inmunoensayos 6

29 de Marzo de 200829 de Marzo de 2008

Dra. Gabriela Villarreal Levy Dra. Gabriela Villarreal Levy Directora de Educación Médica Continua y Extensión, Escuela de MedicinaDirectora de Educación Médica Continua y Extensión, Escuela de Medicina

Dr. Jorge SantiagoDr. Jorge SantiagoOCD Professional Education Manager Latin AmericaOCD Professional Education Manager Latin America

Nuevas Técnicas en Seguridad Microbiológica

Nuevas Técnicas en Seguridad Microbiológica

InmunoensayosInmunoensayos

Inmunoensayos

Son ensayos de laboratorio que permiten la detección de pequeñas concentraciones de metabolitos.

En los inmunoensayos se utilizan antígenos o anticuerpos para el reconocimiento de la molécula que se desea medir.

Los diferentes tipos de inmunoensayos se diferencian en como se revela que la unión Ag-Ab se produjo.

Los inmunoensayos pueden clasificarse de distintas maneras, por ejemplo:

De acuerdo a como se desarrolla la reacción:

• En fase homogénea(Inmunoturbidimetría, EMIT, etc.)

• En fase heterogénea(Latex, ELISA, etc.)

Inmunoensayos

Inmunoensayos

Otra opción es clasificarlos de acuerdo a como se expresan los resultados:

• CuantitativosEl resultado obtenido indica una concentración

• Cualitativos o Cut-0ffEl resultado obtenido indica sólo la presencia o ausencia de la molécula buscada

Los ensayos Cut-off Inmunoensayos

Núm

ero

de in

divi

duos

Señal

Población sana

Infectados

Falsos Negativos

Falsos Positivos

Verdaderos Positivos

Verdaderos Negativos

Valor Cut-off

Características de los ensayos

• Especificidad

• Sensibilidad

• Precisión y exactitud

Especificidad

En los inmunoensayos la especificidad está dada por la especificidad de la reacción Ag-Ab misma.

Está asociada al porcentaje de falsos positivos (FP) que se obtienen con una determinada técnica.


Presente Ausente

Infección

Positivo

Negativo

Resultado

VP FP

FN VN

Especificidad

La especificidad se expresa como:

Presente Ausente

Infección

VP FP

FN VN

Positivo

Negativo

Resultado

E = VN

VN + FP


• Especificidad

• Sensibilidad


Sensibilidad

Indica la mínima concentración que una determinada técnica permite medir de un determinado metabolito.

Debe adecuarse a las concentraciones que dicho metabolito tiene en el fluído biológico en los que se desea realizar la medición.

Sensibilidad

En los inmunoensayos la sensibilidad está determinada por la marca que permite revelar la reacción Ag-Ab.

Está asociada al porcentaje de falsos negativos (FN) que se obtienen con una determinada técnica.

Sensibilidad

La sensibilidad se expresa como:

Presente Ausente

Infección

VP FP

FN VN

Positivo

Negativo

Resultado

S = VP

VP + FN


• Especificidad

• Sensibilidad


Precisión y exactitud

Valor verdadero

Medición exacta pero no precisa


Valor verdadero

Medición exacta pero no precisa

Medición precisa pero no exacta

Valor verdadero


Un sistema ideal de medición sería aquel que mida siempre el valor verdadero, por supuesto ese sistema no existe.

¿Qué es más importante en el laboratorio?¿La precisión o la exactitud?


Un sistema ideal de medición sería aquel que mida siempre el valor verdadero, por supuesto ese sistema no existe.

¿Qué es más importante en el laboratorio?¿La precisión o la exactitud?

Obviamente la precisión.


Por definición la exactitud es una medida de cuánto se acerca la media de las mediciones realizadas, al valor verdadero.

Más aún. ¿Existe en realidad la exactitud?

Pero el valor verdadero es imposible conocerlo, por lo tanto la exactitud tiene sólo un valor teórico.


En los análisis biológicos no importan tanto los valores absolutos de concentración sino la concentración que un determinado metabolito presenta frente a su rango de referencia.

Si bien las calibraciones de los ensayos se realizan contra standards internacionales, cada técnica presenta su propio rango de referencia.


Sociedad Argentina de Endocrinología Ginecológica y Reproductiva

0

50

100

150

200

250

Access Vitros DELFIA ACS 180 Immulite Axsym Elecsys

Prolactina (ng/ml)

98.6

216.2

ECi


3.66 1.30 1.66 3.48 1.51 5.70 2.47Coef. Variación %

Sociedad Argentina de Endocrinología Ginecológica y Reproductiva

0

50

100

150

200

250

Access VitrosECi

DELFIA ACS 180 Immulite Axsym Elecsys

Prolactina (ng/ml)

98.6

216.2

Inmunoensayos más habituales

• Radioinmunoensayo (RIA)

• Enzimoinmunoensayo (EIA)

• Quimioluminiscencia (QL)

Radioinmunoensayo

El marcador es un átomo radioactivo. En general se usa 125I, aunque también se utiliza el tritio (3H).La lectura se realiza midiendo la cantidad de radioactividad en un contador de pozo.

Problemas:- Son lentos- Son difíciles de automatizar- Tienen requerimientos regulatorios

Enzimoinmunoensayo

El marcador es una molécula de enzima (en general peroxidasa). La enzima actúa sobre un sustrato cuyo producto final es coloreado.La medición se realiza en un espectrofotómetro común.

Problemas:- Son Poco sensibles

Quimioluminiscencia

Es la última tecnología desarrollada.El marcador es una molécula c|apaz de emitir luz (en general luminol o ésteres de acridina).

Existen 4 generaciones de reactivos diferentes:

1) Quimioluminiscencia directa2) Quimioluminiscencia indirecta3) Electroquimioluminiscencia4) Quimioluminiscencia amplificada

Quimioluminiscencia directa

En esta técnica el anticuerpo está marcado directamente con la molécula luminiscente.Por lo tanto, por cada anticuerpo marcado se emiten una cantidad limitada de fotones.

Luz

Tiempo

Quimioluminiscencia indirecta

Luz

Tiempo

Funciona de manera similar al EIA. El anticuerpo está marcado con una enzima, ésta actúa sobre un sustrato que es el que emite la luz. Por cada anticuerpo marcado se obtienen muchos fotones.

Electroquimioluminiscencia

Luz

Tiempo

El anticuerpo queda marcado con un complejo Ru-TPA (Tripropilamina) Este complejo emite luz sólo cuando es activado eléctricamente. La energía necesaria para la emisión es provista externamente.

Quimioluminiscencia amplificada

Luz

Tiempo

Es una quimioluminiscencia indirecta.También acá vamos a tener una enzima que va a actuar sobre un sustrato que es el que va a emitir luz, pero hay una molécula que acelera la reacción entre la enzima y el sustrato.

Quimioluminiscencia amplificadaMecanismo de reacción

HRPAg

H2O2

H2O

LUZ

COOH

NH2

COO-

N2Acido 3-aminoftálico

+N

NH2 O •

NH •

NH •

O •

NH2

O •

O •

N •

N •

NH2

O •

O •

HOO-

N

• •

Luminol

(+e)

Quimioluminiscencia amplificadaMecanismo de reacción

HRPAg

H2O2

H2O

LUZ

COOH

NH2

COO-

N2Acido 3-aminoftálico

+N

NH2 O •

NH •

NH •

O •

NH2

O •

O •

N •

N •

NH2

O •

O •

HOO-

N

• •

Luminol

(+e)(+e)

NHCOCH3

NHCOCH3

O •

OH

Cl

Cl

(-e)

Potenciador

Características de la Quimioluminiscencia

Amplificada

Quimioluminiscencia amplificadaCaracterísticas

• Es la última tecnología de quimioluminiscencia desarrollada

• El potenciador multiplica la velocidad de la reacción entre la enzima y el sustrato por un factor de 103

• El sustrato se mantiene emitiendo luz durante 4 horas sin que se pueda detectar una caída en la emisión

• La emisión de luz es 106 veces más brillante que en la quimioluminiscencia directa

• Presenta sensibilidades y rangos dinámicos máximos

Comparación de sensibilidadesSensibilidad

Límite mínimo de detección / moles de marcador

Mét

odo

de d

etec

ción

10-14 10-1910-17 10-1810-16 10-20 10-2110-15

EIA

FPIA

Radioinmunoensayo

Quimiolumiscencia indirecta

Comparación de sensibilidadesSensibilidad

Límite mínimo de detección / moles de marcador

Mét

odo

de d

etec

ción

10-14 10-1910-17 10-1810-16 10-20 10-2110-15

EIA

FPIA

Radioinmunoensayo

Quimiolumiscencia indirecta

Quimiolumiscencia amplificada

Especificidad

Tal como dijimos, en los inmunoensayos la especificidad la aporta la reacción antígeno-anticuerpo misma.

Este tipo de reacciones son altamente específicas, pero con el advenimiento de los anticuerpos monoclonales esta especificidad ha llegado a niveles sencillamente exquisitos.

Precisión

Concentración

Luz emitidaQuimioluminiscencia amplificada

Quimioluminiscencia directa

Indeterminacionesdebidas al

instrumento

Indeterminacionesen la medición

final

QuimioluminiscenciaAmplificada

en el Banco de Sangre


Núm

ero

de in

divi

duos

Señal

Población sana

Infectados

Falsos Negativos

Falsos Positivos

Verdaderos Positivos

Verdaderos Negativos

Valor Cut-off


Núm

ero

de in

divi

duos

Señal

Población sana

Infectados

Distribución de resultadosELISA anti-HCV

n = 1229 pacientes

Pacie

nte

s n

o

reacti

vos

Pacie

nte

s re

activ

os

Relación de positividad0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0 2,0 3.0 5.0 10 15 20 25 30 >30

200

400

600

800

1000

0

1200

100

200

300

0

500

400

704

67

578

253

13691

44 25 19

439

190

1521

41

n = 1229 pacientes

Pacie

nte

s n

o

reacti

vos

Pacie

nte

s re

activ

os


200

400

600

800

1000

0

1200

100

200

300

0

500

400

88

671

30 24 9 6 3

143

305

145

185

1101

2 6 817

48

Distribución de resultadosVitros anti-HCV

n = 1229 pacientes

Pacie

nte

s n

o

reacti

vos

Pacie

nte

s re

activ

os


200

400

600

800

1000

0

1200

100

200

300

0

500

400

Distribución de resultadosanti-HCV

MEIA anti-HIVDistribución de resultados

310

2

367

5010 1 1 1 1 1

3 25

88

23

n = 865 pacientes

Pacie

nte

s n

o

reacti

vos

Pacie

nte

s re

activ

os

Relación de positividad

20

40

60

80

0

100

0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0 1.5 2.0 5.0 10 15 20 40 60 >60

100

200

300

400

500

0

600

700

800

Distribución de resultadosVitros anti-HIV

n = 865 pacientes

Pacie

nte

s n

o

reacti

vos

Pacie

nte

s re

activ

os


20

40

60

80

0

100

0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0 1.5 2.0 5.0 10 15 20 40 60 >60

100

200

300

400

500

0

600

700

800 716

19 2 2 21 2

33

69

19

Distribución de resultadosanti-HIV

n = 865 pacientes

Pacie

nte

s n

o

reacti

vos

Pacie

nte

s re

activ

os


20

40

60

80

0

100

0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0 1.5 2.0 5.0 10 15 20 40 60 >60

100

200

300

400

500

0

600

700

800

MEIA HBsAgDistribución de resultados

Pacie

nte

s n

o

reacti

vos

Pacie

nte

s re

activ

os


20

40

60

80

0

100

0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0 1.5 2.0 5.0 10 15 20 100 200 >200

100

200

300

400

500

0

600

700

800 n = 1208 pacientes

383

386

491

155

327 2 2 1 3 3 3 3

58

21

Distribución de resultadosVitros HBsAg

Pacie

nte

s n

o

reacti

vos

Pacie

nte

s re

activ

os


20

40

60

80

0

100

0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0 1.5 2.0 5.0 10 15 20 100 200 >200

100

200

300

400

500

0

600

700


190

765

133

15 5 4 1 1 13

1 25

2

80

Distribución de resultadosHBsAg

Pacie

nte

s n

o

reacti

vos

Pacie

nte

s re

activ

os


20

40

60

80

0

100

0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0 1.5 2.0 5.0 10 15 20 100 200 >200

100

200

300

400

500

0

600

700


RecesoRecesoCoffee BreakCoffee Break

Los kits de detección de HIV de 4ta. Generación

HIVEl virus

HIVLas principales proteínas

SIDA, 1996-2000, REVISIÓN, Septiembre 1998

gp160

gp120

gp41

p55

p40

p24

p17

p66

p51

p31

Denominación

Precursora de envoltura

Glucoproteína externa

Glucoproteína transmembrana

Precursora del core

Proteína principal

Proteína de la matriz

Transcriptasa inversa

Endonucleasa

Proteína

env

gag

pol

Gen

HIVEl diagnóstico de la infección

“No existe ninguna manifestación clínica que sea característica de la infección VIH o del SIDA y, aunque la presencia de alguna de ellas puedan sugerir en un contexto determinado la presencia de la infección, no es posible establecer un diagnóstico clínico de la enfermedad por lo que éste solo se puede establecer de un modo definitivo por técnicas de laboratorio” (1)

(1) SIDA, 1996-2000, REVISIÓN, Septiembre 1998

HIVLos métodos diagnósticos

• Técnicas inmunométricas

• Métodos directos

• Pruebas confirmatorias

Técnicas inmunométricasGeneraciones

• Primera generación

• Segunda generación

• Tercera generación

Técnicas inmunométricasPrimera generación

• Detección de anticuerpos mediante EIA indirecto con antígeno obtenido de lisado vírico y anticuerpos policlonales

Fasesólida

Antígeno proveniente de lisado vírico

Anti-inmunoglobulina humana policlonalconjugada

Muestra del paciente

Técnicas inmunométricasSegunda generación

• Detección de anticuerpos mediante EIA indirecto con antígeno obtenido de lisado vírico y anticuerpos monoclonales

Antígeno proveniente de lisado vírico


Anti-inmunoglobulina humana monoclonalconjugada

Fasesólida

Técnicas inmunométricasTercera generación

• Detección de anticuerpos mediante EIA tipo sandwich o de inmunocaptura, con antígeno obtenido de proteínas recombinantes y/o péptidos sintéticos y detección conjunta de anticuerpos específicos IgG, IgM e IgA

Antígeno recombinante Muestra del

paciente


Fasesólida

Métodos directos

• Cultivo viral

• Detección de antigenemia (p24) (ELISA)

• Detección molecular de DNA provírico o RNA vírico

Miden en forma directa algún componente de la estructura viral

Pruebas confirmatorias

• Western Blot (WB)

• Inmunofluorescencia indirecta (IFI)

Pruebas de cuartageneración

El período ventana

• Uno de los principales desafíos que presenta el diagnóstico del HIV en banco de sangre es el período ventana

• Este período es el lapso que transcurre desde el momento de la infección hasta el momento de la aparición de algún marcador medible

• Obviamente los primeros marcadores que pueden encontrarse son los antígenos virales, en particular la proteína p24

• Al aparecer los anticuerpos anti-p24 la proteína se hace indetectable pues queda enmascarada formando parte de complejos inmunes

Marcadores en la infección por HIV

HIV RNA

Ag p24

Ab anti-p24

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100Días

Ag / Ab

Día 11 Día 16 Día 22

G. Contreras Carrasco, Sociedad Española Interdiciplinaria del SIDA, Volumen 14, Número 3, Marzo 2003

El período ventana

• De acuerdo al gráfico precedente la determinación conjunta de p24 y anticuerpos anti-HIV permitiría la reducción del período ventana en poco menos de una semana

• Por esta razón muchas legislaciones en el mundo comenzaron a exigir la determinación tanto de Ag como de Ab como métodos de screening

• Es decir que a cada donante se le deberán realizar dos ensayos inmunométricos en lugar de uno, lo cual conlleva un mayor gasto y una mayor complejidad desde le punto de vista operativo

Pruebas de cuarta generación

• Desde el año 1997 se encuentran disponibles en el mercado los ensayos inmunométricos llamados de “cuarta generación”

• Estos ensayos permiten la determinación simultánea de Ag p24 y anticuerpos anti-HIV con el objetivo de bajar el período ventana pero mediante un solo ensayo

• De esta manera se solucionarían los problemas de tipo económico y operativos

Pruebas de cuarta generaciónEstrategia

Detección de Ag

Detección de Ab

p24


Anti-p24monoclonalconjugada

Anti-p24monoclonal


Antígeno recombinante


• La principal pregunta que debemos hacer ahora es si realmente consiguen el objetivo buscado

• Lo que claramente se observa es una pérdida de sensibilidad para los dos tipos de moléculas que se están midiendo, es decir tanto para p24 como para los anticuerpos

• En los ensayos tipo sandwich la sensibilidad viene determinada, entre otros factores, por la cantidad de sitios activos, por unidad de superficie, presentes en la fase sólida

La sensibilidadDistribución de sitios en la fase sólida

Medición de Ag p24 (kits de tercera generación)

Medición de Abs (kits de tercera generación)

Medición de Ag p24 y Abs (kits de cuarta generación)


• “Se han realizado estudios que vienen a demostrar que estos equipos, unos más que otros, tienen ciertos inconvenientes que plantean limitaciones para su uso rutinario en el diagnóstico de la infección. Por un lado, en relación con la sensibilidad, se ha visto que en algunos de ellos el límite de detección para el antígeno p24 está en 20 pg/ml, mientras que para los convencionales de tercera generación está en 3-5 pg/ml. Por otro lado, los anticuerpos pueden perder hasta la tercera parte de su capacidad de unión con los antígenos.” (1)

(1) G. Contreras Carrasco, Sociedad Española Interdiciplinaria del SIDA, Volumen 14, Número 3, Marzo 2003


• “Estos ensayos pierden algo de sensibilidad analítica en cada uno de sus componentes, de modo que el umbral de detección de antígeno es mayor, y lo mismo ocurre con los anticuerpos, observándose una reducción en la señal de reactividad en las muestras en las que el antígeno desciende o desaparece.” (1)

(1) Diagnóstico de la Infección por el VIH, Manuel Rodriguez Iglesias y Alberto Terrón Pernía


HIV RNA

Ag p24

Ab anti-p24

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100Días

Ag / Ab

Detección de p24

Detección de anticuerpos

Umbral

Kits de tercera generación

Períodoventana


HIV RNA

Ag p24

Ab anti-p24

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100Días

Ag / Ab


Detección de p24

Umbral

Kits de cuarta generación


HIV RNA

Ag p24

Ab anti-p24

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100Días

Ag / Ab


Detección de p24

Umbral

Primeraventana



HIV RNA

Ag p24

Ab anti-p24

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100Días

Ag / Ab


Detección de p24

Segundaventana

Umbral

Primeraventana



• Esto implica un acortamiento del período de detección del Ag p24

• Consecuentemente también se demora la detección de los anticuerpos anti-HIV

(1) Meier T. et al.; J Clin Virol. 2001 Dec;23(1-2):113-6(2) Speers D. et al.; J Clin Microbiol. 2005 Oct;43(10):5397-9

• El primer hallazgo interesante, al utilizar los ensayos de cuarta generación, es la aparición de un segundo período ventana (1), (2)


• (1) “Frente a paneles de seroconversión no todos los ensayos tuvieron la misma performance, habiendo diferencias en días al tiempo de obtener el primer resultado positivo (2). Al ensayar los ELISAs frente a muestras clínicas provenientes de pacientes en seroconversión hemos detectado que la mayor diferencia entre ellos es su sensibilidad para antígeno p24, en donde muestras antígeno p24 reactivo y anticuerpos negativo por ensayos de tercera generación, no fueron detectadas por algún ensayo de cuarta generación.” (3)

(1) María Belén Bouzas; Infección por HIV: Una revisión sobre la tecnología en diagnóstico(2) Thoai D.L. et al.; J. Clin. Microbio. 2001; 39:3122-3128 (3) Zapiola I. et al.; The 14 International AIDS Conference. Barcelona. July 2002.


• El número de donantes que pudieran ser detectados durante el período de detección de la proteína p24 es extremadamente bajo

• Peor aún es el hecho de no saber realmente que cantidad de pacientes caen en esa segunda ventana inmunológica, puesto que al ser negativos no se les requiere ningún ensayo posterior

• Estas razones han hecho que este tipo de ensayos prácticamente no sean utilizados

Gracias...

01 800 112 2111 Opción 101 800 112 2111 Opción 1Teléfono en cabinaTeléfono en cabina

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Producción y transmisión a cargo de la

Universidad Virtualdel Tecnológico

de Monterrey.

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D. R. © Instituto Tecnológico y de Estudios Superiores de Monterrey,

Eugenio Garza Sada 2501, Col. Tecnológico,

Monterrey, N.L., C.P. 64849 México 2007

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“Se prohibe la reproducción totalo parcial de este documento por cualquier medio sin el previo y expreso consentimiento por escrito del ITESM”.

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