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Guía de Practicas de Biología Celular y Molecular Universidad Ricardo Palma

PRACTICA Nº 8

IDENTIFICACION DE CITOESQUELETO Y ORGANELAS CELULARES

I) Identificación de citoesqueleto:

El citoesqueleto de las células eucarióticas está formado por filamentos de actina, filamentos intermedios y microtúbulos. Estas estructuras definen la forma de las células.

Funciones del citoesqueleto: Estabilidad y forma celular. Movimiento celular. División celular. Movimiento de orgánulos internos

Microtúbulos: los microtúbulos forman husos mitóticos, rayos astrales de células en división, elementos longitudinales de los axones y de los flagelos. La tubulina es la principal proteína. Ciertas drogas interfieren en la polarización y despolarización, alcaloides como la colchicina, vinca (esta última se utiliza como drogas antimitóticas en el tratamiento antitumoral.Microfilamentos: la actina es la proteína más abundante en las células de los mamíferos. Los filamentos de actina son esenciales para posibilitar los movimientos celulares, para determinar la dinámica de la forma celular, para la adhesividad entre las células o entre células y matrices, y en múltiples niveles para la organización de la superficie celular.Filamentos intermedios: le dan a la celula un soporte puramente mecanico. Son estructuras fuertes, estables, insolubles, resistentes a los cambios de temperatura y dispuestas en densas redes tridimendionales en el citoplasma que se relacionan y forman parte de la uniones intercelulares.

El movimiento intracelular, como por ejemplo: ciclosis realizado en las plantas, depende del ordenamiento de los filamentos de que a manera de rieles de un tren permiten que circulen organelas como los cloroplastos. Las estructuras especializadas por los microtúbulos, son los centríolos, los cilios y los flagelos y el huso mitótico.Los flagelos y cilios son estructuras piliformes ancladas por uno de sus extremos y capaces de ejecutar diversos movimientos con su extremo libre. Gracias a sus movimientos coordinados, desempeñan un importante papel en la locomoción. Los cilios pueden ser encontrados en tejido epitelial y los flagelos en los espermatozoides. Dentro de los protozoarios tenemos el Paramecium, Balantidum, que presentan cilios y los tripanosomas, la Euglena, etc. que poseen flagelos.

II) Identificación de organelas:

Las células eucarióticas se caracterizan por tener un subsistema o nivel de organización de organelas, en estos orgánulos tienen lugar actividades celulares específicas; las organelas se caracterizan por presentar una membrana que separa el compartimiento interno de la organela del entorno citoplasmático.La enorme superficie de membranas internas proporciona a las células no solamente un soporte para la localización ordenada de multiples sistemas enzimáticos diferentes, sino que les provee de subcompartimentos funcionales cerrados que constituyen los diferentes organoides

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Guía de Practicas de Biología Celular y Molecular Universidad Ricardo Palmamembranosos especializados, cada uno de ellos con estructura, dotación enzimática y propiedades funcionales que lo caracterizan.Numerosos compartimentos rodeados de membrana son responsables de funciones celulares vitales, entre las cuales se encuentran la separación y asociación de sistemas enzimáticos, la digestión intracelular de sustancias, la distribución de cada una de las miles de proteínas diferentes de la célula hacia sus destinos finales.El mayor sistema de membranas corresponde al retículo endosplasmático (RE), de donde se originan la mayoría de las organelas celulares, como el aparato de Golgi y los lisosomas. Algunas vesículas provenientes del RE o del Aparato de Golgi, forman orgánulos limitados por membranas llamados lisosomas, que contienen hidrolasas ácidas (enzimas que degradan polímeros en sus unidades monoméricas). Los lisosomas varían en cuanto a su tamaño y forma y en una célula pueden encontrarse en grandes cantidades. Los lisosomas intervienen en la digestión celular uniéndose a las vesículas endocíticas o fagocíticas constituyendo lisosomas secundarios o fagolisosomas.Las células eucarióticas poseen organelas que traducen la energía y reciben el nombre de mitocondrias y cloroplastos. Estas organelas se caracterizan por tener doble membrana que separa su compartimiento interno o matriz del medio citoplasmático. En la membrana interna de ambas organelas se encuentra una serie de proteínas que define en conjunto la llamada cadena transportadora de electrones, así como presentan una estructura denominada complejo F1, F0, a través del cual y por quimiosmosis se va a formar el ATP.Tanto los lisosomas como las mitocondrias no pueden ser observados directamente al microscopio óptico, es necesario para ello, utilizar colorantes en concentraciones muy diluidas, de tal manera que no presenten toxicidad a las células.Actualmente existen muchas evidencias de que el rojo neutro en concentraciones no tóxicas es tomado por la célula y se concentra en el sistema lisosomal.

Las mitocondrias pueden ser observadas en células vivas mediante coloración con una solución de verde de Janus muy diluida con la cual toman un color azul - verdoso.Esta coloración se debe al sistema citocromo - oxidasa, esta es una hemoproteína con amplia distribución en muchos tejidos, constituye el componente terminal de la cadena de acarreadores respiratorios presente en la mitocondria, por tanto, es el componente responsable de la reacción por la cual los electrones resultantes de la oxidación de las moléculas del sustrato, catalizada por las deshidrogenasa, se transfiere al aceptor final, oxigeno. En cambio en el citoplasma el colorante es reducido a su leucobase.

La presencia de pigmentos fotosíntéticos en el cloroplasto, hace posible observarlos sin necesidad de utilizar colorantes.

II) OBJETIVOS

Al finalizar la práctica el alumno será capaz de: Identificar los movimientos dependientes de microflamentos y de microtubulos. Describir el movimiento de cilios y flagelos Explicar las funciones de cilios y flagelos. Reconocer lisosomas y mitocondrias e preparaciones frescas. Utilizar los colorantes adecuados para cada organela.

III) MATERIAL

Por grupo de practica: 1. Muestra de semen2. Hojas de Elodea (planta acuática)

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Por mesa de trabajo:1. Material indispensable2. Agua estancada en frasco oscuro (recolectaela con 4 días de anticipación y añadirle pocas

hojuelas de avena).3. Hisopos largos (3 unid.)

El laboratorio proporcionara:1. Suero fisiológico (en goteros) 2. Solución de cristal de violeta3. Solución de rojo neutro (1/20000)4. Solución de verde de Janus (1/10000)5. Pipetas pasteur 6. Pipetas rotuladas7. Tubos de ensayo 8. Gradilla 9. Papel lente.10. Incubadora

III) PROCEDIMIENTO

CITOESQUELETO:

a) Observación de cilios en Paramecium.1. Coloque una gota de Agua estancada sobre un porta objeto y cubran una laminilla.2. Observe con el objetivo de menor aumento.3. Ajuste el diafragma para incrementar el contraste.4.- Observe el movimiento de los cilios en el Paramecium.

b) Observación de flagelos1. Diluya el semen humano con suero fisiológico, mezclando una gota de semen y tres de

suero.2. Coloque una gota de la dilución anterior en el portaobjeto y cubra con una laminilla.3. Observe al microscopio a 10 y 40 la forma y el movimiento de los espermatozoides.4. Regule la entrada de luz, para mejorar el contraste.5. Después de observar esta preparación coloque una gota del colorante cristal violeta en el

tubo de ensayo donde se realizó la dilución.

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Guía de Practicas de Biología Celular y Molecular Universidad Ricardo Palma6. Tome una muestra con la pipeta pasteur y colóquelo en un portaobjeto cubra con la

laminilla y observe nuevamente.

c) Observación de cloroplastos y movimiento de ciclosis1. Coloque una hoja del Elodea sobre el cubreobjeto, añadas una gota de agua y cúbralo con

una laminilla.2. Observe al microscopio a 10 y 40 .3.- Describa la forma como se mueven los cloroplastos

Elodea sp.

ORGANELAS:

a) Observación de lisosomas en protozoarios

1. Revisar la muestra de agua estancada para determinar la presencia de Paramecium.2. Si se observa Paramecium en la muestra se procederá a incubar 1 ml. de la muestra de

agua estancada con 1 ml de la solución rojo neutro a 37° C por 15 minutos.3. Coloque una gota de la incubación en el portaobjeto, coloque la laminilla y observe a 10

y 40.

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b) Observación de mitocondrias en epitelio bucal

1. Obtenga una muestra de células de epitelio bucal mediante un raspado suave utilizando un hisopo largo.

2. Realice el frotis extendiendo la muestra sobre una lámina portaobjetos, deje secar a medio ambiente.

3. Agregar unas gotas de colorante verde de Janus hasta cubrir la muestra por 10 minutos.4. lavar con agua corriente y deje secar al medio ambiente.5. Observe a 10 x y 40x.

V .- Cuestionario:1.- ¿Cuáles son los componentes del citoesqueleto?2. ¿Qué función tiene el flagelo en el movimiento de los espermatozoides?3. De ejemplos de células humanas que presentan cilios y flagelos. ¿En que tipo de tejidos se localizan y cual es la función que tienen este tipo de células?4. Que función cumple los filamentos de actina en el tejido muscular?5. En que parte de la mitocondria se localiza la citocromo oxidasa?6. Describa la función que realizan los lisosomas.7. Escriba la importancia de la mitocondria.8.- Por que reacciona la mitocondria con el verde de Janus?9.- Si hiciéramos una tinción posterior para fosfatasa acida, veríamos que los gránulos son

lisosomas . Porque?

VI) REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

Smith C.A. y Wood E.J., 1997: Biología Celular Ed. Addison - Wesley Iberoamericana Fred H.E, 1990: Biología. Edit. Mc Graw Hill.

Smith C.A. y Wood E.J., 1997: Biología Celular Ed. Addison - Wesley Iberoamericana .Cooper G. 2002. La Célula. Ed. Marban Libros.

http://books.google.com.pe/books?id=QcU0yde9PtkC&pg=PA512&dq=la+vida+en+la+tierra&hl=es-419&sa=X&ei=AwL5U_GqF87msASdu4KgBA&ved=0CDoQ6AEwBQ#v=onepage&q=la%20vida%20en%20la%20tierra&f=false

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Hoja de Resultados

CITOESQUELETO: parte b.

Muestra: ……………………………….......................

Celula que observa: ……………………………….

Colorante: ……………………………………………...

Estructuras: …………………………………………...

ORGANELAS parte a:

Muestra: ……………………………………………….

Micoorganismo: ……………………………….…..

Organela: ……………………………………………..

Colorante: …………………………………………….

ORGANELAS parte b:

Muestra: ……………………………………………….

Celula que observa ………………………………..

Colorante: ………………………………………….….

Reacción que evidencia la presencia

de mitocondrias: …………………………………………..……..

Conclusión: ……………………………………………………………………………………………………………….

……………………………………….. V°B° Dra. Chambers Fecha: ………………….

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Guía de Practicas de Biología Celular y Molecular Universidad Ricardo PalmaPRACTICA N° 09

CROMATINA SEXUAL

Introducción:

Murray Llewellyn Barr (Junio 20, 1908 – Mayo 4, 1995) un Médico Canadiense y un investigador en Medicina, descubrió en 1948 una importante estructura celular a la que se denominó “Cuerpo de Barr”.

Corpúsculos o cuerpos de Barr: es una masa condensada de cromatina sexual ubicada en el núcleo de las células somáticas de las hembras debido a un cromosoma X inactivo. El fenómeno de inactivación del cromosoma X es un ejemplo del papel de la heterocromatina en la expresión génica. En muchos animales, incluyendo los humanos, las hembras tienen dos cromosomas X y los machos tiene un cromosoma X y un cromosoma Y. El cromosoma X posee miles de genes que no están presentes en el pequeño cromosoma Y, de este modo las hembras tienen el doble de genes localizados en el cromosoma X que los machos. A pesar de estas diferencias, las células de las hembras y de los machos tienen una misma cantidad de proteína codificadas por los genes del cromosoma X. Esto es debido a un mecanismo de compensación de dosis en el que uno de los cromosomas X de las células de las hembras se inactiva en etapas tempranas de desarrollo, transformándose en heterocromatina. Las células que se reproducen mitóticamente de esas células embrionarias tienen el mismo cromosoma inactivado.Esta heterocromatica, se puede observar como una masa plano convexo, con un tamaño de 0.7 * 1.2 micras. El corpúsculo de Barr solamente se encuentra en las células de la mujer y nunca en las del hombre, en condiciones normales. Según la hipótesis de Lyon (propuesto por Mary Lyon en 1966), uno de los dos cromosomas X en cada célula somática femenina es genéticamente inactivo. A esta observación siguió el desarrollo de una técnica sencilla que permitía detectar cuerpos de Barr en células de mucosa oral.

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Como resultado de su aplicación se reconoció que las células femeninas eran “cromatina positiva” mientras que las masculinas eran “cromatina negativa”, pero que existían excepciones: Las pacientes con síndrome de Turner no tienen cuerpos de Barr. Esta una enfermedad genética y, a su vez, una enfermedad rara caracterizada por una alteración en el cromosoma X o ausencia del segundo cromosoma X en algunas o en todas las células de su cuerpo, expresándose en la falta de desarrollo de los caracteres sexuales primarios y secundarios. Esto confiere a las mujeres que padecen el síndrome de Turner un aspecto infantil e infertilidad de por vida. Su incidencia es de alrededor de 1/2.500 niñas.Los pacientes con síndrome de Klinefelter o síndrome 47XXY si presentan cuerpos de Barr, es una condición que se presenta en los hombres como resultado de la presencia de un cromosoma X extra y cuyo síntoma más común es la infertilidad.

Estos hallazgos también demostraron que en presencia de un cromosoma Y, independientemente del número de cromosomas X, el embrión humano se desarrolla como macho, mientras que en ausencia del Y se desarrolla como hembra.

Objetivos:

- Al término de la práctica el alumno sabrá verificar el sexo en forma genética de un individuo, mediante la detección de los cuerpos de Barr en células epiteliales de la cavidad bucal.

Materiales:La mesa de trabajo deberá traer:04 Bajalenguas Material obligatorio (por alumno)

El laboratorio brindará:AcetorceinaMicroscopiosAceite de inmersión

Procedimiento:Cada alumno procederá de la siguiente manera:1. Por separado el hombre y la mujer se enjuagan la boca con agua varias veces.

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Guía de Practicas de Biología Celular y Molecular Universidad Ricardo Palma2. Se obtienen células epiteliales del interior de la mucosa oral, raspando suavemente la parte interna de la mejilla con un bajalenguas.3. Descartar esta primera muestra.4. Tomar la segunda muestra la cual se va a colocar en un portaobjetos limpio y seco, haciendo un frotis o extendido sobre el mismo portaobjetos, deja secar la muestra al medio ambiente por unos minutos.6. Una vez seca la muestra, se le agrega una gota de acetorceina. Cubre con el cubreobjetos y espera aproximadamente 10 minutos.7. Observar con el objetivo de 40, localizando las células epiteliales y posteriormente con el objetivo de 100, procura que se coloque una gota de aceite de inmersión sobre el cubreobjetos, entre la preparación y el objetivo de 100.8. Localiza los núcleos de las células y observa cuidadosamente. Los cuerpos de Barr son corpúsculos pequeños que se localizan muy próximos a la cara interna de la membrana nuclear.10. Dibuja los resultados obtenidos de las muestras comparativas de hombre y mujer.

Cuestionario:

1.- Que otros Síndromes hay relacionados al cromosoma X? explique cada uno de ellos.2.- En que otras células podemos encontrar Corpúsculos de Barr.3.- Que es la heterocromatina?

Hoja de resultados

Muestra: ………………………………………………………….

Colorante: ………………………………………………………

Estructura que señala el puntero: ……………………………..

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PRACTICA Nº 10

NÚCLEO INTERFASICO

I) INTRODUCCIÓN:

El núcleo es el compartimiento de las células eucarióticas donde se encuentran las moléculas biológicas portadoras de la información genética: ADN y ARN, asociadas con proteínas.

El ADN asociado a proteínas determina la asociación supramolecular conocida como CROMATINA. Cuando el ARN se asocia con proteínas forma el NUCLÉOLO, que también esta integrado por el ADN nucleolar. Esta delimitado por la envoltura nuclear, compuesta por dos membranas concéntricas: una interna, que se halla sostenida por la lamina nuclear y otra externa que se continua con la membrana del retículo endoplasmatico. La envoltura nuclear contiene poros, los cuales son un conjunto de proteínas que forman una estructura llamada complejo poror, a través de los cuales se realiza el intercambio de sustancias núcleo-citoplasma.

Los motivos por los cuales las moléculas de ADN han sido confinadas en un compartimento aislándolas de los componentes citoplasmáticos serian:

1. Proteger al ADN de posibles colisiones generadas durante los desplazamientos de las proteínas motoras asociadas a los microtubulos y a los filamentos de actina, esenciales para transportar a los elementos citoplasmáticos.

2. Poder completar el procesamiento de los ARNm antes que se inicie la síntesis proteica, ya que esta debe producirse a partir de ARNm plenamente formados.

Durante su ciclo vital, el núcleo sufre cambios morfofisiológicos muy importantes que permiten mantener la estabilidad celular (núcleo interfásico) por un lado y también originar otras células (núcleo en división).La forma del núcleo interfásico determina la forma de la célula, las células cúbicas tiene un núcleo redondo, las células alargadas tiene un núcleo ovalado, las células aplanadas tiene un núcleo plano. Sin embargo existen una variedad de formas de núcleo en células altamente especializadas.

Utilizando como ejemplos los glóbulos blancos del tejido sanguíneo y mediante la coloración con Wright o Giemsa, Ud, podrá reconocer los diferentes núcleos que caracterizan a cada glóbulo blanco.Un glóbulo blanco algunos presentan granulaciones en el citoplasma y un núcleo a veces lobulado estos son de forma variable, debido a su migración en todos los tejidos entran y salen de los capilares por los movimientos amiboideos y ante gérmenes o sus toxinas presentan un quimiotaxismo positivo, es decir, son atraídos hacia ellos por las sustancias que difunden en el medio. Este fenómeno es conocido con el nombre de fagocitosis, o sea la propiedad de absorber y digerir a los gérmenes.

Los leucocitos polimorfonucleares presentan núcleo lobulado y citoplasma granuloso, tenemos: Neutrófilos: núcleo lobulado y su citoplasma se tiñe con colorantes neutros. Son fagocitos y

se forman en la médula ósea. Eosinófilos: Gránulos del citoplasma mas grandes y se tienen con colorantes ácidos. Basófilos: presentan gránulos que se tiñen con colorantes básicos.

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II) OBJETIVOS:* Reconocer las diferentes formas de núcleos y su ubicación en las células sanguíneas.* Diferenciar los tipos de núcleos en diferentes tejidos. Aplicar técnicas para su coloración e identificación.

III) MATERIALEl alumno deberá traer:

1. Material indispensable.

El laboratorio contará con:1. Microscopio compuesto de campo claro2. Colorante WRIGHT3. Agua destilada4. Lancetas 5. Algodón6. Alcohol7. Aceite de inmersión8. Papel lente9. Láminas patrón.

IV) PROCEDIMIENTO

1. Con ayuda de una lanceta desechable, realice una punción del pulpejo del dedo anular de la mano izquierda, previa desinfección con algodón y alcohol.

2. Tome una gota de sangre y haga un frotis fino sobre el portaobjeto como indica el siguiente dibujo:

3. Colocar el frotis extendido ya seco, sobre una base plana en posición totalmente horizontal.

4. Agregar el colorante Wright hasta cubrir la lámina portaobjetos, inmediatamente agregar sobre el colorante 5 gotas de agua destilada y homogenizar soplando suavemente de arriba hacia abajo hasta que se forme una capa plateada.

5. Dejar reposar la mezcla por 10 minutos.6. Lave con agua corriente y dejar secar al medio ambiente, si es posible con la lamina en forma vertical. 6. Observe al microscopio con el objetivo de 10x, luego agregar una gota de aceite

De inmersión utilice el objetivo de 100x para la observación de las células y núcleos. 9. Diferencie las diferentes formas de núcleo en los neutrofilos, basofilos, eosinofilos,

monocitos y linfocitos.10. Dibuje cada forma de núcleo.

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V) CUESTIONARIO

1.- Explique la relación existente entre estructura y función nuclear.2.- Determina cual son los valores normales en la formula leucocitaria en porcentaje.3.- Explique con un ejemplo, lo que ocurre al incrementarse o disminuir el porcentaje de los diferentes leucocitos en la formula leucocitaria.4.- Que es la anemia?


Berkaloff, A,., Boruguet, J., Lacroix, J.C. 1980. Biología y Fisiología Celular. Vol II Ed. Omega S.A. Barcelona 256 Bregman, A. A. 1983. Laboratory Investigations in Cell Biology. Ed. John Wiley & Sons. New York, 253 pag.

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Guía de Practicas de Biología Celular y Molecular Universidad Ricardo PalmaHoja de Resultados

Muestra: SangreColorante: WrigthTécnica utilizada para obtener la muestra: Punción de la yema del dedoCélula que observa:

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Glóbulo Rojo y Plaquetas

Basófilos

NeutrófilosEosinófilos

Linfocitos Monocitos


PRACTICA Nº 11

CICLO CELULAR

I) INTRODUCCIÓN:

Las células nuevas solo se originan de otras células vivas. Este proceso se llama División Celular. Un tipo de división celular es la mitosis que conduce a la producción de células con características genéticas idénticas a las de su antecesora, mientras que en la meiosis se producen células con la mitad del contenido genético de la célula madre.

El ciclo celular constituye el proceso básico de la génesis de nuevas células, y se extiende desde su formación de una célula, por división de la célula madre, hasta su propia división en dos células hijas. Esta unidad de tiempo represente EL CICLO DE VIDA DE UNA CÉLULA EN PROLIFERACION y constituye una unidad de repetición en todo proceso de reproducción o proliferación celular.El ciclo celular puede dividirse en dos fases principales: La fase M y la Interfase.

La Fase M: es el periodo en el que el contenido de la célula se divide, esta fase incluye: El proceso de mitosis, durante el cual los cromosomas duplicados se separan en dos

núcleos. La citocinesis, en la que toda la célula se divide en dos células hijas.

La interfase: es el periodo entre las divisiones celulares, es un intervalo donde la célula crece, y efectúa diversas actividades metabólicas. Durante la interfase ocurren muchos preparativos para la mitosis próxima, incluye la replicación del ADN celular. La interfase cuenta con 03 fases:

Fase G1 (gap1) que corresponde al intervalo entre la mitosis y el comienzo de la replicación del ADN. Durante esta fase la célula es metabólicamente activa y está creciendo, pero no se replica su ADN

Fase S (síntesis): durante la que se produce la replicación del ADN. Fase G2: aquí prosigue el crecimiento de la célula y en la que se sintetizan proteínas en

preparación para la mitosis.A diferencia de la rápida proliferación en las células embrionarias, algunas células del animal adulto cesan por completo su división y muchas otras células solo se dividen ocasionalmente, cuando es necesario reemplazar la perdida de las células debido a la lesión o a la muerte celular. Entre este último tipo de células se incluyen a los fibroblastos de la piel, así como a las células de muchos órganos internos, como el hígado, el riñón y el pulmón. Estas células salen de G1 para entrar en un estado de reposo del ciclo denominado G0, en el que permanecen activas metabólicamente pero no proliferan a no ser que sean requeridas para ello mediante las señales extracelulares apropiadas.

El final de la mitosis da como resultado a dos células e incluye la división nuclear o cariocinesis y la división del citoplasma o citocinesis.

Para el estudio del ciclo de división celular, se utilizan los índices del ciclo mitótico, interfásico y de fases.

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Guía de Practicas de Biología Celular y Molecular Universidad Ricardo PalmaCICLO CELULAR

Indice Mitótico: está dado por el porcentaje de células proliferativas que se encuentran en mitosis. En el caso de las células meristemáticas de la raíz de la cebolla, el criterio para identificarlas de aquellas que han iniciado los primeros estadios de diferenciación es considerar como meristemáticas a las que tienen núcleo con un diámetro superior a la tercera parte del eje mayor de la célula.

Indice Interfásico. Es el porcentaje de células proliferativas en interfase. Se calcule restando de 100, el índice mitótico.

Indice de Fases. Es el porcentaje de células mitóticas en cada una de sus fases.

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Guía de Practicas de Biología Celular y Molecular Universidad Ricardo PalmaDESCRIPCION DE LA MITOSIS

Profase: el comienzo de la profase queda determinado por la aparición de los cromosomas condensados, cada uno de los cuales está constituido por dos cromátidas hermanas. Estas cromátidas se mantiene unidas a través del centrómero, que es una secuencia de ADN a la que se unen proteínas dando lugar al cinetocoro, este es el lugar de anclaje de los microtúbulos del huso. AL final de la profase ocurre la rotura de la envoltura nuclear lo que posibilita la interacción entre el huso y los cromosomas. La fosforilación de las moléculas de la lamina por la cinasa mitótica Cdk promueve el desensamblaje de la lamina nuclear que constituye la capa interna de la envoltura nuclear.

Prometafase: Los cromosomas se mueven al ecuador del huso.

Metafase: Se caracteriza por la organización del huso mitótico. Los microtúbulos de los polos opuestos del huso se acaban uniendo a los dos cinetocoros de las cromátidas hermanas y el equilibrio de fuerzas que actúa sobre los cromosomas hace que estos queden alineados en la placa metafásica en la mitad del huso. Este huso está constituido por microtúbulos cinetocóricos, que se unen a los cromosomas y por microtúbulos polares, que se superponen unos con otros en el centro de la célula. Además los pequeños microtúbulos astrales irradian desde los centrosomas hacia la periferia celular.

Anafase: el paso de la metafase a la anafase se debe a la proteólisis de proteínas reguladoras mediada por la ubiquitinas, la cual se dispara por la activación de una ubiquitina ligasa denominada complejo promotor de la anafase.El movimiento de los cromosomas hacia el polo se acompaña de un acortamiento evidente en los microtúbulos cromosómicos. Este mecanismo de separación recibe el nombre de DISYUNCION.

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Telofase: Los cromosomas empiezan a desarrollarse, los nucléolos están en fase de reorganización y la envoltura nuclear se forma paulatinamente alrededor de los cromosomas. Simultáneamente se produce la citocinesis (división del citoplasma).

En esta práctica se estudiará el ciclo de división celular en las células meristemáticas de la raíz de Allium cepa "cebolla". Este sistema es muy adecuado porque la población celular está en equilibrio dinámico y los cromosomas son relativamente grandes, con número diploide 2n = 16.

Observación a 10 de las diferentes fases de la mitosis. Coloración con hematoxilina – eosina.

II) OBJETIVOSAl término de la práctica los estudiantes serán capaces de:

Reconocer las fases de la mitosis. Reconocer las características del núcleo interfásico en las células meristemáticas de cebolla. Hallar los índices interfásico, de fases y mitótico en el modelo estudiado

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Guía de Practicas de Biología Celular y Molecular Universidad Ricardo PalmaIII) MATERIALES

Que debe traer la mesa de trabajo:

1. Raíces de bulbo de cebolla. (La cebolla se remojara previamente por 02 días en un recipiente con agua.

2. Material obligatorio.3. Lápiz con cabeza de borrador.4. Papel toalla.

Que proporciona el laboratorio:

1. Orceina acética - clorhídrica2. Mechero de alcohol3. Placas Petri.4. Mascarillas.5. Papel filtro. 6. Microscopio compuesto de campo claro.7. Fósforos.8. Papel lente.9. Láminas patrón.

IV) PROCEDIMIENTOS

1. Desarrollo De Las Raíces

1.1 Coloque bulbos de cebolla en vasos pequeños con agua, de tal manera que la parte inferior toque el agua, como lo indica el grafico, unas 72 horas antes de la práctica. El agua debe removerse cada 24 horas.

Palitos de madera Agua

1.2. Cubra el frasco con una cartulina negra, con la finalidad de dar oscuridad a las raíces.1.3. Las raíces que se desarrollan se usarán en la práctica.

2. Preparación De Las Láminas Para Observar Las Diferentes Fases De La Mitosis.

1. Corte unos 2 mm. de la parte apical de la raíz, unas 4 o 5 raicillas y colóquelas en una placa petri que contenga Orceina acética.

2. Caliente cuidadosamente el petri en la llama de un mechero hasta 60 C aproximadamente, momento que coincide con la emisión de vapores blancos (la temperatura puede controlarse pasando el material de vidrio por el dorso de la mano. No debe de permitirse la ebullición del colorante).

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3. Deje enfriar y repita esta operación tres veces.4. Después del último calentamiento deje enfriar y reposar durante 10 minutos.5. Coloque una raicilla en una lámina porta objeto y añada una gota de Orceina fría.6. Cubra la muestra con una laminilla.7. Coloque un trozo de papel filtro sobre la laminilla y con el borrador de un lápiz golpee el

material describiendo círculos concéntricos para permitir la extensión del tejido meristemático. Este aplastamiento se denomina "squash".

8. Observe la preparación a menor y mayor aumento (40).9. Identifique y haga esquemas de células meristematicas en interfase con sus prominentes

nucléolos, células en profase, metafase, anafase.

V) CUESTIONARIO1. ¿Qué es una población celular en equilibrio dinámico?2. ¿Por qué los cromosomas no son visibles durante la interfase?3. ¿En qué etapa de la mitosis los cromosomas se observan con mayor facilidad? Porqué?.4. ¿Del índice mitótico, ¿qué fase observo en mayor frecuencia? ¿Hay alguna relación con el

tiempo de duración de cada fase y con la hora del día?5. ¿Cuáles son las características de los núcleos interfásicos?


Smith CA. y Wood EJ. 1997: Biología Celular Ed. Addison Wesley Iberoamericana.Karp, Gerald 2009: Biología cellular y molecular. Ed. Mc Graw Hill

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Raicillas con orceína

Guía de Practicas de Biología Celular y Molecular Universidad Ricardo PalmaHoja de Resultados

Muestra: Tejido meristemático de Allium cepaColorante: Orceína Acética.Fases que observa:

Hoja de Resultados

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Interfase Profase

Metafase Anafase

Telofase


Muestra: Corte Histologico de Tejido meristemático de Allium cepaColorante: Hematoxilina - EosinaFases que observa:

PRACTICA No. 1221

Interfase Profase

Metafase Anafase

Telofase


EXTRACCION DE DNA

I) INTRODUCCION

Técnicas en Biología Celular y Molecular

Se denomina así a todas las técnicas de laboratorio que se usan para aislar ADN o extraerlo en alta pureza, visualizarlo para ver su estado, cortarlo y pegarlo (nacimiento de la Ingeniería genética), amplificar una región en una enorme cantidad de moléculas (clonación de fragmentos en bacterias u otros vectores como virus y PCR), corte de una determinada región con enzimas de restricción para ver si por una mutación se gana o se pierde un sitio de restricción (análisis de mutaciones por RFLP o Restriction fragment lengt polymorphism), que significa: diferencias en los tamaños de los fragmentos de restricción debido a polimorfismos en el ADN entre otras.

Todas estas técnicas tiene diversas aplicaciones generalmente en el diagnóstico de enfermedades hereditarias, búsqueda de alelos más o menos frecuentes asociados a una característica que nos interesa seleccionar, diagnóstico de contaminación bacteriana en alimentos (detección de Escherichi coli 0157, cepas diferentes de Salmonellas, Mycobacterium sp) diagnóstico viral o de infección viral (HIV, Hepatitis C, PIF, otros), selección de marcadores moleculares para asistir en el mejoramiento genético de una especie, test de paternidad, diagnóstico de identidad forense, etc.

La primera técnica que todas las demás necesitan es la extracción del ADN, y para ello es necesario purificarlo desde cualquier tejido aunque usualmente se hace a partir de sangre. Se basa en una serie de lavados de la muestra y agregado de proteinasas que eliminan las proteínas del medio, detergentes para eliminar las membranas plasmáticas y luego ir purificando el ADN de esa mezcla de ARN proteínas y restos celulares.

Los ácidos nucleicos son macromoléculas de suma importancia biológica. Todos los organismos vivos contienen ácidos nucleicos en forma de acido desoxiribonucleico (ADN) y acido ribonucleico (ARN). Algunos virus solo contienen ADN, mientras otros solo poseen ARN.

Los cromosomas se componen de ADN y proteínas relacionadas, que en conjunto se conocen como cromatina. El empaquetamiento ordenado del ADN eucariota depende de las histonas, un importante grupo de pequeñas proteínas que poseen un inusual contenido alto de los aminoácidos básicos arginina y lisina. Las histonas se dividen en cinco clases: H1, H2A, H2B, H3, H4.Kornberg postulo que el ADN y las proteínas histónicas se organizan en subunidades repetidas denominadas nucleosomas. Ahora se sabe que cada nucleosoma contiene una partícula nuclear de nucleosoma que consiste en 146 pares de bases de ADN superenrrollado envuelto por lo menos dos veces alrededor de un complejo en forma de disco de ocho moléculas de histona.

El ADN constituye el depósito fundamental de la información genética. Esta información es copiada o transcripta en las moléculas de ARN, cuyas secuencias de nucleótidos contienen el código para las secuencias específicas de aminoácidos. Entonces se produce la síntesis de proteínas, en un proceso llamado de traducción del ARN. Esta serie de fenómenos ha recibido el nombre de dogma central de la Biología Molecular, que puede resumirse de la siguiente manera:

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En las células superiores el ADN se halla principalmente en el núcleo integrando los cromosomas. Una pequeña cantidad se halla en el citoplasma, dentro de las mitocondrias y los cloroplastos. El ARN se localiza tanto en el núcleo donde se forma, como en el citoplasma, donde tiene lugar la síntesis proteica.Toda la vida celular actual almacena su información en código de tripletes en moléculas de DNA lineales o circulares.

Se debe tomar en cuenta la estructura así como la secuencia de nucleótidos o de aminoácidos y la composición del producto del gen para evaluar las homologías y la magnitud y el significado de la divergencia evolutiva en los genes y sus productos.

La organización y secuencia del genoma es capaz de cambiar, ya sea con lentitud en el curso de la evolución o con rapidez a consecuencia de una trasposición. Los genes eucariotas que codifican proteínas casi siempre son miembros de una familia de multigenes, cuyos elementos evidencian datos de una evolución originada en un gen ancestral común. Se cree que el primer paso en este proceso es la duplicación de un gen, la mayor parte de las veces quizá por el fenómeno de entrecruzamiento desigual. Una vez ocurrida la duplicación, sería de esperar que la sustitución de nucleótidos modifique a varios miembros en diferentes formas y produzca una familia de secuencias repetidas con estructura similar pero no idéntica.

II) OBJETIVOS- Examinar un extracto crudo de DNA en células hepáticas- Interpretar el origen del sistema de Información: RNA – DNA

III) MATERIALESQue debe traer el alumno:

1. Hígado de pollo o res 2.- Material obligatorio

Que proporciona el laboratorio.

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Guía de Practicas de Biología Celular y Molecular Universidad Ricardo Palma1. 4 tubos de ensayo en sus gradillas 2. 10 ml de alcohol de 95% helado.3. Pipetas Pasteur4. Mortero de porcelana5. Propipetas6. Centrífuga 5 600 RPM7. Microscopio

IV) PROCEDIMIENTO1. Cortar Aprox. 10 gr. De hígado en trozos pequeños en una placa petri.2. Colocar el hígado cortado en trocitos en un mortero y agregarle 10 ml de solución de lauril

sulfato de sodio al 5%. Esta mezcla se debe homogenizar por aprox.1 hora (NO BATIR), al término del cual es llevado a centrifugar por 5 minutos a 5300 RPM.

3. Extrae el sobrenadante producto del centrifugado con una pipeta pasteur y colocarlo en un tubo de ensayo.

3. Agrega poco a poco, 3 ml de alcohol al 95% que haya estado refrigerado. Si el procedimiento se realizó como es debido, se habrá formado una capa de alcohol encima de la capa de extracto.

IV) CUESTIONARIO

1. Que indica esto con respecto a la estructura de la molécula de ADN?2. Con que finalidad se le agrega lauryl Sulfato de Sodio? Explique3. A qué se debe que en este tipo de experimentos los resultados sean casi siempre mezclas en

lugar de sustancias puras?4. Por que únicamente 20 aminoácidos están incluidos en el código genético cuando muchos

otros no están?5. Si 30% de las bases de una cadena sencilla de ADN es T, entonces 30% de las bases de las

cadenas es A. ¿Cierto o Falso? ¿Por qué?

Referencias bibliográficas:Karp, Gerald. 2008. Biología Celular y Molecular. Ed. Mc Graw Hill.

PRACTICA Nº 13

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GAMETOGENESIS

I) INTRODUCCIÓN Una de las características notables de los sistemas vivientes es la reproducción, esdecir la capacidad de originar nuevos individuos de su misma especie. Todo los los sistemas vivientes , utilizan el mecanismo reproductivo para perpetuar su especie .Se distinguen dos formas generales de reproducción: Asexual y Sexual

Los sistemas vivientes multicelulares, en su nivel de organización celular, han desarrollado procesos por los cuales las células somáticas o germinales originan descendientes a partir de una célula materna.

La mitosis, es el proceso reproductivo mediante el cual una célula somática da origen a dos células hijas con características idénticas a las que la origino. Este proceso a nivel de individuo recibe el nombre de Reproducción Asexual.

La meiosis, otro proceso reproductivo celular origina células germinales a partir de una célula somática. Este mecanismo consiste en que una célula (2n) da lugar a células (n) mediante la reducción del número de cromosomas a la mitad, produciéndose a su vez una recombinación génica. En el nivel de organización de individuo se denomina Reproducción Sexual.

Gameto génesis

Procesos espacio-temporales multifacéticos que ocurren en las gónadas o estructuras reproductivas de los organismos que se reproducen sexualmente , para dar origen a las células reproductivas llamadas gametosEn los animales y en los humanos, se pueden identificar los siguientes procesos:

GONIAS: Mitosis CITOS: Meiosis GAMETOS: Cito diferenciación.

Cada uno de estos procesos ocurre en etapas diferentes del ciclo biológico de los organismos vivos.

Los procesos gameto génicos en los mamíferos y en la especie humana, se inician y terminan en tiempos diferentes en las hembras y machos.

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ESPERMATOGENESISLa espermatogenesis, proceso que se inicia con la pubertad, es la secuencia de eventos celulares a través de los cuales las células troncales espermatogoniales se transforman en espermatozoides.

Tres categorías de células están involucradas en este proceso:

Espermatogonias ( mitosis) Espermatocitos (meiosis) Espermatidas (espermiogenesis)

Citología de las células germinales:

- Espermatogonias y mitosis: Células troncales situadas en la periferie de los tubulos seminíferos entre las células de Sertoli. Producto de las divisiones mitóticas puede distinguirse diferentes tipos de espermatogonias: tipo con núcleo muy tenido (Ad), con núcleo difuso (Ap) y tipo B. En el ser humano las células palidas de tipo Ason las que representan la reserva no cíclica y las oscuras son mitóticamente activas.

- Espermatocitos y meiosis: Espermatocitos primarios se originan de las espermatogonias tipo B. Células redondas , grandes con núcleos esféricos y algunos nucleolos que inician la meiosis (profase I : leptoteno, zigoteno, paquiteno, diploteno, diacinesis ).

- Espermatidas y espermiogenesis : La metamorfosis de espermatides a espermatozoides constituye el proceso de cito diferenciación denominado espermiogenesis . Incluye reorganización nuclear (histonas por protaminas), formación del acrosoma, ensamblaje de las estructuras del flagelo y reorganización citoplasmática cuya fase final es la liberación de los espermatozoides en el lumen de los tubulos seminíferos.

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FUNCION OVARICA El ovario es la estructura que en los mamíferos y en las mujeres , almacena y desarrollan los

ovocitos formados durante la vida embrio-fetal o en los primeros momentos del nacimiento. Algunas etapas de las funciones ováricas:

1. Crecimiento folicular y a tresia de los folículos pequeños.2. Crecimiento de los folículos ovulatorios y su regulación.3. Ruptura folicular en el momento de la evolución.4. Formación del cuerpo luteo y las funciones del mismo.

Foliculogenesis

La foliculogenesis debe medirse desde la formación de esta unidad estructural y funcional ovárica denominada folículo, hasta el momento que este es ovulado o se transforma en un folículo atresico . Este proceso es continuo.

Etapas del desarrollo folicular : Folículo primordial Folículo Primario Folículo Secundario o Antral Folículo Maduro o de Graaf

Folículo Primordial

Los folículos primordiales, son los folículos de reserva que están almacenados en el ovario, los cuales van a ser usados durante la vida de la hembra o de la mujer. Se localizan en la periferie de la corteza del ovario y contienen un ovocito primario. Este esta en la fase inactiva de dictioteno de la meiosis I. Alrededor del ovocito primario esta una sola capa de células epiteliales foliculares planas también conocidas como células de granulosa, rodeadas por una membrana basal.

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Folículo Primario:

En la Pubertad la secreción de la hormona estimulante del folículo (FSH) por la hipófisis estimula la el desarrollo de un pequeño número de los folículos primordiales. Se puede observar un incremento de tamaño del ovocito, asociado con el aumento de tamaño de las células de granulosa que lo rodean, convirtiéndose en células cubicas, en esta fase se denomina Folículo Primario Unilaminar. Las células de estroma que rodean al folículo se diferencian en la teca Si continua la secreción de la FSH las células de granulosa se dividen recubriendo al ovocito en crecimiento con múltiples capas, aquí se puede observar con mayor claridad la zona pelúcida. Este Folículo se conoce con el nombre de Folículo Primario Multilaminar.

Zona pelúcida: Cubierta celular de naturaleza glicoproteica que es sintetizada por el ovocito en crecimiento. Bloquea la polispermia.Específica para cada especie. Foliculo Secundario :

La capa interna de las células estromales (la teca interna) aumenta de tamaño al desarrollar las células un abundante retículo endoplasmático liso y mitocondrias con crestas tubulares (característica de las células productoras de hormonas esteroides); estas células comienzan a segregar estrógeno. La capa externa de células estromales (la teca externa) se mantiene pequeña y compacta y no posee actividad secretora conocida.

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Guía de Practicas de Biología Celular y Molecular Universidad Ricardo PalmaAquí aparece una laguna llena de líquido viscoso y rico en acido hialurónico, entre las células, este espacio se denomina antro.

Folículo Maduro o de Graaf: la hormona luteinizante se encarga de la maduración final del folículo. El ovocito se sitúa a un lado separado del líquido folicular por una capa de células de granulosa denominada cúmulo ooforo. La ovulación es precedida por una acumulación importante de liquido folicular, que exuda la teca interna, por separación del oocito primario y sus células de granulosa, provenientes del cumulus oophorus, y la terminación de la meiosis I. Por rotura del folículo maduro el oocito secundario producido, sobresale en superficie ovárica aun recubierto de células de granulosa que constituyen la llamada corona radiada, el oocito maduro penetra en el extremo proximal de la trompa vecina y la célula comienza su segunda división de maduración que llega hasta la metafase II, pero solo se completa si es fecundado el óvulo.

Antes de la ovulación el folículo contiene: 0.3 x 106 células de granulosa en rata 3.5 x 106 células de granulosa en oveja .50 x 106 células de granulosa en la mujer.

Atresia Folicular:

La atresia es el destino de la mayoría de los folículos. No existen criterios objetivos para detectarlos en las etapas de folículos primordiales e intermedios.

En humanos, ovejas y rata se pueden detectar folículos atrésicos:1. En folículos < 1mm de diámetro se caracterizan por una regresión del ovocito, retracción

de las células de la granulosa e hipertrofia de las células de la teca.2. En folículos grandes, la atresia puede visualizarse por la presencia de vesículas

picnóticas, el número de las cuales determina el estado de atresia.3. En los preantrales la atresia se visualiza por la invasión de la cavidad folicular por

fibroblastos.

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Cambios relacionados con la edad: decrece el número de folículos en todos sus tamaños. Esto es visible en humanos decrecen a partir de los 38 años. En muchos mamíferos el número de folículos en la reserva no son marcadamente afectados por la edad.

Cinética del crecimiento folicular: El índice mitótico de las células de la granulosa se utiliza para establecer el rango de crecimiento folicular.

II) OBJETIVOS:Al término de la práctica los estudiantes serán capaces de: Reconocer formas de espermatogonias, espermatocitos y espermátides. Reconocer las diferentes formas de folículos, desde el primordial hasta el folículo de Graaf o

maduro.

III) MATERIALESQue debe traer el alumno:

1. Material Obligatorio.

Que proporciona el laboratorio:

1. Microscopio compuesto de campo claro.2. Láminas preparadas de cortes de testículos y ovario.

IV) PROCEDIMIENTOSEspermatogénesis1. Observe con diferentes aumentos el corte de testículo humano teñido con HE.2. Distinga y dibuje como se disponen los distintos tipos celulares (espermatogonias,

espermatocitos, espermátides, espermatozoide) desde la base el túbulo seminífero a la luz del mismo.

Foliculogénesis

1. Observe con diferentes aumentos el corte de ovario teñido con HE y distinga el hilo, la médula y la corteza. La ovogénesis tiene lugar en la corteza ovárica.

2. Usando diferentes aumentos reconozca y dibuje: folículo primordiales y folículos en crecimiento: primarios, secundarios, o folículos antral y de Graff.

3. En el folículo de Graff identifique el ovocito.4. Identifique folículos atrésicos.

V) CUESTIONARIO

1. ¿Qué diferencia existe entre una población de espermatogonias y una de espermatocitos?2. ¿Cómo se diferencian las espermátides?

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Guía de Practicas de Biología Celular y Molecular Universidad Ricardo Palma3. ¿En que etapa de la meiosis se encuentran: las espermatogonias, los espermatocitos

primarios, las espermátides y los espermatozoide?.4. ¿Qué diferencia encuentra entre un folículo primordial y un folículo secundario?5. ¿En que fase de la meiosis está el ovocito dentro del folículo de Graff?6.- ¿Qué es el cuerpo lúteo y qué función cumple?7.- ¿Por qué los folículos ováricos no reaccionan a la hormona folículo estimulanteen la

menopausia?


Smith CA. & Wood Ej. 1997: Biología Celular. Ed. Addison Wesley Iberoamericana.

Stevens A., & Lowe J. 1997: Human Histology. 2da. Edición. Mosby. London, Bogotá, México.

Hoja de resultados

Muestra: Corte de ovarioColorante: Hematoxilina - EosinaEtapas que observa y características:

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Hoja de Resultados

Muestra: Corte de TesticuloColorante: Hematoxilina - EosinaEtapas que observa y características:

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Folículo Primordial

Folículo Primario laminar

Foliculo Primario Multilaminar

Folículo Secundario o Antral

Folículo Maduro Folículo Atrésico


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Túbulo Seminífero

Espermatogonia

Espermatocito Primario

Espermatocito Secundario

Espermatide

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