Universidad de La Salle Universidad de La Salle

Ciencia Unisalle Ciencia Unisalle

Medicina Veterinaria Facultad de Ciencias Agropecuarias

2006

Estandarización de la técnica de inmunoperoxidasa para el Estandarización de la técnica de inmunoperoxidasa para el

diagnóstico de Clostridium chauvoei en tejidos de cobayo Cavia diagnóstico de Clostridium chauvoei en tejidos de cobayo Cavia

porcellus porcellus

Leonardo Ladino Alfaro Universidad de La Salle, Bogotá

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Citación recomendada Citación recomendada Ladino Alfaro, L. (2006). Estandarización de la técnica de inmunoperoxidasa para el diagnóstico de Clostridium chauvoei en tejidos de cobayo Cavia porcellus. Retrieved from https://ciencia.lasalle.edu.co/medicina_veterinaria/116

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ESTANDA RIZACION DE LA TÉCNICA DE INMUNOPEROXIDASA PARA EL DIAGNOSTICO DE Clostridium chauvoei EN TEJIDOS DE

COBAYO (Cavia porcellus)

LEONARDO LADINO ALFARO

UNIVERSIDAD DE LA SALLE FACULTAD DE M EDICINA VETERINARIA

BOGOTÁ D.C. 2006

ESTANDA RIZACION DE LA TÉCNICA DE INMUNOPEROXIDASA PARA EL DIAGNOSTICO DE Clostridium chauvoei EN TEJIDOS DE

COBAYO (Cavia porcellus)

LEONARDO LADINO ALFARO Código: 14972055

Trabajo de grado para optar al t ítulo de

Médico Veterinario

DIRECTOR

Dr . DIEGO ORTIZ ORT EGA, MV, MSc.

CODIRECTORES:

Dr . RUBEN DARIO TORO ORTIZ, MVZ, MSc.

Dr . JORGE HUMBERTO OSSA ARISTIZABAL, MV, MSc.

UNIVERSIDAD DE LA SALLE FACULTAD DE M EDICINA VETERINARIA

BOGOTÁ D.C. 2006

DIRECTIVOS UNIVERSIDAD DE LA SALLE

RECTOR. Hno. Fabio Gallego A.

VICE-RECTOR. Hno. Carlos Góm ez R.

VICE-RECTOR DE PROMOCIÓN Hno. Edgar Figueroa A. Y DESARROLLO HUM ANO

VICE-RECTOR ADMINISTRATIVO Hno. Mauricio Fernández F.

DECANO DE LA FACULTAD Dr. Pedro Pablo Martínez M.

SECRETARIA ACADEMICA Dra. Maria Teresa Uribe M .

DIRECTOR CLÍNICA VETERINARIA Dr. Humberto Vásquez R.

NOTA DE ACEPTACIÓN

_________________________________

Director. Dr. Diego Ortiz Ortega. M.V. MSc.

_________________________________

Jurado.

Dra. Iovana Castellanos. Esp.

_________________________________

Jurado.

Dr. Rafael Neira. MSc.

_________________________________

Secretaria Académ ica.

Dr a. Maria Teresa Uribe Mallarino.

COMPROMISO Los trabajos de grado no deben contener ideas que sean contrarias a la

doc trina de la iglesia católica en asuntos de dogma y moral.

Ni la universidad, ni el asesor, ni el jurado calificador son responsables de

las ideas expuestas por el graduado.

AGRADECIMIENTOS

El autor expresa sus agradec imientos a: Doctor Diego Ortiz Ortega por su apoyo y colaborac ión y ayuda personal durante el desarrollo de la tes is. Doctor Rubén Darío Toro por su confianza, continúa dedicac ión e incesante apoyo a lo largo del proyecto, por brindarnos conocimientos, su amistad y su experiencia en el laborator io. Doctor Jorge Ossa Aris tizabal por su colaboración y apoyo brindado a par tir de sus conocimientos y experiencia personal. Doctora Francy Janneth Montoya por su pac ienc ia, dedicac ión, carisma, amistad y ex traordinaria as istenc ia en el laboratorio. Doctor Juan Fernando Gallego y todo el personal de CORPOICA-CEISA quienes nos colaboraron con su trabajo y conocimiento. La Univers idad de La Salle por permitir el desarrollo de este proyecto y por su apoyo financiero. La empresa Colombiana de Productos Veterinarios VECOL S.A. por su apoyo financ iero y técnico.

DEDICATORIA

A mis padres por su amor, apoyo, paciencia, y por brindarme s iempre lo

mejor de ellos durante todo este tiempo, a mis hermanos Camilo y Fabián

por su apoyo y respaldo en todo momento, a mis familiares especialmente

a mi tía Mar ia Sofía por su gran apoyo y ayuda que son muy importantes en mi vida y a mis amigos por estar s iempre conmigo.

Leonardo Ladino Alfaro.

TABLA DE CONTENIDO

Pág.

INTRODUCCIÓN

1. MARCO TEÓRICO 19

1.1. MORFOLOGÍA 24

1.2. ESTRUCTURA BACTERIA GRAMPOSITIVA 24

1.2.1. Síntesis del peptidoglicano 28

1.2.2. Pared bacteriana 29

1.2.3. Protoplastos 31

1.2.4. Espacio per iplásmico 31

1.2.5. Membrana citoplasmática 32

1.2.6. Mesosomas 34

1.2.7. Citoplasma bacteriano 34

1.2.8. Inclusiones bacterianas 35

1.2.8.1. Gránulos de polisacáridos 35

1.2.8.2. Genoma bacteriano 35

1.2.9. Elementos externos 36

1.2.9.1. Flagelos 36 1.2.9.2. Cápsula y capa mucosa 39

1.2.10. Endosporas 40

1.2.10.1. Estructura de las endosporas 41

1.2.10.2. Formación de la endospora 42

1.2.10.3. Germinación del esporo 43

1.2.11. Metabolismo bacteriano 45

1.3. CRECIMIENTO 47

1.4. PROPIEDADES BIOQUIMICAS 47

1.5. RESISTENCIA 48

1.6. Clostridium chauvoei 49

1.6.1. Tox inas de clos tridium chauvoei 49

1.6.1.1. Tox ina alfa 49

1.6.1.2. Tox ina beta 50

1.6.1.3. Tox ina gamma 50 1.6.1.4. Tox ina delta 51

1.7. ECOLOGIA 52

1.7.1. Reservorio 52

1.7.2. Epidemiología 52

1.8. PATOGENIA 54

1.9. HALLAZGOS CLINICOS 57

1.10. HALLAZGOS DE NECROPSIA 57

1.11. HISTOPATOLOGIA 58

1.12. DIAGNOSTICO DE LABORATORIO 58

1.13. DIAGNOSTICO DIFERENCIAL 59

1.14. TRATAMIENTO Y PREVENCIÓN 60

1.15. INMUNOPEROXIDASA INDIRECTA 61

1.15.1. Historia 61

1.15.2. Bases inmunohistoquímicas 61

1.15.2.1. Anticuerpos 62

1.15.2.2. Inmunoglobulinas 62

1.15.2.3. Inmunoglobulina G 63

1.15.2.4. Inmunoglobulina M 64

1.15.2.5. Anticuerpos Policlonales 65

1.15.2.6. Anticuerpos Monoclonales 66 1.15.2.7. Afinidad de anticuerpos 67

1.15.2.8. Reactiv idad cruzada de anticuerpos 70

1.15.2.9. Tasa de reacc ión de anticuerpos 70

1.15.2.10. Estabilidad de anticuerpos 71

1.15.2.11. Manejo de anticuerpos 73

1.15.2.12. Inmunohistoquímica 74

1.15.2.13. Técnicas inmunohistoquímicas 75

1.15.2.14. Marcadores visuales 75

1.15.2.15. Métodos inmunohistoquímicos 76

2. MATERIALES Y METODOS 78

2.1. ANIMALES 78 2.2. MATERIALES 79

2.3 PROTOCOLO TÉCNICA INMUNOPEROXIDASA 81

3. RESULTADOS 84

3.1. OBSERVACION MACROSCOPICA DE LESIONES 84

3.2. HISTOPATOLOGIA 86

3.3. OBSERVACION CON LA PRUEBA DE INMUNO- 88

PEROXIDASA INDIRECTA

4. DISCUSION 95

5. CONCL USIONES Y RECOMENDACIONES 97

BIBLIOGRAFIA 99

ANEXOS 103

LISTA DE TABLAS Pág.

TABLA 1. Las espec ies de Clostridium que más afectan al ganado. 21

TABLA 2. Toxinas produc idas por el genero clostr idium. 22

TABLA 3. Caracter ísticas de las exotox inas y de las endotox inas 46

de las bac ter ias patógenas.

TABLA 4. Resultados estadís ticos de la calificación de lesiones 86

his topatológicas en tejidos de cobayo Cavia porcellus

inoculados con cepa patógena de Clostridium chauvoei.

LISTA DE FIGURAS

Pág.

FIGURA 1 Morfología de la bacteria grampos itiva. 26

FIGURA 2 Estructura del peptidoglicano. 27

FIGURA 3 Estructura de la pared bacteriana. 30

FIGURA 4 Membrana c itoplasmática de la bac ter ia grampositiva. 33

FIGURA 5 Funciones de los principales componentes de la célula. 36

FIGURA 6 Estructura del flagelo de la bacteria grampos itiva. 38

FIGURA 7 Acc ión de los antibióticos sobre las bac ter ias. 40

FIGURA 8 Dibujo esquemático de la formación de esporas

bacter ianas. 44

FIGURA 9 Inmunoperoxidasa indirecta. 77

FIGURA 10 Les iones en cobayo Cavia Porcellus a las 18 horas

de inoculados con Clostridium chauvoei. 85

FIGURA 11 Músculo estriado esquelético de cobayo Cavia porcellus

inoculado con Cl. chauvoei a las 18 horas. 88

FIGURA 12 Músculo estriado esquelético de cobayo Cavia porcellus. 89

FIGURA 13 Observación de las placas de tejido muscular esquelético

de cobayo Cavia porcellus. 90

FIGURA 14 Colorac ión con la técnica de inmunoperox idasa en múscu-

lo estriado esquelético de cobayo Cavia porcellus. 92

FIGURA 15 Tejidos de los cobayos inoculados con diferentes cepas

de Clos tridium. 93

FIGURA 16 Tejidos coloreados con la técnica de Inmunoperox idasa

Indirecta. 94

LISTA DE ANEXOS

Pág.

ANEXO 1. Preparac ión de soluc iones 103

RESUMEN

En el presente trabajo de investigación se estandar izó una técnica de

inmunoperox idasa evaluando los tejidos de cobayos inoculados

exper imentalmente con cepa patógena de Clostridium chauvoei. Durante

el desarrollo del proyecto y con el objeto de demostrar la espec ific idad de la técnica se procedió a infec tar grupos de cobayos con cepas de C.

chauvoei, C. septicum, C. novyi y C. sordelli, que fueron sacr ificados 18

horas post-inoculación, siguiendo las normas de bioética de la legislac ión

colombiana. Se realizó la necropsia de los cobayos, se tomaron las

correspondientes muestras de tejido y se fijaron en formol buferado al

10%. La identificación del C. chauvoei se realizó con el anticuerpo

monoc lonal (Cchex 1) . Como resultado el anticuerpo monoclonal (Cchex

1) reconoce el C. chauvoei en músculo estr iado esquelético y no

reconoce ninguna otra cepa. Eso demuestra que la prueba es altamente

confiable y específica y abre la posibilidad de desarrollar un método

diagnóstico, rápido y exacto para el carbón s intomático en bovinos .

ABSTRACT

In the present research a standardized immunoperoxidase test w as

evaluated us ing a guinea pigs’ tissue assay obtained from experimentally

infected indiv iduals w ith a pathogenic strain of Clostridium chauvoei.

Technique’s specific ity w as also determinated in tissues of infected guinea pigs w ith Clostridium septicum, Clos tridium Novyi and Clostridium sordellii

strains and killed at 18 hours pos t infection follow ing bioethical

procedures. Necropsy w as carried out and tissues w ere placed in a 10%

buffered formalin solution. The monoc lonal antibody Cchex1 w as used like

primary antibody in the standardized inmunoperoxidase test employ ing

skeletal muscle tissue, demonstrating no cross-reac tivity w ith others

Clostr idia used in this assay. Bes ides of observ ing peroxidase labelled C.

chauvoei, the histopathology slides also show ed typical injured tissues,

which allow ed improving the disease diagnosis. The standardized guinea

pigs test demonstrated to be a reliable and faster diagnosis approach for

likely detec tion of black leg disease in cattle.

INTRODUCCION

Las enfermedades infecc iosas causadas por bacter ias son fenómenos

que comprenden factores biológicos y se diferencian de otras

enfermedades por ser provocadas por agentes vivos caracterizados por

su contagiosidad, exis tenc ia de un período de latencia y reacciones

específicas del organismo ante el agente etiológico.

Para que el proceso infecc ioso tenga lugar y evolucione, se requiere de la

presencia de un microorganismo patógeno, su introducc ión en un animal

susceptible y determinadas caracter ís ticas del medio en el que tiene lugar

la interacción (Cedeño, 1996) .

Se sabe de la importancia clínica de las bacter ias anaerobias

par ticularmente de los Clostr idium histotóx icos, como por ejemplo

Clostri dium chauvoei; s in embargo, el conocimiento de estas bacterias y

el papel que juegan en humanos y animales es bien limitado. Exis ten

muchas especies de este género y gran número de ellas son patógenas

para el hombre y animales .

Las bacterias del género Clostri dium se caracterizan por ser anaerobias

estr ictas. Para sobreviv ir en el medio ambiente tienen que protegerse del ox ígeno, y lo hacen esporulando; de es ta manera pueden sobrevivir

durante varios años.

El objetivo del presente trabajo de investigac ión fue la evaluac ión

his topatológica mediante la técnica de inmunoperoxidasa en tejidos de

cobayo inoculados exper imentalmente con cepa patógena de C.

chauvoei, utilizando como anticuerpo primario el anticuerpo monoclonal

Cchex 1 especifico para C. chauvoei.

El carbón sintomático es una enfermedad mundial. En Colombia es

importante en todos los pisos térmicos; por lo tanto es prior itario

investigar sobre su agente causal, para establecer estrategias de identificac ión específica y determinar planes efectivos de vacunación. La

literatura reporta tratamiento con penic ilinas pero no registra gran

efectividad, el control se realiza por medio de vacunación anual que

proporciona protecc ión antitóxica y antibacteriana.

Este trabajo se realizó en el Centro de Investigación en Producción y

Salud Animal (CEISA) de la Corporación Colombiana de Investigac ión

Agropecuaria (CORPOICA), el análisis estadístico, los protocolos y las

fotograf ías usadas en este trabajo de investigación, son de autor ía del

Doctor Diego Ortiz Ortega y Doctor Rubén Darío Toro Ortiz; con apoyo de

la Universidad De La Salle y de la Empresa Colombiana de Productos

Veterinarios (VECOL S.A.).

1. MARCO TEORICO

Los clostr idios son bacilos grampositivos, esporógenos, generalmente

móviles y anaerobios ; las especies patógenas producen una o más

exotox inas que explican su patogenicidad; existen dos grupos: uno de

ellos, que inc luye las especies C. botulinum y C. tetani, no es invasor y

coloniza a individuos de forma muy limitada, y produce enfermedades

idénticas en personas y animales . Los representantes del segundo, grupo

de la ”gangrena gaseosa” , se diseminan a par tir de la puerta de entrada

de la infección y producen manifestaciones locales y sistémicas. Las

enfermedades importantes de los animales , atr ibuibles a los clostr idios de

este grupo son las enterotoxemias, las cuales, con pocas excepciones,

tienen importanc ia secundaria en medicina humana. En los animales se

presentan infecc iones de her idas por clostridios, que se parecen a la

gangrena gaseosa del hombre, de las aproximadamente 80 especies de

Clostri dium, tal vez 10 de ellas tienen importancia en medicina veter inar ia.

Los c lostr idios se pueden clas ificar o agrupar de acuerdo al tipo de

enfermedad que ocasionan en los animales y el hombre en:

Enterotoxem ias (Afecciones que se localizan princ ipalmente en el

sistema digestivo), están generalmente asoc iadas a los C. perfringens,

aunque algunas veces C. septicum causa infección gástr ica en las ovejas.

Esta incluye la disentería de los corderos y la enfermedad de r iñón

pulposo en ovejas (Gyles and Thoen, 1993).

Infecciones tisulares (Afectan distintos tejidos), las cuales causan una

gran variedad de s índromes en animales domésticos , agrupados bajo el

nombre de Carbones, los que incluyen la gangrena gaseosa (mionecrosis

con evolución de gas y toxemia), la pierna negra y edema maligno en

diversas especies animales, particularmente afectando a los bovinos.

Las espec ies de clostridios generalmente involucradas son C. chauvoei,

C. septicum, C. novyi, C. haemolitycum y C. sordellii. Generalmente las

bac ter ias que pueden ser habitantes normales de los tejidos o introducidas de modo traumático, se multiplican y producen tox inas en el

tejido traumatizado, las cuales crean una lesión local y son absorbidas al

torrente sanguíneo causando toxemia (Gy les , 1986, c itado por Ortiz y

Benav ides, 2002) .

Ne urotoxicosis (Afectan las func iones nerviosas), causan lesiones

originadas en el organismo por las neurotox inas producidas por C. tetani y

C. botulinum (Quinn and Markey, 2003). Estas toxinas pueden ingerirse

preformadas como ocurre en la mayoría de los casos de botulismo

(Hathew ay, 1988, citado por Ortiz y Benavides, 2002) ó ser el resultado

del crecimiento de las bacter ias en alguna par te del cuerpo, tal como

ocurre en el caso del tétano (Bizzini, 1986, citado por Ortiz y Benavides,

2002).

Se cree que la(s) toxina(s), en especial la toxina alfa necrosante, pero

pos iblemente también el factor de edema, la hialuronidasa (gamma), la

ADN-asa (beta), la hemolisina oxigeno- lábil (delta) y la neuranimidasa,

son responsables de las lesiones iniciales. Es posible que contr ibuya a

producirlas el metabolismo bacter iano, que produce gas por fermentación.

Las toxinas necrotizantes provocan la muerte mas iva del tejido y son

par ticularmente importantes en las mios itis (pierna negra y edema

maligno) (Quinn and Markey, 2003).

Las tox inas letales tienen una gran capacidad para destruir las células, lo

cual se demuestra al inocular animales de laboratorio, provocando la

muerte en tan solo unas pocas horas (Smith & Holdeman, 1968).

Tabla 1. Especies de Clostridium que más afectan al ganado

Germ en Enferm edad que produce

C. Septicum Edema maligno

C. Chauvoei Pierna negra

C. Sordellii Mios itis necrótica

C. Novyi Hepatitis y miositis necróticas

C. haemolitycum Hepatitis, mios itis y

hemoglobinuria

C. perfringens Enterotoxemia y mios itis

necrótica.

Fuente. (www .saludanimal.com).

Todas las espec ies de c los tridios producen una serie de toxinas que

causan severas les iones en los tejidos, estas toxinas provocan una rápida

muerte celular masiva, dando como resultado, lesiones necróticas

extensas que provocan la muerte del animal en forma aguda. Las tox inas

producidas y sus efectos se muestran en el siguiente cuadro:

Tabla 2. Toxinas producidas por el género Clostri dium

TOXINA GERMEN

C.

septicum

C.

chauvoei

C.

sordellii

C.

novyi

C.

per fringens

Letal +++ +++ +++ +++ +++

Necrotizante +++ +++ +++ +++ +++

Hialuronidasa +++ +++ ? - +

Lec itinasa - - - + +++

Desox irribonucleasa +++ +++ ? +++ +++

Colagenasa - - - - +++

Fuente. Biberstein, 1994.

Las lec itinasas destruyen las membranas celulares de cualquier célula por

donde van pasando, provocando la muerte. Esto es particularmente

importante en el tejido nervioso.

Las hialuronidasas destruyen el cemento intercelular, despegando a las

células unas de otras , permitiendo la difusión de los gérmenes y sus

tox inas.

Las toxinas desoxiribonuc leásas, destruyen el ADN, matando las células.

La colagenasa destruye el colágeno, que da forma y sostén a los tejidos,

alterando la morfología del músculo y favoreciendo también la difusión de

gérmenes y toxinas.

Clínicamente, ex iste fiebre, anorexia y abatimiento. Es normal que ex ista

cojera. Las lesiones superficiales producen tumefacc iones evidentes, que

crepitan al manipular las. Algunos animales mueren de forma súbita,

mientras que otros mueren en un plazo de 1-2 días.

En los bóvidos , la enfermedad probablemente vaya precedida de la

infecc ión de los tejidos, espec ialmente de los músculos esqueléticos, con

esporas procedentes del intestino. Los factores que favorecen la germinac ión de las esporas, la multiplicación de las bacterias y la

producción de toxinas, provocan lesiones que se caracterizan por edema,

hemorragia, y necrosis de las miofibr illas. La parte central de las lesiones

se seca, se oscurece y se convierte en enfisematosa como consecuencia

de la fermentac ión bacter iana, mientras que su periferia es edematosa y

hemorrágica. Microscópicamente, se encuentran cambios degenerativos

en las fibras musculares rotas por el edema, enfisema y hemorragia. La

infiltrac ión de leucocitos es poco importante (www .saludanimal.com).

Las enfermedades producidas por bacterias del género Clostri dium

ocasionan un sin número de muertes de bovinos y ov inos generando

grandes pérdidas a los productores rurales de diferentes partes del

mundo. Las enfermedades más importantes y sus agentes son las

siguientes:

C. chauvoei: Gangrena enfisematosa (pierna negra) en ovinos y bovinos.

C. botulinum: Botulismo en diferentes especies de animales y el hombre

C. tetani: Tétanos en diferentes especies animales y el hombre

C. novyi tipo A: Cabeza grande en carneros. Gangrena gaseosa en

ovinos

C. novyi tipo B: Hepatitis necrótica (enfermedad negra) en ovinos

C. novyi tipo C: Osteomielitis del búfalo doméstico.

C. novyi tipo D (C. haemolitycum): Hemoglobinur ia bac ilar en bovinos

C. septicum: Gangrena gaseosa (edema maligno) en bovinos, ovinos,

cerdos y ocasionalmente otras espec ies, infección del abomaso en

ovinos. (Smith, B. 2002)

C. perfringens tipo A: Celulitis anaeróbica y gangrena gaseosa en

humanos.

C. perfringens tipo B: Disentería de los corderos .

C. perfringens tipo C: Enterotoxemia hemorrágica en terneros, potros y

corderos.

C. perfringens tipo D: Enfermedad del riñón pulposo en corderos, cabras y terneros .

C. perfringens tipo E: Patogenicidad en ovejas y vacas poco conoc ida

(Biberstein 1994) .

1.1 MORFOLOGIA

Los clostridios miden de 0,2 a 0,4 micras (µm) de ancho por 20 µm de

largo, son formas bac ilares, móviles relativamente grandes según la

espec ie; pueden observarse, rectos, curvos, delgados, con ex tremos

romos, redondos, afilados y en ocasiones hasta en espirales o enrollados

(Biberstein, 1994) . No todos los c lostr idios son intensamente

grampositivos, los móviles poseen flagelos per itr icos. De las especies

patógenas, únicamente C. perfringens posee cápsula. Los clostr idios

patógenos se pueden presentar en forma ais lada, en cadenas cortas o

como filamentos largos y las endosporas pueden tener posición central,

subterminal o terminal (Finegold, 1989).

1.2 ESTRUCTURA BACTERIA GRAMPOSITIVA

En el género Clostr idium se pueden comparar los diferentes mecanismos

de los que disponen es tas bac ter ias patógenas como son: la presencia de

substancias en sus cubiertas celulares (cápsula o pared celular) que

dificultan la actividad de las células fagocíticas protectoras del animal o

bien, que después de ser fagocitados les confieren res istencia a ser

degradados, la presenc ia de toda clase de adhesinas como fimbrias o

compuestos de sus paredes celulares como los ác idos lipoteicoicos , la

presencia de endotox inas propias de bacter ias Gram negativas o la

excrec ión de exotox inas tanto por bacterias Gram positivas como Gram

negativas , la excrec ión de enzimas ex tracelulares, entre otros , que les

permitirán invadir y establecerse por organotropismo en las princ ipales

espec ies animales , provocándoles cuadros clínicos de diferente

naturaleza y la mayoría de las veces causándoles la muerte; afectando la producción pecuaria nacional (www.mis ionrg.com).

Las bacter ias se dividen en dos grandes grupos según el color con que se

tiñan por el método de Gram: grampositivas (tiñen de color azul-v ioleta) y

gramnegativas (adquieren un color de rosa a rojo). Esta diferente

respuesta de las bacterias a la tinción de Gram radica en la naturaleza de

la pared celular (Vadillo, et al. 2003).

La pared celular bacteriana es una estructura que rodea a la célula como

si fuera una bolsa membranosa. Con excepción de las bacterias inc luidas

en el orden Mollicutes (micoplasmas) y algunas arqueobacterias, la

mayor ía de las bacterias poseen una pared fuerte la cual les da r igidez y

forma, con lo cual evitan su lis is osmótica. La pared celular de la bacteria

grampositiva es de una sola capa y es mucho más ancha que la de una

gramnegativa. La pared se separa de la membrana citoplásmica por el

espac io periplásmico (Fig. 1).

Figura 1. Morfología de la bac ter ia grampositiva

Fuente. Vadillo, 2003.

Aunque existen diferenc ias entre las paredes de las bacterias

grampositivas, gramnegativas y las denominadas ácido-alcohol

resistentes, todas ellas poseen un componente común el cual forma el

verdadero esqueleto de la pared celular (responsable de la rigidez y, por

tanto, de la forma), denominado peptidoglicano o también glucopéptido,

mureína, mucopéptido o mucocomplejo de Park. Sus componentes son

dos aminoazúcares situados de forma alternativa y unidos por enlaces

beta (1,4): la n-acetil-glucosamina (NAG) y el ácido n-acetil-muramico

(NAM) (Fig. 2).

Figura 2. Estructura del peptidoglicano

Fuente. Vadillo, 2003.

Cada cadena de NAM y NAG permanece unida a las adyacentes

mediante un tetrapéptido, que se une por su aminoác ido inicial,

generalmente la L-alanina, al grupo carboxílico del NAM. La secuencia de

aminoácidos en las grampositivas es L-alanina (L-Ala)- acido D-glutámico

(D-Glu)- L- lisina (L-Lys)- D- alanina (D-Ala). La unión de es tos aminoác idos

se lleva a cabo por un pentapéptido de glicina (Gly), que en el último

aminoácido de un tetrapéptido (D-A la) con el penúltimo aminoác ido del

tetrapéptido subyacente (L-Lys).

1.2.1 Síntesi s del peptidoglicano

La s íntes is del peptidoglicano se div ide en distintas fases que suceden en

diferentes lugares anatómicos de las bacter ias . El proceso comienza en el

citoplasma con la convers ión de la fruc tosa 6-fosfato en glucosamina 6-

fosfato; a esta se le une una molécula de acetato y se transforma en una

molécula de 6-fosfato de N-acetil-glucosamina (NAG). A partir de la NAG y

del trifosfato de ur idina (UTP), se forma el complejo difosfato de uridina

(UDP)-NAG. Este complejo se transforma, pos ter iormente, en UDP-N-

acetil-muramico (NAM). A esta molécula se le unen de forma secuencial,

los tres pr imeros aminoác idos componentes de la cadena lateral. Por

ultimo, se unen dos D-Ala terminales para formar el complejo UDP-N-

acetil-murámico-pentapéptido. Una vez formado este complejo debe

abandonar el citoplasma bacteriano (Vadillo, et al. 2003).

Para ello recurre a la molécula transportadora bactoprenol o undecaprenol

(lípido formado por once unidades de isopreno, con un total de 55 átomos

de carbono) que se encuentra anc lada en la me mbrana c itoplasmática. El

nuevo complejo sirve de cadena principal en la que suceden una serie de

hechos, el pr imero es la incorporación al complejo de una molécula del

NAG que se une al NAM por medio de enlaces glucosídicos β (1,4). En el

caso de las grampos itivas , se incorpora al pentapéptido, formando la

cadena lateral, otro pentapéptido de glicina, or iginándose una cadena de

diez aminoác idos. El transportador (bactoprenol) lleva al complejo

glucopeptídico a un punto de crecimiento en la pared o punto terminal del

peptidoglicano. Terminada su función el transportador se regenera para

comenzar de nuevo el proceso. Si es te no se pudiera regenerar se

detendr ía la s íntesis de la pared celular ya que carece de transportador

disponible para aceptar nuevas unidades de NAM-NAG. Algunos

antimicrobianos bloquean la s íntesis de la pared celular al interferir con la

molécula transpor tadora; entre los cuales es tán: vancomic ina, la

ristocetina y la bac itracina. Una vez que el complejo disacár ido se

encuentra en el extremo del peptidoglicano se unirá a otros complejos

disacáridos, mediante enlaces glucosídicos β (1,4) , formando una

cadena. Las dis tintas cadenas se unen directamente a través del pentapéptido de glic ina que forma par te del decapéptido del NAM.

Estos pasos finales de la formac ión del peptidoglicano están catalizados

por la acción de unas enzimas, con función transpeptidasa y

carbox ipeptidasa, denominadas proteínas fijadoras de penic ilinas (PBP).

Las PBP son los pr inc ipales objetivos de los antibióticos betalactámicos

(penicilinas, cefalospor inas, etc).

La liberación del peptidoglicano durante la infecc ión no influye

sustanc ialmente sobre el poder patógeno de la bacter ia. Los residuos de

NAM de algunas bacterias están o-acetilados en el grupo C-6 hidroxilo.

Estos res iduos son res istentes a la acción hidrolitíca de la lisoz ima y las

glucosidasas produc idas por las células fagoc itar ías, lo que permite que

estas bacter ias hagan frente a la lis is enz imática. Los res iduos de NAM

o-acetilados tienen la capacidad de estimular la formación de interleuc ina

1 en el hospedador (Vadillo, et al. 2003).

1.2.2 Pared bacteriana

En las bacterias grampositivas el 90% de la pared esta constituida por el

peptidoglicano, el resto esta formado por otros componentes como ác idos

teicoicos y ác idos lipoteicoicos (Fig. 3).

Las bacter ias grampos itivas presentan a menudo polisacáridos ác idos

unidos a la pared celular, denominados ácidos teicoicos (Junqueira y

Corneiro, 1997) . Son cadenas de 30 fosfatos de glicerol o r ibitol

entrelazados por enlaces fosfodies téricos. Los grupos alcohol de los

ácidos teicoicos es tán sustituidos por azucares, colina o alanina, lo que

hace que estas moléculas sean muy antigénicas. Los ác idos teicoicos

están ubicados en la pered celular y se comunican con el ambiente

externo. Algunos ác idos que contienen glicerol están unidos a los lípidos

de la membrana citoplasmática ( llamados ác idos lipoteicoicos), atraviesan

la pared celular y se ponen en contacto con el exterior los cuales ac túan como determinantes antigénicos en las bacterias.

Figura 3. Estructura de la pared bacteriana

Fuente. Vadillo, 2003.

Las pr inc ipales func iones de es tos ác idos son: 1) favorecer la

superv ivencia de la bacter ia al actuar como adhesinas, 2) al producirse

una sepsis (distr ibuc ión de un gran numero de bacter ias y sus productos

por el torrente sanguíneo) , provocan en las células del hospedador la

liberac ión de mediadores de la inflamación, como monoc inas y citocinas;

3) regular la actividad de amilasas y glucosidasas que par tic ipan en la

síntes is de la pared celular como autolisinas; 4) influir en la competencia

de algunas bacterias (capacidad para admitir fragmentos de ADN

exógeno); 5) resistir la lis is frente a las lisoz imas; 6)regular el paso de

determinados iones (magnesio) a través de la pared celular (Vadillo, et al.

2003).

1.2.3 Protoplastos

Cuando las bac ter ias grampos itivas son sometidas a la acción de

sustanc ias que destruyen el peptidoglicano, como la lisozima, que rompe

las uniones β (1,4) del NAM y la NAG, estas quedan desprov istas de la

pared celular y se conv ierten en protoplastos, que pueden multiplicarse

normalmente si se mantiene en medio isotónico, aunque no tengan pared

celular .

Los protoplas tos son osmóticamente sensibles, en consecuenc ia captarán

gran cantidad de agua, se hincharán y terminará por produc irse la lisis

celular . Solo la adición de una concentración adecuada de soluto al

medio, produc irá un estado de equilibr io entre la concentración de soluto

en el exter ior y en el interior de la célula, lo que ev itará su destrucción.

1.2.4 Espacio periplásmico

Se trata de un espacio ocupado por un gel, más que por un líquido, que

aparece con mayor frecuencia en las bacter ias gramnegativas que en las grampositivas, debido a que aquellas poseen una presión osmótica

interna menor. Está s ituado entre la pared celular y la me mbrana

citoplasmática, su aspecto y contenido son var iables dependiendo del tipo

de bacter ia y del es tado metabólico en que se encuentre.

Este espacio se puede considerar el zaguán del c itoplasma bacter iano; en

él, los precursores nutr icionales y biosintéticos, as í como los antibióticos y

otras sus tanc ias tóx icas son procesadas de alguna manera antes de

ingresar en el citoplasma (Vadillo, et al. 2003).

1.2.5 Membrana citoplasmática

Es una estructura que rodea completamente a la célula, esta membrana

vital es la barrera cr ítica que separa el interior de la célula de su medio

ambiente (Fig.4). Se conecta con la pared celular a través del espacio

per iplásmico, en ella se ubican receptores y proteínas relacionadas con el

transporte transmembrana (Junqueira y Corneiro, 1997) . Su contenido en

proteínas es del 60 - 70%, algo superior al que presentan las membranas

de células de los mamíferos; posee, igualmente, lípidos (20-30%) y

pequeñas cantidades de hidratos de carbono (10%); si bien las

proporciones de estos constituyentes varían ampliamente de unas

bacter ias a otras , los lípidos de la membrana, al igual que ocurre en las

células eucar iotas, son fosfolípidos . Los esfingolípidos solo se han

encontrado en algunas especies del genero bacteroides. Moléculas

parecidas a los esteroles, denominadas hopanoides se encuentran en

cier tas bacter ias y es posible que desempeñen un papel parecido a los

esteroles de las me mbranas de los eucar iotas.

Figura 4. Membrana citoplasmática de la bac ter ia grampositiva

Fuente. Vadillo, 2003.

Los hopanoides se sintetizan a par tir de los mismos precursores que los

esteroides , probablemente estabilizan la membrana bacter iana. Con la

ayuda del microscopio electrónico, se aprecian dos líneas pálidas

separadas por una zona más oscura. Esta estructura, que mide de 5 a 10

nm de grosor, se denomina me mbrana unitar ia, me mbrana elemental o

unidad de me mbrana. En ella los fosfolípidos se agrupan formando una

doble capa, de tal manera que los grupos hidrófobos de estos se asoc ian

entre s i por un lado, mientras que los grupos hidrófilos se asoc ian por

otro.

Las moléculas de agua se congregan alrededor de la par te ex terna de la

bicapa lipídica (con los grupos hidrófilos) . Además, cationes como el Ca2+

y Mg2+ también contr ibuyen a estabilizar la me mbrana a través de las

interacciones iónicas con los grupos hidrófilos presentes en los

fosfolípidos. También ex isten en la membrana citoplasmática dos tipos de

proteínas: 1) las proteínas per iféricas, que están debidamente conectadas

a ella y pueden eliminarse fác ilmente, y que representan del 20 al 30% del

total de las proteínas de la membrana; 2) las proteínas integrales, que

constituyen del 70 al 80%. Estas, al igual que los lípidos de membrana, son anfipáticas; sus regiones hidrófobas están inmersas en la fracc ión

lipídica, mientras que las porc iones hidrófilas sobresalen de la superficie

de la me mbrana, algunas atraviesan toda la bicapa lipídica. A menudo,

exis ten hidratos de carbono unidos a la superfic ie externa de las proteínas

de la membrana citoplasmática (Vadillo, et al. 2003).

1.2.6 Mesosoma s

Son invaginaciones de la membrana citoplasmática, algunos son de tipo

vesicular , mientras que otros son de tipo concéntrico, formados por

torbellinos laminares que incluso pueden tener forma de túbulos.

Aparecen tanto en las bac terias grampositivas como gramnegativas.

Los mesosomas situados en el septo o tabique que divide a las bacterias

intervienen durante la división en la formación de la pared celular y en la

replicac ión del ADN. Pueden tener funciones secretoras, y en este sentido

hay que señalar la capacidad que tienen de sintetizar exoenzimas del tipo

de las β- lactamasas (Vadillo, et al. 2003).

1.2.7 Citoplasma ba cteriano

Es la sustancia englobada por la me mbrana citoplasmática. Contiene una

solución acuosa de sales (casi el 70% de la masa bacter ina es agua),

hidratos de carbono, aminoác idos, vitaminas, coenz imas y una amplia

variedad de otras sustanc ias solubles. Contiene, además de los

mesosomas y el genoma bacter iano, los ribosomas y las inclus iones. No

posee ni mitocondr ias ni cloroplastos.

1.2.8 Inclusiones bacterianas

1.2.8.1 Gránulos de polisacáridos

Están formados por glucógeno o almidón, pueden demostrarse al tratar la

célula con yodo. Los gránulos de glucógeno, al impregnar los con yodo,

aparecen de color marrón rojizo y los de almidón de color azul. Son

materiales de reserva de las bac ter ias. En los c lostr idios se ha descrito

una sustancia parec ida al almidón denominada granulosa o yógeno.

1.2.8.2 Genoma bacteriano

El material genético esta constituido por ac ido desox irribonucleico (ADN),

el cual dir ige la bios íntesis de todo el material de la bacter ia. Este ADN

también se llama genóforo, cromosoma bacter iano o nucleoide (Fig.5).

Figura 5. Func iones de los pr incipales componentes de la célula

Fuente. Junqueira y Corneiro, 1997.

1.2.9 Elementos externos

1.2.9.1 Flagelos

Muchas bacterias son móviles y esta capacidad de desplazarse por s i

mismas se debe habitualmente a la presencia de unos órganos

espec iales: los flagelos (del latín flagellum: látigo). Son apéndices largos (3-20 µm) y delgados (120-250 Ao) , libres por un extremo y unidos a la

célula por otro. En el flagelo se pueden distinguir tres partes: una

estructura basal o corpúsculo basal (ubicado en la pared celular y

me mbrana c itoplasmática), el gancho (un segmento curvado y corto que

une el filamento al corpúsculo basal) y el filamento, situado fuera de la

célula (Fig.6) .

Las bacter ias gramnegativas tienen un corpúsculo basal constituido por

cuatro anillos. El par externo de anillos está asoc iado con el

lipopolisacárido (anillo L) y el peptidoglicano (anillo P). El par interno esta localizado en la me mbrana citoplasmática (anillos S y M) (Vadillo, et al.

2003).

Las bacter ias grampos itivas, al no poseer la capa de lipopolisacárido,

únicamente presentan los anillos S y M. Se sabe que el flagelo es una

estructura semirr ígida que no se flex iona, s ino que se mueve por rotación,

como una hélice. El mov imiento de rotac ión del flagelo esta provocado por

el corpúsculo basal, que actúa como un motor . Alrededor del par de

anillos internos, y ancladas en la membrana c itoplasmática, ex iste un par

de proteínas denominadas Mot. Estas gobiernan el motor flagelar,

provocando la rotación del filamento. Junto a ellas se encuentra un

conjunto de proteínas denominadas Fli, que actúan como un conmutador

del motor, invirtiendo la rotación del flagelo en respuesta a señales

intracelulares .

El filamento del flagelo esta constituido por subunidades de una proteína

denominada Flagelina. El gancho, ligeramente más ancho que el

filamento, está formado por subunidades de proteínas diferentes. El

filamento es un c ilindro rígido y hueco. El flagelo no crece sobre la base,

como lo hace el pelo de un animal, s ino por la punta. La flagelina formada

en la célula bacteriana se traslada a través del hueco del cilindro y se

agrega al extremo terminal. La síntesis de un flagelo a partir de las

moléculas de flagelina recibe el nombre de autoensamblaje. A lgunas

bacter ias tienen una vaina rodeando los flagelos, esta s íntesis del flagelo

bac ter iano puede ser inhibida por sustanc ias como el cloramf enicol y la

fluorofenilalanina (Junqueira y Corneiro, 1997).

La dispos ición de los flagelos permite clas ificar las bac ter ias en: átricas

(sin flagelos) , monótricas (poseen un flagelo en un ex tremo), anfítricas

(presentan uno o mas flagelos en ambos extremos) y per ítricas (muestran

flagelos en toda la superficie celular) (Hamilton and Chandler, 1975).

Figura 6. Estructura del flagelo de la bac ter ia grampositiva

Fuente. Vadillo, 2003.

Antigénicamente, la flagelina es diferente de otros componentes

bacter ianos. A es ta proteína se le conoce como antígeno H (del alemán

Hauch, película delgada). Induce la formación de anticuerpos específicos

que permiten la serotipificac ión de una bacteria móvil (Vadillo, et al. 2003).

1.2.9.2 Cápsula y capa mucosa

Algunas bacterias están rodeadas por una sustancia viscosa que forma

una cubierta o envoltura alrededor de la célula. Cuando el mater ial esta

dispuesto de un modo compacto alrededor de la superficie celular se

denomina cápsula, mientras que s i es laxo, de modo que forma una capa

difusa, se denomina capa mucosa o s lime.

Están formadas por polisacáridos, polipéptidos o complejos de

polisacár idos y proteínas, s i bien la compos ición es característica de

cada especie bacteriana. Habitualmente contienen potentes antigenos,

confir iendo a la bacter ia propiedades inmunológicas muy definidas ; de ahí

que al antígeno capsular se le denomine antígeno K. A pesar que la

presencia de la cápsula no siempre esta relac ionada con la capac idad de

la bacteria para agredir al hospedador (Junqueira y Corneiro, 1997) . No

exis te duda que esta estructura confiere a las bac ter ias patógenas

protecc ión contra la fagoc itos is, también impide la fijac ión de

bacter iófagos a la célula bacter iana y dificulta el paso de los

antimicrobianos al inter ior de esta (Vadillo, et al. 2003) (fig.7).

Figura 7. Acción de los antibióticos sobre las bacter ias

Fuente. Junqueira y Corneiro, 1997.

1.2.10 Endosporas

Cuando las bacterias se encuentran en ambientes adversos, son capaces

de transformarse en células especiales de alta resistenc ia, llamadas

endosporas o esporos. Estas formas soportan los efec tos bacter ic idas del

calor, falta de agua, radiaciones, congelación y c ier tos químicos tóxicos

como los des infectantes. Pueden permanecer en estado latente durante

largos per iodos de tiempo y se encuentran normalmente en el suelo

(Junqueira y Corneiro, 1997).

Desde el punto de vista clínico hay dos géneros bacter ianos productores

de endosporas: Clostridium y Bacillus, los dos contienen especies

patógenas para animales y humanos. Algunas infecciones solo se originan cuando los esporos de estas bacter ias se introducen en un lugar

donde puedan germinar , por ejemplo, una herida.

1.2.10.1 Estructura de l as endosporas

La estruc tura de los esporos se puede observar a través del microscopio

electrónico, su aspecto es muy diferente al de las formas vegetativas, ya

que es tán rodeadas por var ias capas gruesas que les permiten res istir las

inc lemenc ias ambientales. El citoplasma del esporo se denomina parte

interna o núc leo, contiene una copia del cromosoma, carece de ARNm,

tiene poco ARNt y posee algunas enz imas. Los aminoácidos se

almacenan como proteínas citoplasmáticas de bajo peso molecular y se

llaman proteínas pequeñas solubles en ácido (SASP).

Algunas SASP contr ibuyen a incrementar la capacidad de la endospora

para resistir las radiaciones ultrav ioleta y, quizá el calor, ya que aumentan

de forma estable la actividad negativa de la superhélice del cromosoma.

No se presenta actividad metabólica continua en el esporo maduro y la

energía se almacena como 3-fosfoglicerato, sustancia más estable que el

ATP. También contiene ácido dipicolínico, que se combina con iones

calc io para formar dipicolinato cálcico; este supone el 15% del peso seco

del esporo, y hasta ahora se pensaba que era el responsable direc to de la

resistenc ia al calor por par te de la endospora, pero recientemente se han

ais lado mutantes termores istentes que carecen de esta sustancia. El

núc leo se encuentra parcialmente deshidratado, posee del 10 al 30% del

contenido de agua de la célula vegetativa (Vadillo, et al. 2003).

Esta deshidratación incrementa la termoresistenc ia de la endospora, le

confiere resistencia a diversos productos químicos e inac tiva enzimas del

núc leo. El pH de la parte interna es aproximadamente una unidad inferior

al de la célula vegetativa. El núcleo del esporo se encuentra rodeado,

primero, por una membrana citoplasmática y una delgada pared celular, y después por una capa concéntrica llamada corteza o córtex. La cor teza

esta constituida por peptidoglicano modificado y contiene ác ido

dipicolínico, generalmente en forma de dipicolinato cálcico. Rodeando a la

corteza aparece la cubierta del esporo compuesta por var ias capas de

proteínas. La capa más ex terna, el exospor ium, es una delgada cubierta

de naturaleza proteica.

Los esporos pueden estar s ituados en el centro, cerca de un extremo

(subterminal) o netamente en el extremo (terminal) . El esporo posee

capac idad inmunógena, y algunos de sus antigenos son diferentes a los

de la célula vegetativa, pero específicos y comunes a todas las

biovariedades de la misma espec ie.

Dada la alta res istencia de las endosporas a las condiciones ambientales

y la implicac ión de determinadas especies productoras de las mismas en

procesos infecc iosos de los animales y del ser humano, se hace

necesario emplear procedimientos espec iales para eliminar todos los

esporos bacterianos. En los instrumentos y mater iales clínicos se utiliza la

esterilizac ión en autoc lave utilizando una temperatura de 121°C durante

20 a 30 minutos .

1.2.10.2 formación de l a endospora

Las bacter ias esporulan para sobrevivir a las condiciones ambientales

adversas. La esporulac ión o esporogénes is se inic ia cuando concurren

tres circunstanc ias: 1) la bacteria tiene que estar áv ida de nutrientes

importantes; 2) debe ex istir una alta densidad bacter iana para permitir la

secrec ión y reconocimiento del factor 1 de diferenciación ex tracelular

(EDF-1), fac tor que al parecer es un péptido pequeño que se enlaza con

la bacteria áv ida de nutr ientes y le indica que es el momento de iniciar la

esporulac ión; 3) es necesar io que la bacter ia se encuentre en fase

estacionar ia (Vadillo, et al. 2003).

1.2.10.3 Germinación del esporo

El proceso de esporulación dura de 6 a 8 horas, se necesitan solo 90

minutos para que se lleve a cabo la germinación. El proceso se realiza en

tres etapas. 1) ac tivación, se produce cuando el calor o alguna sustancia

química activa un receptor de la L-alanina, que también es una proteasa.

2) inic iación o germinación, se lleva a cabo cuando la célula activada se

expone a la L-alanina, a otros aminoác idos o a la glucosa. La proteasa

activada pone en marcha una enzima lítica de la corteza, específica para

la germinación y la transforma en su forma activa. Esta degrada la cor teza

y permite la entrada en la endospora de agua y nutr ientes . A lo largo de

esta fase el esporo pierde su resis tenc ia y refrac tar iedad y recupera su

actividad metabólica. 3) crecimiento, se inicia cuando la germinación es

ya irreversible. A lo largo de es ta fase, la bacteria recupera su forma

vegetativa. En las dos primeras fases se emplean mater iales

preformados, y en la tercera etapa se or igina una nueva síntes is proteica

(Fig. 8).

Figura 8. Dibujo esquemático de la formac ión de esporas bacterianas. 1)

Fase inicial, cuando se bosqueja la septac ión. 2) La me mbrana

plasmática se invagina, comienza a ais lar el nucleoide. 3-4) Fase avanzada de la formac ión de la espora, el nucleoide es ta aislado por la

me mbrana. 5 y 6) formación de la cubier ta de la espora.

Fuente. Junqueira y Corneiro, 1997.

1.2.11 Metabolismo bacteriano

No ex iste ningún grupo de seres v ivos que tenga un metabolismo más

divers ificado que el de las bacterias. Gracias a esta característica es

pos ible encontrar las en las más variadas condic iones ecológicas . Algunas

bacter ias viven a bajas temperaturas, mientras que otras, es tán

adaptadas a temperaturas consideradas como incompatibles con la vida.

Desde el punto de v ista metabólico, las bac ter ias pueden ser divididas en

fototróficas (photos, luz y trophe, nutr ición), cuando utilizan la luz solar

como fuente de energía, y quimiotróficas, cuando utilizan la energía

presente en compuestos químicos.

En el segundo grupo, s i el compuesto donador de energía es inorgánico,

las bac ter ias son quim iolitotróficas. Cuando el compuesto es orgánico,

la bacter ia es llamada quimiorganotrófica. Estas últimas ox idan o

fermentan compuestos orgánicos, obteniendo de ellos la energía para sus

procesos v itales.

Todas las bacter ias parás itas son quimiorganotróficas, y las más

exigentes requieren, además de hidratos de carbono, aminoác idos y

cier tas vitaminas para su crecimiento. Esas bacter ias obtienen la energía

necesaria para su v ida a través de la oxidación de hidratos de carbono,

lípidos y proteínas. A lgunas, sin embargo, obtienen energía de la

descomposic ión anaeróbica (fermentac ión) de los hidratos de carbono.

Otras especies solamente crecen en la ausencia del ox igeno (bacterias anaeróbicas).

La capacidad de metabolizar determinados tipos de azúcares, unida a la

morfología y afinidad de las bacterias a los colorantes , es un cr iterio muy

usado para su identificación y clasificac ión. Componentes de los flagelos,

de la cápsula y de la pared constituyen numerosos antígenos,

proporcionando las bases para un anális is inmunológico, también

importante para la identificación de las bac terias y paso trascendente para

orientar el tratamiento de las infecciones.

Varios tipos de bacter ias contienen como componentes de su estructura,

o liberan hac ia el medio de cultivo, sustanc ias tox icas, que reciben el

nombre de endotoxinas y exotoxinas bacterianas (tabla 3) . Es tas tox inas

son, en parte, responsables por la agresión de las bacterias a los

organismos que parasitan. Dos de las toxinas más potentes que se

conocen son produc idas por el Clostridium tetani y Clostridium botulinum,

causantes del tétano y del botulismo respectivamente.

Tabla 3. Características de las exotoxinas y de las endotoxinas de las

bac ter ias patógenas.

EXOTOXI NAS ENDOTOXINAS

Sec retadas por las bact erias; alcanzan

altas concentraciones en el medio de

cultivo.

Parte integral de la pared de las bacterias

gramnegativas, liberadas cuando muere la

bacteria.

Producidas por bact erias grampos itivas y

gramnegativas.

Encontradas exclusivamente en las

bacterias gramnegativas.

Son polipéptidos con peso molecular de

10000 a 900000 dalt ons.

Son lipopol isacáridos de la pared

bacteriana.

Altamente tóxicas Toxicidad moderada.

Inestables, la toxic idad es anulada al

elevar la temperatura sobre los 60°C.

Mas est ables; resisten el calentamiento.

Se unen a receptores de la membrana

celular.

No se ha observado la unión a receptores.

Generalmente no causan f iebre. Generalmente causan f iebre.

Fuente. Junqueira y Corneiro, 1997.

1.3 CRECIMIENTO

El rigor de las exigenc ias anaeróbicas es distinto en cada una de las

espec ies de clostr idios y se puede expresar como potencial de ox ido-

reducc ión o potencial redox en milivoltios . A efectos prácticos los

indicadores de potencial redox (por ej., el azul de metileno, la resazur ina)

son medidas apropiadas de las condiciones de cultivo de los anaerobios

patógenos. Los c lostridios prefieren una atmósfera con un 2-10% de CO2.

Estas condic iones se pueden producir en un frasco en el que el oxígeno

es reducido cataliticamente por hidrogeno generado junto con dióx ido de

carbono mediante un dispos itivo que se puede adquirir en el comercio

(GasPack®). La mayor ía de los clostr idios patógenos neces itan medios de

cultivo complejos que inc luyen aminoácidos, hidratos de carbono y

vitaminas. La sangre o el suero favorecen su crecimiento. Un pH próximo

a la neutralidad y la temperatura de 37°C son óptimos.

El crecimiento generalmente se puede observar en un plazo de 1-2 días.

Con frecuenc ia las colonias tienen una forma y un contorno irregulares.

Varios clos tridios pululan a través de medios de agar sin formar colonias.

La mayor ía de los clostr idios son hemolíticos (Biberstein, 1994).

En los medios líquidos, los clostr idios crecen en presenc ia de aire con tal

de que ex ista un agente reductor (trozos de carne cocida, tioglicolato). El

crecimiento únicamente tiene lugar en reduc idas porciones del medio.

1.4 PROPIEDADES BIOQUIM ICAS

El desprendimiento de olores desagradables debidos a productos del

catabolismo de los péptidos, que constituye una forma corriente de

producción de energía, es típico de los cultivos de clostr idios. La mayoría

de los clostr idios atacan a los hidratos de carbono, a las proteínas, a los

lípidos, o a los ácidos nucleicos. Las reacciones bioquímicas y sus

productos finales proporcionan la base de la identificac ión de espec ies.

1.5 RESISTENCIA

Lo mismo que las demás bacter ias, las formas vegetativas de los

clos tridios son sensibles a las condiciones adversas del medio y a los

des infectantes . Las endosporas son resistentes a la desecación, al calor,

a las radiaciones y a los des infectantes. Para destruir las esporas del

género clos tridium son necesarios 30 minutos de ebullic ión; la

temperatura de 121º C durante 20 minutos las des truye. Son resistentes al

fenol, al alcohol y a los des infectantes de amonio cuaternario. La lejía y el

formol son medianamente espor icidas (Biberstein, 1994).

1.6 Clostridium chauvoei

Clostri dium chauvoei es el agente causal de pierna negra y edema

maligno, en vacas, ovejas, cabras y otras especies animales (Smith, and

Holdeman, 1968); se trata de una mios itis enfisematosa necrosante, su

agente causal, Clostridium chauvoei (Carter, 1989). Es clos tridium típico

que posee esporas subterminales o subcentrales El antígeno de su

espora presenta reacc ión cruzada con el de C. septicum. Produce cuatro

tox inas emparentadas con las de C. septicum, un factor de edema y, con

frecuencia una neuroaminidasa.

1.6.1. Toxina s de C. chauvoei:

1.6.1.1 Toxina alfa.

Es una sustancia letal y necrotizante, es probablemente responsable de la

actividad leucocídica y puede ser idéntica con la hemolisina oxígeno

estable (Smith, and Holdeman, 1968). Verpoorte et al (1966) repor tó que

la α-toxina de C. chauvoei t iene una masa molecular de 27 kDa, es

sintetizada como parte de un complejo de 53.5 kDa, el cual es refer ido

como el “componente soluble inmunizante” (Smith, 1984). C. chauvoei

no produce títulos de α-toxina tan altos como C. septicum. Se ha

encontrado que el antisuero de C. septicum neutraliza la actividad letal

de ambos organismos, pero el antisuero de C. chauvoei neutraliza la

letalidad de organismos homólogos solamente. El mismo autor postuló

que C. septicum produce dos α-tox inas, alfa 1 y alfa 2, mientras que C.

chauvoei produce solamente alfa 1 (Hathew ay, 1990).

1.6.1.2 Toxina beta.

Es una proteína termoestable con activ idad Desox irr ibonucleasa (DNasa).

(Pr incew ill and Oakley, 1976) encontraron que las toxinas β de ambas

espec ies son similares con respecto a estabilidad al calor, activación o

inhibic ión por iones metálicos , inhibición por agentes quelantes y

prec ipitac ión con sulfato de amonio. Ellas son es tables al calor, pierden

cerca del 10% de actividad a 56ºC por 60 minutos y 50% después de

calentarlas a 100º C por 80 minutos. La actividad enz imática es

intens ificada agregando iones de bar io o magnes io e inhibida por cobre,

hierro, mercur io, zinc o iones de plata. La ac tiv idad no es afectada por

concentraciones de calcio, cobalto, magnes io, potasio o iones sodio entre

10-1 y 10- 6 molar (M), la estimación molecular de su masa es de 45 kDa.

1.6.1.3 Toxina gamma.

Es una hialuronidasa, hidroliza enlaces glicosídicos entre N–

acetilglucosamina y residuos de ác ido glucurónico y ácido hialurónico.

Esta enz ima es completamente inactivada por tratamiento con calor

(Pr incew ill and Oakley, 1976) encontraron que la gamma tox ina de C.

septicum fue mucho más sensible al calor que la de C. chauvoei. Se

encuentra en var ios tejidos de los animales y el hombre, como el tejido

conectivo laxo, líquido s inovial y humor vítreo, facilitando la diseminac ión

de la infección. Es ta hialuronidasa al destruir el ácido hialurónico de los

tejidos reduce la viscos idad y permite mayor difusión de las sustancias en

los espac ios tisulares. Es inac tivada por el calor y su ac tiv idad se ve

afectada por iones metálicos como cobre, hierro, mercur io, z inc y plata.

1.6.1.4 Toxina delta.

Es una hemolisina ox ígeno lábil, serológicamente relacionada pero no

idéntica a las hemolis inas ox ígeno lábiles producidas por C. tetani, C.

per fringens, C. novyi, C. histolyticum, los neumococos y algunos de los

estreptococos. La potencia hemolítica de las tox inas es inactivada por

agentes oxidantes tales como peróx ido de hidrógeno, el yodo y también

por la antiestreptolis ina O del suero humano y por el suero normal de

varios animales como conejos, cobayos y caballos (Moussa, l958). Puede ser activada por agentes reductores como tioglicolato de sodio y sulfuro

de hidrógeno (Ballard et al, 1993).

Las células vegetativas de C. chauvoei poseen dos aglutinógenos

conoc idos, un antígeno somático O estable al calor común a todas las

cepas, y un antígeno flagelar H termolábil, del cual se conocen dos tipos.

El flagelo de C. chauvoei es un organelo el cual ayuda a induc ir

mecanismos de res istenc ia inmune siendo el mayor antígeno protec tivo

del organismo la proteína flagelar. Estudios previos sugieren que el

flagelo de C. chauvoei es importante como un factor de virulencia en la

patogénes is de infecc ión causada por es te organismo (Tamura et al,

1995).

C. chauvoei necesita condiciones de anaerobiosis estr ictas y medios ricos

en cis teína y en vitaminas hidrosolubles. Sus colonias son redondas con

contorno liso y en 2 días alcanzan un tamaño de inc luso 4µm. La

hemólis is es variable, C chauvoei se parece a C. septicum y con

frecuencia se aísla junto con él. A diferenc ia de C. septicum, fermenta la

sacarosa, pero no la salicina y no crece a 44°C. (Biberstein, 1994).

1.7 ECOLOGIA

1.7.1 Reservorio

C. chauvoei se encuentra ampliamente distribuido en la naturaleza pero

parece tener dos hábitats principales: en el suelo y en el tracto intestinal

de los animales y el hombre. Exis ten indic ios de que el suelo transmite la

pierna negra, se supone que la puerta de entrada es la mucosa del

aparato digestivo, después de la ingestión de alimentos contaminados o

por dientes en erupción o a través de her idas. Las bacter ias pueden

localizarse en bazo, hígado y tubo diges tivo de animales sanos, y la contaminación del suelo y el pasto puede producirse a partir de heces

infectadas o por la descompos ición de los cadáveres de animales que han

muerto de esta enfermedad (Rodostits, et al. 2002) .

1.7.2 Epidemiología

La pierna negra se presenta en todas las latitudes, con una frecuencia

variable tanto dentro de una misma zona geográfica como en distintas

zonas geográficas, c ircunstanc ia que indica que el suelo es el reservorio

del agente causal o que exis ten factores climáticos o estaciónales que

hasta ahora no han sido definidos . Los bóv idos jóvenes (< 3 años) y bien

alimentados son los preferentemente afectados.

El carbón sintomático registra el mayor número de casos durante los

meses cálidos del año (en la Orinoquía colombiana de agosto a octubre y

de dic iembre a marzo). Algunos brotes de esta enfermedad se han

encontrado después de excavar el suelo, lo que sugiere que estas

maniobras pueden poner en actividad esporas latentes que han quedado

expuestas.

Se sospecha que los esfuerzos, los golpes en los músculos y las

indigestiones agudas desencadenan los problemas (Smith and Jones,

1962). En los ov inos y en algunas otras especies, es típica de C. septicum

la producción de infecc iones en las heridas que parecen edema maligno o

gangrena gaseosa (Hagemoser, 1980) . También es posible que en las

her idas se encuentren otros clostr idios (C. septicum, C. novyi y C.

sordellii). En los bóvidos, esta enfermedad normalmente se produce sin

antecedentes de un traumatismo, pero en las ovejas casi siempre esta

originada por una infecc ión o heridas (Rodostits, et al. 2002).

El carbón sintomático es causa de grandes pérdidas económicas para los

ganaderos que crían ganado bovino en muchas partes del mundo. La

mayor parte de los brotes se previene mediante vacunación, cuando surge la enfermedad suele afectar a varios animales en pocos días. Se

trata de un padec imiento enzoótico en ciertas zonas, especialmente,

aquellas expuestas a inundac iones; el tamaño de estas áreas

contaminadas puede variar desde un grupo de granjas has ta un campo

individual; se presenta en todas las latitudes con más frecuencia en las

zonas templadas, la mortalidad del carbunco sintomático cas i llega al

100% (Valder, 2002).

Factores de riesgo

factores ambientales

El carbón sintomático o pierna negra es típico en los bóv idos, tienen una

inc idencia es tac ional, presentándose la mayoría de los casos en los

meses cálidos del año. La mayor incidenc ia puede variar desde la

primavera al otoño, dependiendo probablemente del mo mento en que los

terneros alcancen la edad susceptible. En algunas áreas ex iste mayor

prevalenc ía durante los meses de intensas lluv ias. Se han produc ido

brotes de carbón sintomático en los animales después de la excavac ión

del suelo, indicando que las alterac iones del suelo pueden exponer y

activar las esporas latentes .

Factores animales

El carbón sintomático se considera habitualmente una enfermedad bov ina

y, ocas ionalmente, ovina, pero se han descr ito brotes de es ta enfermedad

en ciervos y también en caballos. En los bóv idos, esta enfermedad está

limitada pr incipalmente a los animales jóvenes, entre 6 meses y 2 años de

edad, aunque también se produce ocas ionalmente en los animales mas

jóvenes y en los adultos de hasta 3 años. En el campo, los factores de

riesgo incluyen el crecimiento rápido del ganado y una dieta muy

energética.

Importanc ia

El carbón sintomático es una causa de pérdidas económicas importantes

para los ganaderos en muchas partes del mundo. En la mayoría de los

casos, los brotes se previenen mediante la vacunac ión, aunque todavía

se producen brotes en hatos vacunados o en animales vacunados en

forma incompleta (Rodostits , et al. 2002).

1.8 PATOGENIA

Esta enfermedad se ha descr ito en vacunos y ovinos, se han reportado 2

casos de pierna negra propiamente dicha en porcinos. En el caso de los

vacunos, la bacteria puede ser endógena y puede provocar la enfermedad

de esta manera pero en los ovinos la infección s iempre es exógena y la

espora es llevada al organismo por inyección o infección de una her ida

prev ia.

La eliminación de la bacter ia en forma esporular es constante por la vía

digestiva de animales infectados y ésta, por ser un anaerobio estr icto

esporula para mantenerse v iva en el medio ambiente, se queda en la

tierra y el suelo pudiendo infectar el agua de los bebederos y el pasto.

No se tiene muy clara la patogenia de esta bacteria pero se piensa que

ingresa por lo general por v ía oral, al consumir agua o pastos

contaminados con esporas, una vez dentro del organismo, esta espora

llega a la mucosa digestiva en fase vegetativa y por v ía hematógena llega

hac ia diferentes órganos y tejidos del organismo o también v iaja dentro de

un macrófago. También puede llegar a la sangre a través de algunas

her idas predispuestas en la mucosa de los animales por ejemplo en la

época de la dentic ión de los terneros y de allí diseminarse por vía

hematógena a distintos tejidos del cuerpo. Las esporas van

principalmente a las porciones musculares del cuerpo generalmente en el

cuello y miembros poster iores, aunque también se han visto lesiones solamente en el inter ior del cuerpo, en músculos muy profundos como en

el diafragma, la base de la lengua y el miocardio (Smith & Jones, 1962).

Para que se produzca la enfermedad tiene que existir un ambiente

propicio para el desarrollo de la bacter ia en el organismo, este ambiente

propicio se da por magulladura del músculo, ejercicio exces ivo,

indigestión aguda o cualquier proceso que desv italice al tejido. La bacteria

neces ita de un medio r ico en glucógeno como fuente de su energía, esto

con una previa glucólisis anaeróbica produc ida en el músculo. Esto

además tiene que estar acompañado de anaerobiosis y pH ligeramente

alcalino; este ambiente perfecto para el desarrollo de la bacteria

determina pr imariamente la forma vegetativa de este microorganismo

donde por actuación de tox inas que ya se están produciendo, propician el

desarrollo de la enfermedad y sus consecuenc ias (Smith, 2002).

Una vez que el ambiente es adecuado para el desarrollo de la bacteria,

comienzan a producir sus toxinas y enz imas, cada una con un fin

espec ifico. Estas tox inas provocan una reacción tisular y se desencadena

una inflamac ión del músculo comprometido, hemorragia y edema gaseoso

que es útil para hacer el diagnóstico de esta enfermedad ya que al tacto

es crepitante, finalmente ocasiona necros is del músculo comprometido,

además durante este proceso ex iste la apar ición de fiebre alrededor de 40 ºC, por que las tox inas liberadas por las bacter ias son inductoras de

liberac ión de linfoquinas que elevan la temperatura.

Las les iones se hacen evidentes 24 horas después de la germinac ión de

la fase vegetativa en los músculos y se puede notar un edema crepitante

en la zona. Finalmente hay una bacteremia que se da únicamente en la

fase final de la enfermedad y que conlleva a la muerte del animal por

infecc ión s istémica. La muerte se da 1-3 días desde que aparecen los

signos clínicos. En ocas iones se presenta muerte súbita.

En ov inos, la espora ingresa conjuntamente con otros Clostridium en

her idas abiertas, es to lleva a una necros is del tejido afectado produciendo

el cuadro de gangrena enfisematosa. A la necrops ia se encuentra el animal en pos ic ión decúbito lateral con el miembro afectado extendido y

rígido, se produce putrefacción y meteor ismo post mortem rápidamente y

se puede ver un exudado espumoso que sale del ano y la nar iz, los

músculos afectados se ven edematosos y con el centro ennegrec ido por

la destrucción y degenerac ión del tejido. En las cavidades se encuentra

siempre abundante líquido que coagula con facilidad por la gran presencia

de fibrina, además se nota un olor rancio como de ác ido butírico y se

puede notar la producción de gas en el hígado. Cuando un feto es

afectado se puede notar la distens ión del abdomen de la madre

pos iblemente por la edematización del feto, es te puede o no presentar las

les iones típicas de la infecc ión (Valder, 2002).

1.9 HALLAZGOS CLINICOS

Al observar al animal antes de su muerte, éste presenta una cojera grave,

normalmente con inflamac ión pronunc iada de la par te super ior de la

extremidad afec tada. Al examinar atentamente al animal se observará que

esta muy deprimido, tiene anorexia completa, éstasis ruminal y una

temperatura y frecuencia de pulso altas (41°C y 100-120 l/m,

respectivamente). No en todos los casos se observa fiebre.

En las fases iniciales , la hinchazón es ta caliente y dolorosa a la

palpac ión, pero pronto se vuelve fr ía e indolora, pudiendo palparse edema

y enfisema. La piel toma un color diferente y muy pronto se seca y se

cuar tea. Aunque las lesiones normalmente están limitadas a la parte

super ior de una extremidad, se han observado casos ocas ionales en los

que se producen les iones en otras partes del cuerpo, como la base de la

lengua, el músculo cardiaco, los músculos del diafragma y psoas y la

ubre.

A menudo existen lesiones en más de un lugar en un mismo animal. Esta

enfermedad avanza rápidamente y el animal muere entre 12 y 36 horas

después de la aparición de los s ignos. La mayor ía de los animales

mueren s in que se observen los s ignos c línicos .

1.10 HALLAZGOS DE NECROPSIA

Los bovinos encontrados muertos por carbón sintomático a menudo

presentan una posic ión caracterís tica: permanecen en decúbito lateral con

la extremidad afectada levantada r ígidamente. El meteorismo y la

putrefacc ión se producen rápidamente, y los or ificios nasales y el ano

exudan una espuma sanguinolenta y la coagulación de la sangre es

rápida. La inc isión de las masas musculares afectadas revela un color rojo

oscuro a negro, hinchazón tisular con el desprendimiento de un olor

ranc io y un líquido sanguinolento claro que contiene burbujas de gas. Las

superficies rec ién cortadas a menudo están secas y pueden tener un br illo

metálico. Hay que examinar el corazón y todos los músculos esqueléticos,

inc luyendo los de la lengua, el diafragma y la región lumbar, pues la les ión

puede ser pequeña y pasar desaperc ibida durante un examen prec ipitado.

La cav idad torác ica y el saco per icárdico pueden contener una gran

cantidad de líquido sanguinolento con cantidades variables de fibrina.

Esta serositis a menudo se pasa por alto o se interpreta erróneamente

como un componente de la pleuroneumonía. Los pulmones normalmente

están congestionados y pueden presentar atelectas ia debida al

timpanismo abdominal (Rodostits , et al. 2002)

1.11 HISTOPATOLOGIA

Los casos de carbón sintomático se caracter izan por mionecros is, edema,

enfisema e infiltrac ión moderada de neutrófilos . Los microorganismos

pueden ser poco numerosos pero se pueden observar en cortes tisulares.

Es esenc ial que los tejidos se examinen tan pronto como sea pos ible

después de la muerte y que sean conservados en formol para su posterior estudio en el laboratorio.

1.12 DIAGNÓSTICO DE LABORATORIO

En los frotis de tejidos infectados se pueden identificar los bac ilos

grampositivos esporulados (Biberstein, 1994).

Las pérdidas económicas que producen estos microorganismos en los

animales y la falta de c lasificación para un diagnóstico seguro, ha hecho

necesario realizar estudios sobre cada uno de ellos a partir de pruebas

diversas (Caraballo, et al. 1980).

El diagnóstico presuntivo tanto de pierna negra como edema maligno se

hace por s ignos clínicos y patológicos , la confirmac ión de estas

enfermedades se hace rutinar iamente por la identificación de los

microorganismos, aislamiento microbiológico, métodos de caracter ización,

métodos inmunológicos como inmunofluorescencia e inmunoc itometr ía y

por reacc ión en cadena de la polimerasa (PCR) (kojima, et al, 2001) .

1.13 DIAGNÓSTICO DIFERENCIAL

Para definir un diagnóstico cuando se encuentran var ios animales

muertos en un grupo que no se ha observado constantemente y la

descomposic ión post-mortem es ta tan avanzada que se puede obtener

poca información, el médico veter inario depende de sus propios

conoc imientos acerca de la incidenc ia de las enfermedades locales , la

estación del año, la edad del grupo afectado y las condic iones del suelo y

el examen detenido del entorno en el que han permanec ido los animales

muertos.

Es preciso instaurar una vigilancia más cercana para poder examinar los

animales enfermos o realizar un estudio de los cadáveres rec ientes . El

edema maligno y los casos típicos de carbón sintomático en bóv idos se puede realizar un diagnóstico definitivo según los s ignos clínicos y los

hallazgos de necrops ia.

La identificac ión definitiva de C. chauvoei se realiza por la tinc ión de

anticuerpos monoclonales mediante la técnica de inmunoperox idasa y de

anticuerpos fluorescentes. El diagnóstico diferencial basado en las

observaciones macroscópicas post-mortem respecto a otras causas de

miositis por clostr idios es arriesgado y puede derivar en recomendaciones

inadecuadas de control (kojima, et al, 2001).

1.14 TRATAMIENTO Y PREVENCIÓN La literatura reporta tratamiento a base de penic ilinas a altas dos is pero

no registra gran efec tiv idad, el control se realiza por medio de vacunac ión

anual que proporciona protecc ión antitóxica y antibacteriana.

En el mercado colombiano ex isten diec iocho formulac iones diferentes de

vacunas (bacterinas, toxoides, mezcla de bacter inas y toxoides) para el

control de las Clostr idiosis y dos productos para la protección del ganado

contra el ántrax (APROVET, 2002).

La vacuna actualmente empleada para los bovinos es un cultivo de C.

chauvoei formolado y precipitado por alumbre y adyuvado en hidróx ido

de aluminio. En algunas regiones, donde frecuentemente se observan

infecc iones de las her idas causadas por C. septicum, se utiliza una

bacter ina- toxoide bivalente para protección contra ambas infecciones.

Tanto exper imentalmente como en la práctica se ha demostrado que los

agentes inmunizadores preparados para el uso en los vacunos son eficaces para los lanares y que, si bien exis te c ierta diferencia

inmunológica entre las cepas de fuentes ovinas y bov inas, no es

necesario preparar la vacuna con cepas ov inas .

Se recomienda la aplicación de la vacuna a animales entre 3 meses y 2

años; se debe acostumbrar la vacunación anual contra la enfermedad, de

tal manera que los animales rec iban por lo menos dos dos is en su vida.

Una vez se observa un brote, debe evitarse la mov ilizac ión de animales

hac ia otros potreros y el lote or iginal debe conservarse con los mismos

bov inos (enfermos y aparentemente sanos) (Car ta Fedegan Edic ión No.

75) .

1.15 INMUNOPEROXIDASA INDIRECTA

1.15.1 Historia

Una de las primeras técnicas desarrollada y usada fue la

inmunofluorecenc ia, pero esta técnica presentó complicaciones como su

alto costo de desarrollo y los anticuerpos fluorescentes usados no contrastaban con la colorac ión usada para la evaluación histológica.

Esto llevó a que no se podía realizar la evaluación de las lesiones

histológicas y la colorac ión inmunohistoquimica simultáneamente.

Esta serie de problemas llevo a los investigadores a desarrollar métodos

alternativos que permitieran la evaluación de los tejidos y la coloración de

los mismos simultáneamente para usarlos como herramienta práctica de

diagnóstico directo en la identificación de enfermedades en los animales.

Uno de los métodos desarrollado fue la marcac ión de anticuerpos usando

enz imas o sustratos que depos itaran cromógenos en los tejidos en los

sitios de unión antígeno-anticuerpo los cuales van a ser vis ibles al utilizar el

microscopio de luz y que van a produc ir una colorac ión permanente, en

contraste con la técnica de anticuerpo fluorescente; la enzima mas

comúnmente utilizada para esta técnica es la peroxidasa (Nakene, and

Pearse, 1967).

1.15.2 Bases inmunohistoquímicas

La base de la inmunohistoquímica (IHC) es principalmente la identificac ión

de antígenos, conformados ya sea por proteínas, carbohidratos, lípidos,

ácidos nucleicos o por otros compuestos; los cuales están presentes en tejidos generalmente fijados en formol los cuales serán identificados por

anticuerpos monoclonales o polic lonales altamente sensibles dando como

resultado una reacc ión de color en el tejido que nos indica la presencia de

agentes infecc iosos (Boenisch, 2001).

1.15.2.1 Anticuerpos

El reactivo común para todas las técnicas inmunohistoquímicas es el

anticuerpo, la habilidad antisuero, fracciones de inmunoglobulinas y

anticuerpos monoclonales que incrementan el uso c línico de los tejidos

antigénicos para ampliar la cantidad y calidad de los reportes

inmunohistológicos. Para la mejor comprensión de los métodos de cadenas

inmunohistoquímicas como de sus problemas, es necesario tener un

conocimiento básico de anticuerpos, sus potencias y limitaciones.

1.15.2.2 Inmunoglobulinas

Los anticuerpos pertenecen a un grupo de proteínas llamadas

inmunoglobulinas ( Ig). Enumeradas en orden decreciente por su cantidad

encontrada en el plasma y suero, las inmunoglobulinas comprenden 5

grandes c lases: inmunoglobulina G (IgG), IgA, IgM, IgD y IgE. Cada

inmunoglobulina esta compuesta por 2 cadenas pesadas idénticas (H) y 2

cadenas ligeras idénticas (L). Las cadenas H difieren en antígenos y

propiedades estruc turales que determinan la clase y subclase de la

molécula. Las 2 cadenas L son también de tipo Kappa o lambda. La

distr ibución de las cadenas kappa y lambda difieren en todas las clases de

Ig, también entre las diferentes especies . El enlace covalente entre cadenas es la unión disulfuro que une L-H o H-H.

Por participar en una estructura terc iar ia ellas confieren una gran

estabilidad a la molécula de Ig. De las 5 clases de Inmunoglobulinas IgG e

IgM son los anticuerpos mas usados en la inmunohistoquímica.

1.15.2.3 Inmunoglobulina G

Tiene una fórmula general de gamma2, kappa2, o gamma2, lambda2, la cual describe la molécula de IgG (MW = 150 kD). Está compuesta por 2

cadenas pesadas gamma, y 2 cadenas ligeras kappa o lambda.

La estructura de la molécula de Ig ha sido determinada, en parte por

digestión proteolítica y una reducción disociativa de la molécula.

Los resultados de la diges tión en espacio de su unión susceptible en la

terminal-N de la intercadena pesada en las uniones disulfuro.

Esta producción de 2 fragmentos monovalentes antígeno-unión (Fab) y un

fragmento cr istalino (Fc), las uniones de pepsina en las cadenas gamma en

el s itio terminal –C de la intercadena pesada en los puentes disulfuro;

resultando en un antígeno bivalente antígeno-fragmento unión F(ab)2. En

este caso el fragmento Fc es destruido. La reducción disociativa de una IgG

rompe el puente disulfuro, s i el grupo sulfhídrico es bloqueado el resultado

es la formación de 2 cadenas H (con un peso molecular de 50 kD cada

uno) y dos cadenas L (25 kD cada uno).

La IgG puede ser dividida y llamada dominio, por la variable dominante (V)

y el dominio constante (C). Cada dominio de 110-120 aminoác idos y una

unión disulfuro entre cadenas.

En el dominio var iable de la cadena ligera (VL) y el dominio var iable de la

cadena pesada (VH) son encerrados los aminoácidos terminales de la

molécula de inmunoglobulina. VL y VH juntos forman el sitio antígeno-unión. Muchas regiones interactivas HV son encerradas dentro de los dominios VL

y VH del anticuerpo (Boenisch, 1999) .

Durante es ta reacción con antigenos, las regiones HV del anticuerpo están

aproximadamente a 0,2-0,3 nm. En esta región estructuras especificas

únicas llamadas determinantes idiotipicos son encerradas. Cada clon de un

anticuerpo es nuestro idiotipo; cada cadena L también tiene un dominio

constante (CL) en adición con el dominio constante VL. La cadena H

también tiene 3 dominios constantes (CH1, CH 2 Y CH3) y lleva la porc ión

terminal carbox ilo de la inmunoglobulina. Encerrado en el dominio

constante CH2 esta el carbohidrato de la molécula de IgG y muchos

aminoácidos aromáticos neutros hidrófobos fuertes. Las regiones bisagra están encerradas entre los dominios CH1 y CH 2 de la cadena H. Menores

diferencias entre estas regiones bisagra contr ibuyen a la espec ificidad de

las subclases de la IgG.

Los mismos están designados por subtipos como IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3

e IgG4. En humanos se presenta una relación de kappa y lambda de 2:1,

en las subclases IgG2 e IgG4 una relación 1:1 y 8:1 respectivamente. Los

ratones tienen aprox imadamente un 95% de cadenas kappa y una mayoría

de anticuerpos monoclonales IgG. El número de enlaces disulfuro de las

cadenas pesadas también var ía por la cantidad de subclases de IgG. IgG1

e IgG4 cada una tiene 2, mientras que IgG2 e IgG3 tienen 4 o 5

respectivamente. A causa de la flexibilidad de la región bisagra el ángulo de

los fragmentos Fab var ia en dis tancia con los determinantes antigénicos

idénticos (Boenisch, 1999).

1.15.2.4 Inmunoglobulina M

Es un pentámero (MW aproximadamente 900 kD) compuesto de 5

unidades de aproximadamente 180 kD cada una. La formula general puede

ser expresada como (mu2 kappa2)5 o (mu2 lambda2)5. Cada subunidad esta

unida por un péptido-sulfhídr ico, la cadena J (15kD), y consiste en 2 cadenas pesadas (mu) y 2 cadenas ligeras de tipo kappa o lambda.

Las cadenas J contribuyen a la integridad y es tabilidad del pentámero;

como con IgG, las subunidades de IgM pueden ser fragmentadas por

cambios reductivos o enz imáticos en F(ab)2 porciones Fab y FC, como

también en cadenas pesadas y ligeras respectivamente. El fragmento FC de

la IgM es un pentámero cíclico (340 kD). El tratamiento con IgM con 0,1%

de mercaptoetanol con uniones de disulfuro entre sus subunidades de los 5

monómeros nos da subc lases de IgM1 e IgM2 las cuales han s ido

reportadas.

La inmunoglobulina M es el anticuerpo mas abundante en el huésped hiperinmunizado, en el animal recién inmunizado, la IgM es el primer

anticuerpo humoral detectado. La formación primaria de anticuerpos

procede en muchos de los es tados a la primera inyección o inoculac ión de

inmunógeno alto, el equilibr io entre los espacios extra e intravascular, luego

el catabolismo forma pequeños fragmentos y finalmente es eliminado del

espacio intravascular para la nueva formación de anticuerpos.

El per iodo desde la introducción del inmunógeno hasta la primera aparic ión

de anticuerpos humorales de IgM es llamado periodo latente y dura

aproximadamente 1 semana. Dentro de 2 semanas o en respuesta a una

segunda inyección o inoculac ión IgG usualmente predomina, como todas

las proteínas están sujetas al catabolismo los anticuerpos de tipo IgM

tienen una relativa vida media cor ta de solo 4-6 días; IgG sobrevive

aproximadamente de 3 semanas.

1.15.2.5 Anticuerpos policlonales

Los anticuerpos policlónales son producidos por muchas células, y en

consecuencia son diferentes inmunologicamente; ellos reacc ionan con

varios epitopes en el antígeno. El animal mas frecuentemente usado para

la producción de anticuerpos policlónales es el conejo, seguido por la cabra, cerdo, oveja, y caballo. La popularidad del conejo para estas

pruebas se basa en el fácil manejo; además los anticuerpos de conejo

prec ipitan las proteínas humanas.

Dependiendo de la inmunogenicidad del antígeno, dosis desde 10µg-200µg

son tradicionalmente administradas para generar una respuesta inmune en

los animales. El antígeno es inoculado de forma intradérmica o subcutánea;

pero la inoculac ión en músculo o en cavidad per itoneal son también

usados.

En conejos volúmenes de 0,1-0,5 ml son usualmente dados intradérmicos y

distr ibuidos en muchos sitios; el antígeno es suspendido en un volumen

igual de adyuvante. La prueba de booster se repite una vez al mes o cuando los títulos disminuyen. La sangre es tomada de la oreja del conejo,

de la vena yugular o del corazón cuando se sacrifica el animal. Después de

remover las células de la sangre, los anticuerpos policlónales pueden ser

obtenidos estabilizando el suero o en fracciones purificadas de

inmunoglobulinas. La precipitación por sales, seguido de una cromatografía

iónica s irven para remover el resto de otras proteínas ser icas. La afinidad

por la cromatografía puede ser usada para aislar el antígeno-especifico del

anticuerpo (Boenisch, 1999) .

1.15.2.6 Anticuerpos monoclonales

Los anticuerpos monoclonales son el producto un clon individual de células

plasmáticas. Probablemente por razones económicas el ratón es exclusivo

para la producción de anticuerpos monoc lonales.

Después que una respuesta inmune ha sido descrita, los linfocitos B del

bazo o nódulos linfoides son unidos con células de mieloma de ratón no

secretoras. Bajo condiciones especificas los linfocitos B se unen a células

hibridas o hibr idomas las cuales son inmortales en medios de cultivo. Las

células B no reactivas y las de mieloma son descargadas y la producc ión

de anticuerpos híbridos son cultivados y probados para reactivos. La producción puede sacarse del medio de cultivo o por trasplantación de

hibridomas dentro de la cavidad peritoneal de los ratones.

En la inmunohistoquímica hay c iertas ventajas en los anticuerpos

monoclonales sobre los policlonales; esto incluye alta homogenicidad,

ausenc ia de anticuerpos no especificos y fácil caracterización. Los métodos

para la selección de clones útiles y para el control de calidad deben

identificarse los métodos a usarse. También los anticuerpos monoclonales

son caracterizados usando tejidos congelados o tejidos fijados en formol;

para esto el epítope debe sobrevivir a la fijac ión, en algunos casos los

antigenos sobreviven a la fijac ión en formaldehído para el uso de

anticuerpos mono o policlónales. La reac tividad similar del epítope después de una optima fijac ión no asegura necesariamente que esta sobreviva,

luego un nuevo y mejorado antígeno comienza.

El epítope reportado también es único para dar un antígeno, la

especificidad, uno de los grandes beneficios de los anticuerpos

monoclonales, se pierde si el anticuerpo es dir igido contra un epítope por 2

o mas antígenos diferentes. Mientras la reac tividad cruzada de un

anticuerpo policlonal puede usualmente ser removido por absorc ión

(Boenisch, 1999).

1.15.2.7 Afinidad de anticuerpos

Anticuerpos de animales hiper inmunizados no solo difieren en el

reconocimiento de antígenos multivalentes, sino en las diferenc ias de sus

afinidades. El término afinidad ha sido usado para descr ibir ambos

“intr ínseco” y “funcional”.

La afinidad intr ínseca de un anticuerpo radica en la región HV y es

determinada por la misma secuencia de aminoácidos que determinan la

especificidad. Interacciones iónicas, hidrógeno y las fuerzas de Van Der

Walls son los mayores contribuyentes para la afinidad intrínseca entre el

paratope en el anticuerpo y el epítope en el antígeno. La hidr ifobilidad aparece al tener un efecto estable en la formación del

complejo inmune y puede contribuir a su prec ipitac ión. Los enlaces

covalentes entre al anticuerpo y el antígeno no ocurren, la asociac ión

constante (Ka) de la unión entre un anticuerpo y su antígeno determinante

es una medida de afinidad de anticuerpos.

Puede ir de 103 a 1010 litros/mol, lo cual es rec íproco de concentración en

moles por litro. La mayor afinidad de un anticuerpo, la menor concentrac ión

de un antígeno libre necesita de s itios de unión de un anticuerpo para

volverse saturado (equilibrio rico). Solo la cantidad (títulos) de un

anticuerpo se incrementa con el tiempo de la inmunización, eso es calidad

(afinidad); lo cual ha sido llamado afinidad de madurac ión. Las dos is bajas de inmunógeno incrementan la tasa de afinidad de maduración, pero

resulta en bajos títulos de anticuerpos y viceversa.

En inmunohistoquimica la afinidad funcional de un anticuerpo o un

antisuero puede ser definido como el tiempo requer ido para el equilibrio rico

con un tejido antígeno. Si las alícuotas iguales de 2 anticuerpos o

antisueros de idénticos títulos son incubados incrementando periodos de

tiempo con el antígeno en el tejido, el anticuerpo que da un efecto plateau

de máx ima intens idad de unión primero es la mayor afinidad funcional. El

término av idez ha s ido usado como s inónimo para describir la afinidad

funcional, pero también es usada para denotar la tensión entre las cadenas,

entre los anticuerpos y sus antigenos. Frecuentemente el término av idez

ha sido usado para describir la suma total de todas afinidades intr ínsecas

encontradas en una poblac ión de anticuerpos polic lonales .

Las reacciones antígeno-anticuerpo son reversibles, los complejos inmunes

simples formados en el tejido pueden disociarse durante los cic los de

lavado usados en la inmunohistoquimica. La facilidad y el grado de

disociación varia en anticuerpo-anticuerpo y las concentraciones bajas de

sal, as í como la temperatura también se pueden reduc ir lo que formaría el

complejo inmune. La alta afinidad de los anticuerpos tiene una ventaja

durante el lavado, la disociación puede ocurr ir en anticuerpos de baja afinidad como se menc ionó antes, una población de anticuerpos

policlonales contiene más o menos un espectro continuo de baja-alta

afinidad contra muchos epítopes, dadas por los antígenos. Además,

después de la incubación con los anticuerpos pr imar ios de este tipo, el

excesivo lavado es una apreciable causa de pérdida de coloración.

Por otro lado los anticuerpos monoclonales son de afinidad uniforme y si la

afinidad es baja, nos da la pérdida de cadenas por disoc iac ión de los

epitopes.

Estos anticuerpos monoclonales de alta afinidad pueden ser seleccionados

de ser posible; altas temperaturas y muy bajo pH pueden presentarse

durante el lavado de los tejidos. En el manejo de laboratorio de los anticuerpos se ha demostrado en inmunohistoquimica que el lavado con

sustancias buffer y una buena incubación es mas seguro y evita el

rompimiento de las uniones antígeno-anticuerpo mejorando la colorac ión

de la técnica. Generalmente la mayor afinidad de un anticuerpo, es la

tendencia a formar un prec ipitado. La precipitación procede a través de un

rápido estado el cual forma un complejo soluble antígeno-anticuerpo,

seguido de una lenta agregación y eventualmente prec ipitación. Los

anticuerpos no precipitados son generalmente de baja afinidad y son

incapaces de formar el cerco requerido para que ocurra una precipitación.

Los anticuerpos monoc lonales con respecto a la temperatura son de alta o

de baja afinidad, no pueden formar cerco con antígenos que solo rara vez

forman prec ipitados insolubles. Además en la inmunohistoquimica, la

capacidad de un anticuerpo pr imar io para formar un complejo inmune

prec ipitado es de menor importancia porque la reacc ión con el tejido

antígeno captura anticuerpos dentro del tejido.

1.15.2.8 Reactividad cruzada de anticuerpos

El término reactividad cruzada denota una actividad inmunohis toquimica

que ocurre entre un anticuerpo y 2 o mas antigenos o v iceversa, cuando un antígeno reacciona con muchos anticuerpos diferentes .

Ejemplos típicos son cuando anti-L(or-k) cadena de anticuerpos interactúan

con todas las 5 clases de Ig o cuando el antígeno carcinoembrionico (CEA)

reaccionan con anticuerpos contra CEA, grupos de antigenos sanguíneos y

proteínas de tejido normal respectivamente. El común denominador en

cada caso es la porc ión del menor epítope común entre muchos antígenos.

Otro uso válido del término reactividad cruzada denota cambios induc idos

experimental o accidentalmente en uno o muchos epítopes a través de un

antígeno; el término reactiv idad cruzada también describe la interacción de

un anticuerpo con un epítope similar o diferente.

Este fenómeno es frecuentemente una propiedad de anticuerpos de baja afinidad y están usualmente sujetos al cambio de maduración durante la

inmunizac ión. La reactiv idad cruzada de anticuerpos de antigenos

humanos con antigenos idénticos o similares de otras especies pueden ser

de interés al veter inario por la escasez de anticuerpos especificos

animales.

1.15.2.9 Tasa de reacción de anticuerpos

Generalmente la talla y la forma de una molécula de anticuerpos y estos

complejos o conjugaciones parecen ser de menor consecuencia

inmunohistoquimica. Insuficiente penetración de tejido, incluso en la

colorac ión intranuclear o antígeno citoplasmático, no han s ido observadas.

En cuanto a los anticuerpos primarios de c lase IgM (900 kD), complejos

largos como PAP (400-430 kD) o APAAPC (560 kD) o cadenas de

dextranos han s ido usadas. Es razonable asumir que la sobrefijacion de

tejidos puede mostrar una penetración más difícil para los anticuerpos y sus

complejos.

Bajo condiciones ideales , anticuerpos reaccionan con sus ligandos

(antígenos) muy rápidamente, en inmunohistoquimica las condic iones son

raramente ideales. Dependiendo del tejido de fijación, concentración de anticuerpos, temperatura ambiente y otras var iables. El tiempo de

incubación de anticuerpos pr imar ios es super ior a 48 horas para una

reactividad máxima.

El equilibrio entre el antígeno y los anticuerpos libres son raramente

reportados; por esto un per iodo largo de incubación mas una preparac ión

de anticuerpos diluidos son usados en los periodos cortos de incubación,

con mas preparación de anticuerpos concentrados es tablecen un equilibrio

mas rápido, enlaces no espec ificos resultan de estas condiciones, la

incubación de anticuerpos primarios ha s ido hecha exper imentalmente

después de su pr imera aspiración de una secc ión con algunos anticuerpos

(Boenisch, 2001).

1.15.2.10 Estabilidad de anticuerpos

Anticuerpos policlonales cuando se recolectan no congelados y se usan

subsecuentemente en inmunohistoquimica, son menos estables en su

porc ión de inmunoglobulina comparados con aquellos de antisuero

completo. Esta reducción de estabilidad depende del método de aplicac ión.

La expos ición de anticuerpos a pH extremos, al igual que a altas y bajas

concentraciones de sal durante la purificac ión tiende a disminuir su

estabilidad mas que si se expone a condiciones medias como intercambio

iónico por cromatografía.

La formac ión de agregados solubles y subsecuentemente polímeros

prec ipitados son el cambio más frecuentemente notado. Estos cambios son

probablemente el resultado de reacc iones hidrofóbicas entre moléculas de

IgG en la soluc ión. Mientras que la presenc ia de agregados solubles

pueden prec ipitar anticuerpos, su incremento hidrofóbico ha sido

demostrado como causa del incremento de los enlaces no especificos en

inmunohistoquimica. La remoción de estos agregados y polímeros de

fracciones de IgG es importante en la aplicación de inmunohistoquimica.

Solo con el almacenamiento de anticuerpos purificados puede subir la hidrofobia con la agregación y polimerización, también la conjugación de

otras moléculas. La conjugación con glutaraldehido envuelve los grupos

eps ilonamino de lisina y grupos alfa-amino del aminoácido terminal N

resultando una unión cruzada debido a que hay muchos s itios reactivos de

glutaraldehido en la molécula de IgG, la hidrofobia de los anticuerpos

conjugados se incrementa significativamente, resultando una atracc ión de

sitios hidrofóbicos en el tejido.

Anticuerpos monoclonales un 42% ha sido investigado por Underw ood y

Bean mostrando cambios en especificidad, afinidad y reactividad cruzada.

Anticuerpos de clase IgM y subc lase IgG2b fueron específicamente sensibles. La estabilidad de anticuerpos en los productos comerciales esta

determinada en tiempo real, temperatura real; hechos por cada casa

comercial. Aunque dicho tiempo real debe ser ajustado a determinados

tipos de anticuerpos y necesitan un tiempo real diferente para reaccionar y

no perder su actividad (Boenisch, 2001).

1.15.2.11 Manejo de anticuerpos

Es imperativo observar c ier tas reglas bás icas del manejo y

almacenamiento. Las recomendaciones van dadas por el fabricante en

volantes especiales para ser seguidas por el usuar io.

Recepción muchos comerc iales de inmunoquimicos garantizan la

estabilidad por muchos años. Anticuerpos prediluidos tienen una vida

media corta; los inmunoquimicos pueden ser almacenados de acuerdo a

las recomendaciones de la manufactura y deben incorporarse datos útiles

para el uso y pos ibles reclamos como la fecha de expiración y la fecha de

preparación.

Almacenaje hay 2 cons ideraciones importantes para el almacenaje, tales

como los recipientes y la temperatura. Containers de almacenaje; se prefieren mater iales de almacenaje de

soluciones proteicas que no tengan absorción proteica como polipropileno,

policarbonato o borosilicato son los vidrios recomendados. Soluciones que

contengan bajas concentraciones de proteínas (menos de 10-100µg/ml),

generalmente 0,1% a 1.0% de albúmina sér ica bov ina es usada para

reducir la polimer izac ión y absorción dentro del container.

Temperatura de almacenaje monitoreo en refrigeradores y congeladores se

usan en el almacenaje de inmunoquimicos con alarma de temperatura y

sistemas de emergencia de temperatura. Las casas comerciales presentan paquetes de anticuerpos “listos para

usar” sus conjugados y anticuerpos monoclonales en soluciones de 2-8°C

por que al congelarlos no garantizan su efecto y acción.

Uso y cuidado de esto depende la probabilidad de contaminación, calor o

excesivo exposición a la luz. La contaminación puede ev itarse con el uso

de pipetas y kits limpios (Boenisch, 2001).

1.15.2.12 Inmunohistoquimica

El protocolo estandarizado comprende, la recolección de las muestras lo

cual es muy importante en los resultados que vamos a obtener en la

inmunohistoquimica, los tejidos van fijados en formol, la cantidad de formol

usado en el trabajo es formol bufferado neutro al 10%, en el tejido va de

10:1. El tiempo entre la muerte del animal y la recolección de la muestra

debe ser lo mas corto pos ible, es te tiempo no debe sobrepasar las cuatro

horas post mortem ya que la descompos ición que empieza a sufrir el tejido

nos puede causar falsos positivos o falsos negativos .

Exis ten otros factores que influyen en la calidad de las muestras como el

tipo de tejido y tejidos ricos en enzimas como el intestino y el páncreas, los

cuales se autolisan muy rápido; también el tipo de antígeno (los protozoos y hongos son mas res istentes a autolisarse que los virus) , y la distribuc ión del

antígeno. Desafortunadamente, los antígenos no se encuentran distribuidos

siempre por todo el órgano o la les ión, para propósitos eficientes y

prácticos, se deben colocar las muestras rápidamente en el formol y tomar

tanto de la parte afectada como de la parte sana del tejido. Los frascos

usados para la recolección del tejido deben estar estériles y debidamente

rotulados con la mayor informac ión posible acerca del animal y de la

explotación (Ramos, et al. 1997).

La fijación de los tejidos en formol preserva la antigenicidad de las

proteínas y la morfología del tejido, pero el tiempo de fijación debe ser

limitado y no sobrepasar de 2 días, ya que las proteínas de unión cruzada del formol pueden causar falsos negativos aun en presenc ia de grandes

cantidades de antígeno. Pero si no es posible reducir el tiempo de fijac ión

en los tejidos, los laboratorios usan varias técnicas para desenmascarar los

antigenos y recuperar la expresión antigénica como las enz imas o el calor

(Haines, and Chelack, 1991) .

1.15.2.13 Técnicas inmunohistoquímicas Las técnicas en inmunohostoquímica se desarrollan para desenmascarar

los antigenos que están en los tejidos fijados en formol para ser

reconocidos por el antisuero, esto con el fin de reducir las reacciones no

especificas o (background) antes de comenzar la reacc ión

inmunohistoquimica, para evitar esto se han desarrollado varias técnicas a

nivel de laborator io y así recuperar antigenos, estas técnicas o s istemas

son:

• Detergentes (Saponinas, tw een 20 y nonidet p40) y sustancias

caotrópicas (guanidina y tiocianato de sodio).

• Digestión enzimática (Trips ina, proteinasa K y pronasa E). cuando

se usan es tos métodos es necesario utilizar agentes que

bloqueadores de la actividad enzimática endógena como peroxidasa, fosfatasa alcalina, etc .

• Recuperación inducida por el calor, esta técnica provee la energía

necesaria para romper las uniones del antígeno con los hidrox ilos

formadas al estar los tejidos fijados en formol, liberando algunos

antigenos; además rompe las uniones del tejido con los iones de

calcio que se encargan de unir mas al fijador. El calor da mayor

sensibilidad a algunos métodos, lo cual nos permite una mayor y

mejor dilución del anticuerpo.

1.15.2.14 Marcadores visuales

La visualizac ión del sitio de reacción del antígeno-anticuerpo depende de un s istema de generación de marcadores visuales el cual es conjugado con

el anticuerpo u otras moléculas como la avidita. Exis ten tres tipos de

sistemas de marcadores visuales :

• Metales , oro coloidal. La reacción antígeno-anticuerpo es detectada

por un indicador que contiene un agente reductor (la hidroquinona) y

una soluc ión de plata (acetato de plata). La sensibilidad de este método es similar o mayor a las enzimas o métodos enzimáticos .

• Enz imas como la peroxidasa de rábano es la más común, fosfatasa

alcalina, glucosa ox idada y la beta galac tos idasa. Con sus sustratos

histoquímicos espec ificos y su variedad para capturar cromógenos,

los marcadores enzimáticos pueden produc ir diferentes colores,

usualmente café cuando se utiliza diaminobenz idina, y azul cuando

se utiliza fosfatasa alcalina, o rojo que son visibles en el microscopio

de luz.

• Fluorocromos que son visualizados por excitación de la luz de una

longitud de onda apropiada como el isotioc inato de fluoroseina,

rodamina y rojo Texas. Estos elementos son muy usados en tejidos

que están congelados (Beesley, 1993).

1.15.2.15 Métodos inmunohistoquímicos

Exis ten var ios métodos inmunohistoquímicos desarrollados para

incrementar la sensibilidad de las reacciones, dependientes de si la enzima

(peroxidasa) se conjuga con anticuerpos (técnica directa e indirec ta), o si

no se conjuga (método del puente enzimático y de peroxidasa-

antiperoxidasa) (Rose, and Fiedman, 1994) .

• Método directo es el mas simple y consta de un solo paso, donde

un anticuerpo primar io marcado se une con el antígeno por el

fragmento var iable; este es un método rápido de diagnóstico para el

examen de secciones de tejidos congelados y cortados con un

micrótomo de congelac ión y marcados con inmunofluorescencia.

• Método indirecto que se basa en la adic ión de un segundo

anticuerpo marcado que se une directamente al anticuerpo primario

que es especifico contra el antígeno que se va a detec tar. El

fragmento variable del segundo anticuerpo se une al anticuerpo primar io por su fragmento constante. Este método es más sensible

que el directo, pero es mucho más labor ioso (Fig. 9).

• Método puente enzimático donde incluyen los métodos peroxidasa-

antiperoxidasa (PAP) y el complejo adivina – biotina (ABC), son las

mas utilizadas en los laboratorios para los tejidos fijados en formol

(Ramos, et al. 1997).

Figura 9. Inmunoperoxidasa indirecta.

Fuente. Programa nacional de investigac ión en salud animal PNISA.

2. M ATERIA LES Y M ETODOS

2. 1 Anim ales

Los cobayos (Cavia porcellus) son el modelo biológico más utilizado en el

mundo para trabajar con microorganismos anaerobios específicamente

del género Clostridium Spp. El cr iterio de selecc ión de los animales fue

definido como animales de buena condic ión corporal, adultos que no presentaran cuadros febriles o alteraciones c línico patológicas. Se

selecc ionaron 24 cobayos, los cuales se distribuyeron al azar en seis

grupos de tres animales ( inoculados todos con la cepa de Clostri dium

chauvoei 4408, cepa suministrada por el laborator io VECOL S. A) y tres

grupos de dos animales (se inocularon 2 cobayos con Clostri dium

septicum, 2 con Clostridium novyi y 2 con Clostri dium Sordelli). Utilizando

los mismos cr iter ios de inoculac ión que se descr iben a continuación, la

diferencia radico en que se sacr ificaron a las 18 horas post inoculac ión.

Los animales se inocularon v ía intramuscular con 0,5 mililitros de una

solución de cloruro de calcio (CaCl2) al 5% conteniendo 100 dosis

infectantes de Clostridium chauvoei; se sacrificaron cada tres horas. En

cada grupo se dejó un animal como testigo el cual fue inoculado con

CaCl2. La eutanasia de los animales se realizó de acuerdo a los

protocolos de bioética vigentes en la legis lac ión colombiana, utilizando

anestésicos volátiles para evitar el dolor. Una vez se sacr ificaron los

animales se les realizó la necrops ia y se tomaron tejidos de los diferentes

órganos los cuales se fijaron en solución de formaldehído tamponado al

3.7% para histopatología y fueron procesados en el laborator io del Centro

de Investigación en Salud Animal, CEISA, en la ciudad de Bogotá.

2.2 Materiales Los reactivos usados en la estandarización de la técnica de

inmunoperox idasa fueron:

Re activos

• Agua destilada

• Agua ultrapura

• Xilol

• Alcoholes (etanol absoluto, etanol 90% y etanol 80%)

• Peróx ido de hidrógeno al 3%

• PBS

• Suero fetal bovino al 5%

• Anticuerpo monoclonal primar io Cchex1

• Anticuerpo secundar io (conjugado anti IgG ratón-perox idasa)

• Kit DAB-s igmaÒ

• Hematoxilina de Harris

Vidrieria • Beakers

• Erlenmeyer

• Probetas 50, 100, 1000ml

• Laminillas cubreobjetos

• Láminas portaobjetos

• Pipetas 1, 2, 5,10, 25ml

• Pipetas pasteur

Materiales varios

• Agitadores

• Algodón

• Falcón 50

• Tubos

• Ependorf

• Guantes

• Papel aluminio

• Papel filtro

• Pinzas

• Tijeras

• Toallas absorbentes

• Gradillas

Equipos

• Agitador automático

• Balanza analítica

• Cámara de flujo laminar

• Congeladores

• Incubadora

• Microscopio

• Nevera

• Pipeteador

• Potenc iómetro

• Vortex

2.3 Protocolo técnica de inmunoperoxidasa

Descr ipción de la técnica de inmunoperoxidasa indirecta:

Técnica

1. Corte de los bloques de tejidos embebidos en parafina 3-4 micras.

2. Desparafinación de las láminas a 60°C por 1 hora.

3. Aclaramiento de tejidos en xilol puro 2 veces a temperatura ambiente

por 25 minutos.

4. Hidratación de los tejidos introduciéndolos etanol absoluto por 10

minutos, etanol al 90% por 5 minutos y etanol al 80% por 5 minutos. Esta

par te se finaliza con 3 lavados en agua destilada 5 minutos cada uno a

temperatura ambiente.

5. Cubr imiento de las laminas con peróx ido de hidrógeno H2O2 al 3% en

metanol absoluto durante 10 minutos a temperatura ambiente.

6. Lavado de las laminas 3 veces con PBS a temperatura ambiente 3

minutos cada uno.

7. Bloqueo con SFB al 5% en PBS por 45 minutos a 37°C en cámara

húmeda.

8. Lavado con PBS 3 veces a temperatura ambiente por 3 minutos cada

uno y adición del anticuerpo monoclonal pr imar io Cchex1 (0.25mg/ml) en

PBS a 37°C por 2 horas en cámara húmeda.

9. Lavado nuevamente con PBS 3 veces a temperatura ambiente 3

minutos cada lavado.

10. Adic ión del anticuerpo secundario (conjugado anti IgG ratón-

peroxidasa) en diluc ión de 1:2500 en PBS a 37°C durante 1 hora.

11. Lavado con PBS 3 veces a temperatura ambiente durante 3 minutos

y aplicación de la solución de revelado kit DAB-sigmaÒ por 20 minutos

en cámara humada.

12. Coloración con Hematoxilina de Harr is durante 5 minutos.

13. Lavado con H2O destilada y finalmente montaje de la lámina cubreobjeto.

14. Lectura de las láminas en microscopio óptico binocular con objetivos

de 10X, 40X y 100X.

Las les iones de los diferentes tejidos fueron calificadas utilizando una

escala subjetiva del grado de la lesión, dependiendo de la sever idad de la

misma. La escala inc luyo:

A) valor 0; sin cambios patológicos aparentes, el tejido es normal.

B) valor 1; lesiones leves: lesiones ligeras que incluyen cambios

congestivos, hemorrágicos, depleción linfoidea, edema ligero.

C) valor 2; lesiones moderadas, inc luyen cambios congestivos,

hemorrágicos, depleción linfoidea, edema moderado, infiltrados

inflamatorios.

D) valor 3; lesiones severas: inc luyen daños tisulares como necrosis de

coagulación, infiltrado inflamator io polimorfonuclear y mononuclear, zonas

de hemorragia y congestión con edema abundante.

Los grupos control, inyectados solamente con cloruro de calcio

presentaron un ligero edema, el cual se evidenc ió por la separac ión de las

fibras musculares, las lesiones se valoraron entre 0 y 1.

Los resultados de la evaluación subjetiva de las les iones de los grupos de

cobayos inoculados con cepa patógena de Clostridium chauvoei y

teniendo en cuenta la escala de los ítems anter iormente descr itos y

observados durante los per íodos de tiempo de 3 a 18 horas se

encuentran en la (tabla 4 en los resultados).

3. RESULTADOS

Los resultados obtenidos en la investigac ión se div idieron en varios pasos

para definir lesiones en los cobayos y a su vez el resultado de la prueba

inmunoperox idasa. El examen macroscópico de las lesiones en los

cobayos se realizó durante la necropsia y se hizo el estudio

his topatologíco de los tejidos afectados.

3.1 Observa ción macroscópica de lesi ones

Los cobayos fueron inoculados con la cepa patógena e inmediatamente

sometidos a observación continua en la que se pudo determinar que la

zona del inóculo a partir de seis horas comenzó a presentar tumefacción y

calor la cual fue progres iva hacia la parte superior de la pierna, les ión que

no se presentó en los animales tes tigos.

Después de 9 horas se incrementó la tumefacción del miembro posterior

con crepitac ión a la palpac ión e hinchazón moderada, lo que produjo en

los animales una cojera inicial y a las 15 horas se observo postración por

la severidad de las les iones; uno de los animales inoculados murió entre las 15 y 18 horas con lesiones mas severas en el músculo afectado y en

la región inguinal.

Los hallazgos en la necropsia permitieron observar que en las pr imeras

horas se presentaron cambios discretos como son ligero edema en la

zona de inoculación; en los animales sacrificados a las 6 horas post

inoculación es ta lesión comenzó a ser mas notor ia, con presencia de

áreas oscuras (rojo-negruzco) y de un líquido serosanguinolento que paso

de ligero a severo después de las 15 horas y continuó hasta las 18 horas

post-inoculación, presentándose en estos últimos casos un aspecto

mucoide, que se distribuyó por todo el miembro y el tejido subcutáneo del

abdomen en su región inguinal.

En general, se observó congestión ligera desde las 3 horas de inoculac ión

en órganos como pulmón, cerebro, bazo, hígado y r iñón, pasando a

moderado después de las 6 horas y severa a partir de las 15 horas,

cuando el animal presentaba las lesiones vasculares mas severas.

La crepitación y la presencia de gas fueron notorias a partir de las 12

horas en todos los animales inoculados. Las les iones principales en los

animales de 18 horas fueron tumefacciones crepitantes en la musculatura

estr iada esquelética, tejidos de color rojo a marrón oscuro con estr ías

negras; algunas áreas aparec ían húmedas y desprendían exudado oscuro

mezclado con gases que le daban un par ticular olor dulzón (Fig. 10).

Figura 10. Les iones en cobayo Cavia Porcellus a las 18 horas de

inoculados con Clostri dium chauvoei. A. Tumef acciones crepitantes en

musculatura estr iada esquelética, tejidos de color rojo a marrón oscuro

con es trías negras. B. tumefacciones en mayor tamaño.

A B

3.2 Hi stopatología

Tabla 4. Resultados es tadís ticos de la calificación de lesiones

his topatológicas en tejidos de cobayo Cavia porcellus inoculados con

cepa patógena de Clostridium chauvoei.

Inoc ulación Horas

sacrificio

Bazo MEC MEE Duodeno Hígado Páncreas Pulmón Riñón cerebro adrenal

01/01/04 3 1 0 1ab 0 0 0 2 1 1 0

01/02/04 3 1 0 1ab 0 0 0 2 0 0 0

01/03/04c 3 1 0 1a 0 0 0 1 0 0 0

02/01/04 6 1 1 1abc 2 1 0 2 2 2 0

02/02/04 6 0 1 2abc 2 1 0 1 1 1 0

02/03/04c 6 1 1 1a 0 2 0 1 1 1 0

03/01/04 9 3 1 2abc 2 2 0 3 1 1 0 03/02/04 9 1 1 2abc 0 1 0 2 1 1 0

03/03/04c 9 1 2 1a 1 1 0 1 2 0 0

04/01/04 12 1 1 2bc 1 1 0 3 1 1 0

04/02/04 12 0 1 3bc 1 2 0 2 3 1 0

04/03/04c 12 1 1 1a 1 1 0 3 0 1 0 05/01/04 15 1 2 2abc 1 2 0 2 2 1 0

05/02/04 15 1 1 2abc 1 1 0 2 1 1 2

05/03/04c 15 1 0 0a 1 1 0 2 1 1 0

06/01/04 18 2 2 3c 2 1 0 2 2 1 0

06/02/04 18 2 2 3c 1 1 0 2 1 1 0 06/03/04c 18 1 0 1a 0 1 0 1 1 1 0

06/04/04 18 1 1 3c 2 2 0 2 1 2 0

07/01/04 18 2 3 3c 1 2 1 2 2 2 0

Ρ 0,0806 0,1249 0,0001 0,0821 0,0806 0,2429 0,8513 0,2342 0,0632 2,2429

MEC: músculo estr iado cardiaco; MEE: músculo estr iado esquelético.

C= grupos control inoculados con cloruro de calcio. Ρ= nivel s ignificanc ia.

En la tabla 4 se muestra que las les iones mas importantes ocurrieron en

el músculo estr iado esquelético (MEE), única variable que resulto

significativa (ρ= 0,0001) demostrando que hay diferenc ia marcada entre

los grupos experimentales.

Los cobayos después de 3 a 15 horas de la inoculación con C. chauvoei y

luego sacr ificados mostraron lesiones leves a moderadas como s igue: a

par tir de las 3 horas se encontró una ligera necrosis coagulativa e infiltrado de neutrófilos polimorfonuc leares y ligero edema; después de las

6 horas se hizo notor ia la congestión con hemorragias ligeras y se

presentó una var iación moderada; a las 9 y 12 horas se observó necrosis

de coagulac ión. La necros is y el infiltrado polimorfonuclear fueron más

severos a las 18 horas , al igual que la presencia de formas bacilares en

cantidades abundantes. El grupo que demostró los cambios mas severos

fue el grupo experimental de 18 horas de inoculados y no fue necesario

sacrificar algunos cobayos, sino que mur ieron por s i solos.

Las les iones pr incipales fueron gangrena gaseosa con marcada necrosis

de coagulación y de licuefacc ión con olor fétido. Se encontró una marcada

infiltrac ión polimorfonuc lear de tipo neutrófilo (fig. 11B).

En órganos como el bazo se observó depleción linfoide desde las 3

primeras horas de inoculac ión en todos los cobayos, al igual que

congestión desde las 9 horas s in tener una tendenc ia específica; sin

embargo en el cobayo que mur ió repentinamente, presento severa

congestión y hemorragias.

Se observaron cambios vasculares como congestión en: pulmón, hígado,

músculo estriado, músculo cardiaco y riñón (corteza y médula), desde las

3 horas de inoculac ión con C. chauvoei. En el cobayo que mur ió entre las

15 y 18 horas se observó hemorragia muy severa.

Figura 11. Músculo estriado esquelético de cobayo Cavia porcellus

inoculado con Clostridium chauvoei a las 18 horas. Se observa infiltrac ión

polimorfonuclear y necrosis de coagulac ión. A. 100X y B. 400X.

A B

3.3 Observa ción con la prueba de inmunoperoxida sa indirecta

Los resultados con la prueba de inmunohis toquimica indicaron la afinidad

que tiene el Clostridium chauvoei por el músculo estr iado esquelético, ya

que se observó la presenc ia solo en este tipo de tejido. En tejidos de:

bazo, duodeno, hígado, páncreas, pulmón, músculo estr iado cardiaco,

riñón, cerebro y adrenales, con esta prueba no se observo C. chauvoei

(Fig. 12).

Figura 12. Músculo estriado esquelético de cobayo Cavia porcellus . A

Colorac ión de hematox ilina y eos ina; se observa la presenc ia de bac ilos

en el endomis io (400x). B Coloración con la técnica de inmunoperoxidasa;

demostrando la pos itiv idad al detectar los bacilos de Clostri dium chauvoei

(1000x).

A B

Figura 13. Observac ión de las placas de tejido muscular esquelético de

cobayo Cavia porcellus inoculados con cepa patógena de Clostri dium

chauvoei a las diferentes horas de sacrificio.

A y B 3 horas de sacrificio; no se observan cambios en el tejido muscular;

C y D 6 horas ligero edema y necrosis coagulativa e infiltrado de

neutrofilos polimorfonuc leares; E y F 9 y 12 horas presencia de bacilos e

infiltrac ión polimorfonuc lear.

A B

C D

E F

G y H 15 horas necros is de coagulac ión y bacilos; I, J, K, L, 18 horas se

observa infiltración polimorfonuclear, necros is de coagulac ión y la

presencia de bac ilos .

G H

I J

K L

Figura 14. Coloración con la técnica de inmunoperoxidasa en Músculo

estr iado esquelético de cobayo (Cavia porcellus) demostrando la

pos itiv idad de la prueba al detectar los bacilos de Clostridium chauvoei

con el anticuerpo Monoc lonal Cchex 1 (A) y con el anticuerpo Policlonal

anti extracto (control positivo) (B) y la negativ idad del anticuerpo

Monoc lonal contra Leptospira (control negativo) (C) y el Control del

conjugado (D) .

Figura 15. Tejidos de los cobayos (Cavia porcellus) inoculados con cepas

de Clostridium Novyi, Septicum y Sordelli; observados con la tinc ión de

hematoxilina eos ina; se observa la necrosis en los tejidos, edema e

infiltrac ión polimorfonuclear, pero no se observa la presencia de bac ilos

de Clostridium chauvoei; con la inmunoperoxidasa indirec ta se demuestra

la positividad y especific idad de la prueba inmunohistoquimica al detectar

los bac ilos de C. chauvoei.

Hematox ilina eos ina

C. septicum C. novyi

C. sordelli

Figura 16. La prueba de inmunoperoxidasa indirecta demuestra la

presencia de bacilos en el tejido muscular esquelético de cobayo;

demostrando la especificidad del anticuerpo monoclonal el cual identifica

solo el C. chauvoei.

Inmunoperox idasa indirecta

C. septicum C. sordelli

C. novyi C. chauvoei

4. DISCUSIÓN

El diagnóstico de carbón s intomático se confirma en este trabajo con la

técnica de inmunohistoquimica estandar izada, dado que se trabajó con

los anticuerpos especificos para garantizar la determinac ión de Clostri dium chauvoei; estos resultados están de acuerdo con Jones and

Hunt (1990); sin embargo, es necesar io plantear otro trabajo para

determinar la presencia de la bac ter ia en bovinos.

Los cambios patológicos mas importantes se observaron en músculo

estr iado esquelético, y se encontraron alterac iones par tir de las 3 horas

post inoculación que incluyen desde ligero edema hasta la gangrena

gaseosa severa que se produce después de las 15 horas , por la acc ión de

las tox inas alfa y gamma, necrotizante e hidrolizante respectivamente que

destruyen la matr iz del tejido conectivo, resultados que concuerdan con lo

encontrado por Hathew ay (1990) y Titball et al. (2003) .

Esto indica que el tejido muscular es triado esquelético resulta ser el

adecuado para el diagnóstico de carbón sintomático, es te resultado

concuerda con Ass is et al (2005) quienes además lo recomiendan para el

diagnóstico del edema maligno; estos mismos autores que realizaron

trabajos con cobayos sugieren que posiblemente para otras especies

como bov inos, ovinos y capr inos se pudieran utilizar otros tejidos como

riñón e hígado. La fijación del tejido en formaldehído permitió su uso

poster ior a la toma de la muestra, sin presentar cambios que alteren el

diagnóstico; lo que le permitir ía al ganadero tomar muestras en los

animales muertos para su análisis posterior en los laborator ios, utilizando

la técnica de inclusión en parafina y la técnica de inmunoperoxidasa

indirec ta tal como lo indica Haines and Chelack (1991), de la misma

manera permitirá desarrollar investigac iones que ayudar ían a realizar

estudios de prevalenc ia de esta enfermedad en regiones de Colombia

donde no existen laborator ios .

De acuerdo con los resultados obtenidos, la técnica de hematoxilina y

eos ina permite observar lesiones anatomopatológicas generales que nos

hacen pensar en una c los tridios is, pero no permiten confirmar el tipo de Clostr idium involucrado tal como lo indicaron Ortiz y Benavides (2002).

La técnica de inmunoperoxidasa indirec ta es tandar izada en este trabajo

permitió no solo dar c laridad de las les iones anatomopatológicas

producidas por C. chauvoei, sino que es una técnica confirmator ia que

identifica específicamente la bacteria por medio de un anticuerpo

monoc lonal de acuerdo con Haines and Clarck (1991) . El uso de este

anticuerpo monoclonal permitió realizar la técnica con per iodos de

incubac ión relativamente cortos (1 hora), lo que permitió que se

presentara muy baja colorac ión de fondo (Background), así mismo el

utilizar un anticuerpo monoclonal como anticuerpo primario le da la

espec ificidad a la prueba ya que solamente fue positiva para C. chauvoei

y no presentó reacc iones cruzadas con otros c lostridium.

El desarrollo de esta técnica utilizando el anticuerpo monoclonal

específico es un buen comienzo para una ser ie de trabajos de

investigac ión en el área de las clostridios is que nos permitirá tener una

idea de la situac ión de estas enfermedades en nuestro país, para toma de

dec isiones que ayuden al control de las mismas.

5. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES

Este trabajo permite concluir que la técnica de inmunoperox idasa indirecta

es la ideal para el diagnóstico del C. chauvoei debido a que se demostró

su alta sensibilidad, confiabilidad y rapidez; es recomendable para futuras

investigac iones y para su utilización con tejidos de bov inos infectados.

Los cambios patológicos mas importantes se observaron en músculo

estr iado esquelético, y se encontraron alteraciones a partir de las 3 horas

post inoculación que incluyen desde ligero edema hasta gangrena

gaseosa severa que se produce después de las 15 horas , por la acc ión de

las tox inas alfa y gamma, necrotizante e hidrolizante respectivamente que

destruyen la matriz del tejido conectivo.

Esta técnica de inmunoperoxidasa indirecta además de ser confiable, es

rápida y no es costosa, a diferenc ia de otras técnicas para el diagnóstico

de C. chauvoei como la inmunofluorescenc ia directa y PCR.

La utilizac ión de tejidos fijados en formol bufferado al 10%, es una buena

opc ión ya que se pueden env iar muestras desde áreas remotas del país y

también estas muestras pueden ser almacenadas por el tiempo necesario

sin alterar los resultados de la técnica.

De acuerdo con los resultados obtenidos, la técnica de hematoxilina y

eos ina permite observar lesiones anatomopatológicas generales que nos

hacen pensar en una c los tridios is, pero no permiten confirmar el tipo de

Clostr idium involucrado; La técnica de inmunoperoxidasa indirecta

estandarizada en es te trabajo permitió no solo dar clar idad de las lesiones

anatomopatológicas produc idas por C. chauvoei, sino que es una técnica

confirmatoria que identifica específicamente la bacter ia por medio de un

anticuerpo monoc lonal.

Este trabajo es importante como soporte para nuevos es tudios en el área de bacter ias anaerobias en Colombia.

BIBLIOGRAFIA

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ANEXO No. 1

PREPARACIÓN DE SOLUCIONES

BUFFER FOSFATO SALINO (PBS) 0,01 M pH 7,2

• Disolver una pastilla de PBS ICN (CAT 2810305) en 100 ml de

agua destilada

• 2 gotas NaoH 1 normal x cada 100ml.

• Ajus tar el pH a 7,2

• Completar a volumen final de 100 ml

PEROXIDO DE HIDROGENO AL 3% • 3 ml de H2O2 30% + 27 ml metanol

SUERO FETAL BOVINO

• 47.5 ml H2O ultrapura + 0.05 gr albúmina sér ica bovina + 2.5 ml

suero fetal bovino.