INMUNOANALISIS

Servicio Medico Legal Santiago Q. L. Ethel Guerrero R. Q. F. L. Vctor Vidal P.

Definicin Tcnicas que utilizan la reaccin antgenoanticuerpo para el anlisis cualitativo y cuantitativo de diversas sustancias. En general se utiliza un anticuerpo como reactivo para detectar o cuantificar lo que nos interesa, el antgeno. Los anticuerpos pueden ser policlonales o monoclonales

Produccin de Anticuerpos Requiere la inyeccin de varias dosis del antgeno o hapteno unido a molcula transportadora inmungena de Peso Molecular elevado, a un animal (conejo, cabra, oveja, caballo) a intervalos regulares, para posteriormente sacrificar el animal y obtener el antisuero.

Anticuerpos Policlonales

Purificacin de anticuerposSeparar el suero

Anticuerpos Monoclonales Se obtienen de manera similar, pero se extrae el bazo o ganglios linfticos para obtener linfocitos B sensibilizados. Se incuban estos con clulas de mieloma de ratn deficitarias de la enzima HGPRT en presencia de PEG para producir la fusin celular y obtener el hibridoma

Cultivados en medio apropiado, por dos semanas, solo crecen los hibridomas, que producen diferentes tipos de Ac. especficos contra el antgeno. Por dilucin se aislan los diferentes hibridomas, obtenindose los clones adecuados, los cuales se cultivan, para producir el Ac. Monoclonal ms adecuado.

Anticuerpos Monoclonales

Linfocitos sensibilizados

Fusin

Hibridomas

Anticuerpos Monoclonales

Cultivo de clulas individuales en pequeo volumen Produccin de Ac Crecimiento continuo

-

+ +

-

+-

+

Anticuerpos Monoclonales

Cultivo en grandes volmenes

Recuperar y purificar el AcMo secretado

Anticuerpos Monoclonales Ventajas con respecto a los policlonales: Alta especificidad, reconocen un nico lugar antignico. Se pueden obtener en cantidades ilimitadas con las mismas caractersticas.

Desventajas: Mayor costo

Ejemplos

Cualitativo o de identificacin: Inmunoblot Cuantitativo: ELISA

Inmunoanlisis con reactivos marcados Dentro de estos inmunoanlisis tenemos:

radioinmunoanlisis enzimoinmunoanlisis fluoroinmunoanlisis luminoinmunoanlisis

Inmunoanlisis con reactivos marcados

homogneos y heterogneos diseo competitivo o no competitivo

Segn el diseo del ensayo

competitivos (de reactivo limitado)

no competitivos (de reactivo enexceso)

Competitivos Inmunoensayos en que se utiliza el marcado de antgeno o anticuerpo. Una cantidad limitada de anticuerpos que es insuficiente para unir todo el antgeno. El antgeno marcado compite con el antgeno sin marcar por los anticuerpos. La cantidad de analito se determina a partir de la regresin correspondiente.

Competitivo- Captura de anticuerposEAc marcado

E ESustrato

+Ag muestra

Seal

Ag muestra + Ac marcado

Seal

[Ag]

Competitivo- Captura de AntgenoSeal

Antgeno marcado [Ag] Seal

Muestra

Lavado

Mtodos no competitivos o inmunomtricos El antgeno a cuantificar se une a un exceso de anticuerpos. Por ejemplo, con el anticuerpo fijado a la fase slida, revelando con anticuerpo marcado. La concentracin de antgeno se determina a partir de la cantidad de anticuerpo marcado que se une.

No competitivo- sandwich de anticuerposExceso de anticuerpo marcado eliminado por lavado

bloqueanteAg

+ E

E Sustrato

Seal

Seal

Curva standard

[Ag]

Segn el diseo del ensayo

homogneos

heterogneos

Heterogneos: Los ms utilizados. Diversos formatos : micro placas, partculas magnticas, Membranas de nitrocelulosa,

Implican un paso de separacin del antgeno unido del no unido. Por ejemplo ELISA, los pasos de lavado son etapas de separacin.

Homogneos Mas utilizados en drogas de abuso y monitoreo de frmacos Sin pasos de separacin, no se requiere la separacin del antgeno unido del no unido. Ejemplos Emit Cedia

Heterogneos Ventajas Menos interferencias, ms especficos y sensibles Instrumentacin menos costosa Admiten mayor tamao de muestra, as disminuye el lmite de deteccin. Ms verstiles en cuanto a tipo de analito

Homogneos Ventajas Ms precisos Al ser en general automatizados se llevan a cabo sin entrenamiento especial

Desventajas Son ms costosos en reactivos En general slo sirven para frmacos

Desventajas Ms difciles de automatizar Mayor tiempo de anlisis

Heterogneos Algunos mtodos de separacin: Precipitacin fraccionada con sulfato de amonio, etanol en fro o PEG. Unin de la forma unida a una fase slida (EIA, partculas magnticas) Centrifugacin

Homogneos Caractersticas La cuantificacin de la reaccin Ag-Ac en los EIA homogneos se realiza por cambios en la seal proveniente de la marca sin hacer separacin fsica de las formas libre y unida. El cambio de seal depende de la inhibicin , activacin o cambios conformacionales en la enzima. Monitoreo teraputico de frmacos (digoxina) deteccin de drogas de abuso.

HomogneosAc

AgEnzima

Ag

Sustrato Ag

HomogneosSAg

Enzima activa

Enzima inactiva

Deteccin y Cuantificacin:Las medidas se pueden hacer con: - un simple espectrofotmetro o con - un analizador automtico de qumica clnica.

Inmunoanlisis con reactivos marcadosCon compuestos radiactivos: RIA inmunoanlisis heterogneo y competitivo

IRMA inmunoanlisis heterogneo no competitivo

Inmunoanlisis con reactivos marcadosENZIMOINMUNOANALISIS: Las ms utilizadas son: peroxidasa fosfatasa alcalina Glucosa 6-fosfato deshidrogenasa B- galactosidasa

Ventajas disponibles comercialmente se pueden conjugar por tcnicas simples tienen varios sustratos

ENZIMOINMUNOANALISIS Enzimoinmunoanlisis homogneos:- EMIT - CEDIA

- Enzimoinmunoanlisis heterogneos: - ELISA

FLUOROINMUNOANALISIS Fluoroinmunoanlisis homogneos: - FPIA (de polarizacin de fluorescencia) - SLFIA (sustrato marcado) - FETI (transferencia de la energa de fluorescencia) - Fluoroinmunoanlisis heterogneos: - DELFIA (disociacin aumentada por lantnidos)

Inmunoensayos de FluorescenciaFluorforosO

HO

O

O C OH R2

FluorescenaR1

Quimioluminiscencia Es el fenmeno que ocurre en las lucirnagas y consiste en: una reaccin qumica con un muy alto rendimiento energtico produce una molcula potencialmente fluorescente. (No hay excitacin luminosa como en la fluorescencia) Usualmente son reacciones redox catalizadas por enzimas que involucran O2 o H2O2 y un sustrato orgnico oxidable. La energa se libera como luz visible.

Se utiliza para detectar concentraciones muy bajas de molculas, menor lmite de deteccin que en los mtodos isotpicos y en otros enzimticos.

Tcnica analtica Quimioluminiscente Para inmunoensayos se marcan Ag o Ac con sustancias que participan en la reaccin quimioluminiscente (luminol, peroxidasa), y la quimioluminiscencia es el paso final en la deteccin. Se hacen en homogneas fase slida, o en tcnicas