anexo 2 cometa

7/26/2019 Anexo 2 Cometa

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RESUMENEVALUACIN DEL DAO EN EL DNA ESPERMTICO

La esterilidad afecta a casi un 20% de las parejas en edad reproductiva y en la mitad de los casos el factor

masculino tiene un papel relevante. Entre los parmetros clsicos que determinan una buena calidad semi-nal, tales como, la motilidad espermtica, la morfologa o el estado de los acrosomas y de las membranas, laintegridad de la molcula de DNA es crucial para llevar a cabo una fecundacin con xito. Sin embargo, elestudio de este ltimo parmetro no es sencillo, hecho que ha dificultado su incorporacin rutinaria en la ela-

boracin de los seminogramas. La presente revisin tiene dos objetivos: 1) presentar una visin actualizada deaquellas tecnologas que se consideran ms eficaces para el estudio de la fragmentacin del DNA en el esper-matozoide, teniendo en cuenta la posibilidad de su uso en los laboratorios de androloga y de acuerdo con lacomplejidad intrnseca al proceso, el equipamiento y los recursos disponibles, y 2) analizar sus efectos e impli-caciones sobre la fecundacin, desarrollo embrionario y fertilidad.

Palabras clave: Fragmentacin del DNA en espermatozoides. Esterilidad masculina. Fertilidad. Calidad seminal.

ABSTRACTASSESSING SPERM DNA DAMAGE

Infertility affects almost 20% of couples in reproductive age and the male factor being responsible of 50%of this infertility. Among the classic parameters that determine a good seminal quality such as sperm moti-lity, sperm morphology or the quality of the of acrosomes and/or sperm membranes, the integrity of theDNA molecule is crucial to carry out a successful fertilization. Nevertheless, the study of this parameter hasnot been straightforward approached. This fact has shunned its incorporation, as a routine technique, wit-hin a standard seminogram. The aim of the present review is to summarize and update those technologiesthat are considered more successful to study sperm DNA fragmentation with special emphasis to: 1) thelevels of technological complexity and the possibility of its use in laboratories of andrology, according withthe equipment and the resources available, and 2) the effects and possible implications of high level ofsperm DNA fragmentation for fecundation, embryo development and fertility.

Keywords: Sperm DNA fragmentation. Male sterility. Fertility. Semen quality.

Evaluacin del dao en el DNA espermtico

Corts-Gutirrez EI*, Dvila-Rodrguez MI*, Lpez-Fernndez C**, Fernndez JL***, Goslvez J**

*Departamento de Gentica. Centro de Investigacin Biomdica del Noreste. Instituto Mexicano del Seguro

Social (IMSS), Monterrey, Nuevo Len. Mxico. **Departamento de Biologa. Unidad de Gentica. Universidad

Autnoma de Madrid (UAM). Madrid. ***Unidad de Investigacin. Hospital Juan Canalejo. La Corua.

Actas Urol Esp. 2007;31(2):120-131

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ACTAS UROLGICAS ESPAOLAS FEBRERO 2007ORIGINAL

La esterilidad afecta a casi un 20% de las pare-jas en edad reproductiva. Esta cifra estaumentando de modo acelerado en los ltimosaos, debido a un cambio radical en las pautassociales del ser humano. Parece ser que el fen-meno afecta a ambos sexos, de tal forma que elfactor masculino parece estar involucrado en lamitad de los casos de infertilidad1.

El anlisis de las caractersticas de muestrasseminales es esencial para evaluar si el factormasculino tiene influencia en la infertilidad. Parael estudio de la infertilidad masculina relaciona-da con la calidad del semen, la OrganizacinMundial de la Salud2, ha establecido una serie deparmetros que se debieran analizar de formarutinaria en un laboratorio bsico de androloga.


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Corts-Gutirrez EI et al./Actas Urol Esp. 2007;31(2):120-131

Entre las caractersticas clsicas que se determi-nan de modo habitual, destacan el volumen deleyaculado, el pH, el nmero de espermatozoidespor unidad de volumen, la motilidad y la morfo-loga de los espermatozoides. En general y paracada parmetro analizado, se establecen valoresumbral, tanto para el estudio de caracteres cua-litativos como cuantitativos. Sin embargo, anutilizando este tipo de valores, se estima queaproximadamente un 15% de los varones estri-les presentan un espermiograma normal3. Por lotanto, es verosmil que estos parmetros no seandel todo indicativos de la calidad de los esperma-tozoides presentes en una muestra seminal.Adicionalmente, al aadir otro tipo de parme-

tros tales como la integridad del acrosoma, lavitalidad, la evaluacin de ciertas actividadesenzimticas o la integridad funcional de la mem-brana, la conclusin que se alcanza es que nin-gn parmetro, per se, se puede considerar devalor diagnstico absoluto de la infertilidad mas-culina. La situacin es todava ms crtica cuan-do se utilizan tcnicas de reproduccin asistida.En este tipo de situaciones, donde se recurre a lafertilizacin in vitro(FIV) o bien a la inyeccin delespermatozoide en el citoplasma del ovocito

(ICSI), la calidad de los espermatozoides que seutilizan, requiere un control mucho ms delicadoque en el caso de la reproduccin normal. Esto esdebido, por una parte, a las manipulaciones tc-nicas que implican este tipo de procesos y porotra, al simple hecho de que la necesidad derecurrir a esta clase de tcnicas lleva implcitoque puede existir algn problema que interfierecon la concepcin normal4.

Parece lgico asumir que la transferencia de lamolcula del DNA integra e intacta desde elespermatozoide al vulo, es crucial para conse-guir una fecundacin con ciertas perspectivas dexito. Sin embargo, resulta sorprendente que noexista una tecnologa rpida para analizar la cali-dad del DNA en una clula tan crtica como elespermatozoide y que se pudiera utilizar con lamisma facilidad con la que se procede para estu-diar, por ejemplo, la motilidad de estas mismasclulas. En este sentido, es bien conocido que lapresencia de defectos en el material gentico,tales como anomalas en la condensacin de lacromatina, en relacin con el proceso de la

maduracin del espermatozoide, la integridad dela molcula de DNA asociada con la presencia deroturas tanto de doble cadena como de cadenasencilla del DNA, o la presencia de anomalas cro-mosmicas, como pueden ser las aneuploidas olas reordenaciones genmicas estructurales, seasocian estrechamente con la infertilidad5. Sinembargo, no existe una tecnologa adecuada quetraspase el mbito de la investigacin y que sepueda utilizar de forma sistemtica en un servi-cio bsico de androloga.

En lo que se refiere al origen del dao en elDNA del espermatozoide, nos enfrentamos contoda seguridad a un efecto de naturaleza multi-factorial en el que interviene una casustica no

del todo delimitada. Se sabe que la generacin deradicales libres de oxgeno (ROS)6 o bien fallos enel intercambio correcto de la fraccin histnica dela cromatina por las protaminas, pueden produ-cir dao irreversible en el DNA del gameto. Enrelacin directa con este tipo de acontecimientos,la presencia de apoptosis, como un suceso demuerte celular programada, tiene lugar duranteel proceso de maduracin espermtica7,8. No obs-tante, es interesante destacar que la incidenciadel fenmeno apopttico en los espermatozoides

de un eyaculado que se manipula para un proce-so de reproduccin asistida, generara una seriede metabolitos que no sern retirados por tiposcelulares tales como los macrfagos, hecho queocurrira en cualquier muerte celular en el nivelsomtico. Esta situacin puede generar un acu-mulo no deseable de metabolitos altamente reac-tivos, tales como enzimas celulares, enzimas pro-cedentes del acrosoma o bien nucleasas de remo-delacin de la cromatina tales como la topoiso-merasa. Todo este tipo de accin enzimticafuera de control puede contribuir e incluso ace-lerar el proceso de degradacin celular, afectandode forma indirecta, a otros espermatozoides. Eneste escenario, se ha sugerido que el dao provo-cado en la molcula del DNA del espermatozoidepor razones de distinta naturaleza, puede afectarla salud del embrin, la del feto e incluso la de ladescendencia global9,10. Adems, se ha propues-to que el efecto de este dao puede asociarse aenfermedades que aparecen en la descendencia,tales como la propia infertilidad11,12, la presenciade cncer en la niez13 o bien puede relacionarse


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con ciertas enfermedades de impronta genmicaanormal14. Adicionalmente, existen causas denaturaleza exgena a la propia dinmica de for-macin del gameto tras el proceso meitico, queresultan en un incremento notable en el daoque se observa en el DNA de un espermatozoide.De esta forma, el uso de ciertos frmacos, la con-taminacin atmosfrica, el tabaquismo, los episo-dios de fiebre alta, una temperatura testicularelevada, anomalas anatmicas tales como elvaricocele, o una edad avanzada, contribuyen deforma notable a incrementar las tasas de daoregistrado en el DNA del espermatozoide13,15-17.

El propsito de la presente revisin es presen-tar una recopilacin actualizada de aquellas tec-

nologas que consideramos ms eficaces para elestudio de la fragmentacin del DNA en el esper-matozoide, teniendo en cuenta sus niveles decomplejidad y la posibilidad de su uso en distin-tos laboratorios de androloga, de acuerdo con elequipamiento y recurso disponibles. De formaparalela, esta revisin intenta resaltar los efectose implicaciones de la fragmentacin del DNA enlos espermatozoides y en qu situaciones clnicasuna muestra de semen puede presentar unosniveles elevados de dao en la molcula de DNA.

METODOLOGAS PARA LA DETECCINDEL DAO EN DNA DEL

ESPERMATOZOIDEExisten dos estrategias diferentes para estudiar

la fragmentacin del DNA espermtico (Tabla 1).La primera, incluye aquellas metodologas enca-minadas a marcar las roturas, tanto de cadenasencilla como de cadena doble, que se registrande forma natural o fortuita en la molcula deDNA. Dentro de este grupo, podramos incluir eluso de procesos enzimticos para la incorpora-

cin in situde nucletidos marcados, tales comola Terminal dUTP Nick-End Labeling (TUNEL)18 ola In Situ Nick Translation (ISNT)19,20. Dado quelas roturas del DNA incrementan la susceptibili-dad del DNA a la desnaturalizacin, al iniciarseesta a partir de los extremos de la rotura, la segun-da estrategia incluye aquellas tecnologas quemiden la distinta capacidad de la cromatina y enparticular del DNA, para desnaturalizarse frente adeterminados tratamientos. En este grupo seincluyen tcnicas tales como el Sperm Chromatin

Structure Assay (SCSA)21, el DNA BreakageDetection-Fluorescence In Situ Hybridization

(DBD-FISH), una metodologa que utiliza la hibri-dacin in situ de cidos nucleicos22, el ensayocometa bajo condiciones desnaturalizantes23, o laprueba Sperm Chromatin Dispersion (SCD)24.Adicionalmente, existen otras pruebas para elanlisis del estado de la cromatina en el esper-matozoide que comentaremos con menor detalledebido a que no son tan utilizadas, o bien enalgunos casos, son controvertidas.

Ensayo TUNEL(Terminal dUTP Nick-EndLabeling)

Esta prueba permite visualizar la incorpora-

cin de nucletidos marcados en los extremos delas roturas existentes en el DNA, bien sean decadena simple o doble. La reaccin se cataliza, insitu, mediante la accin de una transferasa ter-minal. Esta enzima incorpora deoxiuridina modi-ficada con biotina o digoxigenina, en el extremo3OH de la cadena afectada. Posteriormente, losnucletidos modificados se detectan tras unareaccin con un anticuerpo conjugado con unfluorocromo como molcula trazadora. El nucle-tido incorporado puede estar directamente mar-

cado con el fluorocromo. Tericamente, la sealde marcado obtenida por cada espermatozoide,se incrementara de acuerdo con el nmero deroturas que presente la cadena de DNA18,25.

La tcnica ha tenido una buena aceptacindado que es verstil, esta comercializada en kit ylos resultados pueden ser interpretados median-te microscopa de fluorescencia y citometra deflujo. Segn algn estudio de evaluacin visualdirecta, la variabilidad intraobservador es menordel 8% y la interobservador es menor del 7%26.De todos modos, existen niveles de marcadointermedio de la molcula de DNA e irregulares,o bien niveles de base variables, que pueden pre-sentar cierta confusin. Su uso no se ha expan-dido en la rutina clnica por tres razones:

1) Requiere equipo sofisticado para su anlisis.2) Requiere personal especializado3) El material que se utiliza viene precedido

por un proceso de fijacin de la cromatinaque puede dificultar el acceso de las enzi-mas y la propia actividad enzimtica puedeser irregular.

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Prueba de ISNT(In Situ Nick Translation)La ISNT es bsicamente una tcnica de con-

cepcin similar al TUNEL ya que permite cuanti-ficar el grado de dao que se produce en el DNAevaluando tras la incorporacin de molculas dedUTP modificado con botina o digoxigenina, obien marcado directamente el DNA con un fluo-rocromo conjugado con un nucletido modifica-do, tras utilizar la enzima DNA polimerasa I. Lamayor diferencia con el TUNEL radica en que, eneste caso, existe una actividad enzimtica exonu-cleasa y la incorporacin de nucletidos es mayorpor utilizar la cadena de DNA complementariacomo molde. Los resultados del anlisis de ISNTse han utilizado para el estudio de la presencia deanomalas originadas durante la remodelacin de

la cromatina del espermatozoide27. Desde elpunto de vista prctico, esta tcnica tendra lasmismas prestaciones e inconvenientes que la deTUNEL, pero no existe disponible de modocomercial para su aplicacin directa sobre esper-matozoides.

DBD-FISH (DNA Breakage Detection-Fluorescence In Situ Hybridization)

Se trata de una metodologa relativamentereciente y que se circunscribe al campo de lainvestigacin. Se fundamenta en la capacidad quetienen ciertas soluciones alcalinas de producir unadesnaturalizacin del DNA a partir de los extremosde roturas de doble cadena o de cadena sencilla, obien lugares sensibles al lcali. Despus de la des-

Tabla 1Resumen de las metodologas utilizadas para evaluar alteraciones en el DNA de espermatozoides, as como de algunas desus ventajas e inconvenientes en relacin con la aplicacin clnica de rutina

Metodologas que se basan en el marcaje de roturas del DNA

Mtodo Instrumental Ventajas Desventajas Utilidad clnica

TUNEL Microscopio Fluorescencia Cumple con parmetros de control Equipo sofisticado y costoso Fertilidad masculina

Citometra de flujo de calidad Reproduccin asistida

Prdidas fetales

ISNT Microscopio Fluorescencia Reaccin de marcaje directo Equipo sofisticado y costoso Fertilidad masculina

Citometra de flujo

Metodologas que se basan en la susceptibilidad del DNA para desnaturalizarse

SCSA Citometra de flujo Punto de corte establecido (30%) Instrumentacin costosa Recomendada en estudios

para diferenciar pacientes frtiles Capacitacin tcnica epidemiolgicos de infertilidad

e infrtiles

COMETA Microscopio Fluorescencia Bajo costo Lento de ejecucin Fertilidad masculina Electroforsis DNA Requiere observador con Reproduccin asistida

experiencia Criopreservacin de esperma

SCD Microscopio Fluorescencia Anlisis simple de resultados An no determinada An no determinada

campo claro Bajo costo Varicocele?

DBD-FISH Microscopio Fluorescencia Revela modificaciones estructurales Procedimiento sofisticado An no determinada

de la cromatina. y costoso

Otros mtodos

NA Microscopio Fluorescencia Bajo costo Subjetiva Diferencias significativas en

Citometra de flujo Poco reproducible patologas androlgicas

AT Microscopio campo claro Mtodo simple y Subjetiva Evaluacin de anormalidades

de bajo costo Poco reproducible en la cromatina.

CMA Microscopio Fluorescencia Mtodo simple y Subjetiva Evaluacin de anormalidades

de bajo costo Poco reproducible en la cromatina.

TUNEL: Terminal dUTP Nick-End Labeling. ISNT = In situ Nick Translation. DBD-FISH: DNA Breakage Detection-Fluorescence In Situ Hybridization. SCSA: Sperm

Chromatin Structure Assay. SCD: Sperm Chromatin Dispersion. NA: Naranja de Acridina. AT= Azul de Toluidina. CMA: Cromomicina A3.


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naturalizacin y extraccin de las protenas utili-zando una solucin de lisis, el DNA generado decadena sencilla, puede hibridarse con una sondade DNA (Fig. 1). Cuantas ms roturas existan endicha cadena, mayor ser el nivel de marcado quese obtenga en el ncleo 22. Al igual que las tcni-cas de TUNEL o ISNT, la tcnica de DBD-FISH nose puede considerar de aplicacin rutinaria porrazones similares a las descritas previamente.Desde el punto de vista de la investigacin, tienemucho inters, ya que es la nica tcnica disponi-ble que nos permite evaluar dao de clula a clu-la, in situ, en secuencias especficas del DNA28.

Ensayo del cometa

En realidad este ensayo es una adaptacin de

la electroforesis de DNA desnudo, comnmenteutilizada en biologa molecular, al campo de labiologa celular. La idea es que el DNA de unncleo desproteinizado que contenga roturas ensus cadenas de DNA, estar mas libre para sermovilizado hacia el polo positivo, cuando ste sesometa a un campo elctrico5. La metodologabsica consiste en incluir una muestra de esper-matozoides en un microgel de agarosa sobre unportaobjetos y someterlo a una solucin de lisisque contenga un agente reductor de los grupos

sulfidrilo que se encuentran en la protaminas delespermatozoide, como por ejemplo DTT (dithioth-reitol). Tras la electroforesis, el microgel se tiecon sustancias fluorescentes del tipo DAPI (4,6diamidino-2-phenylindole), IP (Ioduro de Propi-dio) o SYBR-GREEN (Synergy Brand). De esta for-ma, el DNA fragmentado se desplaza generandouna imagen similar a la de un cometa (Fig. 2).Aquellos espermatozoides con su DNA integro nogeneran o slo producen imgenes de discretascolas de cometa, mientras que aquellos ncleosque tienen su DNA daado muestran un clarodesplazamiento de los mltiples fragmentos deDNA23 (Fig. 2). Al igual que las pruebas anterio-res, esta tcnica se aplica en investigacin y se

puede adaptar de forma sencilla para el anlisisde muestras de semen de otras especies29,30. Elmayor inconveniente de este ensayo es querequiere un material de uso no comn en unlaboratorio de androloga, como son fuentes deelectroforesis para DNA, y para la interpretacinde los resultados se requiere un observador conexperiencia o bien un software especfico paraque la prueba tenga cierta objetividad.

SCSA(Sperm Chromatin Structure Assay)La tcnica desarrollada por Evenson et al.21 hace

ahora casi 25 aos, se viene considerando como elreferente para el anlisis de la fragmentacin delDNA en el espermatozoide. Su aplicacin estrelativamente extendida en humanos y tambin

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FIGURA 1. Visualizacin de la integridad del DNA

mediante el mtodo de SCD (Sperm Chromatin Dispersin)combinado con DBD-FISH (DNA Breakage Detection-FISH).

1a. Los halos de dispersin de la cromatina muestran

espermatozoides con su DNA ntegro (ncleos 1,2,5,6),

mientras que los que no presentan halo o este es de tama-

o reducido, contienen DNA fragmentado (ncleos 3,4).

Tincin DAPI. 1b. Representa el mismo campo que la figu-

ra 1a tras DBD-FISH. Tan slo los espermatozoides eti-

quetados como 3 y 4 muestran una clara seal de hibri-

dacin, es decir, con roturas del DNA.

FIGURA 2. Visualizacin de la integridad del DNA media-

nte el ensayo de cometas. Los espermatozoides que pre-

sentan DNA fragmentado (parte inferior de la figura)

muestran un claro desplazamiento de los fragmentos de

DNA al ser sometidos a la accin de un campo elctrico.

Este no se aprecia en los ncleos que mantienen el DNA

ntegro (parte superior de la figura).


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ofrece buenos resultados en animales utilizadospara explotacin ganadera, tales como ganado por-cino y bovino. El principio en el que se sustenta latcnica es que la cromatina que presenta DNA frag-mentado tiene mayor susceptibilidad para ser des-naturalizada in situtras aplicar un tratamiento concalor o una solucin cida. La segunda parte de lametodologa se fundamenta en las caractersticasmetacromticas de la naranja de acridina. Estefluorocromo tiene la capacidad de intercalarseentre las dos cadenas de DNA como un monmero,que al ser excitado emite color verde, pero que pre-senta emisin en color rojo-anaranjado si se incor-pora al DNA de cadena sencilla. Las clulas asteidas se someten a citometra de flujo para dis-

criminar entre ambos tipos de color31. Esta tcnicaes la ms aceptada para establecer correlacionesentre fragmentacin de DNA y fertilidad de un indi-viduo. El grupo del Dr. Evenson ha establecido queindividuos con un porcentaje de fragmentacin ensu DNA de alrededor de un 30% o superior, pre-sentara problemas de fertilidad32. El inconvenien-te que tiene esta tecnologa es que no es accesiblea la mayora de los laboratorios, ya que al funda-mentarse en la utilizacin de la citometra de flujo,restringe su uso por las razones comentadas ante-

riormente para otras tecnologas.

Test SCD (Sperm Chromatin Dispersion)Desde que Calvin y Bedford en 197133 relata-

ron el papel que juegan los puentes disulfuro enla compactacin de la cromatina de los esperma-tozoides y las diferencias que existen con respec-to a la lnea somtica34,35, el anlisis de la estruc-tura de la cromatina espermtica experiment unenorme avance. El DNA del espermatozoide seencuentra unas seis veces mas compactado queel del cromosoma mittico. Este DNA se encuen-tra organizado en bucles de menor tamao quelos de las clulas somticas, anclados a la matriznuclear. Dichos bucles se compactan por laaccin de las protaminas intercaladas, las cualesestabilizan rgidamente la estructura a travs dela formacin de puentes disulfuro entre ellas. Sise rompen los enlaces disulfuro y se usa una

solucin especfica de lisis para extraer prote-nas, los bucles de DNA se relajan constituyendohalos alrededor de la estructura nuclear centralresidual. Se ha comprobado que, tras un trata-miento cido previo, aquellos espermatozoidescon DNA fragmentado no sueltan o ven impedidaen gran medida la liberacin de los bucles deDNA, mostrando halos muy reducidos o ausenciade los mismos, al contrario que los espermatozoi-des sin fragmentacin de DNA24. Simplementevalorando el tamao de los halos de dispersin de

la cromatina, mediante microscopia tanto decampo claro como de fluorescencia, es posiblereconocer la presencia de fragmentacin de DNAen los espermatozoides humanos36 (Fig. 3). Esta

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FIGURA 3. Visualizacin de la integridad del DNA mediante el test SCD (Sperm Chromatin Dispersion) y visualizacin en

microscopa de campo claro (a-e; tincin: colorante de Wright) y microscopa de fluorescencia (a-e: tincin SYBR-Green).

Mientras que los espermatozoides etiquetados como a y b, tienen su DNA integro, el resto presentan DNA fragmentado

(ver DBD-FISH).


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valoracin puede ser automatizada, empleandoprogramas informticos asociados a sistemastipo CASA (Computer Assisted Sperm Analyzer).La tcnica, al igual que ocurre en el caso delensayo cometa, requiere que los espermatozoidesse incluyan en microgeles de agarosa, pero sinelectroforesis, con lo cual el mtodo se simplificanotablemente. La principal ventaja de esta tcni-ca es que la interpretacin de los resultados norequiere la determinacin de color, ni de intensi-dad de fluorescencia y no necesita de un equipocomplejo, ni personal especializado.

Los resultados preliminares de esta prueba,muestran una correlacin con otras metodolog-as, tales como el SCSA o el TUNEL25,36. Adems

existe una versin comercial del producto quefacilita su uso en laboratorios bsicos. La pruebaSCD se ha ensayado con xito para la determina-cin de la fragmentacin del DNA en otras espe-cies, tales como ratn y ganado porcino37,38.Dada su sencillez y no requerimiento de ningnequipo no convencional, se ha propuesto que latcnica SCD puede ser potencialmente utilizadacomo prueba de rutina en el estudio de fragmen-tacin de DNA espermtico en los laboratoriosbsicos de androloga.

METODOLOGAS ALTERNATIVASPrueba de naranja de acridina

Utilizando las propiedades metacromticas dela naranja de acridina, algunos investigadoreshan aplicado el mismo principio que el utilizadoen el SCSA para visualizar los espermatozoidescon DNA fragmentado empleando microscopa defluorescencia39-41. El mayor problema de esta tc-nica es el componente de la subjetividad delobservador en el momento de discriminar entre laemisin del color verde y el naranja de este fluo-

rocromo, dado que existe toda una serie de colo-res intermedios que probablemente se relacionancon una sensibilidad diferencial a la desnaturali-zacin de los distintos espermatozoides. Ademslos resultados no parecen muy reproducibles, yaque parecen variar con el tiempo, y no distingueentre pacientes infrtiles y donantes25 .

Azul de Toluidina

El azul de Toluidina es un colorante nuclearbsico que genera reacciones metacromticas

cuando interacciona con la cromatina. Cuandoeste colorante se incorpora en cromatina rica enhistonas, con abundancia de lisina, presenta unacoloracin violeta-azulada intensa, mientras quecuando lo hace a cromatina rica en protaminaspresenta una coloracin azul-plida42. Se trata-ra, en realidad, de una prueba de maduracin-condensacin nuclear, y los espermatozoides concromatina inmadura tendran ms habitualmen-te roturas del DNA. La tcnica es simple y de unbajo coste y tiene la ventaja de proporcionar pre-paraciones permanentes para su uso en unmicroscopio ordinario, aunque las tincionesintermedias son de difcil valoracin. El anlisisde los resultados tambin puede realizarse en

citometra de flujo43, con los inconvenientes yamencionados. Desafortunadamente, los resulta-dos son poco reproducibles26.

Cromomicina A3 (CMA3)

La Cromomicina A3 es un fluorocromoampliamente utilizado en citogentica debido aque produce una buena diferenciacin longitudi-nal de los cromosomas, ya que se ancla especfi-camente a regiones ricas en guanina-citosina ycompite por los mismos lugares en el DNA, que

las protaminas. Por lo tanto, cuando los esper-matozoides presentan una tincin intensa trasser teidos con CMA3, se interpreta que estapoblacin celular muestra unos niveles bajos deprotaminacin. Es decir, esta tcnica revelaespermatozoides que tienen un nivel deficiente deempaquetamiento en su cromatina20, siendotambin una prueba de maduracin-condensa-cin nuclear. De nuevo, una de las limitacionesms importantes de esta tcnica es la subjetivi-dad del observador a la hora de establecer losgrupos de clasificacin. No obstante, algunos

estudios la muestran como una prueba de elec-cin frente a la naranja de acridina, o derivadosde la toluidina, para el anlisis de la maduracinnuclear del espermatozoide44 .

SIGNIFICADO CLNICO DEL DAO ENEL DNA DEL ESPERMATOZOIDE

La calidad de la cromatina en el espermato-zoide est siendo considerada como un nuevoparmetro de calidad seminal, con posible rela-cin con la fertilidad del individuo. Existen evi-

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dencias que indican que la integridad del DNAespermtico se relaciona con la fertilidad de unapareja y ayuda a predecir las oportunidades deembarazo y de xito de stos5. En concepcinnatural, diversos estudios indican un impactosignificativo del dao del DNA espermtico en lafertilizacin. De esta forma, tanto los datos obte-nidos con la tcnica de TUNEL como con el SCSA,ofrecen diferencias significativas en los nivelesdel dao en el DNA del esperma entre varonesque se consideran frtiles y aquellos que se con-sideran estriles45-47. El nivel de corte para losvalores de fragmentacin del DNA propuesto porEvenson, establece que la probabilidad de la fer-tilizacin in vivo es cercana a cero si la propor-

cin de espermatozoides con dao excede el30%32,48. Aunque el establecimiento de unascifras umbral para predecir la fertilidad es discu-tido por otros autores, existe la conviccin de quela calidad seminal, la capacidad de fertilizacin,la calidad del embrin y el desarrollo hasta blas-tocisto, se ven influenciados por la frecuencia deespermatozoides con DNA fragmentado presentesen la muestra49.

Habra que sealar que la fragmentacin delDNA no parece tener una correlacin plena con

ninguno de los parmetros clsicos de calidadseminal que se analizan para estimar la capaci-dad fertilizante de un individuo. Por lo tanto, seaconseja su estudio con el fin de tener una visinms completa de la calidad seminal. El ndice defragmentacin del DNA, evaluado mediante latcnica SCSA, presenta una dbil o moderadacorrelacin con los criterios clsicos de calidadespermtica50,51. Sin embargo, mediante la pruebaTUNEL y ensayo cometa se ha demostrado unacorrelacin inversa entre el porcentaje de esper-matozoides con DNA fragmentado, la motilidad, la

concentracin y los parmetros morfolgicos rela-cionados con formas anormales52. El dao en elDNA, evaluado mediante SCD, muestra un incre-mento significativo de este parmetro en pacientescon oligoastenoteratozoospermia (47,1%17,3) yen pacientes normozooprmicos (27,3%11,7),frente a individuos frtiles (16,3%6,0)36. Sinembargo, el establecimiento de una correlacinentre un alto grado de fragmentacin en el DNAespermtico y ausencia de embarazo, no se hallegado a establecer de forma absoluta, siendo

discutida por diversos autores53. Obviamente, lacapacidad que presenta el oocito para reparar elDNA daado, tambin debe ser considerada.Posiblemente este problema subyazca con ciertafrecuencia en las infertilidades mixtas. Dado elnivel actual de conocimiento, lo ms sensato estratar la fragmentacin del DNA en el contextoglobal del seminograma, como un parmetro adi-cional que complementara el estudio del semen,para obtener una visin mucho ms completa dela situacin particular de cada individuo.

LA FRAGMENTACIN DEL DNAEN LA CLNICA DIARIA

Las prcticas de reproduccin asistida (inse-

minacin intrauterina, fertilizacin in vitro oinyeccin espermtica intracitoplasmtica en eloocito), requieren una seleccin artificial previade las muestras de semen, lo que podra provocarcierto dao en el DNA de los espermatozoides,incluso aquellos que se evalan como normalespor su apariencia morfolgica, podran tener undao no detectable. Esta situacin es particular-mente crtica en pacientes sometidos a una selec-cin de espermatozoides rigurosa para ser inclui-dos en programas de ICSI. La centrifugacin de

muestras de semen con gran proporcin deespermatozoides inmaduros, que producen altosniveles de ROS, puede resultar en incremento deldao al resto de espermatozoides54,55. Los proce-sos de congelacin-descongelacin no parece queafecten al nivel de fragmentacin en los indivi-duos frtiles. Sin embargo, esto puede no ser ascon los espermatozoides de los individuos infrti-les56. En general, las tasas de xito tras ICSI semantienen en un rango superior a un 65%57,pero, quizs, si se consiguiesen espermatozoidesy por supuesto oocitos de mayor calidad, estosrangos de eficacia podran verse mejorados.

Diversos estudios parecen indicar que la valo-racin de la fragmentacin del DNA de los esper-matozoides es ms predictiva de consecucin deembarazo al aplicar tcnicas de FIV que en elICSI58-60. En la inseminacin intrauterina, utili-zando la tcnica de TUNEL para la valoracin dela fragmentacin del DNA, se ha comprobadoque, en muestras de semen que contienen msdel 12% de espermatozoides con DNA fragmenta-do, las posibilidades de lograr un embarazo dis-

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minuyen de manera drstica61. Asmismo, se hacomprobado que la probabilidad de conseguir unembarazo tras ICSI, tambin es mucho ms pro-blemtica si la proporcin de espermatozoidescon dao en el DNA excede el 30%62,63.

Ciertos trabajos empleando el SCSA, sugierenque la oportunidad de embarazo despus de FIVo ICSI es significativamente mayor cuando elndice de fragmentacin es menor al 27%60,64. Enel caso de la utilizacin de ISCI y utilizando prue-bas de ISNT, TUNEL y ensayo de cometas, se hanencontrado correlaciones negativas entre el daodel DNA espermtico y la fertilizacin del oocito,la calidad del embrin7y el desarrollo hasta blas-tocisto64,65, as como con la implantacin del

embrin66. Recientemente, la determinacin de lafragmentacin del DNA mediante la tcnica SCDha demostrado una correlacin con todos estosparmetros67. Ciertos resultados parecen indicarque la incidencia de la fragmentacin del DNAespermtico puede tener especial relevancia enlas prdidas embrionarias. Cuando ocurre la fer-tilizacin con un espermatozoide que presentadao en su DNA, la habilidad del oocito pararepararlo depende de la severidad de dichodao68. Por lo tanto, el desarrollo embrionario

puede fallar en cualquier etapa o llegar a trminocon ciertas anomalas. Se ha demostrado que laproporcin de espermatozoides con DNA frag-mentado, detectado mediante TUNEL, es signifi-cativamente ms alta en varones de parejas conabortos recurrentes (38,04,2%), comparado conla de la poblacin general (22,02,0%) o con la dedonantes frtiles (11,91,0%)69. Adems, se hasealado que un ndice de fragmentacin de DNAde espermatozoides mayor del 30% (evaluadomediante SCSA) se asocia no slo con ndicesbajos de embarazo, si no tambin con prdidasfetales4. A pesar de estos trabajos, los datossobre la posible relacin entre la fragmentacindel DNA de los espermatozoides y el desarrollo deabortos espontneos, tanto aislados como de repe-ticin, son escasos y por lo tanto no se pueden con-siderar que sean concluyentes4,63,70,71. Sin embar-go, este puede ser unos de los campos donde lafragmentacin del DNA puede tener una relacinmuy clara y directa con un efecto determinado.

Un tipo diferente de contexto clnico es el queafecta a pacientes con cncer. En estas situacio-

nes, donde con frecuencia se tiene que recurrir atratamientos de quimio o radioterapia, la proba-bilidad que estos pacientes dejen descendencia,es muy baja cuando estn sometidos a trata-miento. Una de las razones que podra explicareste hecho, se relaciona con un mayor nivel defragmentacin del DNA espermtico que experi-mentan este tipo de pacientes, al ser comparadoscon grupos control72. En estos pacientes, surge lanecesidad de criopreservar espermatozoides, conbajos niveles de dao del DNA, para su posibleuso en programas de reproduccin asistida26.

La tcnica de SCD ha demostrado reciente-mente que los individuos con varicocele, si bienpueden tener un nivel de fragmentacin ms alto

que los frtiles, ste no tiene porqu ser diferentedel resto de los infrtiles. Sin embargo, el perfil dedistribucin de las categoras de dao es pecu-liar. De cada 4 espermatozoides con DNA frag-mentado, uno es de tipo degradado. Es decir, conel nivel ms alto de dao en el DNA. Sin embar-go, en el resto de grupos, frtiles e infrtiles, laproporcin es de un espermatozoide degradadopor cada 8-9 fragmentados17. Quizs esta situa-cin podra ser un marcador que ayudase al cl-nico a sospechar la presencia de varicocele, aun-

que no deben descartarse otras posibles patolog-as crnicas.

Las patologas infecciosas tambin puedentener repercusin a este nivel. Algunos estudiosrecientes sugieren que las infecciones por ciertascepas de microorganismos podran afectar a laintegridad del DNA. La incubacin de muestras desemen con Escherichia coli o con Staphylococcusaureus parece inducir una mayor frecuencia deespermatozoides con localizacin de fosfatidilseri-na en la cara externa de la membrana plasmtica.Situacin que se suele asociar con la apoptosis. Latcnica de TUNEL ha demostrado un incrementode los niveles de fragmentacin, tras co-incubarespermatozoides con cuerpos elementales deChlamydia trachomatis73. Finalmente, la incuba-cin con DNA de los papilomavirus tipo 16 y 31,tambin increment los niveles de fragmentacindel DNA, medidos tras un ensayo de cometas74.

CONCLUSIONESLa evidencia en la literatura demuestra que el

dao del DNA en los espermatozoides afecta el

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resultado de la fertilidad de tal forma que, unsemen que presente una frecuencia alta de esper-matozoides con DNA fragmentado tendra mayordificultad para producir un embarazo, que unsemen con bajo nivel de fragmentacin. Debido aque la presencia de DNA fragmentado en el esper-matozoide puede tener un origen multifactorial,una de las lneas prioritarias de investigacin sedebiera centrar en llegar a comprender culesson lo mecanismos reales implicados en el dispa-ro de este proceso y por otra, llegar a establecercon nitidez bajo qu circunstancias este factorafecta a la fertilidad de los individuos.

Por ltimo, resaltar que no existe un consen-so claro sobre la tcnica que se debe utilizar para

medir el dao en el DNA de los espermatozoidesde pacientes considerados como sub-frtiles.Actualmente, dada su antigedad, el SCSA esquizs la tcnica que ha sido ms empleada75.Sin embargo, es un mtodo cuyo equipamientolimita su aplicacin en un laboratorio bsico deandrologa. Otras alternativas como el SCD semuestran como de mayor proyeccin y fcil apli-cacin en la clnica rutinaria.

Agradecimientos

Los autores agradecen a la Coordinacin deInvestigacin en Salud del IMSS, por el apoyo otorgadopara la realizacin de estancias de investigacin en elextranjero. Parte de este trabajo se realiz con los fon-dos de los proyectos PGIDIT05SAN43PR y BOS2003-04263 de la UAM.

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Correspondencia autor: Prof. J. GoslvezDepartamento de Biologa. Unidad de GenticaUniversidad Autnoma de Madrid (UAM) 20849-MadridE-mail autor: [email protected] artculo: Original - InfertilidadTrabajo recibido: noviembre 2006Trabajo aceptado: diciembre 2006

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anexo 2 cometa

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