FACULTAD DE QUÍMICADEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA

CURSO DE BIOQUÍMICA(CLAVE 1508)

Licenciaturas de QFB y QA

Prof. Laura Carmona SalazarGrupo: 07

Semestre: 17-I

Este material es exclusivamente para uso educativo y no de lucro

CINÉTICA ENZIMÁTICA

Modelo Michaelis-MentenMecanismos de inhibiciónRegulación enzimáticaRegulación enzimática

S P

REACCIÓN QUÍMICA

EL EQUILIBRIO DEPENDE DEL G

Y LA VELOCIDAD DE LA ENERGÍA LIBREDE ACTIVACIÓN

EN UNA REACCIÓN CATALIZADA POR UN ENZIMA, ÉSTA MODIFICA LA VELOCIDAD

CINÉTICA ENZIMÁTICA.- Disciplina que se encarga deestudiar el mecanismo de una reacción catalizadaenzimáticamente.

OBJETIVO.- Determinar la velocidad de la reacción yevaluar como se ve modificada ésta enrespuesta a cambios en los parámetrosexperimentales

VELOCIDAD= Cantidad de sustrato desaparecido oproducto formado por la enzima por unidad de tiempo

Por tanto sus unidades soncantidad de compuesto sobre unidad de tiempo:

moles mmoles

nmolesgramos

miligramosmgramos

hora

minuto

segundo

E + S ES E + PS P

ESTADOPRE-ESTACIONARIO

1) ESTADO PRE-ESTACIONARIO = HAY EXCESO DE SUSTRATO Y AUMENTALA CONCENTRACIÓN DE ES(ES RÁPIDO, DURA MICROSEGUNDOS)

2) ESTADO ESTACIONARIO = LA CONCENTRACIÓN ENZIMA-SUSTRATOPERMANECE APROX. CONSTANTE

RE

AC

CIÓ

NV

EL

OC

IDA

DD

EL

AR

EA

CC

IÓN

Concentración del sustrato

MODELO DE Leonor MICHAELIS -Maud MENTEN

E + S [ES] E + Pk1

K-1

k2 1

Relaciona velocidad de la reacción con [S] y [E]

Vo = k2 [ES] 2Vo = k2 [ES]

Queremos saber cuánto ES se forma

Velocidad de formación de ES = k1 [E][S] 3

Velocidad de desaparición de ES = (k-1 + k2) [ES] 4

En el estado estacionario, las velocidades de formación y desapariciónde [ES] son iguales, donde [ES] es constante, mientras que [Reactivos] y [Productos] cambian

k1 [E] [S] = (k2 + k3) [ES] 5

[ES] = [E] [S](k2 + k3)/k1

6

Definimos una nueva constante: (para el denominador)

Km = constante de Michaelis

Km = k2 + k3

k1

7

Sustituimos en 6

[ES] = [E] [S]Km

8

Km es independiente de la concentración del enzimay la de sustrato

Asumiendo que ponemos un gran exceso de S con respecto a E, entonces [S]va a ser teóricamente la inicial o sea el total de [S].

Con respecto a [E], ésta se va a estar combinando con él. Va haber también E libre.

[E] = [Etotal] - [ES] 9

Sustituyendo para [E] en 8

[ES] = ([Etotal] - [ES] ) [S]Km

10Km

[ES] = [Et] [S] / Km1 + [S] / Km

11

[ES] = [Et] [S]______ [S] + Km

12 Vo = k2 [ES]

V = k2 [Et] [S]__ [S] + Km

13

Ya que la velocidad máxima (Vmax) se alcanza cuando los sitios de la enzima están saturados con sustratos, o sea cuando [S] >> Km, y entonces

[S]____ [S] + Km

Se aproxima a 1[S] + Km

entonces

Vmax = k2 [Et] 14

sustituyendo 14 en 13

V = Vmax ___[S] ___[S] + Km

Km = [S] a la cual la velocidad de la reacción tienela mitad de su valor máximo

RE

AC

CIÓ

N

V = Vmax ___[S] ___[S] + Km

VE

LO

CID

AD

DE

LA

RE

AC

CIÓ

N

Concentración del sustrato

[S] + Km

GRÁFICA DE DOBLES RECÍPROCOS O DE LINEWEAVER-BURK(TRANSFORMACIÓN DE LA ECUACIÓN DE MICHAELIS-MENTEN)

Vo = Vmax ___[S] ___[S] + Km

INVERSO 1 = Km + [S]Vo Vmax [S]

1 = Km + [S]Vo Vmax [S] Vmax [S]

Pendiente

1 = Km + 1Vo Vmax [S] Vmax

Ecuación de Lineweaver-Burk

Si multiplicamos ambos miembros de la ecuación de inversos por v * Vmax

obtenemos,

Vmax = v + (Km v)/[S]

max

1

maxmax

11vV

SV

Km

Vv

GRÁFICA DE EADIE-HOFSTEE(TRANSFORMACIÓN DE LA ECUACIÓN DE MICHAELIS-MENTEN)

Vmax = v + (Km v)/[S]

y reordenando

y = b - m x

Esta representación se conoce como representación de Eadie-Hofstee

Sv

KmVv max

v Vmax

Vmax/Km

m = -Km

a

La representación de v frente a v/[S] nos da una recta de:- pendiente = -Km

- corte en el eje v = Vmax- corte en el eje v/[S] = Vmax/Km

v/[S]

SIGNIFICADO DE LA KM Y VMAX

La KM es un valor de concentración que resulta muy útilpara asegurar una catálisis efectiva.Puede ser considerada como una medida de la afinidad deun enzima por su sustrato

La V es la máxima velocidad que se alcanza cuandoLa VMAX es la máxima velocidad que se alcanza cuandoen el medio de reacción todos los enzimas tienen los sitiosactivos ocupados

KcatEs una constante de velocidad que describe la velocidad

limitante de cualquier reacción en condiciones de saturación

Kcat = NÚMERO DE RECAMBIO

Equivale a expresar el número de moléculas de sustrato convertidas en producto por unidad de tiempo en una sola molécula de enzima cuando esta se encuentra saturada

Kcat= Vmax / [E]t= Número de recambio en el sitio catalítico por seg

Kcat/ Km= Medida de la eficiencia catalítica si [S]<<<KmEn esta condición, la velocidad de la enzima está sólocontrolada por la difusión de S al sitio catalítico

Algunos enzimas tienen una kcat/Km en el intervalo 108-109 M-1seg-1, es decir transforman al sustrato apenas llega

La actividad específica es la velocidad de una enzima expresada en términos de la cantidad de enzima que produce esa velocidad

Unidades de velocidad

Unidades de cantidad de enzima

La actividad de una enzima se puede expresar en términos de la velocidad por la cantidad de la enzima

Actividad específica

Actividad específica = mmoles / min / mgmmoles / min / mg

nmoles / min / mg

mg (de producto) / min / mg

mg (de producto) / min / mg

velocidad cantidad de enzima

LOS ENZIMAS PUEDEN SER INHIBIDOS

Los inhibidores enzimáticos son agentes moleculares queInterfieren en la catálisis, haciendo más lentas odeteniendo las reacciones.

Pueden ser reversibles o irreversiblesPueden ser reversibles o irreversibles

INHIBIDORES COMPETITIVOS

INHIBIDORES ACOMPETITIVOS

INHIBIDORES MIXTOS

Ki o constante de inhibiciónLa Ki es la constante de equilibrio de fijación de un inhibidor a una enzima

Es otra de las constantes cinéticasSu cálculo depende del tipo de inhibición de que se trate y por tanto del inhibidor y de la enzima

1/V

1/S

INHIBICIÓN COMPETITIVA

INHIBICIÓN MIXTA

INHIBICIÓN ACOMPETITIVA

1/S

REGULACIÓN DE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA

* ALOSTERISMO

*REGULACIÓN COVALENTEa) FOSFORILACIÓN

b) PROTEÓLISIS

MODIFICACIONESSOBRE LA ENZIMA

EXISTENTE

Mecanismos fisiológicos para aumentar o disminuir la actividad enzimática

ISOENZIMAS

a) EXPRESIÓN DEL GENE

b) SÍNTESIS DE LA PROTEÍNA

EN EL RIBOSOMA

MODIFICACIONESPARA CAMBIAR

LA CANTIDAD DEENZIMA

* SÍNTESIS

* DEGRADACIÓN DIFERENTES MECANISMOS

ALOSTERISMO (CAMBIA DE FORMA)

UN ENZIMA ALOSTÉRICA SE DISTINGUE POR SURESPUESTA A LA CONCENTRACIÓN DE SUSTRATO YPOR SU SUSCEPTIBILIDADDE REGULACIÓN POR OTRAS MOLÉCULAS

SE CARACTERIZAN POR TENER MÚLTIPLESCENTROS FUNCIONALES(CENTROS ACTIVOS)YCENTROS REGULADORES(CENTROS ALOSTÉRICOS)

Ligando o efector o regulador alostérico

SITIO CATALITICO

ENZIMA

SITIO REGULADOR

SUSTRATO

ENZIMA ALOSTÉRICA

alostérico

LA UNIÓN DEL REGULADOR INDUCE CAMBIOS CONFORMACIONALES

QUE SE TRANSMITEN AL SITIO ACTIVO

Ligando o efector o regulador alostérico

REGULACIÓN DE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICAALOSTERISMO

SITIO CATALITICO

ENZIMA

Sitio Regulador

SUSTRATO

+ o -alostérico

Ligando o Regulador oEfector alostérico(específico)

Actividad enzimática

Actividad enzimática

+

- Sitio alostérico(es específico)

Sitio alostérico(es específico)

+ o -

Ligando o efector o regulador alostérico

SITIO CATALITICO

ENZIMA

SITIO REGULADOR

SUSTRATO

ENZIMA ALOSTÉRICA

alostérico

LA ACTIVIDAD DE UN CENTROFUNCIONAL AFECTA A LOS DEMÁS

POR TANTO PRESENTANCOOPERATIVIDAD

LOS ENZIMAS REGULADOS ALOSTÉRICAMENTE NO SIGUEN LA CINÉTICADE MICHAELIS-MENTEN

VE

LO

CID

AD

Conforme se le une su sustrato está en estado “relajado”

LA TRANSICIÓN DE T a R POR LA UNIÓN DE SU SUSTRATO,

TAMBIÉN AUMENTA LA ACTIVIDAD

VE

LO

CID

AD

SUSTRATO

Sin sustrato el enzima esta en estado “tenso”

TRANSICIÓN DEL ESTADO T AL R EN LA HEMOGLOBINA

Ligando o efector o regulador alostérico

REGULACIÓN DE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICAALOSTERISMO

SITIO CATALITICO

ENZIMA

Sitio Regulador

SUSTRATO

+ o -alostérico

Ligando o Regulador oEfector alostérico(específico)

Actividad enzimática

Actividad enzimática

+

- Sitio alostérico(es específico)

Sitio alostérico(es específico)

+ o -

EFECTOR UNIÓN A LA ENZIMA INDUCCIÓN DEALOSTÉRICO (SITIO ALOSTÉRICO) CAMBIO+ ó - CONFORMACIONAL

TRANSMISIÓN A TRAVÉSDE LA ENZIMA HASTAEL SITIO CATALÍTICO

Eventos en la transición alostérica

EXPRESIÓN DE MODIFICACIÓN + ó - CAMBIO EN LALA ACTIVIDAD DE LA AFINIDAD POR ESTRUCTURA DEL DE LA ENZIMA EL PRODUCTO, CAM- SITIO CATALÍTICO.(CATÁLISIS) BIO REACTIVIDADES

DE RESIDUOS CRÍTICOS EN LA CATÁLISIS.

ENZIMA ENZIMA

SUSTRATOINHIBIDOR

COMPETITIVO

ENZIMA

INHIBIDOR

NO COMPETITIVO

REGULACIÓN ENZIMÁTICA

SITIO CATALITICO

ENZIMASitio Regulador

SUSTRATO

-

INHIBIDORALOSTÉRICO

ALOSTERISMO: forma de regulación de la actividad de una enzima

* Las enzimas alostéricas NO siguen el comportamiento Michaeliano (hiperbólico). Su cinética de velocidad vs. [S] es sigmoidal.

* Estas enzimas tienen más de un sitio de unión para el sustrato o para otro efector.

* Este segundo sitio no es catalítico, pero al ser ocupado, “transmite” su efecto al sitio catalítico, el cual aumenta o disminuye su afinidad por el sustrato (SITIO ALOSTÉRICO)

El producto de la catálisis, al alcanzar ciertas concentraciones,

se une a la enzima, inhibiéndola (interaccionando en el sitio alostérico,

no en el sitio activo)

REGULACIÓN POR PRODUCTO

A + B CE

-

TIPOS DE REGULACIÓN ALOSTÉRICA

A + B C

REGULACIÓN POR FEEDBACK (RETROALIMENTACIÓN )

Sustrato A Sustrato B Sustrato C Sustrato D Sustrato E

Enz A Enz B Enz C Enz D

Es una inhibición alostérica que se presenta para regular vías metabólicas

REGULACIÓN POR MODIFICACION COVALENTE :

La actividad de la enzima se regula, ya sea + o – por la adición o

substracción de un grupo químico o de una parte de la molécula

de enzima.

Pi (FOSFORILASA O CINASA)FORMA INACTIVA

a) Fosforilación (regulación reversible) :

ENZIMA

DEFOSFORILADAFOSFOENZIMA O

ENZIMA FOSFORILADAPi (FOSFATASA)FORMA ACTIVA

FORMA INACTIVA

ALGUNOS TIPOS DE MODIFICACIONES COVALENTES

MODIFICACIÓN EJEMPLO DE PROTEÍNA

MODIFICADA

Fosforilación Piruvato cinasa

Acetilación Histonas

Miristilación Src

ADP-ribosilación RNA polimerasa

Farnesilación Ras

-Carboxilación Trombina

Sulfatación Fibrinógeno

Ubiquitinación Ciclina

CINASA o

FOSFORILASA

Pi

Pi

Pi

ENZIMADEFOSFORILADA

ENZIMA FOSFORILADA

Sitio de fosforilación

ATP ADP+ Pi

Las cinasas o fosforilasas toman el Pi del ATP, al que hidrolizan en ADP+Pi y este Pi es transferido a la enzima que es sustrato de la cinasa

ACTIVA INACTIVAPi

FOSFATASA

El Pi se esterifica a un grupo hidroxilo de la proteína, por lo que los aminoácidos que se fosforilan en una proteína son la SERINA, TREONINA y TIROSINAEl Pi queda unido de una manera covalente a la enzima, pero esta fosforilación puede ser reversible gracias a una FOSFATASA

REGULACIÓN COVALENTE

b) PROTEÓLISIS (REGULACIÓN IRREVERSIBLE)

ZIMÓGENOS. Proteínas inactivas que tiene un tamaño mayor

al de la enzima madura y que son procesados hasta la forma madura, que es más pequeña

NH2

COO-

NH2

COOH

proteasa

COO-+ NH2

COOHPRECURSOR

(INACTIVO) FORMA MADURA

(ACTIVA)O PROTEÍNA INMADURA

ZIMÓGENO

PROCESAMIENTO

ISOFORMAS O ISOENZIMAS O ISOZIMAS

•Son variaciones estructurales de una misma enzima

•Las isoformas pueden ser de un 70-98 % idénticas entre sí

•Las isoformas de una misma enzima catalizan la misma reacción, perocon ligeras variaciones en la velocidad, la Km, el pH óptimo, sensibilidad a inhibidores, a reguladores alostéricos, etc.

• Esas pequeñas diferencias no son suficientes para que la reacción que • Esas pequeñas diferencias no son suficientes para que la reacción que catalizan sea diferente

•Por eso, las isoenzimas son otras formas de expresar una actividad enzimática regulada

•La isoforma que exista en un tejido o en un momento de desarrollo particulares es justamente la que se necesita ahí por sus características particulares de cinética o de regulación

Una isoforma puede ser específica de un tejido o de una edad del tejido, porque despliega justamente la actividad que demanda este tejido

Así, el organismo modula una misma actividad Así, el organismo modula una misma actividad enzimática en diferentes tejidos, expresando diferentes formas de la enzima