1

UNIVERSIDAD NACIONAL FEDERICO VILLARREAL

FACULTAD DE CIENCIAS NATURALES Y MATEMÁTICA

ESCUELA PROFESIONAL DE BIOLOGÍA

Informe de Prácticas Pre Profesionales I

ESTANDARIZACIÓN DE LA TÉCNICA DE ENSAYO COMETA

EMPLEANDO GENOTOXICIDAD DE CICLOFOSFAMIDA EN

ERITROCITOS DE SANGRE PERIFÉRICA DE TILAPIA,

Oreochromis sp. EN CONDICIONES DE LABORATORIO

ALUMNA: Marlene Gabriela Espinoza Goyas

TUTORA INTERNA: Blga. Gloria María Sáez Flores

TUTOR EXTERNO: Mg. Carlos Scotto Espinoza

LUGAR DE PRÁCTICAS: Laboratorio de Mejora Genética y Reproducción

Animal

Lima – Perú

2013

2

ESTANDARIZACIÓN DE LA TÉCNICA DE ENSAYO COMETA EMPLEANDO

GENOTOXICIDAD DE CICLOFOSFAMIDA EN ERITROCITOS DE SANGRE

PERIFÉRICA DE TILAPIA, Oreochromis sp. EN CONDICIONES DE

LABORATORIO

STANDARDIZED TEST TECHNIQUE USING COMET CYCLOPHOSPHAMIDE

GENOTOXICITY OF PERIPHERAL BLOOD ERYTHROCYTE TILAPIA,

Oreochromis sp UNDER LABORATORY CONDITIONS

RESUMEN

El ensayo de cometa, o electroforesis en gel de una sola célula, es un método

genotoxicológico sensible para la evaluación de daños en el ADN en las células

individuales, lo que permite la cuantificación de las roturas del ADN y sitios

lábiles alcalinos. Actualmente, varios grupos de investigación internacionales

han publicado recomendaciones que describen los protocolos y criterios para el

ensayo cometa, cuyo objetivo es establecer altos estándares para obtener

datos válidos, reproducibles y precisos. En el presente estudio, se tuvo como

objetivo estandarizar el ensayo cometa en condiciones de laboratorio con

ciclofosfamida a diferentes concentraciones y periodos de exposición en

eritrocitos de Oreochromis sp., con el fin de ajustar el método con materiales y

equipos con los que se cuentan en el laboratorio de Mejora genética y

reproducción animal. Para la tinción se utilizó una solución de 0.25 % de Nitrato

de plata, 40 µL/100mL de formaldehído al 37% y agua destilada. Se observó

que el uso de las sustancias utilizadas en la metodología fue óptimo para el

desarrollo de la técnica. Se logró observar cometas, éstos, fueron clasificados

visualmente empleando una escala arbitraria de cinco categorías según la

formación de ADN en la cola, asignando a cada cometa un valor.

Palabras clave: Ensayo cometa, estandarización, Oreochromis sp., tilapia,

ciclofosfamida.

3

ABSTRACT

The test of comet, or gel electrophoresis of a single cell, is a sensitive

genotoxicologico method for the assessment of DNA damage in individual cells,

which allows the quantification of DNA breaks in the labile alkali and sites.

Currently, several international research groups have published recommendations

describing the protocols and criteria for the comet assay, which aims to set high

standards for valid, reproducible and accurate. In the present study, we aimed to

standardize the comet assay laboratory conditions with cyclophosphamide at

different concentrations and exposure periods in erythrocytes of Oreochromis sp.,

In order to adjust the method and equipment with materials that are counted in

breeding laboratory and animal reproduction. For staining, a solution of 0.25%

silver nitrate, 40 μL/100mL of 37% formaldehyde and distilled water. Observed that

the use of the substances used in the methodology was optimal for the

development of the technique. It was possible to observe comets; they were

classified visually using an arbitrary scale of five categories according to the

formation of DNA in the tail, assigning a value to each kite.

Key words: comet assay, standardization, Oreochromis sp., Tilapia,

cyclophosphamide.

4

ÍNDICE

Páginas

I. INTRODUCCIÓN 6

II. MARCO TEÓRICO 7

2.1 Genotoxicidad 7

2.2 Agentes alquilantes 7

2.3 Ciclofosfamida 8

2.4 “Tilapia” Oreochromis sp 9

2.5 Ensayo cometa 9

III. OBJETIVOS 11

3.1 Objetivo general 11

3.2 Objetivos específicos 11

IV. MATERIALES Y MÉTODOS 11

4.1. Animales 11

4.2. Suntancia 12

4.3. Concentración y Tiempo 12

4.4. Materiales 13

4.5. Métodos 13

5.5.1. Ensayo Cometa 13

4.5.1.1. Preparación de la lámina 13

5

4.5.1.1.1. Primera capa de agarosa 14

4.5.1.1.2. Segunda capa de agarosa 14

4.5.1.1.3. Tercera capa de agarosa 15

4.5.1.2. Fase de Lisis 15

4.5.1.3. Fase de denaturación 16

4.5.1.4. Fases de electroforesis 16

4.5.1.5. Fase de neutralización 17

4.5.1.6. Fijación 17

4.5.1.7. Tinción 18

4.5.1.8. Observación de cometas 19

V. RESULTADOS 19

VI. DISCUSIÓN 22

VII. CONCLUSIONES 24

VIII. REFERENCIA BIBLIOGRÁFICA 25

ANEXOS 29

6

I. INTRODUCCIÓN

El ensayo de cometa, o electroforesis en gel de una sola célula, es un método

genotoxicológico sensible para la evaluación de daños en el ADN en las células

individuales, lo que permite la cuantificación de las roturas del ADN y sitios lábiles

alcalinos. En comparación con otras pruebas de genotoxicidad, las ventajas del

ensayo cometa son la detección de ligero daño en el ADN, el bajo número de

células requerido, de bajo costo, precisión, facilidad de aplicación,

reproducibilidad, y corto período de tiempo para llevar a cabo el experimento.

(Belpaeme et al, 1998;. Tice et al, 2000;. Bücker et al, 2006).

Esta técnica es el resultado de los estudios realizados por Östling y Johanson, que

desarrolló la metodología de electroforesis de ADN en micro-gel, y aquellos por

Singh et al. (1988), que mejoró la técnica. Actualmente, varios grupos de

investigación internacionales han publicado recomendaciones que describen los

protocolos y criterios para el ensayo cometa, cuyo objetivo es establecer altos

estándares para obtener datos válidos, reproducibles y precisos. (Klaude et al,

1996;. Brendler-Schwaab et al, 2005;. Di -Paolo, 2006).

Los peces son considerados como buenos bioindicadores porque dependen de

varios eslabones de la cadena trófica y son capaces de acumular sustancias

tóxicas y responden fácilmente a bajas concentraciones de agentes mutagénicos.

(Gustavino 2001).

En los últimos años, la formación de las alteraciones morfológicas nucleares en

eritrocitos ha sido utilizado por diversos autores como posibles indicadores de

genotoxicidad (Cavas y Ergene-GÖZÜKARA, 2005a, b; Da Silva Souza y

Fontanetti, 2006;. Ergene et al, 2007a ).

El ensayo cometa se ha aplicado con éxito en los eritrocitos de varias especies de

peces, mostrando así la sensibilidad de las células de la sangre de estos animales

a los efectos genotóxicos. (Padrangi et al, 1995;. Belpaeme et al, 1998;.. Gontijo et

al, 2003).

7

Por otra parte es conocido que en los estudios de genotoxicidad in vivo se utilizan

sustancias mutagénicas, dentro de las más utilizadas se encuentra la

ciclofosfamida, la cual es un agente alquilante que causa alcalinación en el anillo

de purina, y esto resulta en una mala codificación y replicación de ADN.

En el presente estudio, se tuvo como objetivo estandarizar el ensayo cometa en

condiciones de laboratorio con ciclofosfamida a diferentes concentraciones y

periodos de exposición en eritrocitos de Oreochromis sp., con el fin de ajustar el

método con materiales y equipos con los que se cuentan en el laboratorio de

Mejora genética y reproducción animal.

II. MARCO TEÓRICO

2.1. Genotoxicidad:

La genotoxicidad es el resultado nocivo de la interacción de agentes químicos o

físicos con el aparato hereditario de la célula, y se manifiesta como alteraciones

genéticas y/o cambios en el número o estructura de los cromosomas, que

pueden incorporarse en generaciones celulares subsecuentes llamadas

mutaciones (Clayson, y Grant, 1992).

2.2. Agentes alquilantes

Los agentes alquilantes comprenden un númeroso grupo de compuestos

químicos que contienen grupos alquílicos, muy reactivos, capaces de formar

uniones covalentes con los puntos nucleófilos (ricos en electrones) de los

compuestos orgánicos (Flores, 2006).

Esta unión se realiza sustituyendo los átomos de hidrógeno por los grupos

alquílicos. A nivel celular, los lugares que se alquilan con mayor frecuencia son,

por este orden, los ácidos nucleicos, las proteínas y los fosfolípidos; las

macromoléculas alquiladas sufren profundos cambios estructurales que se

8

manifiestan en la célula por mutaciones, pérdida de las funciones y muerte

(Flores, 2006).

El DNA es la macromolécula preferentemente afectada. La unión del alquilante

y el DNA se efectúa habitualmente a nivel del nitrógeno 7 de la guanina,

formándose una 7-alquilguanina; a partir de esta unión puede ocurrir que la

base se destruya como tal o que se una a otra base no complementaria (por

ejemplo, tímina, en vez de unirse a la citosina), dando lugar a mutaciones

celulares. La alquilación de dos bases puede provocar la destrucción de ambas,

con la consiguiente pérdida de información genética. La acción citocida parece

estar ligada a la formación de uniones estables guanina-guanina, que

impedirían la separación de las cadenas en el momento de la replicación del

DNA (Llopis, 2009).

2.3. Ciclofosfamida

La ciclofosfamida es un fármaco antineoplásico que también tiene propiedades

inmunosupresoras. Pertenece a la familia de los fármacos alquilantes entre los

que se encuentran el busulfan, clorambucil y melfalan. La ciclofosfamida es

activa en la enfermedad de Hodgkin, el linfoma no de Hodgkin, la leucemia

linfocítica aguda, el carcinoma de mama, el cáncer de ovario, los cánceres

pulmonares, la micosis fungoide, el mieloma múltiple, el neuroblastoma y el

retinoblastoma. También se ha utilizado para tratar enfermedades

inmunológicas como el síndrome nefrótico, la granulomatosis de Wegener, la

artritis reumatoide, la enfermedad injerto contra huésped y el rechazo después

de los trasplantes de órganos.

La ciclofosfamida necesita ser activado por el sistema de enzimas

microsomales hepáticas para ser citotóxico. Esta enzimas hepáticas convierten

la ciclofosfamida en primer lugar a aldofosfamida y 4-hidroxiciclofosfamida, y

luego a acroleína y fosforamida, dos potentes sustancias alquilantes del ADN.

Al reaccionar con el ADN, los agentes alquilantes forman unos puentes que

9

impiden la duplicación del mismo y provocan la muerte de la célula (Enns Et. al.,

1999).

2.4. “Tilapia” Oreochromis sp

Los peces cíclidos Oreochromis (Linnaeus) son uno de los taxones más

importantes en la acuicultura global de hoy (FAO, 1980). El género se

encuentra de forma natural en África oriental y occidental, aunque su

distribución no es continua. Es probablemente el género más extendido y el

más abundante de todas los que han sido introducidos ampliamente en muchas

áreas del mundo (Welcomme, 1981). Estas poblaciones introducidas de

Oreochromis se han creado a partir de una variedad de fuentes naturales y

cultivadas (Trewavas, 1983).

Dentro de las características que tiene paras ser una especie modelo

bioindicadora tenemos la tolerancia a condiciones extremas: resistencia a

concentraciones bajas de oxígeno, niveles altos de amonio, valores bajos de

pH. Fácil manejo: resistencia al manipuleo en siembra, transferencias,

cosechas, manejo de reproductores.

2.5. Ensayo cometa:

Existen una gran variedad de bioensayos útiles para evaluar genotoxicidad,

entre ellos se encuentra el de electroforesis unicelular en gel, llamado

comúnmente ensayo cometa, El cual es un método genotoxicológico sensible

para la evaluación de daños en el ADN en las células individuales, lo que

permite la cuantificación de las roturas del ADN y de sitios lábiles alcalinos. En

comparación con otras pruebas de genotoxicidad, las ventajas del ensayo de

cometa son la detección de ligero daño en el ADN, el bajo número de células

requerido, de bajo costo, precisión, facilidad de aplicación, reproducibilidad, y

corto período de tiempo para llevar a cabo el experimento (Belpaeme et al,

1998;. Tice et al, 2000;. Bücker et al, 2006).

10

Rydberg y Johanson (1978) fueron los primeros en cuantificar directamente el

daño del ADN en las células individuales mediante la lisis de células embebidas

en agarosa en portaobjetos bajo condiciones alcalinas suaves para permitir el

desenrollado parcial del ADN. Después de la neutralización, las células se tiñían

con naranja de acridina y el grado de daño en el ADN se cuantificaba midiendo

la proporción de verde (indicando ADN de doble hebra) a rojo (indicando ADN

de una sola hebra) de fluorescencia utilizando un fotómetro.

Para mejorar la sensibilidad para la detección de daño en el ADN en las células

aisladas, el mismo laboratorio (Ostling, O., and Johanson, K. J., 1984)

desarrolló una técnica de electroforesis en microgel. En esta técnica, las células

estaban incrustadas en gel de agarosa en portaobjetos, se lisaron por los

detergentes y la alta concentración de sal, y luego a electroforesis durante un

corto período de tiempo en condiciones neutras. Las células con aumento de la

pantalla de daño en el ADN aumentó la migración de ADN desde el núcleo

hacia el ánodo. El ADN migración se cuantificó por tinción con bromuro de etidio

y por la medición de la intensidad de fluorescencia a dos posiciones fijas dentro

del patrón de migración con un fotómetro microscopio.

Actualmente, varios grupos de investigación internacionales han publicado

recomendaciones que describen los protocolos y criterios para el ensayo

cometa, cuyo objetivo es establecer altos estándares para obtener datos

válidos, reproducibles y precisos (Klaude et al, 1996;. Brendler-Schwaab et al,

2005;. Di -Paolo, 2006).

El fundamento de este ensayo para detectar daños al ADN producidos por un

rompimiento simple o doble en la cadena, daño oxidativo inducido y

entrecruzamiento de ADN-ADN/ADN-proteína, se basa en la fragilidad que

poseen los sitios dañados; al ser sometidos a un pH superior a trece y su

comportamiento en una electroforesis. Los fragmentos de ADN, producto de la

acción de la sustancia a probar, afectados por el pH alcalino, migran a una

velocidad diferente del resto del material nuclear formando la cola del “cometa”,

entre más larga sea esta porción mayor será el daño ocasionado al ADN.

11

Es una técnica electroforética sensible, reproducible, simple y de gran utilidad

en monitoreo en poblaciones humanas expuestas a radiaciones y a diversas

sustancias mutagénicas.

III. OBJETIVOS

3.1. Objetivo general

Estandarizar el ensayo cometa para evaluar genotoxicidad de ciclofosfamida en

eritrocitos de sangre periférica de tilapia, Oreochromis sp. en condiciones de

laboratorio.

3.2. Objetivos específicos

3.2.1. Estandarizar las sustancias y concentraciones a utilizar en las

diferentes fases del ensayo cometa.

3.2.2. Estandarizar los tiempos de cada fase del proceso.

3.2.3. Ajustar la técnica con los equipos y materiales del laboratorio.

3.2.4. Estandarizar la tinción con nitrato de plata para observarse por

microscopia simple.

IV. MATERIALES Y MÉTODOS

4.1. Animales: se trabajó con 112 peces adquiridos en la Facultad de

Pesquería de la Universidad Nacional Agraria La molina. Las medidas de éstos

fueron de 2,5 cm de longitud (juveniles). Se mantuvieron en una piscina de 2,5 x

2,0 x 0.7 m. llena de agua hasta sus tres cuartas partes. Fueron alimentados

con comida peletizada dos veces por día.

12

4.2. Sustancia: la ciclofosfamida se obtuvo del laboratorio NEOPHOS S.A.

presentación en polvo para solución inyectable.

Fig.1 Ciclofosfamida usada para el trabajo

4.3. Concentración y Tiempo: Las concentraciones ensayadas fueron: 2, 4, 6

y 8 mg/L con tres individuos por cada una. Las concentraciones fueron

seleccionadas sobre la base de los resultados de experimentos inmersión por

otros autores para las especies de peces tales como Anguilla anguilla (Pacheco

y Santos, 1996).

Los periodos de sometimiento de los peces a la sustancia fueron de 12, 24, 48,

72 horas. Se hizo dos repeticiones por cada concentración. Y se trabajó con un

control de agua destilada.

Fig. 2 Envases de plástico de 1 litro que contienen los peces a la solución indicada de

ciclofosfamida en agua destilada.

13

4.4. Materiales

Láminas portaobjeto

Láminas cubreobjeto

Probetas

Matraces

Baguetas

Espátulas

Balanza analítica

Fiolas

Erlenmeyer

Beackers

Agua destilada

Cámara electroforética

Microscopio

Estuche de disección

Agarosa bajo punto de

fusión

Agarosa normal punto de

fusión

NaCl

NaOH

Tris

Tritón X-100

Nitrato de plata

EDTA

DMSO

Formaldehído 37%

Ciclofosfamida

PBS 1X

Bencina

Peces Oreochromis sp.

4.5. Métodos:

4.5.1. Ensayo Cometa

4.5.1.1. Preparación de la lámina:

Previamente se limpian las láminas en bencina para retirar la capa de

grasa que contiene, secar con papel tisú para no dejar pelusas.

14

4.5.1.1.1. Primera capa de agarosa: en un portaobjetos limpio formar

una capa delgada de agarosa de normal punto de fusión al 1.5%

(Christofoletti et.al, 2009). en un beacker colocar la agarosa líquida y

sumergir el portaobjetos unas 25 – 30 veces dejando un espacio de

30 segundos en cada una. Dejar secar a temperatura ambiente por 1

½ - 2 horas.

Fig. 3 A) Preparación de primera capa de agarosa. B) observación de la

fina lámina formada.

4.5.1.1.2. Segunda capa de agarosa: aplicar sobre la primera capa la

mezcla de 5 µL de sangre periférica de Oreochromis sp. con 85 µL

de agarosa de bajo punto de fusión al 0.5% (Christofoletti et.al,

2009). Colocar un cubreobjetos sobre ella y llevar a 4 °C por 10

minutos.

A B

15

Fig. 4 Formación de la segunda capa de agarosa con la muestra de sangre.

4.5.1.1.3. Tercera capa de agarosa: retirar la laminilla cubreobjetos y

agregar 85 µL de agarosa de bajo punto de fusión 0.5%

(Christofoletti et.al, 2009), colocar una laminilla cubreobjetos y llevar

a 4 °C por 10 minutos.

Fig. 5 Observación de la forma de retiro del cubreobjetos.

4.5.1.2. Fase de Lisis:

Colocar las láminas en una solución de lisis (volumen suficiente como

para cubrirlas) constituida por 2,5M NaCl, 100mM EDTA, 10mM Tris

pH10, 20 mL DMSO y 1 mL Triton X-100. Por una hora y media a 4°C en

oscuridad.

A B

16

Fig. 6 A) sustancias químicas utilizadas para la solución de lisis. B) solución de

lisis en láminas con muestra.

Al cabo del tiempo sacar las láminas y lavar con solución de

electroforesis. Dejar secar

4.5.1.3. Fase de denaturación:

Las láminas se colocan en una placa Petri con solución de denaturación

(volumen suficiente como para cubrirlas) compuesta por NaOH 300mM y

EDTA 1mM, pH 12, durante 20 minutos en oscuridad y a 4°C.

Fig.7 Sustancias químicas para la preparación de la solución de denaturación.

4.5.1.4. Fase de electroforesis:

Colocar las láminas en la camára electroforética oscura con solución de

electroforesis (NaOH 300mM y EDTA 1mM) por 20 minutos, 21 V. y 270

mA.

A B

17

Fig. 8 A) fuente de poder y cámara electroforética oscura. B) muestras en

cámara electroforética

4.5.1.5. Fase de Neutralización:

La lámina pasa por tres baños de 5 minutos cada uno con 3 mL de

solución de neutralización: 0.4M Tris-HCl, pH 7.5.

Fig. 9 Sustancias utilizadas para la solución de Neutralización

Dejar secar la lámina.

Fig. 10 Imagen de láminas secando a temperatura ambiente en un lugar tenue

para no alterar la muestra.

4.5.1.6. Fijación

Se sumergieron las láminas en etanol absoluto por 10 minutos. Luego se

dejaron secar.

18

Fig.11 Láminas en fijación con alcohol absoluto

4.5.1.7. Tinción

Se utilizó una solución de 0.25 % de Nitrato de plata, 40 µL/100mL de

formaldehído 37% y agua destilada. Las láminas fueron cubiertas de la

solución por 15 minutos o hasta observar un oscurecimiento de la lámina,

luego enjuagarlas con agua destilada y dejar secar.

Fig 12. A) Nitrato de Plata. B) Solución de nitrato de plata 0.25 %. C) Láminas

en proceso de tinción.

A B

C

19

4.5.1.7. Observación de cometas:

Las láminas se observaron a aumento de 400x.

V. RESULTADOS

Se observó que el uso de las sustancias utilizadas en la metodología fue óptimo

para el desarrollo de la técnica.

En cuanto a la técnica para la formación de la primera capa de agarosa de

normal punto de fusión y el tiempo de secado, se tuvo una fina capa casi

uniforme y una adherencia positiva del gel en el 90% de las láminas que

permitió el óptimo desarrollo de los siguientes pasos.

La rapidez al obtener la muestra de sangre periférica cumple un proceso

importante para evitar la coagulación de una muestra tan pequeña (5 µL). El

éxito de la toma de muestra sin coagulación fue del 95 % del total. Aún así las

muestras que se llegaron a semi coagular se aplicaron en el gel. Al final del

ensayo se observó una sola diferencia entre ellas, la aglomeración de los

cometas en el caso de las láminas con sangre semi coagulada.

El tiempo de 10 minutos para el secado de la segunda y tercera capa de

agarosa fue también importante para no perder muestra mientras se retiraba el

cubreobjetos, pues al dejarlo menos o más tiempo se corría el riesgo de retirar

parte de la muestra por no haberse gelificado bien o por haberse adherido

fuertemente el cubreobjetos al agar impidiendo de las dos formas asegurar que

la muestra se hubiese mantenido allí.

En las fases de lisis, denaturación, electroforesis y neutralización, las

concentraciones de las sustancias se siguieron según lo propuesto en la

metodología de Christofoletti et.al, 2009. En todo momento se minimizó la

exposición a la luz, usando una luz muy tenue o en todo caso muy alejada, lo

20

suficiente como para permitir trabajar. Para la fase de electroforesis la cámara

usada fue negra.

La concentración de nitrato de plata usada en el trabajo mostró una tinción

buena en los cometas observados. El tiempo de tinción fue relativo, en la

mayoría de los casos se esperó 15 minutos para observar el oscurecimiento de

las láminas y un máximo de 25 minutos.

Hubo muerte de algunos de los individuos durante la exposición en las

concentraciones de 8 mg/L en 24 horas, 4mg/L en 48h y 8mg/L en 72 horas.

Aparentemente la muerte de éstos habría sido por condiciones de alimentación

o por la poca concentración de oxígeno disuelto porque en los frascos de

repeticiones de esas mismas concentraciones los peces sí se mantuvieron

vivos.

Para cada lámina, 100 núcleos fueron analizados. Todas las pruebas realizadas

con las diferentes concentraciones de Ciclofosfamida utilizando el ensayo

cometa indican daño en el ADN.

Los cometas fueron clasificados visualmente empleando una escala arbitraria

de cinco categorías según la formación de ADN en la cola, asignando a cada

cometa un valor de 1, sin daño; 2, bajo nivel de daño; 3, daño moderado; 4,

daño elevado ó 5, daño extremo (Kobayashi et al. 1995).

A B

C

21

Fig.13 Cometas observados a 400X A) tipo 3, B y C) tipo 1, D) E) nivel 2, F) tipo 4, G)

tipo 3, H) tipo2, I y J) nivel 4.

D

J

I H

F G

E

22

VI. DISCUSIÓN

La electroforesis en gel de una sola célula se ha usado por los investigadores en

una amplia variedad de organismos y tejidos, mejorando de este modo su utilidad.

Por lo tanto, para entender mejor los efectos de los diferentes valores de pH en los

eritrocitos de las tilapias, se hicieron ciertos cambios, sobre la base de estudios de

Tice et al. (2000), Gontijo et al. (2003) y David (2007), el uso de pH 12,1, el tiempo

de desenrrollamiento equivalente a 20 min y el tiempo de electroforesis de 20 min,

21 V y 270 mA., la variación de pH durante las etapas de lisis y electroforesis

influyen en el tipo de rupturas de ADN que pueden ser detectadas, como se

desnaturaliza ADN y desenrolla en valores de pH de alrededor de 12, debido a las

interrupciones en puentes de hidrógeno entre las cadenas de ADN (Kohn, 1991).

La sensibilidad y la reproducibilidad son puntos críticos para cualquier

biomarcador de daño en el ADN, e incluso cuando es un método estandarizado a

fondo es necesario para poner a prueba la capacidad de los laboratorios para

producir resultados reproducibles.

En el ensayo de cometa, la sensibilidad depende en primer lugar de cómo se llevó

a cabo el ensayo. El uso del tinte, intensidad de éste, cambios en las condiciones

de electroforesis, etc, juegan un papel importante en la sensibilidad (Singh, 2000).

De acuerdo con Padrangi et al. (1995) y Lemos et al. (2005), los diferentes tejidos

de organismos acuáticos se pueden utilizar para el ensayo cometa. Sin embargo,

en la mayoría de los casos, los eritrocitos se han utilizado como células diana, ya

que requieren pequeños volúmenes que se pueden obtener a través de una

técnica no perjudicial y la disociación celular no es necesario (Belpaeme et al.,

1998). Para nuestro caso, al trabajar con animales tan pequeños, la muestra se

obtuvo matando a éstos.

La agarosa forma una matriz de fibras de hidratos de carbono que encapsulan las

células, de anclaje en su lugar. La agarosa se considera que es osmótica-neutro,

por lo tanto, las concentraciones usadas permitieron que las soluciones puedan

23

penetrar en el gel y afectar a las células. Aunque otras revisiones nos sugieren

otras concentraciones (Singh, 1988, Wclcomme, 1981, Di-Paolo, 2006) se tomó

las de Christofoletti 2009 por ser empleada específicamente en Oreochromis sp.

En la solución de lisis el papel de cada sustancia es importante; la sal acuosa

altera los patrones de unión dentro de la célula, así como interrumpe el contenido

de ARN de la célula. El detergente se disuelve las membranas celulares. A través

de la acción de la solución de lisis de las células se destruyen. Todas las

proteínas, ARN, membranas y componentes citoplasmáticos y nucleoplasmáticos

se interrumpen y se difunden en la matriz de agarosa. Sólo el ADN de la célula se

mantiene, y se desenreda para llenar la cavidad en la agarosa que toda la célula

anteriormente llena.

En la tinción con nitrato de plata, García et. al., 2004, Wclcomme, 1981, Di-Paolo,

2006 y muchos más usan un método de nitrato de plata con otros componentes.

Algunos de ellos son restringidos en su obtención. Es por eso que se opta por

emplear sólo formaldehído y nitrato de plata en una solución con agua destilada

sacada de un protocolo de tinción en geles de poliacrilamida (Duina Posso Duque

y Thaura Ghneim) modificándolo. El protocolo para la tinción de plata aplicada en

este ejercicio permitió observar los cometas, éste era el principal objetivo de

estandarización. Se podría jugar un poco con la concentración del nitrato de plata,

en este caso, se logró observar bien los cometas.

El laboratorio se acondicionó con respecto a la luz, las ventanas oscuras y la luz

indirecta. El uso de guantes, la rapidez de la toma de muestra, el tiempo de

secado, de exposición a las diferentes soluciones fueron importantes para obtener

resultados confiables y un protocolo que pueda reproducirse.

Se observó que el uso de las sustancias utilizadas en la metodología fue óptimo

para el desarrollo de la técnica.

24

VII. CONCLUSIONES

- Se logró acondicionar la técnica del ensayo cometa a las condiciones del

laboratorio.

- La modificación en la tinción con nitrato de plata, dio resultados objetivos en la

observación de cometas bajo microscopía simple.

- Esta estandarización de la técnica de ensayo cometa es reproducible en

Oreocrhomis sp. bajo diferentes sustancias tóxicas.

25

VIII. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

1. Belpaeme K, Cooreman Kand, Kirsch-Volders M (1998) Development

and validation of the in vivo alkaline comet assay for detecting genomic

damage in marine flatfish. Mutat Res Genet Toxicol Environ Mutagen

415:167-184.

2. Brendler-Schwaab S, Hartmann A, Pfuhler S and Speit G (2005) The in

vivo comet assay: Use and status in genotoxicity testing. Mutagenesis

20:245-254.

3. Bücker A, CarvalhoWand Alves-Gomes JA (2006) Avaliação da

mutagênese e genotoxicidade em Eigenmannia virescens (Teleostei,

Gymnotiformes) expostos ao benzeno. Acta Amazônia 36:357-364.

4. Cavas, T., Ergene-Gozukara, S., (2005ª). Induction of micronuclei and

nuclear abnormalities in Oreochromis niloticus following exposure to

petroleum refinery and chromium processing plant effluents. Aquat.

Toxicol. 74, 264–271

5. Cavas, T., Ergene-Gozukara, S., (2005b). Micronucleus test in fish cells:

a bioassay for in situ monitoring of genotoxic pollution in the marine

environment. Environ. Mol. Mutagen. 46, 64–70.

6. Clayson, D.B. y Grant, D.L. (1992). The assessment of mutagenicity.

Health protection branch mutagenicity guidelines. Enviromental and

Molecular Mutagenesis: Vol. 21:15-37.

7. Christofoletti et.al, (2009). Application of the comet assay in erythrocytes

of Oreochromis niloticus (Pisces): A methodological comparison

26

8. Da Silva Souza, T., Fontanetti, C.S., (2006).Micronucleus test and

observation of nuclear alterations in erythrocytes of Nile tilapia exposed to

waters affected by refinery effluent. Mutat. Res. 605, 87–93.

9. Di-Paolo C (2006) Aplicação do ensaio do cometa a estudo de danos ao

DNA de robalos, Centropomus parallelus (Poey, 1860), expostos à ß-

naftoflavona (Master Thesis, USP, São Paulo, 2006),

http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/21/21131/tde-17102006-

154149/ (January 25, 2008)

10. Duina Posso Duque y Thaura Ghneim. (2009). Electroforesis de

ácidos nucléicos en geles de poliacrilamida. Protocolos de laboratorio

UEG (http://www.ivic.gob.ve/ecologia/ueg/). Instituto Venezolano de

Investigaciones Científicas, Altos de Pipe- Venezuela.

11. Ergene, S., Cavas, T., Celik, A., Köleli, N., Kaya, F., Karahan, A.,

(2007ª). Monitoring of nuclear abnormalities in peripheral erythrocytes of

three fish species from the Goksu Delta (Turkey): genotoxic damage in

relation to water pollution. Ecotoxicology 16, 385–39.

12. Enns, G. M., Roeder, E., Chan, R. T., Ali-Khan Catts, Z., Cox, V. A. and

Golabi, M. (1999), Apparent cyclophosphamide (cytoxan) embryopathy: A

distinct phenotype?. Am. J. Med. Genet., 86: 237–241.

13. Gustavino, B.; Scornajenghi, K.A.; Minissi, S.; Ciccotti, E. (2001).

Micronuclei induced in erythrocytes of Cyprinus carpio (teleostei, pisces)

by X-rays and colchicine. Mutation Research. 494 (1), 151-159.

14. FAO, (1980). Report of the Ad Hoc Consultation on Aquaculture

Research. FAO Fisheries Report 238, FIR/R238. FAO, Rome, 26 pp.

15. Flórez Jesús. (2006). Quimioterapia antineoplásica I. Bases

fundamentales. Antimetabolitos, fijadores a la tubulina, inhibidores de

27

topoisomerasas, en: Farmacología humana. 3ª edición. Editorial:

masson. SA. Barcelona –España

16. Gontijo AMMC, Barreto RE, Speit G, Reyes VAV, Volpato GL and

Salvadori DMF (2003) Anesthesia of fish with benzocaine does not

interfere with comet assay results. Mutat Res 534:165-172.

17. Klaude M, Eriksson S, Nygren J and Ahnström G (1996) The comet

assay: Mechanisms and technical considerations. Mutat Res 363:89-96.

18. Kobayashi H, Sugiyama C, Morikawa Y, Hayashi M, Sofuni T. (1995). A

comparison between manual microscopic analysis and computerized

image analysis in the single cell gel electrophoresis assay. MMS

Commun 3:103–115.

19. Llopis García Mª Carmen. (2009) Tesis Doctoral: Modelado

farmacocinético de ciclofosfamida en pacientes con cáncer de mama.

[Tesis doctoral].Valencia, España, Universidad de Valencia.

20. Ostling, O., and Johanson, K. J. (1984) Biochem. Biophys. Res.

Commun. 123, 291-298.

21. Pacheco, M., Santos, M.A., (1996). Induction of micronuclei and nuclear

abnormalities in the erythrocytes of Anguilla anguilla l exposed either to

cyclophophamide or to bleached Kraft pulp mill effluent. Fresenius

Environ. Bull. 5, 746–751.

22. Padrangi R, Petras M, Ralph S and Vrzoc M (1995) Alkaline single cell

gel (comet) assay and genotoxicity monitoring using bullheads and carp.

Environ Mol Mutagen 26:345-356.

23. Rydberg, B., Johanson, K. J. (1978) in DNA Repair Mechanism

(Hanawalt, P. C., and Friedberg, E. C., Eds), pp. 465468, Academic

Press, New York.

28

24. Shaposhnikov S, Frengen E, Collins AR. Mutagenesis. (2009).

Increasing the resolution of the comet assay using fluorescent in situ

hybridization--a review. Sep;24(5):383-9. doi: 10.1093.

25. Singh, N.P., McCoy M.T., Tice R.R. y Schneider E.L. (1988). A simple

technique for quantitation of low levels of DNA damage in individual cells.

Experimental Cell Research. Vol. 175: 184-191.

26. Singh, N.P. (2000) Microgels for estimation of DNA strand breaks, DNA

protein crosslinks and apoptosis, Mutat. Res. 455 111–127.

27. Trewavas, E., (1983). Tilapiine Fishes of the Genera Oreochromis,

Surorherodon and Dunukiliu. British Museum of Natural History, London,

583 pp.

28. Tice RR, Agurell E, Anderson D, Burlinson B, Hartmann A, Kobayashi

H, Miyamae Y, Rojas E, Ryu JC, Sasaki YF. (2000).Single cell gel/Comet

Assay: guidelines for in vitro and in vivo genetic toxicology testing.

Environ. Mol. Mutagen; 35: 206-21.

29. Wclcomme, R.L., (1981). Register of International Transfers of Inland

Fish Species. FAO Fish-cries Technical Paper No. 2 13. FAO, Rome, 120

pp.

29

ANEXOS

Anexo I. Esquema de la formación del cometa propuesta por Shaposhnikov,

et al. 2009. Tomado de http://ddd.uab.cat/record/64777

30

Anexo II. Esquema típico de un portaobjetos con las capas de agarosa

dispuestas tipo sándwich. Tomado de http://ddd.uab.cat/record/64777

Anexo III. Clasificación visual esquemática usada por Kobayashi et al. 1995

Clasificación de 5 clases de cometas. Tomada de

http://ddd.uab.cat/record/64777