Tema:12. Obtención y análisis de datos cinéticos.

1. Integración de la ecuación de Michaelis-Menten: 1.1. Orden cero de reacción 1.2 . Orden uno de reacción 1.3. Orden mixto de reacción

2. Linearización de la ecuación de Michaelis-Menten: 2.1. Representación de dobles inversos o de Linenweaver-Burk. 2.2. Representación de Hanes 2.3. Representación de Eadie-Hofstee.

2.4. Representación lineal directa o representación de Einsenthal y Cornish-Bowden

1. Integración de la ecuación de Michaelis-Menten: Estudio de acuerdo con el orden de reacción

Dependencia de la velocidad con respecto a la [S]

SKm

SVv

max

maxmax VS

SV

dt

dSv

tVSoSt

dtVdS

max

max

1.1. Orden cero de reacción

S>>>Km10 veces la Km

Integrando entre So y St y entre 0 y t

Permite comparar cantidades totales de enzima

Vmax1= kcat [E01] Vmax2= kcat [E02]

2max

1max

02

01

V

V

E

E

La razón de las cantidades de enzima es proporcional a la razón de velocidades máximas o de las actividades enzimáticas obtenidas experimentalmente

Comparar cantidades de una misma enzima de un tejido o en circunstancias metabólicas diversas, diferenciación, patologías, etc

1.2. Orden uno de reacciónS<<<<KmA concentraciones 1/10 Km

SKm

SVv

max

Km

SV

dt

dSv max

tKm

V

tSt

So

eSoSt

tKm

V

St

So

tKm

VSoSt

dtKm

V

S

dS

max

0

maxln

maxlnln

max

Integrando entre S0 y St

Conociendo cantidad incial de enzima [Eo] puede obtenerse la

constante de especificidad (kcat/Km)

Obtener el valor de Vmax/Km

1.3. Orden mixto de reacción

SKm

SVv

max

t

SS

KmKm

V

St

So

t

tVStSoSo

StKm

dtVdsdt

dSKm

dtVS

SKmdS

SKm

SV

dt

dSv

to

St

So

tSt

So

)(1maxln

1

maxln

max

max

max

0

Km

m1

S ≈ Km

Dividiendo los dos términos por Km y por t

VmaxSt

So

tln

1

t

SS to )(

Linearización de la ecuación integrada de M-M a S ≈ Km

Estudiando el avance de una sola reacción cuando estamos en orden mixto se pueden obtener:

Vmax y Km

Para obtener los parámetros cinéticos de una enzima lo que solemos hacer es obtener la velocidad inicial, v, a diferentes concentraciones de S.

v frente a [S]

Lo primero es obtener los correspondientes parámetros cinéticos.

2. Linearización de la ecuación de Michaelis-Menten

v

[S]

Vmax

SKm

SVv

max

Imaginemos que estamos estudiando una reacción S P catalizada por una enzima E, y que obtenemos los siguientes resultados:

[S] (mmol L-1) vo(mol L-1 min-1)0,30 0,570,50 0,850,75 1,181,50 1,823,00 2,507,50 3,23

A partir de estos datos calcular Vmax y Km mediante la representación V [S].

Calcúlenlo ahora y escriban sus resultados en la pizarra.

* Estas dificultades, fueron ya tenidas en cuenta por Michaelis y Menten, quienes intentaron representar v frente a log[S]. Esta

representación tiene ciertas ventajas, aparte de su valor histórico, pero debido a su poco éxito, en la bioquímica moderna, no

comentaremos nada más sobre ella.

Como acabamos de ver la representación de v frente a [S] es poco útil para estos fines, debido a:

- la dificultad para dibujar con precisión una hipérbola rectangular

- la dificultad para encontrar las asíntotas (Vmax), de manera correcta, y consecuentemente para calcular Km

Analicen los datos.

¿Alguna conclusión?

Para resolver este problema, y poder calcular Vmax y Km con mayor fiabilidad, se han propuesto varios procedimientos o

métodos. La mayoría de ellos basados en la linealización de la ecuación de Michaelis-Menten

Quizás las tres representaciones más usadas sean:

- Representación de Linenweaver-Burk o de dobles inversos (1/v 1/[S])

- Representación de Hanes ([S]/v [S])

- Representación de Eadie-Hofstee (v v/[S])

Además de estas tres representaciones, basadas en la linealización de la ec. de M&M, existe una curta basada en la

representación directa v [S], o representación de Einsenthal y Cornish-Bowden.

- Si escribimos la ecuación de Michaelis-Menten en su forma inversa, obtenemos:

1 1 Km 1

---- = ------------- + ------------- ---------

v Vmax Vmax [S] y = b + m x

SV

Km

SV

S

v

SV

KmS

v

maxmax

1

max

1

2.1.Representación de dobles inversos o de Linenweaver-Burk

1/v

1/[S]

1/Vmax

- 1/Km

m =Km/Vmax

-Pendiente Km/Vmax

-Corte en el eje-x 1/v =0 -1/Km

-Corte en el eje-y 1/[S] =0 1/Vmax

1/v

1/[S])

La representación más utilizada, no es la más recomendable ya que da impresiones extremadamente engañosas de los errores experimentales: así para pequeños valores de v, pequeños errores en la medida de v, conducen a grandes

errores en 1/v, mientras que para valores grandes de v los mismo pequeños errores en la medida de v conducen a errores apenas apreciables en 1/v.

Si multiplicamos ambos miembros de la ec. de dobles inversos, por [S], obtendremos,

La representación de [S]/v frente a [S], da una recta:

y = b + m x

- Esta representación se conoce como representación de Hanes, representación de Woolf o de Hanes-Woolf.

2.2. Representación de Hanes

SVV

Km

v

S

max

1

max

SSV

Km

Vv

1

maxmax

11

maxmax V

S

V

Km

v

S

[S]/v

[S]

Km/Vmax

- Km

m = tg = 1/Vmax

Pendiente = 1/Vmax

corta en el eje [S]/v en un punto = Km/Vmax,

corta en el eje [S] en un punto = - Km

* En esta representación, como puede verse en la siguiente figura, los errores en [S]/v son un reflejo mucho más fiel de los errores cometidos al medir el valor de v. Por este motivo, la representación de Hanes es preferible a otras linealizaciones de la ecuación

de Michaelis-Menten.

[S]/v

[S]

¿Cómo afectarán los errores de medida de la velocidad de reacción en esta representación?

Tarea 1 Imaginemos que estamos estudiando una reacción S P catalizada por una enzima E, y que obtenemos los siguientes resultados:

[S] (mmol L-1) vo(mol L-1 min-1)0,30 0,570,50 0,850,75 1,181,50 1,823,00 2,507,50 3,23

A partir de estos datos calcular Vmax y Km mediante la representación de Hanes.

Si multiplicamos ambos miembros de la ecuación de inversos por v * Vmax

obtenemos,Vmax = v + (Km v)/[S]

y reordenando

y = b - m x

Esta representación se conoce como representación de Eadie-Hofstee

2.3.Representación de Eadie-Hofstee.

Sv

KmVv max

max1

maxmax

11vV

SV

Km

Vv

La representación de v frente a v/[S] nos da una recta de:- pendiente = -Km- corte en el eje v = Vmax- corte en el eje v/[S] = Vmax/Km

v

v/[S]

Vmax

Vmax/Km

m = tg = -Km

Esta representación en general proporciona resultados realmente buenos, ya que v aparece en ambas coordenadas

como factor multiplicativo, por lo que los errores cometidos en la medida de v, harán que la curva se acerque o aleje del origen en

lugar de hacerlo paralelamente al eje de ordenadas.

v/[S]

v

Esta representación, contrariamente a la de dobles inversos que hace aparecer como buenos malos resultados, hace

aparecer como malos, buenos resultados, dificultando grandemente el ocultamiento

de puntos que se desvíen de la recta.

Aspectos Positivos

Aspectos Negativos

Por lo que esta representación es la más adecuada para el estudio de comportamientos que se desvíen del modelo de Michaelis-Menten.

Tarea 2 Imaginemos que estamos estudiando una reacción S P catalizada por una enzima E, y que obtenemos los siguientes resultados:

[S] (mmol L-1) vo(mol L-1 min-1)0,30 0,570,50 0,850,75 1,181,50 1,823,00 2,507,50 3,23

A partir de estos datos calcular Vmax y Km mediante la representación de Eadie-Hofstee.

Independientemente, en 1974:

- J. Jiménez Vargas y J.M. Macarulla. Fisicoquímica Fisiológica, Interamericana (4ª Edición), Madrid, (1974)

- R. Eisenthal y A. Cornish-Bowden. Biochem J., 139, 715-720, (1974)

* Publicaron un procedimiento, totalmente diferente a los anteriores, para la obtención de Vmax y Km, conocido como

representación lineal directa.

2.4.Representación lineal directa o representación de Einsenthal y Cornish-Bowden

- La ecuación de M y M podemos transformarla en la ecuación canónica de una recta en la que tratamos a Vmax y Km como

variables, y a [S] y v como constantes,

Dividiendo por v(S)

Reordenando,

1max

S

Km

v

V

Si r es la recta que pasa por los puntos (a, 0) y (0,b), la ecuación la podemos escribir

v

V

S

Km

SVSKmv

SKm

SVv

max1

max

max

Si el primer par de valores observados de v y [S] son v1 y [S1] y representamos la recta que definen:

Km

Vmax

v1

-S1

Si tomamos ahora un segundo par de valores observados: v2 y (S2), ....

Km

Vmax

v1

-S1-S2

v2

Y luego un tercer par: v3 y (S3), ....

- Como podemos observar, las distintas rectas se cortan, intersecan, en un punto, común a todas ellas, de coordenadas

(Km, Vmax).

Km

Vmax

v1

-S1-S2

v2

-S3

v3

(Km, Vmax)

NOTA: Experimentalmente, de manera general, no obtendremos un punto, si no un entorno de puntos, y la media de las

coordenadas de estos puntos nos dará el valor medio de Km y Vmax con sus correspondientes desviaciones estándar.

Km

Vmax

v1

-S1-S2

v2

-S3

v3

(Km, Vmax)

- El número máximo de puntos de corte vendrá dado por: [n(n-1)]/2, donde n es el número de rectas.

Tarea 3. Suponga que estamos estudiando una enzima E que cataliza la reacción S P, y que obtenemos los siguientes datos

experimentales:

Concentración inicial Concentración de producto (mol L-1)

de sustrato (mmol L-1) a distintos tiempos (t = min) t=0 t=1 t=2 t=3 t=4

5,0 0 150 300 450 6006,5 0 180 360 540 72010,0 0 235 470 705 94020,0 0 325 650 975 130040,0 0 410 820 1230 1640

Calcular Km y Vmax utilizando todos los procedimientos estudiados.

Resumen

Estudiada la ecuación de Michelis-Menten de acuerdo con el orden de reacción podemos encontrar las siguientes circunstancias-a)A concentraciones saturantes de substrato nos encontramos en el orden cero de reacción La comparación de actividades enzimáticas en ordén cero de reacción puede servir para comparar cantidades de una misma enzima en diferentes circunstancias metabólicas. b) A concentraciones de substrato menores que un décimo de la constante de Michaelis, nos encontramos en orden uno de reacción.c) A concentraciones de substrato del orden de la constante de Michaelis es posible obtener una ecuación a partir de la ecuación integrada de Michaelis-Menten permite determinar graficamente los parámetros dinéticos Vmax y Km estudiando la curva del avance de una reacción con respecto al tiempo

La ecuación de Michaelis-Menten es una cónica, hipérbola que pasa por el centro de coordenadas v:S, cuya asintota paralela al eje de las abcisas representa la velocidad máxima.

Diferentes transformaciones algebráicas permiten la linealización de la ecuación de M-M para una determinación más fácil de los parámetros Vmax y Km.Entre estas se encuentran: Representación de dobles inversos o de Linenweaver-Burk. Representación de Hanes Representación de Eadie-Hofstee Representación lineal directa o representación de Einsenthal y Cornish-Bowden