evaluaci n de dos inmunoensayos para la detecci n …
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EVALUACIÓN DE DOS INMUNOENSAYOS PARA LA DETECCIÓN DE
INMUNOGLOBULINA M ESPECÍFICA PARA EL VIRUS DEL DENGUE
CAROLINA BERNAL RODRÍGUEZ
DERLY JOHANNA GRANADA FORERO
TRABAJO DE GRADO Presentado como requisito parcial
Para optar el título de
BACTERIOLOGA
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS
CARRERA DE BACTERIOLOGÍA Bogotá, D.C. Mayo de 2004
ii
NOTA DE ADVERTENCIA
Artículo 23 de la Resolución Nº 13 de Julio de 1946.
“La Universidad no se hace responsable por los
conceptos emitidos por sus alumnos en sus trabajos de
tesis. Solo velará por que no se publique nada contrario
al dogma y a la moral católica y porque la tesis no
contenga ataques personales contra persona alguna,
antes bien se vea en ellas el anhelo de buscar la verdad
y la justicia”.
iii
EVALUACIÓN DE DOS INMUNOENSAYOS PARA LA DETECCIÓN DE
INMUNOGLOBULINA M ESPECÍFICA PARA EL VIRUS DEL DENGUE
CAROLINA BERNAL RODRÍGUEZ
DERLY JOHANNA GRANADA FORERO
APROBADO
__________________________ Maria del Pilar Bernal
Microbióloga. Directora
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EVALUACIÓN DE DOS INMUNOENSAYOS PARA LA DETECCIÓN DE
INMUNOGLOBULINA M ESPECÍFICA PARA EL VIRUS DEL DENGUE
CAROLINA BERNAL RODRÍGUEZ
DERLY JOHANNA GRANADA FORERO
APROBADO
__________________________ Alexandra Porras Ramírez Bacterióloga Epidemiología
Codirectora
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EVALUACIÓN DE DOS INMUNOENSAYOS PARA LA DETECCIÓN DE
INMUNOGLOBULINA M ESPECÍFICA PARA EL VIRUS DEL DENGUE
CAROLINA BERNAL RODRÍGUEZ
DERLY JOHANNA GRANADA FORERO
APROBADO ___________________________ _______________________ Viviana Marcela Rodríguez Pardo Félix Antonio Ruiz Bacterióloga, M.Sc Bacteriólogo, Especialista en Asesora Auditoria en Salud Asesor
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EVALUACIÓN DE DOS INMUNOENSAYOS PARA LA DETECCIÓN DE
INMUNOGLOBULINA M ESPECÍFICA PARA EL VIRUS DEL DENGUE
CAROLINA BERNAL RODRÍGUEZ
DERLY JOHANNA GRANADA FORERO
APROBADO ______________________ ____________________ Orlando Torres Janeth Arias Jurado Jurado
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EVALUACIÒN DE DOS INMUNOENSAYOS PARA LA DETECCIÒN DE
INMUNOGLOBULINA M ESPECÌFICA PARA EL VIRUS DEL DENGUE
CAROLINA BERNAL RODRÍGUEZ
DERLY JOHANNA GRANADA FORERO
APROBADO
__________________________ _________________________ Ángela Umaña Muñoz Aura Rosa Manascero Biologa, PhD. Bacterióloga, M.Sc Decana Académica Directora Carrera Bacteriología
viii
DEDICATORIA
A nuestras familias, guía y apoyo indispensable en cada
una de nuestras vidas.
ix
AGRADECIMIENTOS
Al grupo de virología del Instituto Nacional de Salud, al
laboratorio de Salud Publica de Cundinamarca, al
programa nacional en investigación animal de la
corporación colombiana de investigación agropecuaria
(CORPOICA) y a los hospitales que participaron en este
estudio, por el apoyo económico, técnico y humano
brindado a lo largo de la realización de este proyecto,
especialmente a la Dra. Maria del Pilar Bernal, Dra.
Martha González, Dr. Jairo Andrés Méndez, Dr. Félix
Antonio Ruiz, Dra. Viviana Rodríguez, Dra. Alexandra
Porras, Dra. Carolina Combariza y Dra. Patricia Muñoz.
x
TABLA DE CONTENIDO
RESUMEN
ABSTRACT
1. REVISIÓN DE LA LITERATURA
1.1 Antecedentes del virus 18
1.1.1 Epidemiología 18
1.2 Características estructurales del virus del dengue 21
1.2.1 Proteínas estructurales del virus del dengue 23
1.2.2 Proteínas no estructurales del virus del dengue 24
1.2.3 Replicación del virus del dengue 24
1.3 Dengue clásico y dengue hemorrágico: Manifestaciones
Clínicas 27
1.3.1 Respuesta inmune celular frente al virus del dengue 27
1.3.2 Respuesta inmune humoral frente al virus del dengue 29
1.4 Diagnostico por el laboratorio de la infección producida por 32
el virus del dengue
1.4.1 Técnica de inhibición de la hemoaglutinación 32
1.4.2 ELISA de captura para la detección de inmunoglobulina 33
M (CAM – ELISA)
1.4.3 ELISA indirecta para la detección de inmunoglobulina G 36
1.4.4 Neutralización en placa 36
1.4.5 Aislamiento viral 37
1.4.6 Identificación viral 37
1.4.7 Fijación del complemento 38
xi
1.4.8 Reacción en cadena de la polimerasa – transcriptasa 38
reversa (RT-PCR)
2. HIPÓTESIS 39
3. JUSTIFICACIÓN 40
4. OBJETIVOS 41
5. MATERIALES Y METODOS
5.1 Diseño del estudio 42
5.1.1 Población estudio y muestras 42
5.1.2 Variables del estudio 43
5.1.3 Descripción clínica del dengue clásico 44
5.1.4 Criterios de inclusión 44
5.1.5 Criterios de exclusión 44
5.2 Métodos
5.2.1 Técnica de inhibición de la hemoaglutinación (I.H) 44
5.2.2 Prueba ELISA Panbio® para la detección de 45
inmunoglobulina M específica para dengue
5.2.3 Prueba ELISA Suma® para la detección de 47
Inmunoglobulina M específica para dengue
5.2.4 Prueba ELISA Panbio® para la detección de inmunoglobulina 49
G específica para dengue
5.2.5 Prueba ELISA Suma® para la detección de 51
inmunoglobulina G específica para dengue
5.3 Recolección de la información 53
5.4 Análisis de la información 53
xii
6. RESULTADOS 54
7. DISCUSIÓN 59
8. CONCLUSIONES 63
9. RECOMENDACIONES 64
10. BIBLIOGRAFÍA 65
11. ANEXOS 72
xiii
INDICE DE FIGURAS
Figura 1. Distribución de Aedes aegypti en las Américas 19
Figura 2. Incidencia Anual de Dengue en el Mundo 20
Figura 3. Virus del Dengue 22
Figura 4. Genoma Viral 22
Figura 5. Replicación del Virus del Dengue 25
Figura 6. Evolución Clínica de los Síntomas de dengue clásico y
dengue hemorrágico 27
Figura 7. Fisiopatología del Dengue Clásico 28
Figura 8. Fisiopatología del Dengue Hemorrágico 30
Figura 9. Cinética de los Anticuerpos en Infección por Dengue 32
Figura 10. Detección de inmunoglobulina M por los dos
inmunoensayos en fase aguda (S1) y fase convalesciente (S2) 54
xiv
INDICE DE TABLAS
Tabla 1. Resultados de los títulos de inhibición de hemoaglutinación, 55
Inmunoglobulina M e inmunoglobulina G por las dos pruebas en muestras
Pareadas en fase aguda (S1) y fase convalesciente (S2)
Tabla 2. No. de muestras IgM positivas para dengue en el panel de 57 muestras positivas para otras infecciones.
Tabla 3. Concordancia de los dos inmunoensayos para la detección de 57
inmunoglobulina M
Tabla 4. Sensibilidad, especificidad, valor predictivo positivo (VPP), 58
valor predictivo negativo (VPN) e índice kappa (K) para los dos
inmunoensayos
xv
INDICE DE ANEXOS
Anexo 1. Ficha de notificación Epidemiológica para dengue 72
Anexo 2. Soluciones stock para preparar reactivos usados en las
pruebas de hemoaglutinación y de inhibición de la hemoaglutinación 73
xvi
RESUMEN
Recientemente, un número de inmunoensayos específicos para la detección de
anticuerpos IgM frente al virus del dengue en suero han sido desarrollados.
Considerando la utilidad de la ELISA para el diagnóstico de dengue unido a las
ventajas propias de los sistemas inmunoenzimáticos (rapidez, facilidad de
ejecución, requerimiento de una muestra simple sin previo tratamiento), nosotros
evaluamos el desempeño de dos inmunoensayos para la detección de IgM
específica para el virus del dengue.
En la metodología se incluyeron muestras pareadas de pacientes con sospecha
clínica de infección por dengue en fase aguda y fase convalesciente, utilizando un
panel de muestras negativas y un panel de muestras positivas a IgM de dengue.
Además, se incluyeron muestras simples de pacientes con otras infecciones
confirmadas por serología, con el fin de evaluar la concordancia de las pruebas,
así como la sensibilidad, especificidad, valor predictivo positivo, valor predictivo
negativo e índice kappa de dos inmunoensayos.
Dentro de los resultados obtenidos se encontró que la prueba de Panbio® tuvo una
sensibilidad del 74% y una especificidad del 97% y la prueba de Suma® presentó
una sensibilidad del 94% y una especificidad del 83% El grado de concordancia
entre los dos inmunoensayos fué casi perfecta (K=0.81).
Es importante ampliar el número de muestras utilizadas en cada uno de los
paneles, así como incluir muestras por otras patologías. De igual forma se
recomienda contar con la participación de los diferentes laboratorios a nivel
nacional para evidenciar el desempeño de los dos inmunoensayos a lo largo del
territorio colombiano.
xvii
ABSTRACT Recently, a number of immunoassays for the detection serum of IgM antibodies
dengue virus have been developed. Considering the utility of ELISA for the
diagnosis of dengue, united to the own advantages of the capture enzyme-linked
immunosorbent assay (rapidity, facility of execution, requirement of a simple
sample without previous treatment), we evaluated the performance of two
immunoassays for the detection of IgM antibodies specifies for the virus of dengue.
In the assay, acute phase and convalescent serum samples of patients with
symptoms of infection by dengue were analyzed. We used at panel of negative
serum samples and know IgM positive dengue serum samples were used. To
determine cross reactivity single samples of patients with other know infections
were included, with the purpose of evaluating the agreement of the immunoassay
as soon as sensitivity, specificity, positive predictive value, negative predictive
value and index kappa.
From the results that were obtained we found that the Panbio® presented
sensitivity of 74% and specificity of 97%. The Suma® test presented sensitivity of
94% and specificity of 83%. The agreement between both inmunoensayos was
almost perfect (K=0.81).
It is important to increase the number of samples used in each panels should
include samples obtained from patient with others pathologies. Similarly, it is
recommended to count with concourse of different laboratories from the national
level to demonstrate the performance of both immunoassays throughout the
Colombian territory.
18
1. REVISIÓN DE LA LITERATURA
1.1 Antecedentes del virus del dengue
Los primeros reportes de una enfermedad clínicamente compatible con dengue
fueron encontrados en la enciclopedia China de enfermedades, síntomas y
remedios publicada durante la dinastía de los años 265 a 420 a.C, en donde fué
conocida como “poción de agua” por estar relacionada con insectos voladores
asociados con el agua. Epidemias similares ocurrieron en 1635 en la India
Francesa y en Panamá en 1693. (Gubler, 1998; Henchal & Putnak, 1990)
Para la segunda guerra mundial el daño ecológico creó las condiciones ideales
que incrementaron las enfermedades transmitidas por mosquitos, comenzando así
una pandemia global de dengue; con el aumento de la transmisión epidémica e
hiperendémica (cocirculación de múltiples serotipos del virus del dengue) que se
desarrollaron en las ciudades del Sureste Asiático epidemias de dengue
hemorrágico (DH), una enfermedad para entonces emergente (Gubler, 1998;
Henchal & Putnak, 1990).
1.1.1 Epidemiología de la infección por el virus del dengue
La primera epidemia conocida de dengue hemorrágico ocurrió en Manila, Filipinas
de 1953 a 1954 con los siguientes 20 años de epidemias, lo que permitió la
diseminación al Sureste de Asia. En la década de los setentas el dengue fue
reintroducido a las islas del pacífico y la actividad epidémica aumentó en las
Américas donde los cambios epidemiológicos fueron mas dramáticos (Gubler,
1998).
Para la década de los cincuentas, sesentas y parte de los setentas las epidemias
de dengue habían sido raras en las Américas, debido a que el principal mosquito
19
vector Aedes aegypti había sido erradicado en la mayor parte del Centro y
Sudamérica. Los programas de erradicación fueron descontinuados para el
comienzo de la década de los setentas lo que permitió la reinfestación del vector
en países donde había sido erradicado (Gubler, 1998; Rigau et al, 1998). (figura
1)
Figura 1. Distribución de Aedes aegypti en las Américas Tomado de: http://www.cdc.gov/ncidod/dvbid/dengue/map-ae-aegypti-distribution.htm
En los años ochenta, América experimentó la mayor epidemia de dengue, nuevos
serotipos fueron reintroducidos (DEN-1 en 1977, DEN-2 y DEN-4 en 1981 y DEN-3
en 1994) y desde 1981 a 1997, 24 países americanos reportaron casos de dengue
hemorrágico confirmados por el laboratorio (Gubler, 1998).
En 1997 el virus del dengue y su vector Aedes aegypti aumentaron su distribución
en regiones tropicales: mas de 2.5 billones de personas viven en áreas endémicas
para el virus del dengue y se estima que 100 millones de casos de dengue y
dengue hemorrágico ocurren cada año, siendo una de las mayores causas de
hospitalización y muerte en los países afectados (Gubler, 1998; Kautner et al,
1997). (Figura 2)
1930 1970 2003
20
�
Figura 2. Incidencia Anual de Dengue en el Mundo
Tomado de: http://www.iladiba.com.co/revista/1997/10/medfam.asp
En Colombia la transmisión de dengue se relaciona con densidades poblacionales
entre medianas y altas, altos índices de desplazamiento del área rural al área
urbana debido a los problemas de orden público y búsqueda de oportunidades
laborales. Adicionalmente, en ciudades con condiciones favorables para la
transmisión, ésta se ve favorecida por la urbanización no planificada, dificultades
en la disponibilidad de servicios básicos como el abastecimiento regular de agua y
la recolección de desechos sólidos, las arraigadas creencias y prácticas en la
comunidad que afectan el nivel de saneamiento doméstico y determina la
disponibilidad de lugares de producción larval en el entorno domiciliario (Gibbons
& Vaughn, 2002; Kuno, 1995).
El dengue se ha comportado como una enfermedad endémica, con brotes
epidémicos cíclicos, en casi todas las poblaciones por debajo de los 1.800 metros
sobre el nivel del mar, lo que equivale a 900.000 Kms de los 1.138.000 Kms de
extensión del país y en donde viven aproximadamente 20.000.000 de personas.
Aedes aegypti es el principal transmisor del dengue en Colombia, y se encuentra
distribuido en casi el 80% del territorio situado entre 1.000 a 2.200 metros sobre el
nivel del mar. En 1998 se notificó por primera vez la presencia de Aedes
21
albopictus en Leticia (Amazonas), el cual se considera un eficiente vector urbano
y selvático de dengue, fiebre amarilla y encefalitis equina venezolana (EEV), más
que el Aedes aegypti (INS, 2002).
Desde 1970 después de la reinfestación por Aedes aegypti, en Colombia han
ocurrido varias epidémias de dengue en todo el territorio con circulación de los
cuatro serotipos. Para 1971 se aisló el virus dengue 2 (DEN-2) y ha circulado
desde entonces con el dengue 1 (DEN-1). El dengue 3 (DEN-3) circuló por un
periodo corto a mitad de los años 70 y para el 2001 se presentó nuevamente en el
municipio de Floridablanca, departamento de Santander. Respecto a la circulación
de dengue 4 (DEN-4) este comienza a circular en 1984; los últimos estudios
virológicos señalan que esta circulando DEN-1 y DEN-3 (INS, 2002).
1.2 Características estructurales del virus del dengue
El virus del dengue pertenece a la familia Flaviviridae del género flavivirus de los
cuales existen aproximadamente 70 virus que comparten características similares
en cuanto a la morfología del virus, organización genómica y replicación (OMS,
1997)
El virus del dengue consta en una cadena sencilla de RNA polaridad positiva,
rodeado por una nucleocápside icosaédrica de aproximadamente 30 nm de
diámetro. La nucleocápside esta cubierta por una bicapa lipídica de 10 nm con
proyecciones superficiales y que presentan glicoproteínas ancladas a la
membrana. Los lípidos de envoltura constituyen cerca del 17% del peso seco del
virion y provienen de las membranas celulares del huésped (Kautner et al, 1997;
Leitmeyer et al, 1999; Knipe et al , 2001). (Figura 3)
22
Figura 3. Virus del Dengue
Tomado de : Ministerio de Salud. Dengue clásico y dengue hemorrágico: Ministerio de salud, OGE, INS, 2000. pp: 10.
El genoma viral es de aproximadamente 11 Kd Contiene un marco abierto de
lectura (open reading frame ORF) de cerca de 10.000 nucleótidos que codifican
para tres proteínas estructurales y siete proteínas no estructurales. El orden de los
genes desde el extremo 5¨ es: C-PrM (M)-E-NS1-NS2A-NS2B-NS3-NS4A-NS4B Y
NS5. Las proteínas son sintetizadas como una glicoproteína de cerca de 3.000
aminoácidos, la cual es procesada por proteasas virales y del huésped (Leitmeyer
et al 1999; Knipe et al , 2001). (figura 4)
Figura 4. Genoma Viral
Tomado de: http://sisbib.unmsm.edu.pe/BVRevistas/Medicina_Experimental/Vol20N1/pdf /a10.pdf
23
1.2.1 Proteínas estructurales del virus del dengue
Las proteínas estructurales incluyen una proteína de cápside (proteína C) de
aproximadamente 11 Kd rica en resíduos de lisina y arginina, altamente básica
que le permite formar complejos de ribononucleoproteínas con el RNA. La región
central contiene dominios hidrofóbicos que interactúan con la membrana celular y
juega un papel importante en el ensamblaje del virion (Chambers et al, 1990;
Henchal & Putnak, 1990; Kautner et al, 1997; Gubler. 1998; Yabar, 2003)
La proteína PrM es de aproximadamente 26 Kd y es generada en el retículo
endoplasmático por señales peptidasa del huésped. Durante la salida del virion,
PrM es clivada en el aparato de golgi en donde reside la enzima furina que forma
la proteína M estructural de cerca de 8 Kd y el segmento N-terminal Pr, el cual es
secretado al medio extracelular (Chambers et al, 1990; Knipe et al , 2001; Yabar,
2003).
La proteína E es una proteína de membrana tipo I de cerca de 50 Kd que contiene
un dominio transmembranal en el extremo C-terminal que sirve como anclaje de
esta proteína a la membrana y es la secuencia señal para la translocación de NS1
(Chambers et al, 1990; Knipe et al , 2001; Yabar, 2003).
La proteína E es considerada como una proteína multifuncional involucrada en la
unión al receptor celular del huésped, así como en la entrada del virus por fusión a
la membrana, interactuando con una segunda proteína viral, la proteína PrM
(Wang et al, 1999). Los títulos de anticuerpos frente a la proteína E en infección
primaria y secundaria son frecuentemente detectados, debido a que es la principal
proteína de la superficie del virion, la cual es altamente antigénica y participa en la
respuesta inmune humoral y de protección (Hung et al, 1999, Valdés et al, 2000;
Yabar, 2003).
24
1.2.2 Proteínas no estructurales del virus del dengue
La primera proteína no estructural es NS1, una glicoproteína de aproximadamente
46 Kd que se encuentra asociada a la célula, a la superficie celular o las formas
extracelulares no vírales (Leitmeyer et al 1999; Knipe et al, 2001; Yabar, 2003). La
proteína NS1 es detectada en altos títulos en pacientes por infección secundaria
con dengue, pero raramente se encuentra en infección primaria (Valdés et al,
2000; Young et al, 2000; Yun Shu et al, 2000; Libraty et al, 2002). La región NS2
codifica para dos proteínas NS2A y NS2B las cuales están implicadas en la
replicación viral. NS2B es requerida como cofactor para la actividad serin
proteasa de NS3. La proteína NS3 es de aproximadamente 70 Kd y se encuentra
asociada a la membrana, es considerada una proteasa viral implicada en el
procesamiento de proteínas y en la replicación del RNA.
La región NS4 codifica para dos pequeñas proteínas hidrofóbicas NS4A y NS4B,
involucradas en la estabilidad de la membrana y forman parte del complejo de
replicación del RNA (Chambers et al, 1990; Knipe et al, 2001; Yabar, 2003).
La proteína NS5 se caracteriza por ser la más conservada de los flavivirus y
presentar actividad de polimerasa. La respuesta de anticuerpos contra la proteína
NS5 es detectada en infección primaria e infección secundaria (Chambers et al,
1990; Valdés et al, 2000; Knipe et al , 2001; Yabar, 2003).
1.2.3 Replicación del virus del dengue
La envoltura del virus esta compuesta por una bicapa lipídica que contiene
proteínas que circundan la nucleocápside, donde reside el genoma viral que
consiste en una cadena sencilla de RNA (Chambers et al, 1990; Knipe et al, 2001;
Yabar, 2003).
25
Todas las proteínas son producidas a partir de una poliproteína sencilla de 3000
aminoácidos la cual es clivada por una combinación de proteasas del huésped y
virales. Las proteínas estructurales son codificadas en la porción N-terminal de la
poliproteína, y las proteínas no estructurales en el resto de la poliproteína
(Chambers et al, 1990; Knipe et al, 2001; Yabar, 2003).
En la figura 5 se observa la unión del virus a los receptores de la superficie celular
que permiten la entrada del virus por endocitosis. Una vez en las vesículas
endocíticas el pH bajo produce cambios que facilitan la fusión del virus con las
membranas de la célula huésped, liberando la nucleocápside al citoplasma donde
ocurre la replicación del RNA. La progenie del virus se ensambla y se fusiona con
la membrana plasmática liberando viriones maduros al medio extracelular
(Mcbride and Ománn, 2000; Knipe et al, 2001; Rey, 2003; Yabar, 2003).
Figura 5. Replicación del Virus del Dengue
Tomado de: http://biology.fullerton.edu/courses/biol_426/web/somudules/s0lfb/ flavivirus%20%20cycle.htm.
26
1.3 Dengue clásico y dengue hemorrágico: Manifestaciones clínicas
La forma clásica del virus del dengue consiste en una enfermedad autolimitada
que aparece 2 a 7 días después de la picadura. Tiene un curso bifásico, con un
comienzo abrupto de intenso malestar general, fiebre, escalofríos, mialgias,
artralgias, cefalea y dolor retroocular. En los días siguientes aparecen anorexia,
dolor abdominal y vómito (Henchal & Putnak, 1990; Morens, 1990; OPS, 1995;
Kalayanarooj et al, 1997; Kautner et al, 1997; Gubler, 1998; Rigau et al, 1998;
Murgue et al, 2000; Gibbons & Vaughn, 2002).
Luego de un período de recuperación que dura entre 2 y 6 días la fiebre
reaparece, lo mismo que un exantema eritematoso maculopapular que se inicia en
el tronco y se extiende hacia la región facial y las extremidades. Otras
manifestaciones comunes incluyen adenomegalias generalizadas y síntomas
hemorrágicos menores como epistaxis o petequias. En la mayoría de los casos
hay una resolución completa durante la segunda semana, aunque algunas
personas pueden permanecer con adinamia y cansancio fácil durante semanas o
meses (Henchal & Putnak, 1990; OPS, 1995; Kautner et al, 1997; OMS, 1997;
Gubler, 1998; Rigau et al, 1998).
El tratamiento en la fase aguda es sintomático y consiste en la administración de
antipiréticos y analgésicos para controlar la fiebre y los síntomas constitucionales.
En todo caso debe evitarse el uso de aspirina, pues puede aumentar las
manifestaciones hemorrágicas.( Kautner et al, 1997; Rigau et al, 1998; Gibbons &
Vaughn, 2002).
Por su parte, el dengue hemorrágico tiene un cuadro clínico idéntico a la forma
clásica, pero 2 a 5 días después, el paciente comienza a deteriorarse
desarrollando dolor abdominal intenso, irritabilidad, inquietud motora y rubor facial.
Posteriormente aparecen manifestaciones hemorrágicas prominentes como
27
sangrado de vías digestivas y en las áreas de venopunción. Simultáneamente se
produce extravasación de plasma hacia el espacio intersticial y las cavidades, lo
cual produce ascitis y derrame pleural, así como disminución del líquido
intravascular. Esto se manifiesta como falla circulatoria progresiva, con
hipotensión, disnea, cianosis y frialdad distal (OPS, 1995; Gubler, 1998; OMS,
1997). (figura 6)
Figura 6. Evolución Clínica de los Síntomas de Dengue Clásico y Hemorrágico.
Tomado de: http://www.iladiba.com.co/revista/1997/10/medfam.asp
1.3.1 Respuesta inmune celular frente al virus del dengue
El virus del dengue tiene un tropismo por las células del sistema linforreticular, en
especial monocitos y macrófagos, aunque también pueden infectar linfocitos B,
células estromales en la médula ósea, células dendríticas y hepatocitos (Ho et al,
2001; Libraty et al, 2001).
28
En infección primaria la glicoproteína E del virus presenta en su estructura una
secuencia de aminoácidos, que le permiten reconocer ciertas moléculas de
heparan-sulfato ubicadas en la membrana celular del monocito. Posiblemente el
siguiente paso involucra receptores específicos como las integrinas, que estimula
el proceso de endocitosis y permiten la liberación del RNA y la capside al
citoplasma como se observa en la figura 7 (Chen et al, 1996; Hilgard & Stockert,
2000; Diamond et.al, 2000).
Figura 7. Fisiopatología del Dengue Clásico
Tomado de: http://www.iladiba.com.co/revista/1997/10/medfam.asp
Dentro de los macrófagos el virus se replica y se expresan determinantes
antigénicos virales en su superficie, los cuales son presentados a los linfocitos T
CD4 y T CD8, generando anticuerpos específicos para el serotipo infectante. La
infección con un serotipo viral no produce inmunidad protectora contra otro
serotipo (Gubler, 1998; Leitmeyer et al, 1999; Knipe et al, 2001).
29
1.3.2 Respuesta inmune humoral frente al virus del dengue
Los mecanismos responsables de dengue hemorrágico muestran claras
diferencias con respecto a las formas clásicas. La teoría mas conocida para
explicar la patogénesis del dengue hemorrágico es el incremento de anticuerpos
potenciadores ADE (Antibody Dependent Enhancement) (Halstead et al, 1970;
Halstead et al, 1989; Henchal & Putnak, 1990; Morens, 1994; Kuno, 1995; Gubler,
1998; Mcbride and Ománn, 2000; Yang et al, 2001; Anderson & Mosser, 2002).
Esta teoría explica que los anticuerpos preexistentes originados a partir de una
previa infección por dengue pueden ligarse a otros serotipos del virus pero no
neutralizarlos. El complejo antígeno-anticuerpo se une y se internaliza a través de
los receptores Fcγ presentes en la membrana celular de los leucocitos,
especialmente macrófagos, donde el virus se replica libremente (Littahua et al,
1990; Mady et al, 1991; Morens, 1994; Chen et al, 1996; Mongkolsapaya et al,
2003; Suhrbier et al, 2003). La activación de linfocitos T específicos por monocitos
infectados pueden originar incremento en la permeabilidad vascular por dos
mecanismos (Avirutnan et al, 1998; Green et al, 1999; Mathew et al, 1999; Carr
et al, 2003; Suhrbier & Linn, 2003). (figura 8)
30
Figura 8. Fisiopatología del Dengue Hemorrágico
Tomado de: http://www.iladiba.com.co/revista/1997/10/medfam1.asp
El primer mecanismo involucra la producción de citocinas por la activación de
linfocitos T específicos para el virus del dengue. Estos linfocitos producen altos
niveles de IFNγ, IL-2, TNFα y TNFβ., induciendo extravasación capilar por efectos
sobre el endotelio vascular, además de aumentar y potencializar la expresión de
receptores de inmunoglobulinas en los monocitos (Bethell et al, 1998; Hober et al,
1998; Rothman & Ennis, 1999; Diamond et al, 2000; Juffrie et al, 2000; King et al,
2000; Mangada et al, 2002).
El segundo mecanismo es la lisis celular. Las poblaciones de linfocitos T CD4+ y
CD8+ podrían lisar las células blanco infectadas por el virus por interacciones
31
entre Fas ligando expresados en los linfocitos T activados y Fas expresado en las
células infectadas (Suss & Shortman, 1996).
En infección por virus del dengue el pico máximo de viremia se encuentra entre el
segundo y quinto día después de la picadura por el mosquito. En infección
primaria la inmunoglobulina M aparece aproximadamente de 3 a 5 días después
del inicio de los síntomas y alcanza su máximo pico dos semanas después
persistiendo de 60 a 90 días (Innis, 1997; Vaughn et al, 1997; Sang et al, 1998;
Vaughn et al, 2000).
Independiente del serotipo, en infección secundaria la respuesta de IgM es
variada. Los niveles de anticuerpos IgM son bajos en relación con los niveles de
IgG. En mas del 50% de las infecciones secundarias los niveles de anticuerpos
IgM declinan a niveles indetectables a los 30 días y en algunos pacientes los
niveles de IgM son indetectables debido al limitado numero de nuevos epítopes
presentados por el virus infectante (Innis, 1997).
La diferencia entre infección primaria y secundaria es marcada al comparar la
cinética de anticuerpos IgM e IgG. En infección primaria, únicamente bajos niveles
de IgG frente al virus del dengue son detectados en fase febril o convalesciente
temprana de la infección, mientras niveles de IgM frente a dengue virus son altos y
exceden altamente los niveles de IgG por 2 a 4 semanas. En infección secundaria
altos niveles de IgG son detectables en fase aguda y aumentan dramáticamente
sobre las 2 semanas después de la infección, mientras los niveles de IgM son
bajos o ausentes en comparación con los niveles de IgG (Innis, 1997, Koraka et
al, 2001). (figura 9)
32
Figura 9. Cinética de los Anticuerpos en Infección por Dengue
Tomado de: OPS, 1995; Vaughn et al, 1997; Vaughn et al, 2000.
1.4 Diagnóstico por el laboratorio de la infección producida por el virus del dengue
El diagnostico por el laboratorio de infección por dengue puede realizarse por
aislamiento viral, la identificación del antígeno viral o el RNA viral o la detección de
anticuerpos específicos contra el virus del dengue (Guzmán & Kourí, 1996; OPS,
1995; OMS, 1997), a continuación se mencionan las técnicas diagnósticas
utilizadas en infección por el virus del dengue.
1.4.1 Técnica de inhibición de la hemoaglutinación
La prueba de inhibición de la hemoaglutinación fue desarrollada por Clarke y
Cassals en 1958 y ha sido utilizada como método serológico estándar para la
confirmación y clasificación serológica del virus del dengue, según la Organización
Infección primaria
IgG
IgM
IgM
IgG
Infección secundaria
Niveles de Anticuerpos
33
Mundial de la Salud (OMS). La inhibición de la hemoaglutinación se basa en la
habilidad que tienen los anticuerpos para neutralizar el virus e inhibir la
aglutinación de eritrocitos de ganso (Innis, 1997; OMS, 1997).
Sin embargo esta prueba resulta ser bastante dispendiosa ya que requiere de
muestras pareadas en fase aguda y fase convaleciente, además las muestras de
suero deben ser tratadas con acetona o kaolín para remover inhibidores no
específicos de aglutinación. Debido a que los anticuerpos persisten por largos
periodos de tiempo esta prueba es ideal para estudios seroepidemiológicos (Innis,
1997; OMS, 1997).
Los anticuerpos obtenidos por la prueba de inhibición de la hemaglutinación,
aparecen en niveles detectables hacia el día 5 o 6 de la enfermedad y los títulos
de anticuerpos en fase convalesciente son generalmente menores a 1:640 en
infección primaria. En contraste, en una infección secundaria los títulos de
anticuerpos se incrementan rápidamente durante los primeros días de la
enfermedad. La prueba de la inhibición de la hemoaglutinación determina y
cuantifica la presencia de anticuerpos totales. Títulos de anticuerpos de IH mayor
ó igual 1:1280 es un criterio ampliamente aceptado para clasificar un caso como
infección secundaria (Innis, 1997; Ministerio de Salud, 2000).
1.4.2 ELISA de Captura para la detección de inmunoglobulina M (CAM-ELISA)
El diagnostico por la prueba de ELISA de captura de anticuerpos IgM (CAM-
ELISA) se basa en la detección de anticuerpos IgM específicos contra el virus del
dengue en el suero del paciente captándolos a partir de la solución mediante el
empleo de un anticuerpo de IgM antihumana que se ha unido previamente a la
fase sólida de una placa. Si el suero del paciente contiene anticuerpos IgM contra
el virus del dengue, estos unirán el antígeno de dengue que se agrega en el
34
próximo paso y se detectarán añadiendo después un anticuerpo antidengue
marcado con enzimas (Gubler, 1996; OPS, 1997; Gubler, 1998).
La detección de anticuerpos IgM frente al virus del dengue por ELISA ha sido uno
de los más importantes métodos para el diagnóstico de la enfermedad, ya que
requiere de muestras simples y un equipo poco sofisticado. Los anticuerpos anti
IgM son producidos durante infección primaria y secundaria. La detección de
anticuerpos anti IgM indica una infección activa o reciente. Los anticuerpos se
desarrollan rápidamente a niveles detectables en la mayoría de los pacientes
sobre el 5 día de la enfermedad; hacia los días 6 a 10 de la enfermedad del 93 al
99% de los enfermos poseen anticuerpos de IgM detectables. Unos de los
inconvenientes de esta prueba es que no permite detectar infecciones por dengue
si la muestra sérica se extrae muy pronto (<5 días) después del comienzo de la
enfermedad (Gubler, 1996; Guzmán and Kouri, 1996; OPS, 1997; Gubler, 1998).
Aunque la técnica de CAM-ELISA es ligeramente menos sensible que la inhibición
de la hemoaglutinación para el diagnóstico de las infecciones por el virus del
dengue, ofrece la ventaja de requerir una sola muestra de suero del paciente. En
una serie de 288 muestras de sueros de pacientes durante la epidemia de dengue
en Puerto Rico en 1986, se comparó la prueba de CAM-ELISA en muestras de un
solo suero agudo, con muestras pareadas de los mismos pacientes estudiados
mediante la técnica de inhibición de la hemoaglutinación. 228 muestras pareadas,
correspondientes al 79% fueron consideradas positivas por inhibición de la
hemoaglutinación, mientras CAM-ELISA indicó que 203 muestras simples,
correspondientes al 70% eran positivas. Cinco muestras, es decir 1.7% fueron
falsos positivos y 30 muestras correspondiente al 10% fueron falso negativos por
CAM-ELISA. Teniendo en cuenta la dificultad para conseguir segundas muestras
sanguíneas y de lo mucho que se tarda en obtener resultados concluyentes con la
prueba de la inhibición de la hemoaglutinación, este bajo índice de errores resulta
aceptable en la mayoría de los sistemas de vigilancia, debe recalcarse, sin
35
embargo, que como los anticuerpos IgM pueden persistir de 60 a 90 días, los
resultados positivos con CAM-ELISA en muestras séricas únicas son solo
provisionales y no significan necesariamente que la infección por dengue este
vigente. No obstante, es seguro que la persona ha sufrido dicha infección durante
los dos a tres meses anteriores. Un resultado negativo de una muestra tomada en
fase aguda puede ser un falso negativo, debido a que la muestra puede haber sido
tomada antes de que lo niveles de IgM fueran detectables. Infortunadamente, en
muchos laboratorios han adoptado la CAM-ELISA como diagnostico confirmatorio
de infección por dengue dejando a un lado el seguimiento de las muestras para la
confirmación IgM presuntivo (OPS; 1997; Gubler 1997; Gubler 1998).
El uso de la detección de inmunoglobulina M ha sido una invaluable herramienta
en los programas de vigilancia de dengue clásico, dengue hemorrágico y síndrome
shock de dengue y es la prueba serológica de elección en los laboratorios. En
áreas donde el dengue es endémico, CAM-ELISA es utilizada por su bajo costo y
un mínimo requerimiento de equipo sofisticado y personal entrenado. Es
especialmente usada en pacientes hospitalizados quienes son admitidos cuando
la inmunoglobulina M ya esta presente en sangre (Gubler, 1998).
En áreas donde el dengue no es endémico, la prueba de CAM-ELISA puede ser
usada para vigilancia clínica de enfermedades virales o estudios de
seroprevalencia en los cuales un resultado positivo indica infección reciente (<2 a
3 meses). Un adecuado diagnostico por CAM-ELISA durante una epidemia puede
ser definitivo para evitar la diseminación de la enfermedad (Gubler, 1998).
Por otra parte, Laferté et al, 1996 estandarizaron y evaluaron una ultramicroelisa
para la detección de anticuerpos IgM contra el virus del dengue. Comparados con
la técnica de la inhibición de la hemoaglutinación, el sistema mostró un 85.7% de
sensibilidad y un 100% de especificidad, mientras que la comparación de ELISA
36
IgM tuvo una sensibilidad del 100% y una especificidad del 98.6% (Guzmán and
Kouri, 1996).
1.4.3 ELISA indirecta para la detección de inmunoglobulina G
La ELISA IgG indirecta es comparable con la técnica de inhibición de la
hemoaglutinación para diferenciar infección primaria e infección secundaria por el
virus del dengue. La prueba de ELISA IgG, a pesar de ser rápida y sencilla no es
muy específica y exhibe algo de reactividad cruzada con otros flavivirus como la
técnica de inhibición de la hemoaglutinación. No es una prueba que permite
diferenciar el serotipo infectante. Sin embargo, es mas sensible que la técnica de
inhibición de la hemoaglutinación (Gubler 1996; Gubler 1998).
1.4.4 Neutralización en placa
La neutralización en placa es utilizada para estudios seroepidemiológicos y
requiere de sueros pareados de casos sospechosos de infección por dengue. Esta
prueba se basa en la capacidad que tienen los anticuerpos contra el virus del
dengue de inhibir el efecto citopático sobre cultivos celulares susceptibles. Aunque
se han descrito cierto número de pruebas de neutralización para los virus del
dengue, el método mas sensible y específico es la prueba de reducción de placa
con dilución del suero y virus constante. Después de infecciones primarias por el
virus del dengue se detectan en la etapa convalesciente temprana anticuerpos
neutralizantes relativamente monotípicos. Tras infecciones secundarias por el
dengue se producen títulos elevados de anticuerpos neutralizantes contra dos a
cuatro tipos de dengue. En algunas combinaciones de infecciones sucesivas, el
título más alto de anticuerpos neutralizantes en el suero convalesciente esta
dirigido contra el virus con el que el paciente había sido previamente infectado
(Gubler, 1996).
37
1.4.5 Aislamiento viral
Un importante factor que favorece el éxito del aislamiento viral es la obtención de
la muestra en una etapa inicial de la enfermedad, usualmente hasta el cuarto día
después del inicio de los síntomas. Cuatro sistemas de aislamiento viral han sido
rutinariamente utilizados: inoculación intracerebral en ratones de 1 a 3 días de
nacidos, cultivo en células de mamíferos (VERO, células primarias LLC-MK2),
inoculación intratoráxica en mosquitos adultos y cultivos en células de mosquito
C6/36 de Aedes albopictus (Guzmán and Kourí, 1996; OMS, 1997; Gubler, 1998).
1.4.6 Identificación viral
El método de elección para la notificación del virus del dengue es la
inmunofluorescencia; anticuerpos monoclonales seroespecíficos producidos en
cultivos tisulares o líquido ascítico de ratones e IgG conjugada con fluoresceína-
isocianato son utilizados. Esta prueba es fácilmente realizada en cultivos celulares
infectados, cerebro de mosquito o tejido macerado, en cerebro macerado de
ratones o bien en tejidos fijados en formalina. Este es el método más simple y
rápido, permite además detectar virus múltiples en pacientes con infecciones
concurrentes. El aislamiento viral sirve para caracterizar la cepa viral y esta
información es crítica para la vigilancia del virus y los estudios patogénicos. El
aislamiento del virus del dengue procedente de suero humano depende de varios
factores: la forma de manipulación de suero y su almacenamiento y el nivel de
viremia que varia considerablemente dependiendo de los días de evolución de la
enfermedad (Guzmán and Kourí, 1996; OMS, 1997; Gubler, 1998).
38
1.4.7 Fijación de complemento
La prueba de fijación de complemento no es usada rutinariamente en el
diagnóstico serológico de dengue. Es mas difícil de realizar, requiere personal
altamente capacitado. Esta prueba se basa en el principio de que el complemento
es consumido durante las reacciones antígeno-anticuerpo (OMS, 1997).
1.4.8 Reacción en cadena de la polimerasa – trascriptasa reversa (RT-PCR)
Esta técnica ha sido desarrollada para un gran numero de virus RNA y en los
últimos años ha revolucionado el diagnostico por el laboratorio para infecciones
por dengue. La RT-PCR provee un diagnóstico rápido, sensible, reproducible y
específico de serotipo para detectar RNA viral en muestras clínicas humanas,
tejidos y mosquitos (Guzmán and Kourí, 1996; OMS, 1997; Gubler, 1998).
39
2. HIPÓTESIS
Ha: La prueba de Panbio® y la prueba de Suma® para la detección de
inmunoglobulina M específica para el virus del dengue tienen una sensibilidad y
especificidad �95%.
Ho: La prueba de Panbio® y la prueba de Suma® para la detección de
inmunoglobulina M específica para el virus del dengue tienen una sensibilidad y
especificidad <95%.
40
3. JUSTIFICACION
Debido a que el dengue es una enfermedad endémica en Colombia, se hace
necesario evaluar la prueba de Panbio® y la prueba de Suma® para el diagnóstico
de inmunoglobulina M específica para dengue disponibles en nuestro país, ya que
se han presentado problemas en el desempeño de cada uno de los ensayos en
los diferentes laboratorios de salud pública del país.
41
4. OBJETIVOS
OBJETIVO GENERAL:
• Evaluar la sensibilidad, especificidad, valor predictivo positivo y valor
predictivo negativo y la concordancia de dos inmunoensayos para la
detección de inmunoglobulina M frente al virus del dengue.
OBJETIVOS ESPECIFICOS:
• Recolectar muestras pareadas de pacientes con sintomatología compatible
con dengue en fase aguda tardía (5-7 días después del inicio de los
síntomas) y en fase convalesciente (10-15 días después de tomada la
primera) en el departamento de Cundinamarca.
• Evaluar la sensibilidad y especificidad de cada uno de los inmunoensayos
para la detección de inmunoglobulina M frente al virus del dengue.
• Evaluar el valor predictivo positivo y valor predictivo negativo de cada uno
de los inmunoensayos para la detección de inmunoglobulina M frente al
virus del dengue.
• Observar la seroconversión de las muestras pareadas a través de la técnica
de inhibición de la hemaglutinación.
• Evaluar una posible reinfección a partir de la presencia de anticuerpos IgG
en muestras pareadas de pacientes con sintomatología compatible con
dengue en el departamento de Cundinamarca.
42
5. MATERIALES Y MÉTODOS
5.1 Diseño del estudio
Estudio descriptivo de corte transversal y de concordancia que permite generar
hipótesis de investigación, estimar la prevalencia de algunos padecimientos (esto
es, la proporción de individuos que padece alguna enfermedad en una población
en un momento determinado), así como identificar posibles factores de riesgo para
algunas enfermedades. En este proyecto el estudio permitirá comprobar la
hipótesis de que las pruebas de serología para IgM de dengue son sensibles y
específicas y adicionalmente, permitirá estimar la seroprevalencia de dengue en
las ciudades objeto de estudio. En este tipo de estudio se obtiene únicamente una
medición de las exposiciones y eventos en los sujetos de estudio en un momento
dado (seroprevalencia IgM).
Así mismo el estudio es de concordancia para determinar las diferencias entre las
pruebas serológicas de dengue y determinar su sensibilidad y especificidad. Los
estudios de concordancia abarcan una amplia gama de diseños relacionados entre
sí que se utilizan principalmente para evaluar el grado de acuerdo entre los
clínicos al interpretar pruebas diagnósticas, o la exactitud con que estas pruebas
orientan hacia un diagnóstico correcto.
5.1.1 Población de Estudio y Muestra
��Población de estudio: Pacientes que asisten a consulta médica con
sospecha clínica de infección por dengue en el departamento de
Cundinamarca.
��Muestra: En el programa EpiInfo 6.04d se estableció la muestra de sueros a
tomar teniendo en cuenta que se quieren determinar diferencias de las
pruebas serológicas con un nivel de confianza del 95% y un nivel de
43
significancia del 5% en regiones endémicas para dengue. Para tal fin se
utilizó el muestreo para estudios de corte transversal aumentando al
número obtenido un efecto de diseño de 2 en las muestras pareadas (fase
aguda tardía y fase convalesciente). Se determinó un panel de sueros
negativos a IgM procedentes de pacientes de banco de sangre (n=20) y
sueros de cordón umbilical (n=15). Un panel de sueros (n=30) con resultado
positivo a IgM realizado en los laboratorios de salud pública del país.
Además, se incluyó un panel de sueros IgM positivos (n=45) para
Sarampión, Rubéola, Malaria, Leptospirosis, Hepatitis C, Fiebre amarilla y
pacientes vacunados contra fiebre amarilla.
Las muestras fueron obtenidas en los servicios de hospitalización y urgencias
de los hospitales de los municipios de Girardot, La Vega, San Juan de Rioseco,
San Francisco y Villeta en el departamento de Cundinamarca.
Las muestras de suero se tomaron en tubo seco y se separaron en viales que
fueron enviados en condiciones de refrigeración al Instituto Nacional de Salud
en donde se conservaron a una temperatura de –70°C.
5.1.2 Variables del Estudio
��Variables Independientes: Edad, sexo, lugar probable de infección, fecha de
inicio de síntomas, fecha de toma de muestra, antecedentes de infección
por dengue, signos y síntomas.
��Variables Dependientes: Presencia de anticuerpos IgM en infección por
dengue.
44
5.1.3 Descripción clínica del dengue clásico
Enfermedad febril aguda en la que se observan dos o más de las siguientes
manifestaciones: dolor de cabeza, dolor retroorbital, mialgias (dolor en músculos),
artralgia (dolor en las articulaciones), erupción, manifestaciones hemorrágicas.
5.1.4 Criterios de inclusión
Pacientes con fiebre �38.5°C y dos o más de los siguientes síntomas: míalgias,
artralgias, dolor retroocular, cefalea, exantema, dolor abdominal y/o prueba de
torniquete.
5.1.5 Criterios de Exclusión
Pacientes: fiebre ocasionada por otra infección (otitis, neumonía, infecciones
urinarias).
Muestras: los resultados de anticuerpos IgM indeterminados no se tendrán en
cuenta para calcular la concordancia de los dos inmunoensayos.
5.2 Métodos
5.2.1 Técnica de inhibición de la hemoaglutinación (I.H)
La técnica de I.H fue realizada según el protocolo descrito por Clarke y Cassals,
1958, excepto las modificaciones realizadas al formato de microplaca. Los sueros
fueron tratados por el método de la acetona para remover inhibidores
inespecíficos, y las aglutininas no específicas fueron absorbidas con glóbulos rojos
de ganso. Los sueros fueron diluidos en solución salina boratada pH: 9.0. Los
45
cuatro antígenos del virus del dengue fueron donados por el laboratorio de
virología del Instituto Nacional de Salud (Clarke y Cassals, 1958).
5.2.3 Prueba Elisa Panbio® para la detección de inmunoglobulina M específica
para dengue
��Fundamento
La ELISA Dengue IgM de captura se basa en la detección de anticuerpos IgM
presentes en el suero del paciente que se combinan con anticuerpos anti IgM
humana en la fase sólida. Un pool concentrado de antígenos de dengue (1-4) es
diluido en un solución diluyente de antígeno. Un volumen igual de conjugado de
anticuerpos monoclonales (Mab) es agregado a la solución en la que se han
diluido los antígenos, alli se formaran complejos antígeno-Mab. El suero residual
es removido por lavado y el complejo antígeno-Mab es agregado a la placa de
ensayo. Después de la incubación, se hace un nuevo lavado y se agrega un
sistema de sustrato de color tetrametilbenzidina / peroxido de hidrógeno
(TMB/H2O2). El sustrato es hidrolizado por la enzima y después de parar la
reacción con ácido el TMB revela un color amarillo. La aparición de color indica la
presencia de anticuerpos IgM contra el virus del dengue.
��Dilución del suero y los controles
De acuerdo a las recomendaciones del fabricante se utilizó un pozo para el control
negativo, un pozo para el control positivo y un calibrador en triplicado. Estos
controles junto con las muestras fueron diluidas 1:100, tomando 10 µl de suero o
control y 1000 µl de diluyente de muestra.
46
��Preparación del antígeno
El antígeno fue diluido 1:250 con diluyente de antígeno. Se tomaron 10 µl de
antígeno y 2.5 ml de diluyente de antígeno. Un volumen igual del antígeno
previamente diluido y conjugado de anticuerpos monoclonales (Mab Tracer) son
mezclados e incubados durante una (1) hora a temperatura ambiente.
��Preparación de la solución de lavado
Un volumen de 60 ml de buffer fosfato pH 7.2 con Twen 20 se llevo hasta
completar un volumen final de 1.200 ml con agua destilada, según las
recomendaciones del fabricante. Todos los lavados de la placa fueron realizados
con un volumen final de 350 µl por pozo con la solución de lavado.
��ELISA
100 µl de la dilución de la muestra y los controles fueron añadidos a cada pozo
llevando a incubar a 37°C durante una (1) hora. Luego de la incubación se lavó la
placa seis (6) veces con solución de lavado. Se agregaron 100 µl del complejo
antígeno Mab-Tracer a cada pozo y se llevó a incubar a 37°C durante una (1)
hora. Después de lavar la placa seis (6) veces con solución de lavado, se
agregaron 100 µl de TMB a cada pozo dejando a temperatura ambiente durante
10 minutos. Pasado el tiempo se agregaron 100 µl de solución de parada a cada
pozo y se procedió a leer en espectrofotómetro a 450 nm.
5.2.3 Prueba Elisa de Suma® para la detección de inmunoglobulina M especifica
para dengue
47
��Fundamento
Este ensayo inmunoenzimático heterogéneo en su variante captura que emplea
las ventajas de la reacción de alta afinidad entre la estreptavidina y la biotina y
donde se utiliza como fase sólida tiras de ultramicroELISA revestidas con anti IgM
humana.
Las muestras se incuban en los pocillos de las tiras y los anticuerpos en su
superficie capturan la IgM presente en el suero. A continuación, previo lavado que
elimina los componentes de la muestra no fijados, se añade el antígeno de dengue
que se unirá a la IgM no especifica capturada en el paso anterior.
Una vez eliminado el antígeno en exceso, se añaden anticuerpos monoclonales
biotinilados específicos al virus del dengue, que se unirán al complejo formado
sobre la fase sólida.
Luego de otro paso de incubación y lavado se aplica el conjugado
estreptavidina/fosfatasa alcalina, que se unirá al complejo formado anteriormente
en caso de reacción positiva. Un nuevo lavado de las tiras eliminara el conjugado
en exceso. Por ultimo, se adiciona el sustrato fluorigénico (4-metilumbeliferil
fosfato), que será hidrolizado y la intensidad de la fluorescencia emitida permitirá
detectar en la muestra la presencia de anticuerpos IgM específicos al virus del
dengue.
��Preparación de las soluciones de trabajo
Solución Tampón R1: Para una tira de reacción se diluyó 1 ml de solución R1
hasta un volumen de 25 ml con agua Milli-Q®. Todos los lavados de la microplaca
fueron realizados con un volumen final de 30 µl por pozo con la solución de
lavado.
48
Suero de Carnero R2: Se diluyó 1:4 con solución de trabajo R1. La cantidad
necesaria por tira fué de 2 ml (0.5 ml de R2 y 1.5 ml de R1).
Sustrato R8: Se diluyó 1:10 con Tampón sustrato R9. La cantidad necesaria por
tira fué de 0.5 ml (0.05 ml de R8 y 0.45 ml de R9).
��Preparación del antígeno
Se reconstituyó con 2 ml de solución de trabajo R2. la cantidad necesaria por tira
fué de 0.2 ml.
��Preparación de las muestras y controles
Los controles se presentan en el estuche listos para usar por triplicado. Las
muestras se diluyen 1:21 con la solucion de trabajo R2 (5 µl de suero y 100 µl de
solución)
��UltramicroELISA
Se colocaron 10 µl de las muestras previamente diluidas y de los controles sobre
los pocillos de reacción. Las muestras fueron analizadas por duplicado según las
recomendaciones del fabricante, y se llevaron a incubar a 37°C en cámara
húmeda previamente equilibrada a esa temperatura durante 30 minutos. La
microplaca se lavó cuatro (4) veces con la solución de lavado. Luego, se
agregaron 10 µl de antígeno a cada pocillo de reacción y se llevó a incubar a 37°C
durante 30 minutos. Después de lavar cuatro (4) veces con la solución de lavado,
se agregaron 10 µl de anticuerpos biotinilados y se llevó a incubar a 37°C durante
30 minutos. Posterior a los cuatro (4) lavados se agregaron 10 µl de conjugado en
cada pocillo de reacción y se llevó a incubar a 37°C durante 30 minutos. Después
de lavar cuatro (4) veces con la solución de lavado, se agregaron 10 µl de sustrato
49
previamente diluido a cada tira de reacción y se incubó a temperatura ambiente
durante 15 minutos en cámara húmeda. Sin embargo, debido a las variaciones de
temperatura se recomienda que cada laboratorio establezca su propio tiempo de
incubación óptimo. Se realizó la lectura para determinar la fluorescencia emitida.
5.2.4 Prueba Elisa Panbio® para la detección de inmunoglobulina G específica
para dengue
��Fundamento
La ELISA Dengue IgG de captura se basa en la detección de anticuerpos IgG
presentes en el suero del paciente que se combinan con anticuerpos anti IgG
humana en la fase sólida. Un pool concentrado de antígenos de dengue (1-4) es
diluido en un solución diluyente de antígeno. Un volumen igual de conjugado de
anticuerpos monoclonales (Mab) es agregado a la solución en la que se han
diluido los antígenos, allí se formaran complejos antígeno-Mab. El suero residual
es removido por lavado y el complejo antígeno-Mab es agregado a la placa de
ensayo. Después de la incubación, se hace un nuevo lavado y se agrega un
sistema de sustrato de color tetrametilbenzidina/peroxido de hidrógeno
(TMB/H2O2). El sustrato es hidrolizado por la enzima y después de parar la
reacción con ácido el TMB revela un color amarillo. La aparición de color indica la
presencia de anticuerpos IgG contra el virus del dengue.
��Dilución del suero y los controles
De acuerdo a las recomendaciones del fabricante se utilizó un pozo para el control
negativo, un pozo para el control positivo y un calibrador en triplicado. Estos
controles junto con las muestras fueron diluidas 1:100, tomando 10 µl de suero o
control y 1000 µl de diluyente de muestra.
50
��Preparación del antígeno
El antígeno liofilizado fué reconstituido con 1 ml de reconstituyente de antígeno.
Un volumen igual del antígeno previamente diluido y conjugado de anticuerpos
monoclonales (Mab Tracer) son mezclados e incubados durante una (1) hora a
temperatura ambiente.
��Preparación de la solución de lavado
Un volumen de 60 ml de buffer fosfato pH 7.2 con twen 20 se llevó hasta
completar un volumen final de 1.200 ml con agua destilada, según las
recomendaciones del fabricante. Todos los lavados de la placa fueron realizados
con un volumen final de 350 µl por pozo con la solución de lavado.
��ELISA
100 µl de la dilución de la muestra y los controles fueron añadidos a cada pozo
llevando a incubar a 37°C durante una (1) hora. Luego de la incubación se lavó la
placa seis (6) veces con solución de lavado. Se agregaron 100 µl del complejo
antígeno-Mab-tracer a cada pozo y se llevo a incubar a 37°C durante una (1) hora.
Después de lavar la placa seis (6) veces con solución de lavado, se agregaron 100
µl de TMB a cada pozo dejando a temperatura ambiente durante 10 minutos.
Pasado el tiempo se agregaron 100 µl de solución de parada a cada pozo y se
procedió a leer en espectrofotómetro a 450 nm contra blanco de aire.
5.2.5 Prueba Elisa Suma® para la detección de inmunoglobulina G específica para
dengue
51
��Fundamento
Es un ensayo inmunoenzimático en su variante de captura, en el cual la fase
sólida esta constituida por tiras de ultramicroELISA revestidas con anti IgG
humana.
Las muestras se incuban en los pozos y si estas contienen anticuerpos IgG
específicos se fijaran a la anti IgG humana del recubrimiento. A continuación,
previo lavado que elimina los componentes no fijados, se añade el antígeno de
dengue seguido nuevamente de incubación y lavado. Se añade entonces un
anticuerpo monoclonal murino específico al virus del dengue, conjugado con
fosfatasa alcalina. En caso de reacción positiva este anticuerpo marcado se unirá
al complejo formado previamente sobre la fase sólida. Un nuevo lavado eliminara
entonces el conjugado en exceso. Al añadir un sustrato fluorigénico (4-
metilumbeliferil fosfato), este será hidrolizado y la intensidad de la fluorescencia
emitida permitirá detectar la presencia de anticuerpos IgG específicos contra el
virus del dengue.
��Preparación de las soluciones de trabajo
Solución Tampón R1: Para una tira de reacción se diluyó 1 ml de solución R1
hasta un volumen de 25 ml con agua Milli-Q®. Todos los lavados de la microplaca
fueron realizados con un volumen final de 30 µl por pozo con la solución de
lavado.
Suero de Carnero R2: Se diluyó 1:4 con solución Tampon R1. La cantidad
necesaria por tira fué de 2 ml (0.5 ml de R2 y 1.5 ml de R1).
Sustrato R7: Se diluyó 1:10 con tampón sustrato R8. La cantidad necesaria por
tira fué de 0.5 ml (0.05 ml de R7 y 0.45 ml de R8).
52
��Preparación del antígeno
Se reconstituyó con 2 ml de solución de trabajo R2. La cantidad necesaria por
tira fue de 0.2 ml.
��Preparación de las muestras y controles
Los controles se presentan en el estuche listos para usar por triplicado. Las
muestras se diluyen 1:21 con la solución de trabajo R2 (5 µl de suero y 100 µl de
solución)
��UltramicroELISA
Se colocaron 10 µl de las muestras previamente diluidas y de los controles sobre
los pocillos de reacción. Las muestras fueron analizadas por duplicado según las
recomendaciones del fabricante, y se llevaron a incubar a 37°C en cámara
húmeda previamente equilibrada a esa temperatura durante una (1) hora. La
microplaca se lavó seis (6) veces con la solución de lavado. Luego, se agregaron
10 µl de antígeno a cada pocillo de reacción y se llevó a incubar a 37°C durante
una (1) hora. Después de lavar seis (6) veces con la solución de lavado, se
agregaron 10 µl de conjugado en cada pocillo de reacción y se llevó a incubar a
37°C durante una (1) hora. Después de lavar seis (6) veces con la solución de
lavado, se agregaron 10 µl de sustrato previamente diluido a cada tira de reacción
y se llevaron a incubar a temperatura ambiente durante 9 minutos en cámara
húmeda. Sin embargo, debido a las variaciones de temperatura se recomienda
que cada laboratorio establezca su propio tiempo de incubación óptimo.
Finalmente, se realizó la lectura de la intensidad de la fluorescencia emitida.
53
5.3 Recolección de la Información
La Información de los pacientes con sintomatología compatible con dengue se
obtuvo a través de fichas epidemiológicas diligenciadas en los centros de salud de
cada uno de los municipios participantes del departamento de Cundinamarca.
5.4 Análisis de Información
De acuerdo a la información obtenida se realizó un análisis estadístico univariado,
bivariado y multivariado en el programa Epiinfo 6.04d.
En el análisis univariado se describirán cada una de las variables del estudio en
términos de frecuencias absolutas y relativas. En el análisis bivariado se cruzaran
las variables de interés independientes con la variable dependiente y en el análisis
multivariado se realizara la prueba estadística de concordancia utilizando el índice
kappa (k) para evaluar la reproducibilidad de los dos inmunoensayos.
54
6. RESULTADOS
El número de muestras pareadas fué de 30, con un rango de edad de 4 a los 62
años de edad, de estos el 56.7% fueron pacientes de género femenino. La
seroprevalencia de la enfermedad fue del 42.3% donde la mayoría de los
pacientes procedían de los municipios de Girardot y Pulí con un 26.7%.
En la figura 10 se presentan los resultados del desempeño de los dos
inmunoensayos para la detección de IgM en 30 muestras pareadas de pacientes
con sospecha clínica de infección por dengue tomadas en fase aguda tardía (5-7
días después del inicio de los síntomas) y en fase convalesciente (10-15 días
después de la toma de la primera muestra). Durante la fase aguda tardía la
prueba de Panbio® detectó 14 pacientes (47%) IgM positivos, mientras que la
prueba de Suma® detectó 19 pacientes (63%). Durante la fase convalesciente la
IgM fué detectada con la prueba de Panbio® en 13 pacientes (43%) y con la
prueba de Suma® en 20 pacientes (67%).
Figura 10. Detección de IgM por los dos inmunoensayos en fase aguda tardía (S1) y fase convalesciente (S2)
14
19
13
20
02468
101214161820
No.
de
paci
ente
s co
n Ig
M
posi
tiva
S1 S2
Panbio® Suma®
55
Tabla 1. Resultados de los títulos de inhibición de hemoaglutinación, inmunoglobulina M e inmunoglobulina G por las dos pruebas en muestras
pareadas en fase aguda tardía (S1) y en fase convalesciente (S2)
En la tabla 1 se observan 10 pacientes (3,5,7,8,9,11,12,19,25,26) con títulos en I.H
>1:320 y positividad a IgM e IgG por las dos pruebas tanto en fase aguda tardía
como convalesciente, correspondiente a infección secundaria según los criterios
de la Organización Mundial de la Salud, sin embargo 4 pacientes (7,8,9,19)
presentaron negatividad a IgM en fase convalesciente la prueba de Panbio®.
No. TITULOS I.H PANBIO® IgM PANBIO® IgG SUMA® IgM SUMA® IgG
S1 S2 S1 S2 S1 S2 S1 S2 S1 S2
1 20 40 Negativo Positivo Negativo Negativo Positivo Positivo Negativo Positivo
2 20 80 Negativo Positivo Negativo Negativo Positivo Positivo Negativo Positivo
3 1.280 1.280 Positivo Positivo Positivo Positivo Positivo Positivo Positivo Positivo
4 20 40 Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Positivo Positivo
5 1.280 1.280 Positivo Positivo Positivo Positivo Positivo Positivo Positivo Positivo
6 20 40 Positivo Positivo Negativo Negativo Positivo Positivo Negativo Positivo
7 1.280 1.280 Positivo Negativo Positivo Positivo Positivo Indeterminado Positivo Positivo
8 1.280 640 Positivo Negativo Positivo Positivo Positivo Positivo Positivo Positivo
9 320 640 Positivo Negativo Positivo Positivo Positivo Positivo Positivo Positivo
10 20 80 Positivo Positivo Negativo Negativo Positivo Positivo Negativo Positivo
11 640 1.280 Positivo Indeterminado Positivo Positivo Positivo Positivo Positivo Positivo
12 40 640 Positivo Positivo Positivo Positivo Positivo Positivo Positivo Positivo
13 40 40 Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Positivo Positivo
14 20 20 Positivo Positivo Negativo Negativo Positivo Positivo Positivo Positivo
15 20 20 Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Positivo Negativo Negativo
16 20 20 Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Positivo Positivo Positivo
17 20 20 Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo
18 20 20 Negativo Positivo Negativo Negativo Positivo Positivo Negativo Positivo
19 1.280 640 Positivo Negativo Positivo Positivo Positivo Positivo Positivo Positivo
20 20 20 Negativo Positivo Negativo Negativo Positivo Positivo Positivo Sin dato
21 80 80 Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Positivo Positivo
22 20 20 Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Positivo Positivo
23 20 20 Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo
24 20 20 Indeterminado Indeterminado Negativo Negativo Positivo Positivo Positivo Positivo
25 320 640 Positivo Positivo Positivo Positivo Positivo Positivo Positivo Positivo
26 1.280 1.280 Positivo Positivo Positivo Positivo Positivo Positivo Positivo Positivo
27 80 40 Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Positivo Positivo
28 20 20 Positivo Positivo Negativo Negativo Positivo Positivo Negativo Positivo
29 20 20 Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Positivo Positivo
30 40 40 Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Positivo Positivo
56
En ausencia de títulos en I.H (�1:20), la prueba de Suma® determinó 4 pacientes
(16,22,24,29) con positividad para IgG en fase aguda y convalesciente, mientras
que en la prueba de Panbio® solo se observó positividad a IgM en fase aguda
tardía o en fase convalesciente en 4 pacientes (14,18,20,28).
Las dos pruebas presentaron positividad a IgM en 4 pacientes (6,10,14,28) en fase
aguda tardía y convalesciente. Sin embargo, la prueba de Suma® determinó IgM
en mayor número respecto a Panbio® en fase aguda tardía y convalesciente.
Únicamente, 4 pacientes presentaron positividad a IgG en fase aguda y fase
convalesciente por la prueba de Suma®. Sin embargo ninguno de estos presentó
IgM por las dos pruebas.
En el panel de negativos las dos pruebas detectaron un resultado positivo para
IgM (1/35). En el panel de muestra IgM positivas para dengue, la prueba de
Panbio® detectó 4 (4/30) resultados IgM negativos y 2 resultados (2/30)
indeterminados, mientras que Suma® detectó 6 (6/30) resultados IgM negativos.
Dos resultados IgM negativos fueron comunes para las dos pruebas en este panel.
En la Tabla 2 se observa el porcentaje de muestras con reacción cruzada para
otras infecciones por los dos inmunoensayos. La prueba de Suma® detectó 3
muestras con diagnóstico serológico de Fiebre amarilla, una muestra positiva en
pacientes vacunados contra fiebre amarilla, Hepatitis C, Sarampión, Rubéola y
Leptospirosis, mientras que la prueba de Panbio® detectó anticuerpos IgM para
dengue en una muestra con diagnóstico serológico de Fiebre amarilla y una con
diagnóstico previo de infección por Rubéola, comunes en las dos pruebas. No se
detectaron muestras con reacción cruzada para Malaria en las dos pruebas.
57
Tabla 2. No. de muestras IgM positivas para dengue en el panel de muestras positivas para otras infecciones
La concordancia entre los dos inmunoensayos para la detección de
inmunoglobulina M específica para el virus del dengue esta presentado en la
Tabla 3. Del total de las 170 muestras, la prueba de Panbio® detectó IgM en 54
muestras (31.8%), 111 muestras (65.3%) presentaron un resultado negativo y 5
muestras (2.9%) presentaron un resultado indeterminado para IgM. La prueba de
Suma® detectó 72 muestras (42.3%) con un resultado positivo a IgM, 96 muestras
(56.5%) presentaron un resultado negativo y 2 (1.18%) presentaron un resultado
indeterminado para IgM.
Tabla 3. Concordancia de los dos inmunoensayos para la detección de Inmunoglobulina M
Muestras No. positivos para IgM dengue / No. de
muestras por otras infecciones (%) Panbio® Suma® Fiebre Amarilla 1/5 (80) 3/5 (60) Fiebre Amarilla Posvacunal 0/10 (100) 1/10 (90) Hepatitis C 0/10 (100) 1/10 (90) Sarampión 0/5 (100) 1/5 (80) Rubéola 1/5 (80) 1/5 (80) Malaria 0/5 (100) 0/5 (100) Leptospirosis 0/5 (100) 1/5 (80) Total 2/45 (96) 8/45 (82)
No. (%) de los resultados de IgM
Resultado Panbio® Suma®
Positivo 54 (31,8) 72 (42,3)
Negativo 111(65.3) 96 (56,5)
Indeterminado 5 (2,9) 2 (1,18)
Total 170 (100) 170 (100)
58
Los resultados de cada una de las pruebas respecto a su sensibilidad,
especificidad, valor predictivo positivo (VPP), valor predictivo negativo (VPN) e
índice Kappa (k) fueron evaluadas utilizando cada prueba como “estándar de oro”,
resumidos en la Tabla 4. En general, la concordancia entre los dos
inmunoensayos fue casi perfecta (K=0.81).
La sensibilidad de la prueba de Panbio® fué del 74% y para la prueba de Suma®
fué del 94%. La especificidad de la prueba de Panbio® fué del 97% y para la
prueba de Suma® del 83%. El valor predictivo positivo de la prueba de Panbio® y
de la prueba de Suma® fué 94% y 74%, respectivamente. El valor predictivo
negativo de la prueba de Panbio® fué de 83% y de la prueba de Suma® del 97%
(Tabla 4).
Tabla 4. Sensibilidad, Especificidad, Valor predictivo positivo, Valor predictivo
negativo e índice kappa para los dos inmunoensayos
DETECCIÓN DE INMUNOGLOBULINA M
Inmunoensayo Sensibilidad
(%) Especificidad
(%) VPP (%)
VPN (%) K
Panbio® 74 97 94 83 0.81
Suma® 94 83 74 97 0.81
59
7. DISCUSION
Recientemente, un número de inmunoensayos específicos para la detección de
anticuerpos IgM frente al virus del dengue en suero han sido desarrollados y
evaluados en diferentes estudios (Vaughn et al, 1997; Sang et al, 1998 (A); Sang
et al, 1998 (B); Branch and Levett, 1999; Cuzzubbo et al, 1999; Porter et al, 1999;
Vaughn et al, 1999; Groen et al, 2000; Lam et al, 2000).
Considerando la utilidad de la ELISA para el diagnóstico de dengue unido a las
ventajas propias de los sistemas inmunoenzimáticos (rapidez, facilidad de
ejecución, requerimiento de una muestra simple sin previo tratamiento), nosotros
evaluamos el desempeño de dos inmunoensayos para la detección de IgM
específica para el virus del dengue, a partir de muestras pareadas de pacientes
con sospecha clínica de infección por dengue en fase aguda tardía y fase
convalesciente, utilizando un panel de muestras negativas y un panel de muestras
positivas a IgM de dengue. Además, se incluyeron muestras simples de pacientes
con otras infecciones confirmadas por serología (Sang et al, 1998 (A); Sang et al,
1998 (B); Branch and Levett, 1999; Cuzzubbo et al, 1999; Porter et al, 1999;
Vaughn et al, 1999; Groen et al, 2000; Lam et al, 2000).
En Colombia el diagnóstico de dengue se realiza a partir de la detección de IgM al
quinto día del inicio de los síntomas, sin tener en cuenta que en áreas endémicas
la mayoría de los casos por dengue podrían presentarse como reinfecciones con
una elevación significativa en los niveles de IgG que conllevan a un diagnóstico
erróneo con base en la detección de IgM. Sin duda alguna esto genera un
subregistro de la enfermedad, sumado al diligenciamiento inapropiado de las
fichas de notificación que afectan la interpretación de los resultados, además de
la falta de continuidad en el seguimiento de la enfermedad en los pacientes. Es
importante considerar que un resultado negativo para IgM en una muestra tomada
al quinto día de la enfermedad no descarta una infección por dengue, es
60
aconsejable confirmar el diagnóstico con muestras pareadas (Henchal and
Putnak,1990; Kuno, 1995; Vorndan and Kuno, 1997; Gubbler, 1998; Vaughn et al,
1999; Lam et al, 2000).
A partir de los resultados encontrados en nuestro estudio respecto a los niveles de
IgG, la prueba de Suma® determinó positividad en la mayoría de los pacientes con
bajos títulos en I.H, posiblemente estos resultados podrían sugerir que los
pacientes estuvieron alguna vez en contacto con el virus, reflejando que en áreas
endémicas la mayoría de los pacientes presentan anticuerpos IgG frente al virus
del dengue. Es importante tener en cuenta que la prueba de Suma® fué capaz de
detectar IgG con títulos bajos en I.H. Contrario ocurre con la prueba de Panbio®,
en donde los resultados positivos a IgG se presentaron con altos títulos en I.H.
Tradicionalmente la técnica de inhibición de la hemoaglutinación ha sido usada
para diferenciar entre infección primaria y secundaria. Según los criterios de la
Organización Mundial de la Salud se considera que los títulos �1:2.560 son
indicativos de infección secundaria (OMS, 1997). Sin embargo, en nuestro estudio
los pacientes con infección secundaria presentaron títulos en I.H �1:1.280.Estos
resultados pueden ser debidos a factores nutricionales, ambientales y geográficos
que cambian la respuesta a la enfermedad en diferentes regiones.
Del total de los pacientes con sospecha clínica de dengue, solamente en 3
pacientes fué evidente una seroconversión por la técnica de I.H, los demás
pacientes presentaron infección primaria con una buena correlación en los
resultados de IgM e IgG para las dos pruebas.
En el panel de muestras con otras infecciones, los dos inmunoensayos detectaron
positividad a IgM de dengue, sin embargo la prueba Panbio® mostró una alta
especificidad para infecciones por no dengue (95%) frente a la prueba de Suma®
que presentó una especificidad del 82%. La reactividad cruzada puede ser debida
61
a coinfección con otras enfermedades con síntomas clínicos similares al dengue y
a regiones homologas entre Flavivirus y diferentes microorganismos. Los
resultados de nuestro estudio confirman la reactividad que existe para Fiebre
amarilla y Hepatitis C, flavivurus presentes en Colombia que interfieren en el
diagnóstico de dengue. (Henchall and Putnak, 1990; Kuno, 1995; Guzmán and
Kourí, 1996; Gubler, 1998; Lam et al, 2000; Mcbride and Omán, 2000).
Los resultados positivos a IgM en el panel de muestras negativas corresponden a
2 pacientes de banco de sangre que pudieron haber estado infectados meses
antes de la donación, a pesar de ser habitantes de zonas no endémicas.
Dentro de los resultados obtenidos en nuestro estudio se encontró que la prueba
de Panbio® tuvo una sensibilidad del 74% y una especificidad del 97% y la prueba
de Suma® presentó una sensibilidad del 94% y una especificidad del 83%. Los
dos inmunoensayos presentaron una concordancia casi perfecta (K=0.81). Las
variaciones en sensibilidad y especificidad para los dos inmunoensayos dependen
del principio de la prueba (Sang et al, 1998 (A); Sang et al, 1998 (B); Cuzzubbo
et al, 1999; Porter et al, 1999; Groen et al, 2000). El principio de fluorescencia
permite realizar la lectura de los controles en tiempos que varían de 5 a 30
minutos de acuerdo a las condiciones ambientales de cada laboratorio, causando
dificultades en el desempeño diario de la prueba y posibles alteraciones en los
resultados de los controles que invalidan la prueba.
El desempeño de las pruebas inmunoenzimáticas pueden verse afectadas por
condiciones ambientales como pH, humedad y temperatura que pueden interferir
en la estabilidad del antígeno, así como en la unión a los anticuerpos.
El uso de proteínas recombinantes utilizadas en los inmunoensayos han sido una
importante herramienta en el diagnóstico, debido a que representan la mayor parte
de los epítopes de la proteína de envoltura, blanco de la respuesta inmune,
favoreciendo el desempeño de la prueba respecto a su especificidad, sin embargo
62
presenta limitaciones en la sensibilidad debido a que los anticuerpos solo
reconocen el epítope utilizado (Cuzzubbo et al, 2001).
En pruebas diagnósticas en donde se utiliza proteínas purificadas del virus, la
sensibilidad se ve favorecida por el aumento en el número de epítopes utilizados,
disminuyendo su especificidad por presentar regiones conservadas en la mayoría
de los flavivirus.
De acuerdo a los resultados obtenidos en este estudio, la prueba de Suma® por
presentar una alta sensibilidad (94%) podría ser útil en estudios
seroepidemiológicos para dengue. Por otra parte, la prueba de Panbio® por su
alta especificidad (97%) y valor predictivo positivo (94%) podría aportar
herramientas importantes en el diagnóstico de infección por dengue.
63
8. CONCLUSIONES La evaluación de los dos inmunoensayos permitió establecer que son técnicas
más rápidas, simples y de bajo costo que presentan un nivel de concordancia casi
perfecto.
Dentro de los resultados obtenidos se encontró que la prueba de Panbio® tuvo una
sensibilidad del 74% y una especificidad del 97% y la prueba de Suma® presentó
una sensibilidad del 94% y una especificidad del 83%. Los valores predictivos
positivos fueron de 94% y 74% para las pruebas de Panbio® y Suma®,
respectivamente y el valor predictivo negativo para la prueba de Panbio® fué del
83% y para la prueba de Suma® fue del 97%.
La mayoría de los pacientes presentaron infección activa por el virus del dengue
con la presencia de anticuerpos IgM frente al virus por los dos inmunoensayos. En
un menor número se presentaron casos de reinfección en pacientes que viven en
zonas endémicas demostrado por el resultados positivos a IgG y títulos >1:20 por
la técnica de inhibición de la hemoaglutinación.
La prueba de Suma® detectó 3 muestras con diagnóstico serológico de Fiebre
amarilla, una para pacientes vacunados contra fiebre amarilla, Hepatitis C,
Sarampión, Rubéola y Leptospirosis, mientras que la prueba de Panbio® detectó
anticuerpos IgM para dengue en una muestra con diagnóstico serológico de Fiebre
amarilla y una con diagnóstico previo de infección por Rubéola, comunes en las
dos pruebas. No se detectaron muestras con reacción cruzada para Malaria en las
dos pruebas
64
9. RECOMENDACIONES
Es importante ampliar el número de muestras utilizadas en cada uno de los
paneles, así como incluir muestras por otras patologías. De igual forma se
recomienda contar con la participación de los diferentes laboratorios a nivel
nacional para evidenciar el desempeño de los dos inmunoensayos a lo largo del
territorio colombiano.
65
9. REFERENCIAS
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72
ANEXO 1 INSTITUTO NACIONAL DE SALUD
SUBDIRECCION DE EPIDEMIOLOGIA y LNR VIGILANCIA DE ENFERMEDADES FEBRILES EMERGENTES
DATOS DE LA INSTITUCION DONDE SE TOMA LA MUESTRA Nombre Dirección Municipio
Teléfono
DATOS DEL PACIENTE Nombre
Edad: Años: Meses:
Genero: Masculino __Femenino __
Dirección de residencia/Barrio Municipio/Vereda
Departamento Teléfono
Lugar probable de infección: Animales enfermos lugar de residencia: Animales muertos:
Ha viajado en los 10 días anteriores al inicio de la enfermedad Si ___ No ___ A donde _____________________
Padeció en el pasado dengue Si __ No __
Vacunado con Fiebre amarilla ___ / ___ / ___ DD / MM / AA Si __ No___
RESUMEN DE HISTORIA CLINICA Fecha inicio de síntomas
___ / ___ / ___ DD / MM / AA
Fecha de toma de muestra ___ / ___/ ___ DD / MM / AA
Hospitalizado Si ___ No ___
Fecha de hospitalización: ___ / ___/ ___ DD / MM / AA
SIGNOS Y SINTOMAS Si No No sabe Exámenes de
laboratorio Fecha de toma DD / MM / AA
Resultado
Fiebre Gota gruesa ___ / ___/ ___ Cefalea Mialgias Hematocrito 1 ___ / ___/ ___ Artralgias Hemoglobina 1 ___ / ___/ ___ Dolor retroorbital Plaquetas 1 ___ / ___/ ___ Erupción Sangrado Hematocrito 2 ___ / ___/ ___
Petequias Hemoglobina 2 ___ / ___/ ___ Equimosis Plaquetas 2 ___ / ___/ ___ Epistaxis gingivorragia hematemesis PARA USO DEL LABORATORIO DE
SALUD PUBLICA metrorragia Fecha de recepción en el laboratorio Melenas Hematuria Exámenes Fecha de toma Resultado
Ictericia DD / MM / AA Choque IgM dengue Muerte IgG dengue ___ / ___/ ___ Fecha muerte
___ / ___/ ___ DD / MM / AA PARA USO DEL LABORATORIO NACIONAL DE
REFERENCIA
Aislamiento viral Dengue
___ / ___/ ___ DD / MM / AA
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ANEXO 2
SOLUCIONES MADRES PARA PREPARAR REACTIVOS USADOS EN LAS PRUEBAS DE HEMOAGLUTINACION Y DE INHIBICION DE LA
HEMOAGLUTINACION a. Cloruro de sodio (NaCl) 1.5 M NaCl 87.675 gramos
Agua destilada 1.000 ml Guardar a 4°C b. Acido bórico (H3BO3) 0.5 M H3BO3 30.92 gramos Disolver en 700 ml de agua destilada caliente.
Dejar enfriar a temperatura ambiente y agregar agua destilada 1000 ml. Guardar a temperatura ambiente.
c. Hidróxido de sodio (NaOH) concentrado
NaOH 500 gramos Disolver en 500 ml de agua destilada. Dejar enfriara a temperatura ambiente. Tapar bien y dejar en reposo por varios días para que sedimente. Pasar el sobrenadante a un frasco de tapa hermética.
Guardar a temperatura ambiente. d. Fosfato dibásico de sodio (Na2HPO4) 0.5 M Na2HPO4 (anhidro) 70.99 gramos Agua destilada 1.000 ml Guardar a 4° C E .Fosfato monobásico de sodio (NaH2PO4) 1.0 M
NaH2PO4 H2O 138.01 gramos Agua destilada 1.000 ml Guardar a 4°C.
74
REACTIVOS PARA LAS PRUEBAS DE HEMOAGLUTINACION Y DE INHIBICION DE LA HEMOAGLUTINACION
1. Solución salina boratada pH 9.0
Se prepara con las soluciones madres A, B y C. A. NaCl 1.5 M 80 ml B. H3BO3 0.5 M 100 ml C. NaOH 1.0 M 24 ml Verificar el pH. El hidróxido de sodio 1.0 M se prepara hacienda en agua destilada la dilución apropiada de la solución concentrada. Guardar a 4° C. 2. Ajustadores de pH Se preparan con las soluciones madres A, D y E. Se debe tener presente que los diferentes pH del cuadro siguiente, no son los valores de cada uno de los ajustadores, sino el pH que resulta de mezclar un volumen del ajustador respectivo con un volumen igual de solución salina boratada pH 9.0. Guardar a 4C
Solución madre (Cantidades en ml)
6.0
6.2
6.3
6.4
6.5
6.6
6.8
7.0
A. NaCl 1.5 M B. Na2HPO4 0.5 M
E. NaH2PO4 1.0 M Agua destilada
100 32
184 1000
100 62
169 1000
100 92
154 1000
100 112 144
1000
100 136 132
1000
100 160 120
1000
100 192 104
1000
100 240 80
1000
3. Albúmina bovina (fracción V ) al 4% pH 9.0 Albúmina bovina (fracciòn V) 4 gramos Solución salina boratado pH 9.0 90 ml La solución salina boratado se pone en un vaso y sobre la superficie se deposita el polvo de albúmina bovina. Se deja en reposos hasta que la albúmina se disuelve. No se debe agitar pues se forma espuma. Se ajusta el pH, con NaOH 2.0 M y se completa el volumen a 100 ml con solución salina boratada.
75
Distribuir en volumen de 10 ml en frascos de 100 a 120 ml de capacidad y guardar en el congelador.
4. Albúmina bovina (fracción V) al 0.4 % pH 9.0 Se prepara añadiendo 90 ml de solución salina boratado pH 9.0, a un frasco de albúmina bovina al 4% (ver punto anterior) Guardar a 4° C 5. Solución Acido-Citrato-Dextrosa (A.C.D) Acido cítrico (H3C6H5O7 H2O) 4 gramos Citrato de sodio (Na3C6H5O7.2H2O) 11.26 gramos Dextrosa 11.00 gramos Agua destilada 500 ml Esterilizar en autoclave a 10 libras por 10 minutos Guardar a 4° C