guia de inmunoensayos

Introduccin a los Inmunoensayos

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Introduccin a los InmunoensayosObjetivos del EntrenamientoUna vez finalizado este captulo, usted podr: Definir inmunoensayo Describir la estructura y preparacin de los anticuerpos Definir cuatro categoras de metodologas de inmunoensayos (competitiva y no competitiva, y homognea y heterognea).


Introduccin a los InmunoensayosIntroduccinInmunoensayo es una prueba que usa complejos de anticuerpo y antgeno como medio para generar un resultado perceptible. Un complejo anticuerpo:antgeno tambin es conocido como inmuno-complejo. Inmuno se refiere a una respuesta inmunolgica que hace que el cuerpo genere anticuerpos, y ensayo se refiere a una prueba. Entonces, un inmunoensayo es una prueba que utiliza inmunocomplejos cuando se unen los anticuerpos y los antgenos. Los Inmunoensayos se diferencian de otros tipos de pruebas de laboratorio, como las pruebas colorimtricas, ya que usan complejos anticuerpo:antgeno para generar una seal que pueda medirse. En oposicin, la mayora de las pruebas de rutina de qumica clnica utilizan reacciones qumicas entre el reactivo (solucin de sustancias qumicas u otros agentes) y la muestra del paciente para generar un resultado de la prueba.


Introduccin a los InmunoensayosInmunoensayo: Anticuerpos, Antgenos y AnalitosAnticuerpo es una protena producida por el cuerpo en respuesta a una sustancia invasora (extraa)1. Los anticuerpos se producen como parte de la respuesta inmunolgica del cuerpo para protegerse. Es tambin el caso, por ejemplo, de algunos test de inmunoensayos para determinar la presencia de anticuerpos contra las molculas de cncer. As, si los anticuerpos estn presentes, significa que las clulas invasoras de cncer tambin lo estn. Antgeno es la sustancia que el cuerpo est tratando de combatir (eliminar o reducir) preparando una respuesta inmunolgica. Algunos test de inmunoensayos determinan la presencia de antgenos directamente, en vez de buscar anticuerpos. En un anlisis para medir la concentracin de una droga teraputica, por ejemplo, la droga es el antgeno que se une al anticuerpo.

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Una excepcin es el caso de las enfermedades autoinmunes, donde el cuerpo produce anticuerpos para protenas que existen naturalmente en vez de sustancias extraas.GDS_0418723_McClelland_v4 4

Introduccin a los InmunoensayosInmunoensayo: Anticuerpos, Antgenos y AnalitosAnalito es todo lo que se mide en una prueba de laboratorio. En el inmunoensayo, el analito puede ser tanto un anticuerpo como un antgeno.


Resumen de Tcnicas del InmunoensayoLos inmunoensayos utilizan un anticuerpo selecto o ms para detectar analitos de inters. Los analitos que se miden pueden ser aquellos que estn presentes en el cuerpo naturalmente (como por ejemplo una hormona tiroidea), aquellos que el cuerpo produce pero no estn tpicamente presentes (como por ejemplo un antgeno de cncer), o aquellos que naturalmente no existen en el cuerpo (como por ejemplo una droga de abuso). Los anticuerpos poseen una alta especificidad y afinidad para un antgeno especfico. Es la unin especfica de un anticuerpo a un antgeno lo que permite la deteccin de analitos por medio de una variedad de tcnicas de inmunoensayo.


Estructura de los AnticuerposLos anticuerpos (Ab) son un tipo de protenas denominado inmunoglobulinas. La ms comn es la inmunoglobulina G (IgG). IgG es una protena compuesta por dos regiones principales, estructural y funcional:Regin Fab: Contiene el punto de unin del antgeno (Ag) que vara entre diferentes anticuerpos. Regin Fc: Regin de estructura constante dentro de una clase de anticuerpo.Figura 1-1 Estructura del anticuerpo y puntos funcionalesGDS_0418723_McClelland_v4 7

Preparacin de Anticuerpos Policlonales y MonoclonalesLos reactivos para anticuerpo se desarrollan a partir de anticuerpos policlonales como monoclonales. El antisuero policlonal (suero sanguneo que contiene los anticuerpos deseados) se genera en animales, siendo los ms comunes ovejas, conejos, o cabras. Los animales producen el antisuero igual que un ser humano como mecanismo de defensa al ser expuestos a un antgeno. El antisuero contiene una mezcla de anticuerpos, cada uno de los cuales puede unirse a diferentes puntos de unin del antgeno o eptope.


Preparacin de Anticuerpos Policlonales y MonoclonalesEl proceso de preparacin de un anticuerpo comienza cuando le se inyecta a un animal una solucin que contenga el antgeno de inters. A este antgeno de inters a veces se lo denomina sustancia inmungena, debido a que puede estimular una respuesta inmunolgica. Transcurrido un tiempo, y en algunos casos con mltiples inyecciones, el sistema inmunolgico del animal produce anticuerpos para el antgeno que fue inyectado. Se toma sangre del animal, y se separa el suero. Este suero generalmente es rico en anticuerpos que reconocen el antgeno y se lo denomina antisuero.


Preparacin de Anticuerpos Policlonales y MonoclonalesEl antisuero por lo general contiene una mezcla de anticuerpos que reconocen y se unen al mismo antgeno, pero pueden combinarse con diferentes eptopes (ver Figura 1-2). Un antgeno que contenga mltiples puntos de unin para los anticuerpos se denomina antgeno multivalente. Estos tipos de anticuerpos, presentes como una mezcla diversa, se denominan anticuerpos policlonales.

Figura 1-2 Especificidades del antgeno mltiple de anticuerpos policlonalesGDS_0418723_McClelland_v4 10

Preparacin de Anticuerpos Policlonales y MonoclonalesLos anticuerpos monoclonales se diferencian de los anticuerpos policlonales en que son muy especficos para un eptope simple en un antgeno multivalente (ver Figura 1-3). Se producen a partir de una lnea celular simple usando tecnologa para hibridomas y lneas celulares de mieloma de ratn. Las hibridomas son clulas tumorales productoras de anticuerpos que producen varias copias del mismo anticuerpo y se desarrollan fcilmente en poblaciones celulares de laboratorio.


Preparacin de Anticuerpos Policlonales y MonoclonalesUna ventaja de los anticuerpos monoclonales es que la lnea celular hibridoma que los produce es potencialmente inmortal y que puede producir los mismos anticuerpos en forma constante e indefinida. Un antisuero policlonal producido por inmunizacin de animales puede variar de un animal a otro, y un antisuero til puede ya no estar ms disponible si el nico animal que lo produce muere.

Figura 1-3 Especificidades uniformes de anticuerpos monoclonalesGDS_0418723_McClelland_v4 12

Preparacin de Anticuerpos Policlonales y MonoclonalesLas hibridomas se producen en mltiples etapas (ver Figura 1-4) : Inyectando un antgeno especfico en un animal husped (tpicamente un ratn) Aislando clulas productoras de anticuerpos (clulas B) del bazo del ratn Fusionando estas clulas B con un tipo especfico de clula tumoral que se desarrolla fcilmente en poblaciones y produce anticuerpos Aislando hibridomas logrados (clulas fusionadas) que produzcan anticuerpos especficos para el antgeno de inters


Preparacin de Anticuerpos Policlonales y MonoclonalesEn los inmunoensayos, ambos anticuerpos monoclonales y policlonales se usan para detectar antgenos, cada uno con fortalezas especficas para aplicaciones particulares. Es probable que los inmunoensayos que detectan anticuerpos en sueros de pacientes supongan la deteccin de anticuerpos policlonales generados por el sistema inmunolgico del paciente.


Clulas plasmticas productoras de anticuerpos

Fusin de clulas para realizar hibridomas

Las clulas hibridomas se desarrollan en poblaciones

Se clonan las clulas hibridomas individuales

Los tumores de hibridomas se mantienen vivos en el ratn

Figura 1-4 Procedimiento para generar anticuerpos monoclonales GDS_0418723_McClelland_v4

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Categoras de las Tcnicas de InmunoensayoEn este captulo, se tratarn cuatro categoras de tcnicas de inmunoensayo. Ellas son: inmunoensayos no competitivos y competitivos, e inmunoensayos homogneos y heterogneos.


Categoras de las Tcnicas de InmunoensayoTodos los inmunoensayos requieren el uso de material marcado para medir la concentracin de antgeno o anticuerpo presente. Una marca es una molcula que reacciona como parte del ensayo, por lo tanto un cambio en la seal puede medirse en la sangrereactivo. Los ejemplos de marcas incluyen un compuesto radioactivo, una enzima que hace que cambie el color de una solucin, o una sustancia que produzca luz. La marca puede aplicarse durante la fabricacin del reactivo tanto al anticuerpo (Ab*, ver Figura 1-5) como al antgeno (Ag*, ver Figura 1-6). Las tecnologas de inmunoensayo utilizan diferentes formatos para distinguir el complejo antgeno-anticuerpo de la marca libre no unida.


Figura 1-5 Los anticuerpos marcados permiten la deteccin de complejos antgeno/anticuerpo en los inmunoensayos

Figura 1-6 El antgeno marcado tambin permite la deteccin de complejos antgeno/anticuerpo en los inmunoensayosGDS_0418723_McClelland_v4 18

Inmunoensayos Competitivos y no Competitivos

La medicin del analito en un inmunoensayo se logra usando tanto un formato competitivo como uno no competitivo En los formatos competitivos, el analito sin marcar (generalmente antgeno) en la muestra se mide por su capacidad para competir con un antgeno marcado en el inmunoensayo. El antgeno sin marcar bloquea la capacidad del antgeno marcado de unirse puesto que ese punto de unin en el anticuerpo ya se encuentra ocupado.


Formato CompetitivoAs, en un inmunoensayo competitivo, el hecho de que se mida menos marca en el ensayo significa que hay ms antgeno marcado (muestra) presente. La concentracin de antgeno en la muestra est inversamente relacionada a la concentracin de marca que se mide en el formato competitivo (Figura 1-7).

Figura 1-7 La concentracin de antgeno est inversamente relacionada a la concentracin de marca (seal) en formatos competitivosGDS_0418723_McClelland_v4 20

Formato CompetitivoEn el formato competitivo de un solo paso (ver Figura 1-8), tanto el reactivo del antgeno marcado (Ag*) como la muestra sin marcar (o analito de la muestra) compiten por una cantidad limitada de anticuerpo.

Figura 1-8 Inmunoensayo competitivo de un solo pasoGDS_0418723_McClelland_v4 21

Formato CompetitivoEn el formato competitivo de dos pasos, la concentracin de anticuerpo del reactivo se encuentra presente en exceso comparada con la concentracin de antgeno. El reactivo del anticuerpo primero se incuba con una muestra que contenga antgenos de inters, luego en el segundo paso, se agrega el antgeno marcado.


Formato CompetitivoRecuerde que en el formato competitivo, menor concentracin de antgeno marcado unido indica mayor concentracin de antgeno presente en la muestra. Los formatos de ensayos competitivos de dos pasos proporcionan una sensibilidad mejorada, comparados con los formatos de ensayos de un solo paso.

Figura 1-9 Inmunoensayo competitivo de dos pasosGDS_0418723_McClelland_v4 23

Tcnica No Competitiva (sndwich)Los formatos de ensayo no competitivos generalmente proporcionan el nivel ms alto de sensibilidad y especificidad del ensayo (ver Glosario para la definicin de estos trminos) y se aplican a la medicin de analitos crticos como pueden ser los marcadores cardacos y de hepatitis (ver Captulo 3). A este formato se lo conoce como ensayo sandwich ya que el analito est unido (como un sandwich) entre dos reactivos de anticuerpo muy especficos (Figura 1-10).Figura 1-10 Tcnica sndwich no competitiva de inmunoensayoGDS_0418723_McClelland_v4 24

Tcnica No Competitiva (sandwich)Los formatos de ensayo no competitivo tambin pueden utilizar las tcnicas de un paso o de dos pasos, como en el ensayo competitivo. El formato del ensayo de dos pasos emplea etapas de lavado en el que se asla y se lava el complejo sndwich para quitar el exceso del reactivo marcado no unido y cualquier otra sustancia que interfiera. El formato no competitivo de dos pasos generalmente ofrece la mayor especificidad y sensibilidad de todos los formatos de ensayo que se tratan en la presente gua.


Tcnica No Competitiva (sandwich)En los ensayos no competitivos, la medicin del analito marcado, generalmente un anticuerpo, es directamente proporcional a la concentracin de antgeno presente en la muestra. Esto puede representarse por medio de una curva de respuesta a la concentracin. (Figura 1-11). El eje X traza la concentracin de un antgeno. El eje Y traza la respuesta, que en este caso se trata de la seal. As, cuanto mayor sea la cantidad de antgeno presente, ms anticuerpos marcados se unirn. Esta proporcin directa contrasta con la indirecta de los inmunoensayos competitivos Figura 1-11 La concentracin de antgeno es tratados anteriormente. directamente proporcional a laconcentracin de marca (seal) en los formatos no competitivosGDS_0418723_McClelland_v4 26

Tcnicas de Inmunoensayo Homogneas y HeterogneasA las tcnicas de inmunoensayo que requieren la separacin del complejo unido Ab-Ag* se las conoce como inmunoensayos heterogneos. Aquellas que no requieren separacin se denominan inmunoensayos homogneos.


Tcnicas de Inmunoensayo Homogneas y HeterogneasLas tcnicas homogneas generalmente se han aplicado a la medicin de pequeos analitos como por ejemplo las drogas de abuso y teraputicas. Debido a que las tcnicas homogneas no requieren la separacin de la unin Ab-Ag* del Ag* libre, generalmente son ms fciles y ms rpidas de realizar.Tubo de Reaccin Reactivo de Anticuerpo de Fase Slida (]-Ab) Tcnica Homognea

Se mide el complejo Ab-Ag

Muestra (Ag)

Tcnica Heterognea

Aislar y Lavar el Complejo ]-Ab- Ag- Ab*

Reactivo de Anticuerpo Marcado (Ab*)

Figura 1-12 Inmunoensayos homogneos y heterogneosGDS_0418723_McClelland_v4 28

ResumenInmunoensayos son pruebas que usan complejos de anticuerpo y antgeno (tambin denominados inmunocomplejos) para medir la presencia de un analito especfico en una muestra. Anticuerpos son protenas que normalmente produce el sistema inmunolgico en respuesta a una sustancia extraa. Antgenos son las molculas a las que se unen los anticuerpos, que en el cuerpo podran ser un un agente patgeno invasor, o las molculas extraas inyectadas a un animal con el fin de provocar la respuesta inmunolgica. Anticuerpos se componen de dos regiones principales, la regin Fab (antgeno especfico) y la regin Fc.


ResumenLas preparaciones de anticuerpo son antisueros policlonales, que reconocen mltiples puntos en los antgenos, o anticuerpos monoclonales, que reconocen puntos simples en los antgenos. En los inmunoensayos, se marca el anticuerpo o antgeno con el fin de obtener una seal perceptible que corresponda a la concentracin del analito. Los inmunoensayos pueden ser competitivos o no competitivos. En los inmunoensayos competitivos, la concentracin de antgeno es inversamente proporcional a la concentracin de la seal. En los inmunoensayos no competitivos, la concentracin de antgeno es directamente proporcional a la concentracin de la seal.


ResumenInmunoensayos homogneos no requieren la separacin de los complejos no unidos de los complejos unidos y de ah que sean ms rpidos y ms fciles de llevar a cabo que los inmunoensayos heterogneos. Inmunoensayos heterogneos requieren la separacin de los complejos no unidos, a menudo utilizando un reactivo de fase slida como una partcula magntica o una esfera plstica.


RevisinLos anticuerpos monoclonales y los anticuerpos policlonales: A. Pueden proveer especificidad y sensibilidad para medir los analitos B. Son inmunoglobulinas C. Se unen al antgeno a travs de la regin de unin Fab D. Todas las opciones anteriores


RevisinLos anticuerpos monoclonales y los anticuerpos policlonales: A. Pueden proveer especificidad y sensibilidad para medir los analitos B. Son inmunoglobulinas C. Se unen al antgeno a travs de la regin de unin Fab D. Todas las opciones anteriores


RevisinEnumere tres clases de marcas usados en las tcnicas de inmunoensayo: 1. ________________________________________ 2. ________________________________________ 3. ________________________________________


RevisinEnumere tres clases de marcas usados en las tcnicas de inmunoensayo :

Enzimas 1. ________________________________________ Compuesto radioactivo 2. ________________________________________ Compuestos generadores de luz 3. ________________________________________


RevisinUn anticuerpo monoclonal individual se une a varios puntos diferentes (eptopes) en un analito. Verdadero Falso


RevisinUn anticuerpo monoclonal individual se une a varios puntos diferentes (eptopes) en un analito. Verdadero

Falso


RevisinEn los formatos de inmunoensayos no competitivos, la seal medida es tpicamente _____________ a la concentracin de analito de la muestra. A. Proporcional B. Inversamente proporcional


RevisinEn los formatos de inmunoensayos no competitivos, la seal medida es tpicamente _____________ a la concentracin de analito de la muestra. A. Proporcional B. Inversamente proporcional


RevisinQu tcnica de inmunoensayo se prefiere para proporcionar la mayor sensibilidad y la mayor especificidad? A. Competitiva de un paso B. No competitiva de dos pasos C. Competitiva de dos pasos D. No competitiva de un paso


RevisinQu tcnica de inmunoensayo se prefiere para proporcionar la mayor sensibilidad y la mayor especificidad? A. Competitiva de un paso

B. No competitiva de dos pasosC. Competitiva de dos pasos D. No competitiva de un paso


Tecnologas de Deteccin del Inmunoensayo


Tecnologas de Deteccin del InmunoensayoObjetivos del EntrenamientoUna vez finalizado este captulo, usted podr : Describir las tcnicas de RIA, EIA, FPIA, MEIA y CMIA Identificar ensayos que utilizan tcnicas


Tecnologas de Deteccin del InmunoensayoPrimeras Tcnicas de Inmunoensayo: RIA y EIAEl desarrollo de los inmunoensayos prcticos comenz en los aos 60 con la aplicacin de radioinmunoensayos (RIA). RIA utilizan istopos radioactivos como marca (Figura 2-1), y la concentracin de radioactividad medida indica la concentracin de analito presente. Recuerde que en el formato sndwich no competitivo, a la izquierda en la Figura 2-1, la concentracin de marca tiene relacin directa con la concentracin de antgeno presente; mientras que en el formato competitivo, a la derecha en la Figura 2-1, la concentracin de antgeno tiene relacin inversa con la concentracin de antgeno.

Figura 2-1 Los radioinmunoensayos (RIA) utilizan una marca de istopo radioactivoGDS_0418723_McClelland_v4 44

Tecnologas de Deteccin del InmunoensayoRIA: an se usan en la actualidad, particularmente para la deteccin de cantidades muy bajas de analitos. Sin embargo, debido a las complicaciones inherentes al manipuleo y desecho de los materiales radioactivos en el laboratorio clnico, RIA se usa con menos frecuencia que otro tipo diferente de inmunoensayo, denominado inmunoensayo enzimtico (EIA). En EIA, las marcas de las enzimas se usan en lugar de las marcas radioactivas. Las marcas tpicas de enzimas son la fosfatasa alcalina, peroxidasa de rbano picante, y la galactosidasa B. Mientras que RIA usa radioactividad para medir la concentracin de analito, EIA tpicamente usa un cambio de color, emisin de luz, u otra seal. Se requiere un equipo especfico para obtener la concentracin de enzimas presentes midiendo el cambio especfico que ocurri.


Tecnologas de Deteccin del InmunoensayoELISA, o Enzimo-inmunoensayo, representa una aplicacin popular del inmunoensayo sndwich heterogneo de fase slida que combina un reactivo marcado enzima-anticuerpo con un anticuerpo unido a una fase slida. Un ensayo ELISA es un tipo de EIA. Inicialmente, se utilizaban como material de base slida tanto las placas de microttulo como las esferas de 1/4 de pulgada. Una placa de microttulo es simplemente una placa plstica cuadrada con pocillos de poca profundidad recubiertos con un analito.


Tecnologas de Deteccin del InmunoensayoHacia fines de la dcada del 70 y durante los aos 80 y 90, se lograron importantes avances en lo que se refiere a la automatizacin y sensibilidad de los inmunoensayos, y EIA en particular. Las tecnologas de inmunoensayos por polarizacin de fluorescencia (FPIA) e inmunoensayo por micropartcula (MEIA) representaron a las tecnologas predominantes durante algunos aos. Ms recientemente, la tecnologa del inmunoensayo magntico quimioluminiscente (CMIA) se ha aplicado como rutina debido al significativo aumento de sensibilidad. Cada una de estas tcnicas ser tratada ms detalladamente.


Inmunoensayo por Polarizacin de Fluorescencia FPIAInmunoensayo por Polarizacin de Fluorescencia (FPIA) es un tipo de inmunoensayo homogneo competitivo por fluorescencia. Con la unin competitiva, el antgeno de una muestra y el reactivo marcado antgeno-fluorescena (AgF) compiten por los puntos de unin en el anticuerpo. Como inmunoensayo homogneo, la reaccin se lleva a cabo en una solucin de reaccin simple, y el complejo Ab-AgF no requiere un paso de lavado para separarlo de la marca AgF libre.

Figura 2-2 Inmunoensayo competitivo por polarizacin de fluorescencia (FPIA)GDS_0418723_McClelland_v4 48

Inmunoensayo por Polarizacin de Fluorescencia FPIAFPIA se utiliza para proporcionar una medicin exacta y sensible de pequeos analitos de toxicologa como pueden ser las drogas teraputicas, y las drogas de abuso, toxicologa y algunas hormonas. La aplicacin de FPIA al sistema TDx de Abbott automatiz en gran medida los inmunoensayos manuales de otros tiempos que requeran mucha mano de obra. El reactivo FPIA incluye: S: Reactivo para anticuerpo: Antisuero para analito T: Indicador radioactivo (Tracer): analito marcado fluorescena P: Detergente para pretratamiento: facilita la liberacin de la droga de las protenas del suero


Inmunoensayo por Polarizacin de Fluorescencia FPIAFPIA utiliza tres conceptos claves para medir analitos especficos en un formato homogneo: fluorescencia, rotacin de molculas en la solucin y luz polarizada. Fluorescencia: La fluorescena es una marca fluorescente. Absorbe la energa de la luz a 490nm y libera esta energa a una longitud de onda superior (520nm) como luz fluorescente (Figura 2-3).

Figura 2-3 Deteccin de fluorescencia en complejos de conjugado de fluorescenaGDS_0418723_McClelland_v4 50

Inmunoensayo por Polarizacin de Fluorescencia FPIARotacin de Molculas en la Solucin: Las molculas ms grandes rotan ms lentamente en la solucin que las molculas ms pequeas. Este principio puede utilizarse para distinguir entre la molcula ms pequea antgeno-fluorescena: AgF, que rota rpidamente, y los complejos Ab-AgF ms grandes , que rotan lentamente en la solucin.


Inmunoensayo por Polarizacin de Fluorescencia FPIALuz Polarizada: La tecnologa de polarizacin por fluorescencia distingue la marca antgeno-fluorescena (AgF) del antgenofluorescena (Ab-AgF) unido al anticuerpo por sus diferentes propiedades de polarizacin por fluorescencia cuando son expuestos a la luz polarizada (Figura 2-4).

Figura 2-4 Medicin de grandes complejos usando fluorescencia, rotacin, y luz polarizada en FPIAGDS_0418723_McClelland_v4 52

Inmunoensayo por Polarizacin de Fluorescencia FPIALa luz polarizada describe ondas de luz que solamente estn presentes en un plano simple del espacio. Cuando la luz polarizada es absorbida por la molcula ms pequea AgF, la AgF tiene la capacidad de rotar su posicin en la solucin rpidamente antes de que la luz sea emitida como fluorescencia.

Figura 2-5 Los complejos ms pequeos en FPIA dan como resultado una seal de fluorescencia ms bajaGDS_0418723_McClelland_v4 53

Inmunoensayo por Polarizacin de Fluorescencia FPIALa luz emitida se liberar en un plano diferente del espacio de donde fue absorbido y por consiguiente se la denomina luz no polarizada. Con el complejo Ab-AgF de mayor tamao, la misma luz polarizada absorbida se libera como fluorescencia polarizada ya que cuanto ms grande sea el complejo Ab-AgF no rota tan rpidamente en la solucin. La luz es liberada en el mismo plano del espacio como energa de la luz absorbida, y el detector puede medirla.


Inmunoensayo por Polarizacin de Fluorescencia FPIALos resultados de FPIA se muestran como una curva inversa por cuanto a valores bajos de analito del paciente producen una seal ms alta (en este caso, la seal es luz polarizada). Una seal alta a niveles bajos de analitos del paciente dan como resultado un ensayo muy sensible (Figura 2-6).Figura 2-6 FPIA da como resultado una relacin inversa inferior entre la seal y la concentracin de analito


Inmunoensayo por Micropartcula MEIAEl Inmunoensayo por micropartcula (MEIA) es una tcnica de inmunoensayo que utiliza el aislamiento de complejos anticuerpo/antgeno en una superficie de fase slida de pequeas esferas denominadas micropartculas. MEIA se ha adaptado ampliamente para automatizar la medicin de molculas grandes como por ejemplo marcadores asociados al anlisis cardaco, de fertilidad, de cncer, metablico, de hepatitis, y de tiroides.


Inmunoensayo por Micropartcula MEIALos componentes de MEIA incluyen ,en suspensin en un buffer especfico optimizado para el ensayo, lo siguiente: (Figura 2-7): Fase Slida Micropartcula-Anticuerpo : Micropartculas de ltex que estn recubiertas con un anticuerpo para unirse al analito especfico que est siendo medido Conjugado Anticuerpo-Enzima: Enzima Fosfatasa Alcalina unida al anticuerpo Sustrato de Enzima: Fosfatasa 4-Metil Umbelliferona Fluorescente (MUP) en solucin, la que est disponible para una reaccin con la enzima en el anticuerpo.

Figura 2-7 Componentes de MEIAGDS_0418723_McClelland_v4 57

Inmunoensayo por Micropartcula MEIAEn la figura 2-8 se puede ver un resumen de la forma en que los componentes trabajan en combinacin con la muestra para producir una seal y el correspondiente resultado de la prueba. Observe cmo la matriz de fibra de vidrio sirve para fijar los complejos. Tambin note que esta tcnica usa un formato no competitivo, de modo que la concentracin de analito es directamente proporcional a la concentracin de seal.


Las micropartculas recubiertas con anticuerpos antianalito y muestra se incuban juntas para formar una mezcla de reaccin.

Se transfiere una alcuota de la mezcla de reaccin a la matriz de figra de vidrio.

Se deja que los anticuerpos antianalito marcados con fosfatasa alcalina se unan al complejo de micropartculas.

Se agrega el sustrato Fosfato 4Metil Umbeliferona (MUP) a la mezcla. Se mide el producto fluorescente, metilumbeliferona (MU).

Figura 2-8 Proceso de la tcnica MEIAGDS_0418723_McClelland_v4 59

Inmunoensayo Magntico Quimioluminiscente CMIALos compuestos quimioluminiscentes tambin pueden usarse para marcar analitos. Los compuestos quimioluminiscentes son distintos de los marcados radioactivos, fluorescentes, y enzimticos. Una marca quimioluminiscente produce luz cuando se lo combina con un reactivo trigger. Aunque muchos instrumentos en el laboratorio clnico se basan en la tecnologa quimioluminiscente, el tipo especfico de marca vara y a menudo est patentado, y por ello puede variar la performance.


Inmunoensayo Magntico Quimioluminiscente CMIAEn el caso de Abbott ARCHITECT (de Abbott Laboratories, Chicago, Illinois, Estados Unidos), por ejemplo, la marca es un derivado de acridina patentado. Esta marca produce una alta emisin de luz, y por consiguiente alta sensibilidad (es ms fcil medir una gran concentracin de luz). El principio qumico se ilustra en la Figura 2-9.

Figura 2-9 marca de quimioluminiscencia para CMIA de Abbott ARCHITECTGDS_0418723_McClelland_v4 61

Inmunoensayo Magntico Quimioluminiscente CMIALos pasos de la reaccin para ChemiFlex (marca comercial de la versin de CMIA de Abbott) son muy similares a los de MEIA descriptos anteriormente, y se los compara en la Figura 2-10. Ambos utilizan la tecnologa de ensayo sndwich no competitiva para medir analitos. Recuerde que en estos dos inmunoensayos no competitivos, la concentracin de seal medida es directamente proporcional a la concentracin de analito presente en la muestra.Figura 2-10 Comparacin de las tcnica MEIA y CHEMIFLEXGDS_0418723_McClelland_v4 62

Inmunoensayo Magntico Quimioluminiscente CMIALas tcnicas de MEIA y CMIA usan micropartculas para fijar anticuerpos, pero existen otras similitudes y diferencias tambin (Tabla 2-11). La marca, la etapa de separacin y la tecnologa de medicin difieren entre estas dos tcnicas.

Tecnologa

Fase Slida

Etapa de Separacin

Marca

Tecnologa de Deteccin

MEIA CMIA

Micropartcula de Ltex Micropartcula Magntica

Matriz de Fibra de Vidrio Imn

Enzima Fosfatasa Alcalina Compuesto Quimioluminiscente

Detector de Fluorescencia Tubo Fotomultiplicador de Quimioluminiscencia

Figura 2-11 Comparacin de los pasos en las tcnicas MEIA y CMIAGDS_0418723_McClelland_v4 63

ResumenExisten cinco tcnicas de inmunoensayo que se resumieron en este captulo. Radioinmunoensayo (RIA): El anticuerpo o el antgeno se marcan con radioactividad, y se usan en un formato no competitivo o competitivo. Inmunoensayo enzimtico (EIA): El anticuerpo o el antgeno se marcan con una enzima que convierte un sustrato en un producto con una seal resultante que se mide, como por ejemplo cambio de color.


Resumen (cont.) Inmunoensayo por Polarizacin de Fluorescencia (FPIA): Tpicamente se marca el antgeno con una marca fluorescente y compite con el antgeno sin marcar de la muestra. La rotacin relativamente lenta de las molculas grandes, como tambin la capacidad de las partculas de movimientos lentos de polarizar la luz se utilizan para obtener una medicin del nmero de partculas grandes de anticuerpo-antgeno-fluorescena en la solucin. En este formato competitivo, la concentracin de analito presente es indirectamente proporcional a la concentracin de seal medida. Inmunoensayo por Micropartcula (MEIA): Se cubre una micropartcula de fase slida con anticuerpos en contra de un antgeno de inters, y se usa para capturar el analito. Se marca el anticuerpo para la deteccin con un enzima al igual que en EIA. La concentracin de analito es proporcional a la cantidad de seal medida. Un formato sndwich no competitivo produce resultados que son directamente proporcionales a la cantidad de analito presente.


Resumen (cont.) Inmunoensayo Magntico Quimioluminiscente (CMIA): Una marca quimioluminiscente se conjuga con el anticuerpo o antgeno, y produce luz cuando se lo combina con su sustrato. Esta tcnica es muy similar a MEIA, aunque la reaccin quimioluminiscente ofrece alta sensibilidad y facilidad para la medicin. Un formato sndwich no competitivo produce resultados que son directamente proporcionales a la cantidad de analito presente.


RevisinEnumere cuatro tecnologas de deteccin del inmunoensayo (5 posibles) 1. ___________________________________________ 2. ___________________________________________ 3. ___________________________________________ 4. ___________________________________________ 5. ___________________________________________


RevisinEnumere cuatro tecnologas de deteccin del inmunoensayo (5 posibles)

Radioinmunoensayo 1. ___________________________________________ Inmunoensayo enzimtico 2. ___________________________________________ Inmunoensayo por polarizacin de fluorescencia 3. ___________________________________________ Inmunoensayo por micropartcula 4. ___________________________________________ Inmunoensayo magntico quimioluminiscente 5. ___________________________________________


RevisinEn la tecnologa FPIA: A. La seal medida es directamente proporcional a la concentracin de analito B. La molcula Ag-Fluorescena rota rpidamente y emite luz polarizada C. Tanto el analito marcado como el analito sin marcar de la muestra compiten por los puntos de unin del anticuerpo D. Todas las opciones anteriores


RevisinEn la tecnologa FPIA: A. La seal medida es directamente proporcional a la concentracin de analito B. La molcula Ag-Fluorescena rota rpidamente y emite luz polarizada

C. Tanto el analito marcado como el analito sin marcar de la muestra compiten por los puntos de unin del anticuerpoD. Todas las opciones anteriores


RevisinLa tecnologa FPIA se aplica usando cul de las siguientes opciones?: A. Ensayo homogneo B. Formato no competitivo C. MEIA D. Ensayo heterogneo


RevisinLa tecnologa FPIA se aplica usando cul de las siguientes opciones?:

A. Ensayo homogneoB. Formato no competitivo C. MEIA D. Ensayo heterogneo


RevisinQu tipo de fase slida utiliza MEIA?: A. Micropartculas magnticas B. Placas de microttulo C. Micropartculas de ltex D. Esferas de 1/4 pulgada


RevisinQu tipo de fase slida utiliza MEIA?: A. Micropartculas magnticas B. Placas de microttulo

C. Micropartculas de ltexD. Esferas de 1/4 pulgada


RevisinCul de las siguientes opciones tpicamente representa la marca ms sensible? A. Quimioluminiscencia B. Enzima C. Fluorescencia D. Micropartcula


RevisinCul de las siguientes opciones tpicamente representa la marca ms sensible?

A. QuimioluminiscenciaB. C. D. Enzima Fluorescencia Micropartcula


Factores de Impacto en el Rendimiento Analtico del Inmunoensayo


Factores de Impacto en el Rendimiento Analtico del InmunoensayoObjetivos del EntrenamientoUna vez finalizado este captulo, usted podr: Describir la exactitud y la precisin en lo que se refiere a inmunoensayos Discutir el uso de calibradores y controles en estos ensayos Comprender los riesgos potenciales para las pruebas de inmunoensayo, particularmente interferencias del efecto hook en concentraciones elevadas y los anticuerpos humanos anti-ratn (HAMA)


Factores de Impacto en el Rendimiento Analtico del InmunoensayoIntroduccinLos fabricantes de inmunoensayos pasan un tiempo importante determinando qu tcnica de inmunoensayo es la ms apropiada para un analito especfico con el fin de asegurar resultados de calidad superior. En muchas instancias, se modifica una tcnica particular, quizs con el agregado de un componente especial del reactivo, para combatir algunos obstculos comunes y as obtener resultados ptimos. A veces estos desafos se deben a sustancias que interfieren, presentes en la sangre, problemas inherentes a la tecnologa de medicin y/o a tcnicas de laboratorio. Este captulo tratar la forma en que se optimizan los inmunoensayos para asegurar resultados de alta calidad que dan como resultado un ptimo cuidado del paciente. En este captulo se trata el impacto de la calibracin, material de control, interferencias, y los efectos hook en concentraciones elevadas.GDS_0418723_McClelland_v4 79

Factores de Impacto en el Rendimiento Analtico del InmunoensayoLos Inmunoensayos Deben Ser Exactos y PrecisosLa exactitud y la precisin en los inmunoensayos son fundamentales para la utilidad de los mismos (Figura 3-1). Exactitud significa que el ensayo le est dando la respuesta correcta tanto al bioqumico como al mdico, y est describiendo la cantidad de analito realmente presente. A menudo se lo ilustra con una flecha dando en el blanco.Exacto Preciso Sensible Especfico

Da en el centro del blanco

Da en el mismo blanco

Capacidad de excluir falsos negativos

Capacidad de excluir falsos positivos

Figura 3-1 Exactitud, precisin, sensibilidad, especificidad en los inmunoensayosGDS_0418723_McClelland_v4 80

Factores de Impacto en el Rendimiento Analtico del InmunoensayoLos Inmunoensayos Deben Ser Exactos y PrecisosPrecisin en los inmunoensayos significa que la combinacin de reactivos, analizador, y otros factores de influencia puede proporcionar resultados reproductibles. Puede compararse con la flecha dando en el mismo punto del blanco, una y otra vez, aunque no necesariamente en el centro. Exactitud es la capacidad de medir la concentracin correcta de analito en una muestra. Los inmunoensayos pueden ser exactos pero imprecisos, precisos pero inexactos, o ambas cosas, exactos y precisos.


Factores de Impacto en el Rendimiento Analtico del InmunoensayoTpicamente se cree que la sensibilidad y la especificidad clnicas son subconjuntos de la exactitud y la precisin. Si un ensayo tiene la capacidad de generar resultados con exactitud y en forma reproductible que no produzcan falsos positivos, entonces se lo considera especfico. Un falso positivo significa que un resultado puede indicar errneamente que existe una cierta condicin de un paciente (el resultado positivo realmente no identifica a un paciente que es positivo).


Factores de Impacto en el Rendimiento Analtico del InmunoensayoEn un anlisis de hepatitis, por ejemplo, un falso positivo significa que el ensayo indic que un paciente es positivo para hepatitis, cuando no lo es. Esto puede ocurrir por muchas razones, pero en la mayora de los casos se debe a que la metodologa del ensayo no puede distinguir entre el analito deseado que se est midiendo y uno que se comporta igual que ese (tal vez comparten estructuras moleculares similares, pero fisiolgicamente tienen un efecto diferente sobre el organismo).


Factores de Impacto en el Rendimiento Analtico del InmunoensayoSe considera que un ensayo muestra sensibilidad clnica cuando en forma exacta y reproductible puede asegurar que no ocurren falsos negativos. Volviendo al ejemplo del anlisis de hepatitis, el bioqumico no quiere entregarle al mdico un resultado que errneamente indique que un paciente no tiene hepatitis cuando s la tiene. Si el paciente es realmente positivo para hepatitis, un ensayo con sensibilidad clnica deficiente que no pueda detectar niveles muy bajos de hepatitis (no es lo suficientemente sensible) puede indicar falsamente que el paciente es negativo para hepatitis (no tiene hepatitis).


Impacto del Calibrador en los Inmunoensayos

Calibracin y Controles en los InmunoensayosLos calibradores son soluciones con valores conocidos que establecen la relacin entre la cantidad de seal producida en el ensayo y la concentracin de analito. Al correr un set de calibradores, en el software del instrumento se produce una curva de calibracin (Figura 3-2) (bsicamente una curva de respuesta a la concentracin como se tratara anteriormente) y se establece una correlacin entre ciertos valores de la seal para las concentraciones de analito conocidas.

Figura 3-2 Curva de calibracin de una muestraGDS_0418723_McClelland_v4 85


Calibracin y Controles en los InmunoensayosAl comparar con esta curva de calibracin los niveles de seal producidos por las muestras de un paciente, se puede determinar el valor de concentracin de analito de un paciente, o el resultado. Es muy importante que se trate adecuadamente el material de calibracin de acuerdo con el inserto de fabricacin, y que el criterio de aceptacin sea el apropiado, as se puede establecer una correcta curva de calibracin. Si la calibracin no es correcta, los resultados del paciente correspondiente no sern correctos. La mayora de los aspectos de la calibracin estn automatizados en los analizadores para inmunoensayos actuales, aunque los calibradores lquidos, refrigerados y listos para usar aseguran menos posibles errores por parte del operador comparados con aquellos que necesitan ser reconstituidos o descongelados manualmente.GDS_0418723_McClelland_v4 86


Calibracin y Controles en los Inmunoensayos

Tambin es importante que el fabricante elija la matriz correcta para los calibradores. La matriz es el solvente que contiene al analito en el calibrador (o control). Es para asegurar que la respuesta de la seal de la curva de calibracin sea idntica a la seal de las muestras de los pacientes. Las matrices pueden ser a base de suero animal, acuosas, o derivadas de otros materiales.


Impacto del Control en los InmunoensayosLos controles son muestras que contienen concentraciones conocidas de analito. Se utilizan para monitorear la exactitud y la precisin del rendimiento de un ensayo y de un analizador. Si el control se encuentra dentro del rango, se supone que el rendimiento de los reactivos y del analizador es correcto y que el anlisis del paciente puede comenzar. Es tpico hacer un ensayo de los controles en cada corrida, turno o da, dependiendo del analito y/o del analizador y del inserto de fbrica. Tpicamente se lleva a cabo el anlisis usando una Tabla de Levey Jenning (Figura 3-3).


Impacto del Control en los InmunoensayosEste tipo de grfico traza los valores del control e indica si se estn desarrollando posibles tendencias al respecto. Si los controles tienden a subir o bajar (o por el contrario se comportan de una manera no aceptable), probablemente indica algn problema del reactivo, la calibracin, o el analizador que puede estar afectando los resultados de un paciente de una manera similar.Muchas de las mismas consideraciones que se discutieron anteriormente para Calibracin tambin son relevantes para los controles, como asegurar el mnimo error por parte del operador y usar una matriz base apropiada que sea idntica a las muestras de los pacientes.

Figura 3-3 Tabla de Levey Jenning para anlisis y seguimiento de controlesGDS_0418723_McClelland_v4 89

Interferencias en los EnsayosLos inmunoensayos de un paso pueden tener tendencia a las interferencias que afectan tanto la sensibilidad como la especificidad. En la mayora de los casos las interferencias se deben a agentes que interfieren en la unin de anticuerpos con antgenos por varias razones.


Interferencias en los EnsayosEn este captulo, nos ocuparemos de las interferencias que se deben al efecto hook en concentraciones elevadas y a anticuerpos humanos anti-ratn. En general, es ms probable que los ensayos en secuencia (de dos pasos) proporcionen resultados exactos eliminando la contribucin adversa de las protenas de unin, sustancias endgenas de interferencia y efectos generales de la matriz, debido al paso extra de lavado (Figura 3-4).

Figura 3-4 Efecto hook en concentraciones elevadasGDS_0418723_McClelland_v4 91

Efecto Hook en Concentraciones Elevadas : Exceso de Antgeno (Fenmeno Prozona)La posibilidad de que exista un efecto hook en concentraciones elevadas es un fenmeno inherente a los diseos de los ensayos sndwich de un paso. Las concentraciones muy elevadas de antgeno en la muestra del paciente se unen a todos los sitios disponibles saturndolos, tanto en el anticuerpo- fase slida como en el anticuerpo- conjugado marcado y as evitar la formacin sndwich. Bajo estas condiciones, el nivel medido de analito puede ser significativamente ms bajo que el nivel real presente en la muestra. El efecto hook en concentraciones elevadas se refiere al gancho que se observa en la curva de respuesta a la concentracin cuando la informacin se traza como una seal versus la concentracin de analito (Figura 3-4). Este efecto hook en concentraciones elevadas tambin se denomina efecto prozona.GDS_0418723_McClelland_v4 92

Anticuerpos Humanos Anti-Ratn (HAMA)Otra forma de interferencia en los inmunoensayos es la presencia de anticuerpos humanos anti-ratn (HAMA). Estos anticuerpos pueden estar presentes en la sangre humana como consecuencia de la respuesta inmunolgica del cuerpo al estar expuesto a antgenos de ratn. Existen varias razones para que un sistema inmunolgico humano produzca anticuerpos para combatir antgenos invasores que derivan de la exposicin a ratones. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales del ratn se usan en algunos tratamientos para el cncer. Un sistema inmunolgico humano tambin puede producir una respuesta a los ratones si el paciente est en contacto con ellos. Tambin es comn la exposicin ambiental a los ratones.


Anticuerpos Humanos Anti-Ratn (HAMA)Las muestras de pacientes que contienen HAMA pueden producir resultados falsamente elevados (falso positivo) o reprimidos (falso negativo) en los inmunoensayos que utilizan anticuerpos monoclonales de ratn. Los ensayos sndwich por lo general son los ms susceptibles a la interferencia HAMA. Para evitar los efectos prozone (efectos hook en concentraciones elevadas), se pueden disear los ensayos usando un formato de ensayo de dos pasos, el cual usa pasos de lavado para eliminar el exceso de antgeno.


Anticuerpos Humanos Anti-Ratn (HAMA)Falsos Positivos Debidos a HAMA: En el caso de falsos positivos, se forma un ensayo sndwich y as se produce la seal, aunque no haya presente analito del paciente (Figura 3-5). HAMA se une tanto al anticuerpo de captura de fase slida como al reactivo de anticuerpo marcado. Por lo tanto parece como si el analito estuviese presente en la muestra del paciente, causando el complejo.

Figura 3-5 Cmo HAMA genera un falso positivoGDS_0418723_McClelland_v4 95

Anticuerpos Humanos Anti-Ratn (HAMA)Falsos Negativos Debidos a HAMA: HAMA puede provocar resultados del ensayo falsos negativos por medio de dos mecanismos: unindose y bloqueando al anticuerpo de captura de fase slida, o unindose y bloqueando al reactivo de anticuerpo marcado.

Figura 3-6 Cmo HAMA genera un falso negativoGDS_0418723_McClelland_v4 96

Anticuerpos Humanos Anti-Ratn (HAMA)Los fabricantes utilizan varias tcnicas para minimizar el impacto de HAMA incluyendo: Diseo real de dos pasos para eliminar las interferencias Bloqueadores para reducir o eliminar las interferencias ocupando los puntos de unin en los anticuerpos HAMA.

Los bloqueadores son nicos para la formulacin de cada ensayo y algunos ejemplos pueden ser detergentes, protenas depuradas y suero animal.


ResumenExactitud significa que el ensayo est dando la respuesta correcta, midiendo la cantidad de analito realmente presente en la muestra. Precisin significa que el ensayo mide la cantidad de analito de una manera reproductible cada vez. Sensibilidad clnica y especificidad clnica se refieren a la capacidad del ensayo de generar resultados exactos y reproductibles que minimicen la cantidad de falsos positivos y falsos negativos que ocurran. Calibradores son muestras de concentracin conocida usados para establecer los parmetros del analizador o instrumentos.


ResumenControles son muestras de concentracin conocida que se usan para monitorear la exactitud y la precisin de un analizador y un ensayo.El efecto hook en concentraciones elevadas, tambin denominado efecto prozona es un tipo de interferencia que puede reducir la exactitud y la precisin de los inmunoensayos. Bajo condiciones de exceso de antgeno, el ensayo lee una concentracin de antgeno inferior a la que realmente se encuentra presente.


ResumenOtro tipo de interferencia se debe a la presencia de anticuerpos humanos anti-ratn (HAMA) que pueden estar presentes en el suero de pacientes que hayan sido tratados con anticuerpos de ratn para alguna terapia, o se hayan expuesto a ratones de alguna otra manera. Los inmunoensayos de dos pasos pueden reducir la interferencia de un efecto hook en concentraciones elevadas o la presencia de anticuerpos HAMA.


RevisinLa capacidad de un ensayo de dar en forma reproductible con una concentracin fijada se denomina: A. Especificidad B. Sensibilidad C. Precisin D. Exactitud


RevisinLa capacidad de un ensayo de dar en forma reproductible con una concentracin fijada se denomina: A. Especificidad B. Sensibilidad C. Precisin D. Exactitud


RevisinCon cul de las siguientes opciones puede eliminarse la interferencia de efecto hook por exceso de antgeno?: A. Metodologa de inmunoensayo de dos pasos B. Metodologa de inmunoensayo de un paso C. Disminucin del reactivo de anticuerpo D. Disminucin del reactivo de soporte slido


RevisinCon cul de las siguientes opciones puede eliminarse la interferencia de efecto hook por exceso de antgeno?: A. Metodologa de inmunoensayo de dos pasos B. Metodologa de inmunoensayo de un paso C. Disminucin del reactivo de anticuerpo D. Disminucin del reactivo de soporte slido


RevisinLa interferencia de HAMA puede eliminarse metodologas de inmunoensayo de dos pasos. Verdadero Falso


RevisinLa interferencia de HAMA puede eliminarse metodologas de inmunoensayo de dos pasos.

VerdaderoFalso


RevisinLos anticuerpos HAMA se producen como resultado de: A. Exposicin del paciente a ratones o a protenas de ratn B. Contaminacin de la muestra con protenas de ratn C. Inmunizacin D. Alergias a los alimentos


RevisinLos anticuerpos HAMA se producen como resultado de : A. Exposicin del paciente a ratones

o a protenas de ratn

B. Contaminacin de la muestra con protenas de ratn C. Inmunizacin D. Alergias a los alimentos


RevisinLos calibradores son muestras de individuos que se sabe que estn dentro del rango normal usados para verificar el funcionamiento del instrumento. Verdadero Falso


RevisinLos calibradores son muestras de individuos que se sabe que estn dentro del rango normal usados para verificar el funcinamiento del instrumento. Verdadero

Falso


Ejemplos de Pruebas que Utilizan Inmunoensayos


Ejemplos de Pruebas que Utilizan InmunoensayosObjetivos del EntrenamientoUna vez finalizado este captulo, usted podr : Nombrar varias clases de pruebas que utilizan tecnologa de inmunoensayo. Describir el uso de pruebas especializadas para hormonas endocrinas, dao cardiovascular, antgenos de hepatitis, y antgenos tumorales.2

2

El auspiciante de esta Gua educativa, Abbott Laboratories, no hace representaciones de este u otros productos dentro o fuera de los Estados Unidos.GDS_0418723_McClelland_v4 112

Ejemplos de Pruebas que Utilizan InmunoensayosIntroduccinAl concluir los captulos uno al tres de esta Gua de Entrenamiento, usted habr aprendido varias tecnologas y tcnicas utilizadas en la aplicacin de inmunoensayos. El presente captulo tratar sobre la aplicacin de estas distintas tcnicas de inmunoensayo para pruebas de laboratorio especficas. Existen cuatro clases principales de inmunoensayos especializados que sern tratados: hormonas endocrinas, marcadores cardacos, antgenos de hepatitis y antgenos tumorales.


Ejemplos de Pruebas que Utilizan InmunoensayosTipos de Pruebas Especializadas Hormonas EndocrinasLas hormonas generalmente son producidas en glndulas endocrinas especficas y se transportan a las clulas a travs del sistema circulatorio. Los ejemplos de glndulas endocrinas incluyen hipotlamo, lbulo pituitario anterior, glndula tiroidea, ovario, testculo, corteza suprarrenal, placenta, y pncreas. Las hormonas juegan varios roles para mantener el funcionamiento normal del cuerpo y medir los niveles de estas hormonas puede ser crucial para diagnosticar una enfermedad o para monitorear el tratamiento. Varias hormonas claves se miden tpicamente a travs de la tecnologa de inmunoensayo (ver Tabla 4-1).


Hormona Tirotrofina (TSH) Tiroxina (T4) y Triyodotironina (T3) Tiroxina Libre (fT4) y Triyodotironina Libre (fT3)

Categora de Anlisis Tiroides Tiroides Tiroides

Punto Primario de Accin Glndula Tiroidea Tejido Corporal General Tejido Corporal General

Funcin Estimulacin de la secrecin de la hormona tiroidea Estimulacin del consumo de oxgeno y de la tasa del metabolismo del tejido Formas libres de las hormonas tiroideas que se encuentran en el suero, no unidas a otras protenas, de ah, libre; se cree que son la medida ms exacta del estado tiroideo. Metabolismo de hidratos de carbono, protenas, y grasas Crecimiento de folculos y secrecin de estrgeno, y ovulacin Ovulacin, secrecin de progesterona Crecimiento de la glndula mamaria, iniciacin de la produccin de lecha Desarrollo de caractersticas sexuales secundarias Preparacin del tero para la implantacin del vulo, mantenimiento del embarazo Desarrollo de caractersticas sexuales secundarias Mantenimiento de la funcin del cuerpo lteo, ovulacin, secrecin de progesterona

Cortisol Hormona Foliculoestimulante (FSH) Hormona Luteinizante (LH) Prolactina Estrgeno Progesterona

Metablico Fertilidad Fertilidad Fertilidad Fertilidad Fertilidad

Tejido Corporal General Ovarios, Testculos Ovarios, Testculos Glndula Mamaria rganos Sexuales Femeninos. Auxiliar. Estructura Reproductiva Femenina. Auxiliar. rgano Sexual Masculino. Auxiliar. Ovarios, Testculos

Testosterona Gonadotrofina Corinica Humana (hCG)

Fertilidad Embarazo/ Fertilidad

Tabla 4-1 Hormonas Endocrinas Medidas a travs del InmunoensayoGDS_0418723_McClelland_v4 115

Indicadores de Lesin CardiovascularEl anlisis de inmunoensayo es de gran ayuda para evaluar el dao cardaco durante o despus de un infarto de miocardio (o ataque al corazn). A menudo se llevan a cabo anlisis de inmunoensayo para protenas especficas liberadas durante y despus de un ataque cardaco, para un diagnstico y monitoreo de la condicin del corazn. Tales marcadores incluyen troponina, mioglobina, CK-MB, y ms recientemente Pptido Natriurtico del tipo B y Protena Reactiva C de alta sensibilidad (hsCRP). Los marcadores se enumeran en la Tabla 4-2.


Marcador de Lesin Cardaca

Descripcin

Cmo se Correlacionan los Niveles con la Lesin Cardiovascular

Troponina-I

Protena que se libera de las clulas musculares muertas o daadas del corazn Protena que se encuentra en el corazn y otros msculos, importante para transportar el oxgeno a las clulas musculares Una forma de la enzima que se encuentra principalmente en los msculos del corazn y que se libera ante algn dao Hormona de la protena que se libera del ventrculo izquierdo del corazn cuando est daado Protena liberada en el suero en respuesta a una lesin, infeccin, e inflamacin

Los niveles aumentan a las 4 horas despus del infarto de miocardio; solo o mejor an cuando se lo combina con pruebas para CK-MB (ver abajo), es un anlisis de diagnstico muy confiable; permanece elevado hasta 8 das posteriores a la lesin. Se libera ante el dao de algn msculo; los niveles aumentan a las 2 horas despus del infarto de miocardio; los niveles vuelven a los rangos de referencia a las 24 horas aproximadamente; se lo considera un anlisis de diagnstico prematuro muy sensible, especialmente junto con otros marcadores de infarto de miocardio. Los niveles aumentan a las 4 o 6 horas despus del infarto de miocardio; los inmunoensayos rpidos son tiles para los diagnsticos de emergencia; se lo considera una prueba estndar en el diagnstico de infarto de miocardio.

Mioglobina

Creatinine Kinase-MB (CKMB)

Pptido Natriurtico del tipo B (BNP)

Los niveles elevados indican lesin o stress en el ventrculo izquierdo del corazn, lo que incluye infarto de miocardio, hipotensin (presin sangunea baja), o stress del msculo ventricular por la acumulacin de sangre y fluido como en un ataque cardaco congestivo. Puede ser til para predecir riesgo de otro infarto de miocardio, en el caso de que ya haya ocurrido uno; sin embargo, deben considerarse mltiples disparadores para la produccin de CRP al interpretar los resultados.GDS_0418723_McClelland_v4 117

CRP de Alta Sensibilidad (hsCRP)

Tabla 4-2 Marcadores de Dao Cardiovascular

HepatitisLa hepatitis es la inflamacin del hgado, y pueden causarla virus, bacterias, frmacos, toxinas o la ingestin excesiva de alcohol. En parte, debido al desarrollo de los inmunoensayos, se han identificado cinco virus distintos que causan hepatitis: Hepatitis A, Hepatitis B, Hepatitis C, Hepatitis D, y Hepatitis E. Cada virus puede ser individualizado usando tcnicas de inmunoensayo (ver Tabla 4-3).


Familia del Virus

Vas de Transmisin

Aparicin

Incubacin

Mortalidad

Virus de la Hepatitis A (HAV): Picornaviridae; enterovirus pequeo, ARN de una sola hebra Virus de la Hepatitis B (HBV): Hepadnaviridae; virus ADN de cadena doble parcialmente Virus de la Hepatitis C (HCV): Flaviviridae; virus ARN de una sola hebra

Va Fecal Oral

Generalmente abrupto

15 45 das

Alrededor del 0.3%

Agujas contaminadas, transfusiones con sangre no analizada, tatuajes, contacto sexual Similar a HBV

Generalmente insidioso

Promedio de 60 90 das Extensin 45 180 das

0.5 1.0%

Insidioso

2 26 semanas

0.2 0.4%; proceso crnico a menudo sin sntomas que puede producir cirrosis hasta en un 30% de los pacientes infectados 2 20% con coinfeccin, hasta un 30% con sobreinfeccin Alrededor del 1 2%, 15 20% en mujeres embarazadas

Virus de la Hepatitis D (HDV): virus ARN de una sola hebra Virus de la Hepatitis E (HEV): Apariencia de calicivirus; virus ARN de una sola hebra

Similar a HBV


21 90 das

Ingestin de agua contaminada, higiene personal deficiente


Promedio de 40 das Extensin 15 60 das

Table 4-3 Tipos de Hepatitis detectados por Inmonoensayos


HepatitisTodos los tipos de hepatitis virales afectan las clulas hepticas. Los individuos infectados con un virus de hepatitis tienden a padecer sntomas generalizados, que en la primera etapa son similares a la gripe. Los sntomas incluyen fatiga, dolor muscular/articular, prdida del apetito, nuseas, diarrea, fiebre e ictericia. Debido a que los sntomas no son especficos, se requieren inmunoensayos para distinguir entre los virus especficos. Las pruebas de hepatitis se utilizan tanto para screening como para monitoreo. Por favor consulte la Gua de Entrenamiento sobre Hepatitis de Abbott Diagnstico para obtener ms detalles.


Marcadores TumoralesLas clulas tumorales pueden producir protenas que se detectan en suero por medio del inmunoensayo, y estas protenas se conocen como marcadores tumorales. Los marcadores tumorales generalmente son especficos para un cierto tipo de cncer. La medicin de los marcadores tumorales puede ser til para el diagnstico y monitoreo de diferentes tipos de cncer, y estas pruebas pueden usarse para detectar cncer y monitorear la progresin del tratamiento (ver Tabla 4-4).


Clases

Ejemplo

Localizaciones del Cncer

Hormonas Antgenos Oncofetales

Gonadotropina Corinica Humana (hGC) Alfafetoprotena (AFP) Antgeno Carcinoembrionario (CEA) Antgeno Prosttico Especfico (PSA)

Testicular, Mama, Tracto GI , Pulmn, Ovario Test Sindrome de Down, Estmago. Esfabo, Ovario Colon rectal, Tracto GI , Pulmn, Mama Prstata Cncer de Mama Carcinoma de Ovario y Endometrio Pncreas, Tracto GI Pncreas, Tracto GI Ovario, Tracto GI Pncreas, Tracto GI Mieloma Mltiple Macroglobulinemia WaldenstromNota: no todos los inmunoensayos del mercado estn aprobados por normas gubernamentales para todas las indicaciones mencionadas arriba.GDS_0418723_McClelland_v4 122

Marcadores de Carbohidratos Antgenos del Grupo Sanguneo

CA 15-3, CA 549, CA 27-29 Ca 125 CA 19-9 Ca 50 Ca 72-4 CA 242

Protenas

Monoclonal IgA, Monoclonal IgG Monoclonal IgM, B2-Microglobulina

Tabla 4-4 Marcadores Tumorales Detectados por inmunoensayo

Marcadores TumoralesIdealmente, los marcadores tumorales seran 1) especficos para el rgano objetivo, y 2) producidos en una concentracin lo suficientemente grande como para ser detectados con exactitud en pacientes con cncer pero no en una poblacin normal. Desafortunadamente, con la posible excepcin de PSA (marcador comn usado para indicar la presencia de cncer de prstata), rara vez se logran ambas caractersticas. Por lo tanto, en la prctica clnica, los marcadores tumorales se usan ms como ayuda en el diagnstico en combinacin con otras pruebas de diagnstico (p. ej., MRI), y para monitorear la progresin de la enfermedad despus de su deteccin y tratamiento.GDS_0418723_McClelland_v4 123

Marcadores TumoralesEl porcentaje y la magnitud de la reduccin de los marcadores tumorales se usa para evaluar la eficacia del tratamiento. Despus del tratamiento, el marcador tumoral debera reflejar si aquel ha sido exitoso. Un descenso del nivel del marcador tumoral reflejara una respuesta positiva al tratamiento mientras que un mnimo cambio en el nivel del marcador tumoral reflejara una respuesta pobre al tratamiento. Si el tratamiento es exitoso, entonces una vez que el nivel del marcador tumoral se ha estabilizado en un nuevo nivel inferior, las mediciones de seguimiento del marcador programadas en forma regular son de ayuda para determinar la estabilidad de la enfermedad.


Pruebas CongnitasTambin se encuentran disponibles los inmunoensayos que miden ciertos agentes infecciosos que son especialmente perjudiciales si un feto est expuesto. Estos ayudan a diagnosticar proactivamente alguna infeccin de la paciente y a prevenir un dao en ella o en el feto (Tabla 4-5).Prueba Rub IgG y Rub IgM Factor que se Mide Anticuerpos IgG o IgM para Rubeola Condicin Mdica que Puede ser Causa de la Infeccin Causa una erupcin que generalmente es leve en nios y adultos; la infeccin durante el embarazo puede ser perjudicial para el feto y provocar aborto, muerte, y deficiencias de nacimiento Defectos del sistema nervioso central, especialmente si la infeccin tiene lugar en el primer trimestre del embarazo; causa principal de muerte en paciente con SIDA Neumona intersticial, mononucleosis, deficiencias congnitas de nacimiento, aborto, retraso mental, ceguera y sordera

Toxo G y Toxo M

Anticuerpos IgG o IgM para Toxoplasmosis Anticuerpos IgG o IgM para Citomegalovirus

CMV G y CMV M

Tabla 4-5 Pruebas para Factores CongnitosGDS_0418723_McClelland_v4 125

Pruebas CongnitasLas pruebas para exposicin a la Rubeola, Toxoplasmosis, y CMV son de especial importancia para el screening de embarazadas y gente con inmunosupresin. Los recin nacidos, pacientes con SIDA, pacientes con cncer, y quienes hayan recibido un transplante de rgano son susceptibles de enfermarse si se exponen a estas enfermedades, mientras que las personas con sistemas inmunolgicos normales luchan contra las infecciones en forma exitosa. Los recin nacidos pueden padecer alguna infeccin si sus madres estn expuestas durante el embarazo.


Pruebas CongnitasExisten pruebas para detectar anticuerpos IgM e IgG que son especficos para virus particulares en los pacientes. Si un paciente es positivo en anticuerpos IgM, recientemente ha estado expuesto al virus y se encuentra preparando una pronta respuesta inmunolgica. Si un paciente es positivo en anticuerpos IgG, estuvo expuesto por lo menos varios meses antes de la prueba, y puede ser un infectado crnico. El tipo de anticuerpo que se encuentra en los recin nacidos tambin puede ayudar al mdico a descubrir si el infante adquiri en forma pasiva anticuerpos de la madre, o si l se infect con el virus. Estas pruebas proporcionan informacin importante acerca de infecciones actuales y pasadas en poblaciones susceptibles.


Pruebas MetablicasLos inmunoensayos tambin estn disponibles para una amplia variedad de indicadores de funciones metablicas y deficiencias nutricionales. Las deficiencias especficas pueden surgir como resultado de dietas inadecuadas, o como indicio de alguna enfermedad fisiolgica, como la anemia. Existen mltiples formas de anemia que requieren un cuidadoso diagnstico y tratamiento. Algunos ejemplos de estos tipos de pruebas y sus indicaciones se detallan en la Tabla 4-6.


Pruebas MetablicasCondicin Mdica que Puede ser Causada por una Infeccin

Prueba

Factor que se Mide

Ferritina

Protena que almacena hierro para ser usado posteriormente por mltiples tejidos del cuerpo Vitamina, cobalamina, que ayuda a formar glbulos rojos que llevan oxgeno a los tejidos del cuerpo

Los niveles de ferritina en suero se correlacionan con la cantidad de hierro almacenado; niveles bajos indican anemia o dieta deficiente Las deficiencias pueden causar anemia macroctica, enfermedades neurolgicas, y pueden ser un indicio de enfermedades autoinmunes y otros desrdenes del tracto digestivo Las deficiencias durante el embarazo pueden causar defectos de nacimiento en la columna vertebral; la deficiencia de la vitamina B12 y del folato pueden llevar a una anemia megaloblstica

Vitamina B12

Folato

Vitamina que es cofactor en diversas rutas metablicas

Tabla 4-6 Pruebas para Factores MetablicosGDS_0418723_McClelland_v4 129

Otras Pruebas y Tecnologas de InmunoensayoMuchos otros analitos se analizan usando inmunoensayos. Un ejemplo es el uso de ensayos turbidimtricos para las pruebas de protenas especficas en analizadores de qumica clnica. Los inmunoensayos tambin se usan para analizar los niveles de drogas teraputicas en suero, lo que puede ser de utilidad para asegurar la dosis adecuada de medicamentos para un paciente individual. Las pruebas para drogas de abuso son otra aplicacin de los inmunoensayos.


ResumenEste captulo se centr en ejemplos de inmunoensayos comnmente usados en el entorno clnico. Se describieron seis categoras de pruebas. Hormonas Endcrinas: Entre los ensayos para una variedad de hormonas tiroideas, de fertilidad, y de embarazo se incluyen las pruebas para tirotrofina, hormona foliculoestimulante, testosterona, y otras. Indicadores de Dao Cardiovascular: Los ensayos para las protenas liberadas por el msculo daado del corazn tras un ataque cardaco son tiles para el diagnstico y tratamiento de esta condicin. Entre las pruebas se incluyen aquellas para medir troponina, mioglobina, Creatinine Kinase-MB, Pptido Natriurtico del tipo B , y otros marcadores cardacos. Antgenos de Hepatitis: Los ensayos para cada una de las cinco cepas de virus de Hepatitis se utilizan con fines de diagnstico y monitoreo.


Resumen Antgenos Tumorales: Los ensayos para antgenos especficos producidos por clulas cancergenas pueden usarse para diagnstico y monitoreo, e incluyen antgeno especfico de prstata (PSA) para cncer de prstata y alfa fetoprotena (AFP) para cncer testicular, entre otros ejemplos. Agentes Infecciosos Congnitos: Los ensayos de suero para los anticuerpos IgM e IgG en personas expuestas a agentes infecciosos como la Rubeola, Toxoplasmosis, y Citomegalovirus (CMV) son tiles para diagnosticar y monitorear la posible infeccin, particularmente en mujeres embarazadas para determinar el riesgo de defectos de nacimiento de sus hijos. Metablicos: Los ensayos para protenas y vitaminas que intervienen en el metabolismo pueden medirse, incluyendo la ferritina como medida de los niveles de almacenamiento de hierro, y las vitaminas B12 y folato.


RevisinLas pruebas para cul de las siguientes opciones no se cuantifican rutinariamente usando inmunoensayos: A. TSH B. AFP C. Glucosa D. Folato


RevisinLas pruebas para cul de las siguientes opciones no se cuantifican rutinariamente usando inmunoensayos : A. TSH B. AFP C. Glucosa D. Folato


RevisinUna prueba para hCG se clasificara como: A. Ensayo para tiroides B. Marcador de hepatitis C. Marcador de embarazo D. Marcador de cncer


RevisinUna prueba para hCG se clasificara como : A. Ensayo para tiroides B. Marcador de hepatitis C. Marcador de embarazo D. Marcador de cncer


RevisinCul de los siguientes son los cinco virus principales que causan hepatitis viral: A. HBV1, HBV2, HBV3, HBV4, y Virus de Epstein-Barr B. HAV, HBV, HCV, HDV, HEV C. Ictericia y sus cuatro subtipos D. Ninguna de las opciones anteriores


RevisinCul de los siguientes son los cinco virus principales que causan hepatitis viral : A. HBV1, HBV2, HBV3, HBV4, y Virus de Epstein-Barr B. HAV, HBV, HCV, HDV, HEV C. Ictericia y sus cuatro subtipos D. Ninguna de las opciones anteriores


RevisinLos paneles de la hepatitis viral se usan para: A. Diagnstico B. Monitoreo C. Screening D. Todas las opciones anteriores


RevisinLos paneles de la hepatitis viral se usan para: A. Diagnstico B. Monitoreo C. Screening D. Todas las opciones anteriores


RevisinUn paciente que es positivo por anticuerpos IgG para Rubeola estuvo expuesto recientemente al virus y est preparando una respuesta inmunolgica temprana. Verdadero Falso


RevisinUn paciente que es positivo por anticuerpos IgG para Rubeola estuvo expuesto recientemente al virus y est preparando una respuesta inmunolgica temprana. Verdadero

Falso


Bibliografa y Sugerencias para una Estudio ms ProfundoHarlow E, Land D, eds. Antibodies: A Laboratory Manual. New York: Cold Spring Harbor Laboratory; 1988. Wild D, editor. The Immunoassay Book. New York: Stockton Press;1994. Moore WT, Eastman RC, eds. Diagnostic Endocrinology. Toronto: BC Decker; 1990. Kricka L. Human anti-animal antibody interferences in immunological assays. Clin Chem. 1999; 45:942-956.


GlosarioAfinidad medida de la atraccin entre un punto simple del antgeno y un anticuerpo simple con ese punto. Analito sustancia, conjunto de sustancias, o factor que se analizar. Anticuerpo glicoprotena producida por los linfocitos B en respuesta a la exposicin a un antgeno y se une especficamente a ese antgeno. Antgeno sustancia que es capaz, bajo condiciones apropiadas, de inducir una respuesta inmune especfica y de reaccionar con el producto de esa respuesta (anticuerpo o especficamente linfocitos T sensibilizados).


GlosarioExceso de antgeno la presencia de exceso de antgeno en relacin con la concentracin de anticuerpo, provoca una desestimacin de la concentracin de antgeno (a veces denominado efecto prozona). Antisuero suero que contiene anticuerpos. Avidez la intensidad combinada de reactividades de un anticuerpo y un antgeno, representando la afinidad neta de todos los puntos de unin en el antisuero. Calibrador material de caractersticas conocidas (concentracin, actividad, reactividad) usado para calibrar o ajustar un procedimiento de ensayo. El material debera tener las mismas caractersticas de rendimiento que las muestras para la prueba en ese procedimiento.GDS_0418723_McClelland_v4 145

GlosarioQuimioluminiscencia emisin de luz a travs de una reaccin qumica que incluye la oxidacin de un compuesto orgnico por medio de un oxidante (por ejemplo perxido de hidrgeno). Sensibilidad clnica la capacidad de una prueba para clasificar correctamente a los pacientes que padecen una enfermedad produciendo un resultado de la prueba verdadero positivo. Especificidad clnica la capacidad de una prueba para clasificar correctamente a los pacientes que no padecen una enfermedad produciendo un resultado de la prueba verdadero negativo. Curva de respuesta de concentracin describe la relacin entre la seal del ensayo y la concentracin de analito.


GlosarioEptope regin nica en un antgeno que se une a un anticuerpo especfico. ELISA (Enzimo-inmunoensayo) inmunoensayo que utiliza un anticuerpo marcado con un marcador enzimtico. El cambio en la actividad enzimtica como resultado de la reaccin enzimaanticuerpo-antgeno es proporcional a la concentracin de antgeno y se puede medir. Resultado falso positivo de un ensayo resultado positivo de una prueba que se obtiene de una muestra realmente negativa. Resultado falso negativo de un ensayo resultado negativo de una prueba que se obtiene de una muestra que realmente contiene un analito. Polarizacin por fluorescencia ocurre cuando una molcula absorbe luz a una longitud de onda y reemite luz a una longitud de onda mayor.GDS_0418723_McClelland_v4 147

GlosarioHAMA (Anticuerpo Human Anti Ratn) producido en los seres humanos como respuesta inmune luego de una exposicin a anticuerpos de ratn. Inmunocomplejos complejos formados por la unin de molculas de antgenos y anticuerpos, con o sin fijacin del complemento. Inmunoglobulina protena compuesta por cadenas pesadas y livianas y que funciona como un anticuerpo. Anticuerpos monoclonales anticuerpos que se producen in vitro por una lnea celular que se origina en una clula simple. Todas las molculas son de tipo y subtipo simple y poseen una especificidad antignica simple.


GlosarioInmunoensayo no competitivo inmunoensayo en el cual el analito de la muestra y el analito marcado se presentan en forma consecutiva al anticuerpo de la reaccin. Precisin punto hasta el cual los anlisis de replicacin de una muestra concuerdan entre s. Estadsticamente, es lo contrario de la varianza de una medicin o clculo. Radioinmunoensayo (RIA) ensayo cuantitativo para la deteccin de reacciones antgeno-anticuerpo usando sustancia marcada radioactivamente para medir la unin de sustancia sin marcar a un anticuerpo especfico o receptor. Ensayo sndwich se usa para describir un inmunoensayo, que combina analitos entre dos anticuerpos especficos.


GraciasAbbott Divisin Diagnstico Global Marketing: Inmunoqumica


guia de inmunoensayos

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