3.- Considere el destino del piruvato marcado con 14C en cada una de las siguientes posiciones: carbono1 (carboxilo), carbono2 (carbonilo) y carbono 3 (metilo). Prediga el destino de cada carbono marcado durante el ciclo del ácido cítrico.

guía labs b005 2-2012

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