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ESCUELA SUPERIOR POLITECNICA DE CHIMBORAZO

FACULTAD DE CIENCIAS

ESCUELA DE BIOQUMICA Y FARMACIA

SEPARACIN DE METABOLITOS SECUNDARIOS DE MARTIN GALVIS

(Senna multijuga) CON ACTIVIDAD ANTIBACTERIANA

TESIS DE GRADO

PREVIA LA OBTENCIN DEL TTULO DE

BIOQUMICO FARMACETICO

PRESENTADO POR

DIANA ELIZABETH SISALEMA SNCHEZ

RIOBAMBA- ECUADOR

2013

2

DEDICATORIA

A Dios por ser mi gua espiritual por haberme permitido

llegar a este punto por darme la vida para lograr mis

objetivos y por su infinita bondad y amor.

A mis padres por darme la vida y ser mi pilar fundamental

de lucha y perseverancia.

A mi hermano Walter por estar conmigo y apoyarme

siempre.

A mi esposo Huguito por su amor constante y por ensearme a ser perseverante y a no desmayar frente a las

adversidades de la vida.

A mis gemelitas Anah y Fernandita quienes sern mi

nueva gua de mis metas e ideales.

3

AGRADECIMIENTO

Mi gratitud, principalmente est dirigida a Dios por

haberme dado la existencia y permitido llegar al final de

una etapa ms en mi vida.

A la Escuela Superior Politcnica de Chimborazo por ser los forjadores de mi enseanza.

A la Dra. Cumand Jtiva por su asesoramiento en la

direccin de la presente tesis por sus conocimientos que han sido el eje fundamental para la culminacin de mi trabajo.

Al Dr. Jacinto Mera, por la colaboracin desinteresada

que me ha brindado en el transcurso del trabajo de tesis y por motivarme a la realizacin de la misma.

A los Drs. Miembros del tribunal de Tesis por el gran aporte

brindado en la elaboracin del trabajo.

A mis padres por haberme apoyado en todo momento, por

sus consejos, sus valores, por la motivacin constante que

me ha permitido ser una persona de bien.

A mi amor eterno Huguito por siempre estar a mi lado,

brindndome todo su amor, entrega, dedicacin y sobre

todo tenerme mucha comprensin y paciencia.

A todas las personas que colaboraron de una u otra

manera para la culminacin de este trabajo de

investigacin.

4

ESCUELA SUPERIOR POLITCNICA DE CHIMBORAZO

FACULTAD DE CIENCIAS

ESCUELA DE BIOQUMICA Y FARMACIA

El Tribunal de Tesis certifica que: El trabajo de investigacin: SEPARACIN DE

METABOLITOS SECUNDARIOS DE MARTIN GALVIS Senna multijuga CON

ACTIVIDAD ANTIBACTERIANA, de responsabilidad de la seorita egresada Diana

Elizabeth Sisalema Snchez, ha sido prolijamente revisado por los Miembros del Tribunal de

Tesis, quedando autorizada su presentacin.

FIRMA FECHA

Dr. Silvio Alvarez L. --------------------------- -----------------------------

DECANO FAC. CIENCIAS

Dr. Ivn Ramos. --------------------------- -----------------------------

DIRECTOR ESCUELA

BIOQUMICA Y FARMACIA

Dra. Cumand Jtiva. --------------------------- -----------------------------

DIRECTOR DE TESIS

Dr. Jacinto Mera ---------------------------- -----------------------------

MIEMBRO DEL TRIBUNAL

Tc. Carlos Rodrguez ---------------------------- ------------------------------

DIRECTOR CENTRO

DE DOCUMENTACIN

NOTA TESIS --------------------------

i

Yo, Diana Elizabeth Sisalema Snchez soy responsable de

las ideas, doctrinas y resultados expuestos en esta Tesis; y el

patrimonio intelectual de la Tesis de Grado, pertenece a la

ESCUELA SUPERIOR POLITCNICA DE

CHIMBORAZO

________________________________________

DIANA ELIZABETH SISALEMA SNCHEZ

NDICE DE ABREVIATURAS

Bu(OH) Butanol

C6H6 Benceno

CeSO4 Sulfato de cerio

Cl3CH

CH3COOH

Cloroformo

cido actico

Et(OH)

EtOAc

Etanol

Acetato de etilo

Exten.conj

g

Extencin de la conjugacin

Gramo

H2SO4 cido sulfrico

KOH

Me(OH)

Hidrxido de potasio

Metanol

mL Mililitros

nm.

CCF

CCFP

Nanmetros

Cromatografa en capa fina

Cromatografa en capa fina preparativa

UV

Ultravioleta

Longitud de onda

i

NDICE GENERAL

NDICE DE ABREVIATURAS............................................................................................ i

NDICE DE CUADROS ..................................................................................................... vi

NDICE DE TABLAS ....................................................................................................... vii

NDICE DE GRFICOS .................................................................................................. viii

NDICE DE FIGURAS ....................................................................................................... ix

NDICE DE FOTOGRAFAS .............................................................................................. x

NDICE DE ANEXOS ........................................................................................................ xi

NTRODUCCIN

1. MARCO TERICO.......................................................................................... 1

1.1 Plantas medicinales.......................... 1

1.2 Cassia angustifolia-Valh (India). 1

1.3 Senna multijuga................... 4

1.3.1 Clasificacin cientfica 5

1.3.2 Descripcin.................. 5

1.4 Extractos vegetales.................. 6

1.4.1 Mtodos de Extraccin 6

1.4.1.1 Maceracin...... 6

1.4.1.2 Percolacin o lixiviacin. 6

1.4.2 Clasificacin de los Extractos Vegetales..................... 7

1.4.3 Preparacin de Extractos 7

1.4.4 Especificaciones de calidad de la droga vegetal.. 8

1.4.5 Concentracin de extractos.. 9

1.5 Tamizaje Fitoqumico.. 9

1.5.1 Fundamento......................................................................................................... 9

1.5.2 Metodologa en el anlisis fitoqumico.... 10

1.5.3 Reacciones de identificacin .................. 10

1.6 Cromatografa de capa fina.. 15

1.6.1 Concepto de Rf.................... 15

1.6.2 Cromatografa en columna.................. 16

1.6.3 Cromatografa preparativa................... 16

1.7 Cromatografa en Capa Fina de Senna fructus y follum.................. 17

ii

1.8 Espectrofotometra................... 18

1.8.1 Espectrofotometra ultravioleta-visible... 19

1.8.2 El espectrofotmetro.................................................... 19

1.8.3 Caractersticas del sistema................... 19

1.9 Reglas de Woodward-Fieser ................... 21

1.9.1 Aplicacin de las reglas de Woodward-Fieser................... 23

2. PARTE EXPERIMENTAL.............................................................................. 28

2.1 Lugar de la investigacin..... 28

2.2 Materiales, Equipos y Reactivos.......... 28

2.2.1 Materiales.... 28

2.2.1.1 Material vegetal... 28

2.2.1.2 Materiales de laboratorio..................... 28

2.2.2 Equipos.................... 30

2.2.3 Reactivos...................... 30

2.3 Mtodos y tcnicas.. 31

2.3.1 Recoleccin.............................. 31

2.3.2 Comprobacin taxonmica.. 31

2.3.3 Procesamiento de la materia prima...................... 32

2.3.4 Obtencin de los extractos botnicos...................... 32

2.3.5 Preparacin de los sub extractos.............................. 33

2.3.5.1 Sub extracto etreo.............................. 33

2.3.5.2 Sub extracto clorofrmico................... 33

2.3.5.3 Sub extracto Butanlico... 34

2.3.6 Determinacin de las propiedades organolpticas y fsicas.................... 34

2.3.6.1 Color.................... 34

2.3.6.2 Olor...................... 34

2.3.6.3 Aspecto....... 34

2.3.6.4 Determinacin de la densidad relativa.................... 36

2.3.6.5 Determinacin del ndice de refraccin................... 36

2.3.6.6 Determinacin del pH del extracto ..... 37

iii

http://es.wikipedia.org/wiki/Espectrofot%C3%B3metro

2.3.7 Tamizaje fitoqumico....................... 37

2.3.7.1 Ensayo de la espuma................................................ 37

2.3.7.2 Ensayo de H2SO4 concentrado. 38

2.3.7.3 Ensayo de Shinoda... 38

2.3.7.4 Ensayo del cloruro frrico....................... 38

2.3.7.5 Ensayo de Borntrger.................. 38

2.3.7.6 Ensayo de Dragendorff.................... 39

2.3.7.7 Ensayo de Wagner....................... 39

2.3.7.8 Ensayo de Rosentaler ...................... 39

2.3.7.9 Ensayo de Baljet...................... 40

2.3.7.10 Ensayo de Sudan III..................... 40

2.3.7.11 Ensayo de Liebermann-Burchard.... 40

2.3.8 Anlisis cromatogrficos del extracto y sub extractos............................ 41

2.3.8.1

2.3.8.2

2.3.8.3

2.3.8.4

2.3.8.5

3.

3.1

3.2

3.3

3.4

3.5

3.5.1

3.5.2

3.5.3

4.

5.

6.

7.

Comparacin cromatogrfica del Sen y Senna multijuga

Separacin de metabolitos secundarios del sub extracto etreo II..................

Tratamiento del Sub extracto clorofrmico III....................

Tratamiento del Sub extracto Butanlico IV...

Purificacin de metabolitos del extracto Etanlico I...

RESULTADOS Y DISCUSIN...

Composicin taxonmica e identificacin botnica....................

Control de calidad de la droga.................

Propiedades organolpticas y tamizaje fitoqumico....................

Discusin de resultados de las cromatografas....................

Determinacin de compuestos en el UV.................

Determinacin de compuestos del sub extracto etreo........................

Determinacin de compuestos del sub extracto Butanlico....................

Determinacin de compuestos del sub extracto Etanlico..................

CONCLUSIONES.

RECOMENDACIONES...

RESUMEN.

BIBLIOGRAFA...

41

42

44

44

45

55

55

55

55

57

60

60

61

62

64

66

67

70

iv

8.

ANEXOS.....................

.

78

v

INDICE DE CUADROS

CUADRO No. 1 Esquema de preparacin de los extractos y sub

extractos. 35

CUADRO No. 2 Preparacin del extracto de sen. 41

CUADRO No. 3 Tratamiento de las fracciones 7-22... 44

vi

NDICE DE TABLAS

TABLA No. 1 Valores de absorcin para las BI y BII de los diferentes

flavonoides..............................

21

TABLA No. 2 Valores Rf y mximos de absorcin de algunas

antraquinonas.......... 21

TABLA No. 3 Determinacin de % de sub extractos............. 40

TABLA No. 4 Comparacin del sen y Senna multijuga. 41

TABLA No. 5 Resultados de propiedades fsicas y reacciones de coloracin del

extracto etanlico

56

TABLA No. 6 Determinacin de compuestos UV (cumarinas)......... 60

TABLA No. 7 Determinacin de compuestos UV (flavonoides)... 61

TABLA No. 8 Determinacin de compuestos UV (sesquiterpeno lactonas).......... 62

TABLA No. 9 Determinacin de compuestos UV (antraquinonas)... 62

vii

NDICE DE GRFICOS

GRFICO No. 1

TLC de Senna fructus y folium. 18

viii

NDICE DE FIGURAS

FIGURA No. 1 Estructuras de compuestos antracnicos . 3

FIGURA No. 2 Placa preparativa.. 17

FIGURA No. 3 Estructura de sensidos ........... 18

ix

NDICE DE FOTOGRAFAS

FOTOGRAFA No. 1 Martin Galvis, Senna multijuga 4

x

NDICE DE ANEXOS

ANEXO No. 1 Tamizaje fitoqumico del extracto etanlico.. 78

ANEXO No. 2 Espectrofotometra UV...... 79

xi

INTRODUCCIN

El empleo de las plantas medicinales con fines curativos es una prctica que se ha utilizado

desde tiempo inmemorial. Durante mucho tiempo los remedios naturales, y sobre todo las

plantas medicinales fueron el principal e incluso el nico recurso que disponan los mdicos.

Esto hizo que se profundizara en el conocimiento de las especies vegetales que poseen

propiedades medicinales y ampliar su experiencia en el empleo de los productos que de ellas

se extraen.

En la actualidad las especies del gnero Senna han sido segregadas en dos gneros ms,

Chamaecrista Moench (250 especies) y Senna Mill. (250 especies) basndose en el detalle

androceo, de los frutos y la semillas se encuentran entre 2700 3800 msnm. Existen la Cassia

senna L.(Cassia acutifolia Delile, Senna alexandrine Mill) y Cassia augustifolia Valh, la

Cassia tora L. es utilizada en el Per como sustituto del caf, existe tambin la Cassia alata

L. (Senna alata L. Roxb), la Cassia occidentalis (Senna occidentalis L.) usada como laxante

y purgante.

Los vegetales del gnero Cassia o Senna son conocidas por la presencia de compuestos

antraquinnicos, reportados con diferentes acciones farmacolgicas. Estudios etnobotnicos

realizados en Cuba, reconocen a varias especies de Cassia como plantas que poseen inters

por sus propiedades medicinales y se reportan empleos tradicionales como antihipertensivos,

antiinflamatorios, antiinfecciosos, diurticos, antitumorales, antianmicos, antimicrobianos,

antiherpticos, anticatarrales, analgsicos, contra afecciones cutneas, para el tratamiento de

trastornos estomacales, espasmos, clicos nefrticos y clculos renales.

Se reporta como la accin ms reconocida de las quinonas detectadas en las plantas del gnero

Cassia la de laxante, por ejemplo, algunas antraquinonas presentes en el Sen (Cassia

angustifolia). Tambin se han reconocido los efectos beneficiosos de las hojas de estas plantas

en el tratamiento antiparasitario y contra infecciones cutneas de origen bacteriano y fngico.

La revisin bibliogrfica de la Senna multijuga indica se emplea en la Amazona ecuatoriana,

la infusin de Martin Galvis como antiinflamatorio.

En la Universidad Federal de Juiz de Fora, Laboratorio de productos Naturales Bioactivos, de

Brasil, se realiz un estudio sobre la actividad antimicrobiana y antioxidante de algunos

extractos de plantas en el que incluyen Senna multijuga, obteniendo resultado positivo para

Staphylococcus aureus (ATCC 6538) por lo cual ha motivado el inters de investigacin para

realizar el anlisis de sus metabolitos secundarios.

Con estas razones se plante los siguientes objetivos identificar la especie de Senna multijuga

existente en la Regin del Oriente Ecuatoriano Lago Agrio, Preparar el extracto y

subextractos, Identificar los grupos fitoqumicos por mtodos fsicos cromatogrficos,

Extraer, purificar y posible identificacin de metabolitos secundarios del extracto de Martin

Galvis (Senna multijuga).

Esta investigacin empieza con la identificacin taxonmica de la especie y una vez obtenida

el vegetal fue necesario que en conocimiento de que las antraquinonas son los metabolitos

secundarios presentes en las diversas variedades de Sennas se realiz la preparacin de los extractos etanlicos y sub extractos etreo, clorofrmico y butanlico seguida de la realizacin

del Tamizaje Fitoqumico para determinar la presencia de que grupos fitoqumicos estn

presentes en la composicin qumica de la Senna multijuga.

Posteriormente se separ, purific y se determin su posible estructura mediante mtodos

espectroscpicos (UV). Se hizo posible separar los metabolitos mediante la extraccin de

solventes orgnicos, separando cromatogrficamente ya sea en CCF, placa preparativa o en

columna y mediante las reglas de Woodward- Fieser la posible estructura de estos metabolitos

teniendo como resultado a los flavonoides, cumarinas, terpenoides y antraquinonas.

CAPTULO I

1. MARCO TERICO

1.1 PLANTAS MEDICINALES

Plantas medicinales: Son aquellos vegetales que elaboran unos productos llamados principios

activos, que son sustancias que ejercen una accin farmacolgica, beneficiosa o perjudicial,

sobre el organismo vivo. Su utilidad primordial, a veces especfica, es servir como droga o

medicamento que alivie la enfermedad o restablezca la salud prdida; es decir que tienden a

disminuir o neutralizar el desequilibrio orgnico que es la enfermedad. Constituyen

aproximadamente la sptima parte de las especies existentes.(1)(3)(4)(20)

1.2 Cassia angustifolia-Valh (INDIA)

Los frutos y las hojas de la planta de sen contienen los llamados sensidos, que ejercen su

efecto laxante bien tolerado y seguro en destino, en el extremo del intestino grueso. Sensidos

actan en total: laxante. La motilidad intestinal es estimulada.

La liberacin de sodio y agua en el intestino se inhibe, por lo que ms agua que permanece en

el intestino y las heces se mantiene hmedo.

La afluencia de agua y electrolitos en el intestino se promueve.(26)(27)

Aplicacin

- 2 -

Se recomienda el uso de sen como laxante estimulante con un estreimiento grave, si un

cambio en la dieta y agentes de relleno no han tenido el efecto deseado.

Adems, una aplicacin puede ser til para:

Enfermedades en las que un taburete suave es deseable, como las hemorroides, fisuras anales

o ciruga del recto-anal.

Limpieza del intestino antes y despus de la ciruga en el abdomen o de los rayos X.

Contraindicaciones No se debe utilizar Senna en:

Intestino (leo)

Apendicitis las enfermedades crnicas inflamatorias intestinales como la enfermedad de

Crohn, la colitis ulcerosa.

Dolor abdominal de causa desconocida

Deshidratacin severa.

Alergia al sen en el embarazo y la lactancia

Los nios menores de 12 aos

Efectos secundarios

Si se aplica correctamente, son efectos secundarios raros. En raras ocasiones puede causar

molestias gastrointestinales como calambres, que puede ser resuelto por una dosis ms baja.

Tambin puede ocurrir en algunos casos de reacciones alrgicas tales como picor, urticaria y

erupcin cutnea. (14)(27)

Interaccin

El uso a largo plazo no debe hacerse. En general, una aplicacin es suficiente de 1 a 2 semanas.

Si se abusa, puede causar una deficiencia de potasio. La deficiencia de potasio aumenta el

efecto de ciertos medicamentos, tales como glucsidos cardiacos (para la insuficiencia

cardaca) y antiarrtmicos (para trastornos del ritmo cardiaco). Por otra parte, las prdidas de

- 3 -

potasio se ven reforzadas por ciertos medicamentos como los diurticos de tiazida,

Nebenierenrindensteroide (cortisona) y raz de regaliz.

Dosis

La dosis de la droga no debe exceder de 30 mg diario. Lo importante y til es una dosis

individual.

La diarrea o heces muy lquidas es un signo seguro de dosis muy altas o el uso frecuente de

esta droga.

El Senna est disponible en formas farmacuticas diferentes, por ejemplo en forma de

comprimidos o t. Los tees debe aplicarse en forma de infusin en fro, porque es mejor

tolerada.(47)

Componentes:

- Antraquinonas: Rehina, aloemodina, Sensidos A y B; C y D

- Flavonoides: Kamferol.

- cido crisofnico

- Cumarinas: visnadina

- sitosterol

- Aceites y resinas(11)((18)

FIG N1 ESTRUCTURAS DE COMPUESTOS ANTRACNICOS

FUENTE: http.quinonasp.pdf.co

- 4 -

Kamferol Sitosterol

Uso Tradicional: las hojas de Senna se han utilizado tradicionalmente como una de las

principales recursos para el tratamiento de estreimiento.(32)(50)

1.3 Senna multijuga

FOTOGRAFA N1 MARTIN GALVIS, Senna multijuga FUENTE: http://www.henrietteesherbal.com

Senna es un gnero de la familia Fabaceae con alrededor de 250 especies. Es nativo de todas

las regiones tropicales con alguna de las especies distribuidas por las regiones

templadas.(43)(49)

http://es.wikipedia.org/wiki/Genushttp://es.wikipedia.org/wiki/Fabaceaehttp://es.wikipedia.org/wiki/Especies

- 5 -

1.3.1 CLASIFICACIN CIENTFICA

Clase: Equisetopsida C. Agardh

Subclase: Magnoliidae Novk ex Takht.

Superorden: Rosanae Takht.

Orden: Fabales Bromhead

Familia: Fabaceae Lindl.

Gnero: Senna Mill.

Especie: Senna multijuga

1.3.2 DESCRIPCIN

Nombre comn: Martin Galvis

Forma de vida: rbol de hasta 12 m de alto y a. d. p. de hasta 40 cm, tronco derecho y copa

aplanada con las ramas ascendentes.

Corteza: externa lisa, pardo griscea, con numerosas lenticelas protuberantes dispuestas en

lneas horizontales. Interna pardo verdosa, ligeramente fibrosa de sabor muy amargo, exuda

un jugo verde amarillento. Grosor de la corteza de 7 a 8 mm.

Hojas: Dispuestas en espiral, paripinnadas, de 5 a 13 cm de largo incluyendo el peciolo,

compuestas por 20 a 50 pares de foliolos opuestos subssiles; laminas lineares con margen

entero y revoluto, pice redondeado y mucronado. Haz verde opaco y ligeramente glauco en

el envs con el margen pubescente.(43)(47)

Flor: En panculas o racimos axilares y terminales de 5 a 10 cm de largo, zigomorfas de 1.5 a

2.5 cm de dimetro, de color amarillo. Florecen de julio a enero.

- 6 -

Fruto: Vainas de 10 a 15 cm de largo y de 1.5 a 2 cm de ancho, aplastadas con numerosas

septos angostos y paralelos, negras y glabras, cada septo contiene una semilla aplastada de 1

cm de largo, de color pardo brillante. Fructificacin de noviembre a febrero.

Distribucin: Esta especie se presenta en la vertiente del Golfo desde el sur de Hidalgo hasta

el norte de Chiapas. Es abundante en la vegetacin secundaria derivada de selvas altas o

medianas perennifolias y subperennifolias.

Usos: Se emplea frecuentemente como rbol de ornato. (50)

1.4 EXTRACTOS VEGETALES

Se define como extracto vegetal el producto lquido obtenido a partir de plantas o parte de

ellas con varios procedimientos y con varios solventes. (10)(39)

1.4.1 MTODOS DE EXTRACCIN

La extraccin slido-lquido es una operacin que est presente prcticamente en todos los

procesos tecnolgicos relacionados con la industria qumica y mdico-farmacutica; dentro de

sta, los mtodos de extraccin por maceracin y la percolacin o lixiviacin son los ms

utilizados. (18)(19)

1.4.1.1 Maceracin

El material crudo previamente triturado se pone en contacto duradero con cantidad suficiente

de solvente, en un tanque cerrado a temperatura ambiente durante 2-14 das hasta el

agotamiento de la droga vegetal. Puede utilizarse agitacin. Posterior a este tiempo la mezcla

es filtrada, el material insoluble es lavado con el mismo solvente y los filtrados se mezclan

para concentrar el extracto. (19)(20)

1.4.1.2 Percolacin o lixiviacin:

El material crudo previamente triturado se pone en contacto con cantidad suficiente de

solvente de forma tal que el solvente cubra la capa de slido en el tanque percolador. El

- 7 -

solvente se renueva de modo continuo mantenindose un gradiente de concentracin, el

disolvente puro desplaza al que contiene la sustancia extrada sin ser necesario aplicar presin.

La droga residual es prensada y el fluido obtenido es combinado con el percolado para

concentrar el extracto. (23)

1.4.2 CLASIFICACIN DE LOS EXTRACTOS VEGETALES

Dependiendo del grado de concentracin de los extractivos, los extractos pueden clasificarse

en:

-Extractos fluidos o lquidos

-Extractos semislidos o blandos

-Extractos secos (20)

1.4.3 PREPARACIN DE EXTRACTOS

Es importante establecer los parmetros de extraccin para lograr la estandarizacin del

proceso, esto garantizar la calidad, rendimiento, seguridad y eficacia del producto medicinal.

Por ejemplo: (1) (4)

Naturaleza qumica de la materia prima vegetal: conocer las caractersticas del metabolito

o compuesto qumico a extraer.

Seleccin del solvente: definir la selectividad del solvente a emplear, el solvente ptimo ser

el que logre extraer un mayor rendimiento del compuesto de inters.

Relacin slido-lquido: la proporcin ms conveniente de trabajo ser aquella con la que se

alcancen los mayores rendimientos de extraccin.(2)

Tamao de partcula del slido: de la forma y dimensin de los slidos depende en gran

medida el xito de la lixiviacin, a menor tamao de partcula, mayor superficie de contacto

entre la droga y el disolvente, y por tanto, mayor acceso de los principios activos al medio

lquido; no obstante, tamaos de partcula muy pequeos conducen a la formacin de polvos

demasiado finos, que pueden causar problemas en el proceso de extraccin.

- 8 -

Temperatura: el aumento de la temperatura favorece la extraccin, hay que prestar especial

atencin cuando la sustancia de inters es termolbil o el menstruo es voltil, adems,

temperaturas elevadas pueden conducir a lixiviar cantidades excesivas de solutos indeseables.

(23)

Velocidad de agitacin y tiempo de extraccin: los ptimos valores de estos parmetros

sern aquellos que logren extraer un mayor rendimiento del producto. A mayor tiempo de

contacto, mayor capacidad tendr el disolvente para alcanzar el equilibrio de concentraciones.

Viscosidad del medio: no deben seleccionarse solventes de viscosidad relativamente alta.

El extracto vegetal obtenido se debe caracterizar en cuanto a: sustancias activas y marcadores,

densidad, solventes residuales, slidos totales, pH, control microbiolgico y volumen total.

(39)

1.4.4 ESPECIFICACIONES DE CALIDAD DE LA DROGA VEGETAL

Entre las especificaciones de calidad exigidas para la evaluacin de materias primas vegetales

con fines medicinales se encuentran:

Caractersticas macroscpicas (forma, tamao, caracteres superficiales, textura y

fractura).

Identificacin y cuantificacin de sustancias activas o marcadores.

Sustancias solubles.

Cenizas totales.

Materias extraas.

Contenido de agua.

Tamao de partculas.

Control microbiolgico.

Metales pesados(8)

http://www.monografias.com/trabajos13/ladrogcc/ladrogcc.shtmlhttp://www.monografias.com/trabajos11/conce/conce.shtmlhttp://www.monografias.com/trabajos14/problemadelagua/problemadelagua.shtml

- 9 -

1.4.5 CONCENTRACIN DE EXTRACTOS

Toda vez que se ha realizado la etapa de extraccin y separacin, se procede a eliminar parte

del solvente de extraccin para aumentar el contenido de slidos en el extracto. Este proceso

se realiza a presin reducida con lo que se disminuye la temperatura de calentamiento

necesaria para la salida del solvente, el rotavapor es una buena alternativa para trabajos en el

laboratorio y es ampliamente usado mientras que sistemas anlogos se utilizan a escala

industrial (evaporadores, condensadores).

Tambin pueden utilizarse mtodos de precipitacin del principio activo, combinados con

etapas de filtracin, extraccin lquido-lquido, entre otras. (18)

1.4.6 EXTRACTO ETANLICO

De 100g de planta fresca y molida se coloca en un matraz erlenmeyer de 500mL y se deja

macerar con suficiente cantidad de etanol para cubrir completamente la planta. Despus se

filtra (papel filtro No. 4) u algodn y en un rotavapor se lleva a sequedad el extracto a 47oC

y a presin reducida. Se pesa el extracto seco y se coloca en un vial bien cerrado, en el

refrigerador (16)(23).

1.5 TAMIZAJE FITOQUMICO

El tamizaje fitoqumico o screening fitoqumico es una de las etapas intermedias de la

investigacin fitoqumica, que permite determinar cualitativamente los principales grupos

qumicos presentes en una planta y a partir de all, orientar la extraccin y/o fraccionamiento

de los extractos para el aislamiento de los grupos de mayor inters. El tamizaje fitoqumico

consiste en la extraccin de la planta con solventes apropiados y la aplicacin de reacciones

de color y precipitacin. Debe de permitir la evaluacin rpida, con reacciones sensibles,

reproducibles y de bajo costo.

1.5.1 FUNDAMENTO

Se basa en pruebas preliminares sencillas y rpidas que permiten detectar cualitativamente la

presencia de determinados grupos de compuestos. Se ayudan de la micro qumica para

http://www.monografias.com/trabajos15/informe-laboratorio/informe-laboratorio.shtmlhttp://www.monografias.com/trabajos11/teosis/teosis.shtmlhttp://www.monografias.com/trabajos6/dige/dige.shtml#evohttp://www.monografias.com/trabajos/compelectropas/compelectropas.shtml

- 10 -

evidenciar estos grupos de constituyentes mediante formacin de precipitados, coloraciones,

etc.

Estas reacciones se caracterizan son selectivas para las clases o grupos de compuestos que se

investigan, son simples y rpidas, detectan la mnima cantidad posible y utilizan un mnimo

de equipo de laboratorio (1) (3).

1.5.2 METODOLOGA EN EL ANLISIS FITOQUMICO

En trminos generales un anlisis fitoqumico debe comprender cuatro etapas bien definidas:

Recoleccin y clasificacin botnica de la especie en estudio.

Extraccin, separacin y purificacin de constituyentes qumicos.

Determinacin estructural, y

Ensayos farmacolgicas (1).

1.5.3 REACCIONES DE IDENTIFICACIN

Ensayo de Sudan

Permite reconocer en un extracto la presencia de compuestos grasos, para ello, a la alcuota

de la fraccin en el solvente de extraccin, se le aade 1 ml de una solucin diluida en el agua

del colorante Sudan III o Sudan IV. Se calienta en bao de agua hasta evaporacin del

solvente. La presencia de compuestos grasos se considera positiva si aparecen gotas o una

pelcula coloreada de rojo en el seno del lquido o en las paredes del tubo de ensayo

respectivamente.

Ensayo de Dragendorff

Permite reconocer en un extracto la presencia de alcaloides, para ello, si la alcuota del

extracto est disuelta en un solvente orgnico, este se debe evaporarse en bao de agua y el

residuo redisolverse en 1 ml de HCl al 1% en agua. Si el extracto es acuoso a la alcuota se le

aade 1 gota de HCl concentrado, (calentar suavemente y dejar enfriar hasta acidez). Con una

solucin acuosa cida se realiza el ensayo, aadiendo tres gotas de reactivo de Dragendorff, si

hay opalescencia se considera (+), turbidez definida (++), precipitado (+++).

- 11 -

Ensayo de Mayer

A la solucin cida se le adiciona una pizca de NaCl en polvo, se agita y se filtra. Al filtrado

se le adiciona 2 3 gotas de solucin reactiva de Mayer, si se observa opalescencia se

considera (+), turbidez definida (++), precipitado coposo (+++).

En el caso de alcaloides cuaternarios y/o amino-xidos libres, stos slo se encontrarn en el

extracto acuoso y para considerar su presencia la reaccin debe ser (++) (+++), en todos los

casos, ya que un resultado (+), puede provenir de una extraccin incompleta de bases

primarias, secundarias o terciarias.

Ensayo de Wagner

Se parte de una solucin cida, aadiendo 2 3 gotas del reactivo de Wagner, y se reporta los

resultados de igual forma que en la reaccin anterior.

Ensayo de Baljed

Permite reconocer en un extracto la presencia de compuestos con agrupamiento lactnico, en

particular coumarinas, aunque otros compuestos lactnicos pueden dar positivo al ensayo.

Para ello, si la alcuota del extracto no se encuentra en alcohol, debe evaporarse el solvente en

bao de agua y redisolverse en la menor cantidad de alcohol (1ml). En estas condiciones se

adicional 1 ml del reactivo, considerndose un ensayo positivo la aparicin de coloracin o

precipitado rojo (++ y +++) respectivamente.

Ensayo de Borntrger

Es til para detectar la presencia de quinonas.

Si la alcuota no est en cloroformo debe evaporarse el solvente en bao de agua y el residuo

redisolverse en 1 ml de cloroformo. Se adiciona 1 ml de hidrxido de sodio, hidrxido de

- 12 -

potasio o amonio al 5%. Se agita mezclando las fases y se deja en reposo hasta su ulterior

separacin. El ensayo es positivo cuando la fase acuosa alcalina (superior) se colorea de

rosado, en este caso se reporta (++) o rojo, para lo cual se reporta (+++).

Ensayo de Lieberman Buchard

Permite reconocer en un extracto la presencia de triterpenos y/o esteroides, por ambos tipos

de productos poseer un ncleo del androstano, generalmente insaturado en el anillo B y la

posicin 5-6. Para ello, si la alcuota del extracto no se encuentra en cloroformo, debe

evaporarse el solvente en bao de agua y el residuo redisolverse en 1 ml de cloroformo. Se

adiciona 1 ml de anhdrido actico y se mezcla bien. Por la pared del tubo de ensayo se dejan

resbalar 2-3 gotas de H2SO4 concentrado sin agitar. Un ensayo positivo se tiene por un cambio

rpido de coloracin.

1. Rosado-azul muy rpido

2. Verde intenso-visible aunque rpido

3. Verde oscuro-negro-final de la reaccin

A veces el ensayo queda en dos fases o desarrollo de color. Muy pocas veces puede observarse

el primer cambio. El tercer cambio generalmente ocurre cuando el material evaluado tiene

cantidades importantes de estos compuestos.

Ensayo de Resinas

Para detectar este tipo de compuestos, se adiciona a 2 ml de la solucin alcohlica, 10 ml de

agua destilada. La aparicin de un precipitado indica un ensayo positivo.

Ensayo de Fehling

- 13 -

Permite reconocer en un extracto la presencia de azcares reductores. Para ello, si la alcuota

del extracto no se encuentra en agua, debe evaporarse el solvente en bao de agua y el residuo

redisolverse en 1-2 ml de agua. Se adiciona 2 ml del reactivo y se calienta en bao de agua 5-

10 minutos la mezcla. El ensayo se considera positivo si la solucin se colorea de rojo o

aparece rojo. El reactivo se prepara de la siguiente forma:

Solucin A: Se pesa 35 g de sulfato cprico hidratado cristalizado y se disuelve con agua hasta

un volumen total de 1000 ml.

Solucin B: Se pesa 150 g de tartrato de sodio y potasio y 40 g de hidrxido de sodio y se

disuelve con agua hasta un volumen total de 1000 ml.

Las soluciones se tienen preparadas de forma independiente y se mezcla igual cantidad en

volumen de cada de ellas justo en el momento de realizar en ensayo. Dicha mezcla es la que

se adiciona a la alcuota a evaluar.

Ensayo de Espuma

Para reconocer en un extracto la presencia de saponinas, tanto del tipo esteroidal como

triterpnica. De modo que si la alcuota se encuentra en alcohol, se diluye con 5 veces el

volumen en agua y se agita la mezcla fuertemente durante 5-10 minutos.

El ensayo se considera positivo si aparece espuma en la superficie del lquido de ms de 2 mm

de altura y persistente por ms de 2 minutos.

Ensayo del Cloruro Frrico

Permite reconocer la presencia de compuestos fenlicos y/o taninos en un extracto vegetal. Si

el extracto de la planta se realiza con alcohol, el ensayo determina tanto fenoles como taninos.

A una alcuota del extracto alcohlico se le adicionan 3 gotas de una solucin de tricloruro

- 14 -

frrico al 5% en solucin salina fisiolgica (cloruro de sodio al 0.9% en agua). Si el extracto

es acuoso, el ensayo determina fundamentalmente taninos.

A una alcuota del extracto se aade acetato de sodio para neutralizar y tres gotas de una

solucin de tricloruro frrico al 5% en solucin salina fisiolgica, un ensayo positivo puede

dar la siguiente informacin general:

- Desarrollo de una coloracin rojo-vino, compuestos fenlicos en general.

- Desarrollo de una coloracin verde intensa, taninos del tipo pirocateclicos.

- Desarrollo de una coloracin azul, taninos del tipo pirogalotnicos.

Ensayo de Shinoda

Permite reconocer la presencia de flavonoides. Si la alcuota del extracto se encuentra en

alcohol, se diluye con 1 ml de cido clorhdrico concentrado y un pedacito de cinta de

magnesio metlico. Despus de la reaccin se espera 5 minutos, se aade 1 ml de alcohol

amlico, se mezclan las fases y se deja reposar hasta que se separen.

Si la alcuota del extracto se encuentra en agua, se procede de igual forma, a partir de la adicin

del cido clorhdrico concentrado.

El ensayo se considera positivo cuando el alcohol amlico se colorea de amarillo, naranja,

carmelita o rojo; intenso en todos los casos.

Ensayo de Kedde

Permite reconocer en un extracto la presencia de glicsidos cardiotnicos. Una alcuota del

extracto en etanol se mezcla con 1 ml del reactivo y se deja reposar durante 5-10 minutos. Un

ensayo positivo es en el que se desarrolla una coloracin violcea, persistente durante 1-2

horas. El reactivo de Kedee se prepara de la siguiente forma:

- Solucin 1: cido 3-5 dinitrobenzico al 2% en metanol

- Solucin 2: Hidrxido de potasio al 5-7 % en agua.

- 15 -

Las soluciones se tienen preparadas de forma independiente y se mezcla igual cantidad en

volumen de cada una de ellas justo en el momento de realizar el ensayo. Dicha mezcla es la

que se adiciona a la alcuota a evaluar.

Ensayo de Muclagos

Permite reconocer en los extractos de vegetales la presencia de esta estructura de tipo

polisacrido, que forma un coloide hidrfilo de alto ndice de masa que aumenta la densidad

del agua donde se extrae. Para ello una alcuota del extracto en agua se enfra a 0-5C, si la

solucin toma una consistencia gelatinosa el ensayo es positivo.

1.6 CROMATOGRAFA DE CAPA FINA

La I.U.P.A.C define la cromatografa de forma ms amplia. Para ellos es un mtodo usado

principalmente para la separacin de los componentes de una muestra, en el cual los

componentes son distribuidos entre dos fases, una de las cuales es estacionaria, mientras que

la otra es mvil.(21)(28)

1.6.1 CONCEPTO DE RF

Es el registro y se define como la distancia que recorre la muestra desde el punto de aplicacin

/distancia que recorre el disolvente hasta el frente del eluyente.

Rf =Distancia recorrida desde el origen por el compuesto (Y)

Distancia recorrida desde el origen por el compuesto de referencia (X)

El valor de Rf depende de las condiciones en las cuales se corre la muestra (tipo de absorbente,

eluyente, as como las condiciones de la placa, temperatura, vapor de saturacin, etc.). Tiene

una reproductibilidad de +/- 20%, por lo que es mejor correr duplicados de la misma

placa.(30)(31)

- 16 -

1.6.2 CROMATOGRAFA EN COLUMNA

Se emplea para la separacin de mezclas o purificacin de sustancias a escala preparativa.

Como fase estacionaria se usa, generalmente, gel de slice o almina dentro de una columna.

La eleccin del disolvente es crucial para una buena separacin. Dicho disolvente pasa a travs

de la columna por efecto de la gravedad o bien por aplicacin de presin (cromatografa flash).

La columna se prepara mezclando el soporte con disolvente y se rellena la columna poniendo

en el fondo de sta un poco de algodn o lana de vidrio, para evitar que la slica o la almina

queden retenidas en la columna y que el disolvente se engrase hasta el nivel del soporte. A

continuacin se introduce la muestra por la parte superior de la columna y se eluye con el

disolvente elegido, recogindose por lo general en tubos de ensayo. Una columna de

cromatografa es un tubo de vidrio relleno con una sustancia slida de propiedades adsorbentes

constituida por pequeas partculas: gel de slice y almina son las ms usadas. Este relleno

es lo que se conoce en cromatografa como la fase estacionaria. A travs de la columna se har

pasar una corriente de un disolvente o mezcla de disolventes denominada eluyente y/o fase

mvil .La mezcla de compuestos a separar se disuelve en una pequea cantidad de disolvente

y se coloca sobre el adsorbente, en la parte superior de la columna, quedando adsorbida por el

mismo.(30)(31)

1.6.3 CROMATOGRAFA PREPARATIVA

Las placas utilizadas en cromatografa preparativa son placas grandes, de aproximadamente

20x20 cm. que permiten separar aproximadamente 1 g. de mezcla utilizando unos 35 g. de

adsorbente.

La siembra de la muestra se realiza mediante la ayuda de una jeringuilla o tubo capilar. La

siembra se realiza a lo largo de una lnea recta (existen en el mercado diverso utensilios para

- 17 -

evitar torcerse). Si al terminar la primera siembra todava queda muestra, se seca la primera

siembra y se aplica la segunda, intentando que sta quede sobre la anterior, para as conseguir

que el frente sea lo ms estrecho posible. La siembra debe realizarse a lo ancho de la placa.

Una vez sembrada la muestra se desarrolla la cromatografa. Se utiliza un adsorbente con

indicador fluorescente para ver en la lmpara ultravioleta donde han quedado las manchas de

los diferentes compuestos, dichas manchas se marcan.

Una vez localizados los compuestos, stos se extraen de la fase estacionaria, uno a uno, con la

ayuda de una esptula, sobre un papel de filtro u otro soporte. Posteriormente se coloca cada

componente en un erlenmeyer, y se mezcla con un disolvente (metanol). Una vez disuelto el

compuesto se filtra varias veces para separar el compuesto y la fase estacionaria. Una vez

separado se elimina el disolvente (destilacin), con lo cual se obtiene el componente separado.

Si no se dispone de indicador fluorescente, no se pueden usar reveladores qumicos sobre toda

la placa. El proceso a seguir es el siguiente: se raya la placa separando totalmente una pequea

franja de placa, sobre la cual se aplica el revelador qumico, y a partir de esta franja se marcan

las franjas de compuestos.(21)(30)

FIG:2 PLACA PREPARATIVA

FUENTE: http://quimica.laguia2000.com/general/cromatografia-en-columna#ixzz2Msd2NjA

1.7 CROMATOGRAFA EN CAPA FINA DE Senna fructus y follum

Fase estacionaria: Slica gel

Solvente de corrido: n-propanol-EtOAc-H2O-cido actico glacial (40:40:29:1)

Muestra: Senna fructus y follum

http://quimica.laguia2000.com/general/cromatografia-en-columna#ixzz2Msd2NjA

- 18 -

Revelador: HNO3-KOH

Senna Fructus (1) y folium (2)

GRFICO N1 TLC DE Senna fructus y folium FUENTE: WAGNER.H. PAG 69.

Las zonas pardas corresponden a los sensidos B (T2),A(T1) :(Rf 0.25 y 0.40) y los sensidos

D,C (Rf 0.5 y 0.7). Las zonas amarillas indican a la rehina Rf 0.8 y sus glucsidos (Rf 0.3 a

0.6).

FIG:3 ESTRUCTURA DE SENSIDOS FUENTE: WAGNER.H. PAG. 71

1.8 ESPECTROFOTOMETRIA

La espectrofotometra se utiliza para identificar compuestos por su espectro de absorcin,

conocer la concentracin de un compuesto en disolucin.

La espectrofotometra surgi con el estudio de la interaccin entre la radiacin y la materia

como funcin de la longitud de onda ().

- 19 -

1.8.1 ESPECTROFOTOMETRA ULTRAVIOLETA-VISIBLE

La espectroscopia UV-visible se utiliza para identificar algunos grupos funcionales de

molculas, y adems, para determinar el contenido y fuerza de una sustancia.

Se utiliza de manera general en la determinacin cuantitativa de los componentes de

soluciones de iones de metales de transicin y compuestos orgnicos altamente conjugados

(30)(32).

Principio fsico

El principio de la espectroscopia ultravioleta-visible involucra la absorcin de radiacin

ultravioleta visible por una molcula, causando la promocin de un electrn de un estado

basal a un estado excitado, liberndose el exceso de energa en forma de calor. La longitud de

onda () comprende entre 190 y 800 nm.

La luz visible o UV es absorbida por los electrones de valencia, stos son promovidos a estados

excitados (de energa mayor). Al absorber radiacin electromagntica de una frecuencia

correcta, ocurre una transicin desde uno de estos orbitales a un orbital vaco. Las diferencias

entre energas varan entre los diversos orbitales. Algunos enlaces, como los dobles, provocan

coloracin en las molculas ya que absorben energa en el visible as como en el UV (31)(32).

1.8.2 EL ESPECTROFOTMETRO

El espectrofotmetro es un instrumento que permite comparar la radiacin absorbida o

transmitida por una solucin que contiene una cantidad desconocida de soluto, y una que

contiene una cantidad conocida de la misma sustancia.

Esta espectrofotometra utiliza radiaciones del campo UV de 80 a 400 nm, principalmente de

200 a 400 nm (UV cercano) y de luz visible de 400 a 800 nm, por lo que es de gran utilidad

para caracterizar las soluciones en la regin ultravioleta-visible del espectro.

1.8.3 CARACTERSTICAS DEL SISTEMA

http://es.wikipedia.org/wiki/Radiaci%C3%B3n_ultravioletahttp://es.wikipedia.org/wiki/Radiaci%C3%B3n_ultravioletahttp://es.wikipedia.org/wiki/Electr%C3%B3nhttp://es.wikipedia.org/wiki/Espectrofot%C3%B3metrohttp://es.wikipedia.org/wiki/Espectrofot%C3%B3metro

- 20 -

Las muestras en solucin se ponen en una pequea celda de Si.

Se utilizan dos lmparas: una de H o deuterio para la regin UV, y una de W / halgeno

para la regin visible

Se utiliza tambin una celda de referencia que contiene slo solvente.

La luz pasa simultneamente por la celda de muestra y la celda de referencia.

El espectrmetro compara la luz que pasa por la muestra con la que pasa por la celda de

referencia.

La radiacin transmitida es detectada y el espectrmetro obtiene el espectro de absorcin

al barrer la longitud de onda de la luz.

Consideraciones generales

La espectroscopia ultravioleta-visible es la ms limitada para la informacin de compuestos.

Los compuestos que tengan un cromforo o instauraciones son visibles en esta regin.

Los compuestos orgnicos, especialmente aquellos con un alto grado de conjugacin, tambin

absorben luz en las regiones del espectro UV. Los disolventes orgnicos pueden tener una

significativa absorcin de UV, por lo que no todos los disolventes son adecuados para su uso

en espectrofotometra UV. El etanol absorbe muy dbilmente en la mayora de longitudes de

onda. La polaridad y el PH del disolvente pueden afectar la absorcin del espectro de un

compuesto orgnico (32).

Los espectros de los flavonoides son determinados usualmente en solucin metanlica. El

espectro tpicamente consiste de dos mximos de absorcin en los rangos de 240-285 nm

(Banda II) y 300-500 nm (Banda I).

Podra indicarse como caractersticas de dihidroflavonas. Dihidroflavanoles e isoflavonas.(17)

- 21 -

TABLA 1.- VALORES DE ABSORCIN PARA LAS BI Y BII DE LOS DIFERENTES FLAVONOIDES.

TABLA 2.- VALORES RF Y MXIMOS DE ABSORCIN DE ALGUNAS ANTRAQUINONAS

FUENTE: http.quinonasp.pdf.com

1.9 REGLAS DE WOODWARD-FIESER

Las reglas de Woodward-Fieser son un conjunto de observaciones empricas que pueden

utilizarse para predecir la longitud de onda de la absorcin ( max) UV-Visible,para

compuestos orgnicos conjugados como dienos y cetonas.

Banda II,nm Banda I, nm Tipo de flavonoide

250 - 280 310 - 350 Flavonas

250 - 280 330 - 360 Flavonoles

250 - 280 350 - 385 Flavonoles

245 - 275 310-330 Isoflavonas (5-deoxi-6,7

dioxi)

275 - 295 300-330 Isoflavonas,

dihidroflavonoles

230-270(baja intensidad) 340-390 Chalconas

230-270(baja intensidad) 380-430 Auronas

270-280 465-560 Antocianidinas,antocianinas

- 22 -

Las longitudes de onda de los picos de absorcin pueden correlacionarse con los tipos de

enlace en una determinada molcula, y son valiosos para determinar los grupos funcionales

dentro de la molcula. La absorcin UV- Visible no es sin embargo, una prueba especfica

para ningn compuesto determinado, la naturaleza del disolvente, el pH de la solucin, la

temperatura, la concentracin de electrolitos, y la presencia de sustancias interferentes pueden

influir en los espectros de absorcin de los compuestos as como las variaciones en la anchura

de la hendidura (ancho de banda efectivo) en el espectrofotmetro (32).

Espectroscopa UV/Vis

Reglas de Woodward para compuestos carbonlicos conjugados

Valores bsicos:

X = R

Enona de partida con anillo de seis miembros o acclica =215 nm

Enona de partida en anillo de cinco miembros =202 nm

Dienona acclica =245 nm

X = H =208 nm

X = OH, OR =193 nm

Incrementos para

Doble enlace conjugado adicional 30

Doble enlace exocclico 5

Doble enlace endocclico en un anillo de 5- o 7- miembros para X = OH, OR 5

Componente dinico homocclico 39

Sustituyente alquilo o resto de anillo 10

12

o superior 18

Grupos polares

-OH 35

30

50

-OC(O)CH3 6

-OCH3 35

30

- 23 -

17

31

-Cl 15

12

-Br 30

25

-NR2 95

Correcin por disolvente max (calc'd) variable

1.9.1 APLICACIN DE LAS REGLAS WOODWARD-FIESER

Flavonoide (Kamferol (250,266,298,320nm)

- 24 -

Benzo y pirona246

OH (o) 7

OH (p) ......25

Exten.conj5

283nm

Terpenoide ( sitosterol (202-250nm))

Quinonas

Las antraquinonas muestran intensa absorcin bencenoide a 250 nm y de intensidad media

322 nm;la absorcin quinoidea fuerte se observa a 263 y 277 nm y una debil a 405 nm.(17)

- 25 -

A=250 nm y 322 nm

B=quinoidea 263 y 272 nm debil a 405 nm

Crisofanol (228,257,277,289 nm)

Anillo A.250 Anillo B..263 Anillo C fenol.211

OH(o)7 OH(o).7 C=O(o)...3

C=O(o)..3 OH(o).....7 C=O(m...3

C=O(m).3 CH3(m)..3 CH3(m)...3

263 nm 280 nm 220nm

Rehina (230, 260, 432 nm)

Anillo A..250 Quinoide405

OH(o).7 ( A) OH(o).7

COOH(m)..3 COOH(p).10

260 nm (C) OH(o).....7

429 nm

- 26 -

Anillo base.204

OH(o).7

COOH(m)......7

C=O(o)...........3

C=O(o)...........3

224 nm

Cumarinas (274 - 311)

Las cumarinas muestran bandas de absorcin ultravioleta caractersticas a 274 y 311 nm las

cuales son atribudas a los anillos de benceno y pirona respectivamente.(17)

Benceno..274 Pirona.311

O(m)...7 O(m).......7

C(o)3 C(o)3

284 nm 321 nm

Sesquiterpeno lactona (250-270nm)

- 27 -

Enona cclica215 nm Enona cclica 215 nm

OH ()30 nm Exten.conj...5 nm

Enlace.conj.30 nm Residuo.......3 nm

Residuo....... 3 nm 223 nm 278 nm

- 28 -

CAPTULO II

2. PARTE EXPERIMENTAL

2.1 LUGAR DE INVESTIGACIN

La presente investigacin se llev a cabo en la Escuela Superior Politcnica de Chimborazo

en la Facultad de Ciencias:

Laboratorio de Fitoqumica

2.2 MATERIALES, EQUIPOS Y REACTIVOS

2.2.1 MATERIALES

2.2.1.1 Material vegetal

-Martin Galvis (Senna multijuga), recolectada en la Amazona Ecuatoriana (Puerto del

Carmen) por Lennin Rea.

2.2.1.2 Material de Laboratorio

- Tubos de ensayo

- Vasos de precipitacin

- Balones esmerilados de 1000mL.

- Pipetas de 1, 5 ,10mL

- 29 -

- Pinzas para tubos

- Gradillas

- Embudo simple

- Varrilla de vidrio

- Papel aluminio

- Papel toalla absorbente

- Frascos mbar de 10, 30, 50,1000 ml.

- Algodn

- Reverbero

- Mascarilla 3M

- Gafas

- Esptula

- Probetas

- Erlenmeyer

- Trpode

- Piceta

- Embudo

- Pera de succin

- Termmetro

- Cinta adhesiva

- Tapones de caucho para tubos

- Embudo de Separacin

- Capilares

- Cuba de vidrio

- Mandil Blanco

- Estilete

- Mangueras

- Regla

- Tijeras

- 30 -

- Borrador

- Cuaderno de apuntes

2.2.2 EQUIPOS

- Rotavapor (HEIDOLPH TYPE HEIZBAD HEI-VAP)

- Balanza analtica (BOECO GERMANY)

- Desecador

- Cmara Fotogrfica (SONNY)

- Refrigerador (ELECTROLUX)

- Estufa (MEMMERT)

- Cmara UV

- Refractmetro

- Espectrofotmetro

- Bomba de presin

- Computadora

- Peachmetro

- Sorbona

- Atomizador (Equipo de revelado cromatogrfico).

2.2.3 REACTIVOS

- Agua destilada

- Alcohol potable 96%

- Reactivo Dragendorff

- Reactivo Wagner

- Reactivo Sudan III

- Reactivo de Borntrger

- Reactivo Mayer

- Cloroformo

- 31 -

- Anhdrido actico

- cido sulfrico concentrado

- Hidrxido de potasio o Sodio

- Reactivo de Baljet

- Hidrxido de Sodio

- Metanol

- Tricloruro frrico al 5%

- Solucin de Ninhidrina al 5%

- cido sulfrico concentrado

- ter Dietlico

- cido clorhdrico concentrado

- Limaduras de magnesio metlico

- ter

- Benceno

2.3 MTODOS Y TCNICAS

2.3.1 RECOLECCIN

La Senna multijuga recolect Lennin Rea el 25 de Octubre del 2012 en la Amazona

Ecuatoriana, Puerto del Carmen a 900-1300 m.s.n.m., se trata de un rbol de hasta 12 m de

alto, el mismo debe estar en flor (amarillas) y estn dispuestas en racimos axilares y terminales

de 5 a 10 cm de largo incluyendo el peciolo, sus frutos se tratan de vainas de 10 a 15 cm de

largo aplastadas con numerosos septos angostos y paralelos, cada septo contiene una semilla

aplastada de 1 cm de largo y de color pardo brillante, sus hojas de color verde opaco, dispuestas

en espiral, paripinnadas, de 5 a 13 cm de largo incluyendo el peciolo.

2.3.2 COMPROBACIN TAXONMICA E IDENTIFICACIN BOTNICA

- 32 -

La identificacin taxonmica fue realizada por el Ing. Jorge Caranqui; curador del herbario de

la ESPOCH quien certific el ejemplar

2.3.3 PROCESAMIENTO DE MATERIA PRIMA: LIMPIEZA Y DESINFECCIN DEL

MATERIAL VEGETAL

- Se tomo el vegetal 587g con todas sus partes y se desecha sus partes secas y daadas,

impurezas y cuerpos extraos.

- Se lav con abundante agua sumergiendo en un recipiente con agua varias veces.

- Se sumergi el material vegetal en una solucin de hipoclorito de Sodio al 1%.

- Se elimina el hipoclorito de sodio del vegetal con abundante agua.

- Se dej escurrir a temperatura ambiente por 12 horas, hasta secarla.

- Se tritur toda la planta lo ms fino posible.

- Se almacen la droga evitando contacto con luz y humedad en bolsas de papel de ser posibles

estriles o de plstico.

2.3.4 OBTENCIN DE LOS EXTRACTOS BOTNICO INICIALES

Para el desarrollo de esta investigacin se llevo a cabo el siguiente proceso, el mismo que fue

obtenido de todo el vegetal Martin Galvis (Senna multijuga).

1. En un recipiente de vidrio con su respectiva tapa, se transfiere la droga cruda triturada y

pesada, se humedece directamente con el etanol a 96, procurando que no quede lquido

residual. (generalmente se emplea por cada gramo de droga, 2mL de alcohol para la

humectacin). Macerar por 3-5 das.

2. A los 3-5 das se transfiere a un erlenmeyer de 1000mL el lquido obtenido por

decantacin.

- 33 -

3. Filtrar la solucin, para eliminar las impurezas.

4. El filtrado se coloca en un baln esmerilado (previamente pesado), para concentrar por

destilacin simple hasta 1/8 de su volumen inicial que da lugar al extracto.

5. El extracto se mantiene fuera del alcance de la luz y humedad.

2.3.5 PREPARACIN DE LOS SUB EXTRACTOS

2.3.5.1 Sub extracto Etreo

100 ml de extracto etanlico se trat con solventes de menor constante dielctrica e inmiscible

para separar los metabolitos secundarios de acuerdo a su polaridad; generalmente se procesa

en un embudo de separacin al que se aade unos 20 ml de ter dietlico, y se agit

suavemente, dejar en reposo hasta separacin en fases, la superior corresponde al ter II y la

inferior al etanol I.

La extraccin se lo realiz tantas veces fueron necesarias hasta que la parte etrea recobre su

estado inicial transparente lo cual indico la extraccin completa de los compuestos solubles

en ter.

Colocar en un baln esmerilado previamente pesado, concentrar al vaco, dejar en desecador,

posteriormente pesar.

2.3.5.2 Sub extracto Clorofrmico

A la fase etanlica I se agreg Cl3CH en un embudo de separacin agitar en forma circular y

dejar en reposo, se forman dos fases en este caso el cloroformo corresponde a la fase inferior,

la misma que se separa cuidadosamente.

Se procedi a realizar las extracciones necesarias hasta que el cloroformo no se coloree,

recobre su caracterstica de color inicial, el nmero de veces que se extrae depende de la

coloracin de la fase inferior.

Colocar todas las fases clorofrmicas en un baln esmerilado previamente pesado, concentrar

y pesar forma el sub extracto clorofrmico III

- 34 -

2.3.5.3 Sub extracto Butanlico

A la fase superior etanlica I contenida en un embudo de separacin agregar un volumen de

butanol agitar y dejar en reposo, posteriormente separar la solucin etanlica (fase inferior) de

la butanlica (fase superior) extraer cuantas veces sean necesarias hasta recobre el color inicial

del solvente puro. Las fases butanlicas se unen en un baln pesado concentrar por destilacin

normal se elimina el olor del solvente con aire comprimido, dejar en desecador, y pesar da el

sub extracto Butanlico IV.

La fase inferior correspondiente al etanol I, se concentra en un baln pesado y se tiene el sub

extracto etanlico. El producto que se obtuvo se envas en frascos mbar de vidrio, y se los

conserva en refrigeracin.

2.3.6 DETERMINACIN DE LAS PROPIEDADES ORGANOLPTICAS Y FSICAS

DE LOS EXTRACTOS

2.3.6.1 Color

Se procedi a colocar en un vaso de precipitacin limpio y seco se llen las 3 cuartas partes

con el extracto etanlico, se procedi a observar el color a tras luz, la presencia de partculas

y la transparencia.

2.3.6.2 Olor

Se determin con el olfato el olor caracterstico del extracto.

2.3.6.3 Aspecto

Se analiz el aspecto externo, teniendo en cuenta la limpidez de la muestra de ensayo. Es decir

la presencia o no de partculas.

- 35 -

CUADRO No. 1. ESQUEMA DE PREPARACIN DE LOS EXTRACTOS Y SUB EXTRACTOS

EtOH 96%

Macerar

Macerado Filtrar

Filtrado Vegetal que se elimina

Concentrar

Propiedades Fsicas

Extracto Etanlico I Alcuota

Tamizaje Fitoqumico

Alcuota 100ml

ter etlico 20ml c/vez

6 veces

Fase Etanlica I Fase Etrea CHCl3 20ml c/vez Concentrar

6 veces

Sub extracto Etreo II

Fase Clorofrmica Fase Etanlica Concentrar BuOH 20ml c/vez

6 veces

Sub extracto Clorofrmico III

Fase Butanlica Extracto Etanlico Final I

Concentrar

Sub extracto Butanlico IV

Senna multijuga triturada 587g

- 36 -

2.3.6.4 Determinacin de la densidad relativa

Se entiende por densidad relativa a la relacin entre masa de un volumen de la sustancia a

ensayar a 25C y la masa de un volumen igual de agua a la misma temperatura. Este trmino

equivale a peso especfico.

Primeramente psese el picnmetro vaci y secos 2 C y llnese con la porcin de ensayo,

mantngalo a la temperatura de 25 C (1C) durante 15 min y ajuste el lquido al nivel

empleado, si es preciso, una tira de papel para extraer el exceso secar exteriormente el

picnmetro.

Se pesa cuidadosamente el picnmetro con la porcin de ensayo y se repite la operacin con

el agua destilada a 25 C, despus de limpio el picnmetro.

Expresin del resultado.

La densidad relativa a 25C se calcula por la siguiente frmula:

25 =Masa

Volumen

2.3.6.5 Determinacin del ndice de refraccin

Es una constante caracterstica de cada sustancia, la cual representa la relacin entre el seno

del ngulo de incidencia de la luz y el seno del ngulo de refraccin cuando la luz pasa

oblicuamente a travs del medio.

Para calibrar el equipo, se coloc sobre el prisma de medicin una gota de agua destilada,

utilizando para ello una varilla de vidrio que no tenga cantos agudos, y se seleccion la zona

del espectro visible que aparece en la lnea lmite del campo visual, moviendo el compensador

cromtico y colocando la interseccin del retculo sobre la lnea lmite de los campos claro y

oscuro.

Se coloc una gota de la muestra de ensayo sobre el prisma de medicin, se cerr el termo

prisma y se enfoc la luz por medio del espejo, de modo tal que la misma incidi sobre la

apertura de entrada del prisma de medicin, y se procedi igual que con el agua.

- 37 -

2.3.6.6 Determinacin del pH del extracto

La acidez o la alcalinidad de las soluciones acuosas se caracterizan por el valor del ndice de

hidrgeno (pH). El pH es por tanto un ndice numrico que se utiliza para expresar la mayor

o menor acidez de una solucin en funcin de los iones hidrgenos. Se calcula tericamente

mediante la ecuacin:

pH = - log [H+]

[H+ ] = actividad de los iones hidrgeno.

En la prctica la medicin del pH se lleva a cabo por medio de la lectura de pH en la escala de

un instrumento medidor de pH, ya sea igual o analgico. Esta lectura est en funcin de la

diferencia de potencial establecida entre un electrodo indicador y un electrodo de referencia

usando como solucin de ajuste de la escala del medidor de pH, una solucin reguladora del

mismo.

Se ajusta el equipo con la solucin reguladora de pH adecuada al rango en que se realizar la

determinacin. Posteriormente determnese el valor del pH de la muestra.

2.3.7 TAMIZAJE FITOQUMICO

El tamizaje se realiz en el extracto alcohlico del vegetal objeto de estudio. Se toma 10 mL

de extracto y se lo divide en tubos de ensayo, sobre los cuales se realiza las siguientes pruebas.

2.3.7.1 Ensayo de la espuma

Se aade sobre el extracto una proporcin igual de agua, se agita vigorosamente y se observa.

Permite reconocer en un extracto la presencia de saponinas, tanto del tipo esteroidal como

triterpnica. De modo que si la alcuota se encuentra en alcohol, se diluye con 5 veces su

volumen en agua y se agita la mezcla fuertemente durante 5-10 minutos.

El ensayo se considera positivo si aparece espuma en la superficie del lquido de ms de 2 mm

de altura y persistente por ms de 2 minutos.

- 38 -

2.3.7.2 Ensayo del H2SO4 concentrado

Por la pared del tubo de ensayo se deja caer cido sulfrico concentrado, una coloracin

fuertemente amarilla indica la presencia de flavonas y flavonoides, las flavonas forman un

complejo soluble color naranja o guinda, las chalconas y auronas forman coloraciones rojo-

guinda a rojo-azulado. (6) (49)

2.3.7.3 Ensayo de Shinoda

Permite determinar la presencia de flavonoides. En un tubo de ensayo se coloca una alcuota

de extracto, y se agrega una pequea cantidad de limaduras de Mg y unas gotas de HCl

concentrado.

La reaccin se considera positiva cuando se presenta coloracin amarilla, naranja, carmelita,

rosada o rojo guinda; intensos en todos los casos.

2.3.7.4 Ensayo del Cloruro Frrico

Se aade sobre el extracto de 2 a 3 gotas de Cloruro Frrico, y se observa.

Permite reconocer la presencia de compuestos fenlicos y/o taninos en un extracto vegetal.

1. Desarrollo de una coloracin rojo-vino, compuestos fenlicos en general.

2. Desarrollo de una coloracin verde intensa, taninos del tipo pirocateclicos.

3. Desarrollo de una coloracin azul, taninos del tipo pirogalotnicos.

2.3.7.5 Ensayo de Borntrger

Con este ensayo se determina la presencia de quinonas, para lo cual se tom una alcuota de

extracto en un tubo de ensayo y se agreg gotas de NaOH 5%, finalmente se aadi 1mL de

- 39 -

cloroformo y se observ la coloracin de la fase acuosa alcalina. El ensayo es positivo cuando

se presenta las siguientes coloraciones:

- Amarillo para Benzoquinonas

- Rosado para Naftoquinonas

- Violeta para Antraquinonas

2.3.7.6 Ensayo de Dragendorff

Este ensayo sirve para determinar la presencia de alcaloides, se aadi sobre una alcuota de

extracto 3gotas del reactivo de Dragendorff, y se observa, si hay opalescencia se considera

(+), turbidez definida (++), precipitado (+++).

2.3.7.7 Ensayo de Wagner

Este ensayo determina la presencia de alcaloides, a la solucin formada en el ensayo de

Borntrger, se le evapor el cloroformo, obtenindose un residuo al que se aadi 1mL de

EtOH, una gota de HCl y unas gotas del reactivo de Wagner (2g de yodo y 2g de yoduro de

potasio aforados a 100mL con agua), se agit suavemente, los resultados se clasifican as:

Opalescencia: (+)

Turbidez definida: (++)

Precipitado: (+++)

2.3.7.8 Ensayo de Rosenthaler

Permite comprobar en los extractos etanlicos la presencia de terpenos. Se tom una alcuota

de extracto etanlico, se adicion gotas de reactivo de Rosentaler (solucin 1% de vainillina

en EtOH y 5mL de H2SO4 concentrado) y se calent. Se considera positivo cuando se forma

una coloracin en gama de rosada a violeta o pardas.

- 40 -

2.3.7.9 Ensayo de Baljet

En un tubo de ensayo de coloc una pequea porcin de extracto etanlico y se aadi 2-3

gotas de cido Pcrico y gotas de KOH 5%.

Una coloracin anaranjada o rojiza indica que la prueba es positiva para

sesquiterpenolactonas.

2.3.7.10 Ensayo de Sudan III

Con este ensayo se determina la presencia de monoterpenos, entonces, se aadi a la muestra

1mL de una solucin diluida en agua del colorante Sudan III (solucin al 6% en partes iguales

de alcohol y glicerina.) Se calienta en bao de agua hasta evaporacin del solvente.

La presencia de compuestos grasos se considera positiva si aparecen gotas o una pelcula

coloreada de rojo en el seno del lquido o en las paredes del tubo de ensayos respectivamente.

(26) (28) (42).

2.3.7.11 Ensayo de Liebermann-Burchard

Mediante esta reaccin se determina triterpenos, esteroles y esteroides. En un tubo se coloc

una alcuota de extracto etanlico, se evapor a sequedad. Se disolvi el evaporado en 1mL

de CHCl3, y se aadi, por las paredes del tubo, 1mL de reactivo (anhdrido actico: H2SO4

(40:1), sin agitar.

Si forma un anillo verde la prueba ser positiva o puede darse el siguiente cambi (rpido) de

coloracin de verde-azul, pasando por verde intenso hasta llegar a negro en la interfase.

Tabla #3 Determinacin de % de sub extractos

Subextractos Peso del Baln vaco Peso del Baln vaco

+ muestra

% de muestra

- 41 -

2.3.8 ANALISIS CROMATOGRFICOS DEL EXTRACTO Y SUB EXTRACTOS

Con los resultados del tamizaje fitoqumico se procede a comprobar la presencia de

compuestos en placas de silicagel G F254 con solventes de recorrido para cada grupo

fitoqumico, y revelando en soluciones caractersticas propuesto en bibliografa siendo estos

Rosentaler para terpenos, Sulfato de Cerio para Flavonoides, KOH para cumarinas y

antraquinonas buscando los parmetros cromatogrficos, eficiencia, eficacia y resolucin para

la separacin de los metabolitos secundarios.

2.3.8.1 Comparacin cromatogrfica del sen y Senna multijuga

Cuadro N2 PREPARACIN DEL EXTRACTO DE SEN

5ml H2O y alcohol

Calentar e ebullicin

Centrifugar

Lquido pardo claro Extracto etanlico Sedimento pardo obscuro

Comparar CCF

Fase estacionaria de Slica gel G F254

Muestras: Extracto etanlico de Sen y de Senna multijuga

Solvente de recorrido: CH3COOH, H2O, EtOAc, 1 propanol; (1:30:40:40)

Revelador: KOH alcohlico

Etreo 117.1985 g 117.3485 g| 2.5%

Clorofrmico 117.2083 g 118.0113 g 13.68%

Butanlico 117.2199 g 118.1399 g 15.67%

Etanlico 117.2143 g 119.5843 g 34.82%

Sen(Cassia angustifolia)

triturado 0.5g

- 42 -

Al comparar la cromatografa del sen (1) y la Senna multijuga (2); determinamos que 4

manchas son similares en color y Rf. siendo as.

Tabla N4 COMPARACION DEL SEN Y Senna multijuga

Especificaciones Resultados

Sen Senna multijuga

Rf Rf

0.5

0.7

0.8

Sensido D pardo

Sensido C violeta

Rehina amarilla

0.5

0.7

0.8

Sensido D pardo

Sensido C violeta

Rehina amarilla

FUENTE: WAGNER.H. PAG 69.

Segn datos de bibliografa las manchas amarillas corresponden a antraquinonas agliconas

con Rf 0.8 a la rehina y sus glucsidos crisofanol; cafs y violeta Rf 0.5 y 0.7 sensidos D y

C . (CCF N1)

Cromatografa en capa fina de los sub extractos

Se realiz cromatografa de los 3 sub extractos: Sub extracto Etreo (II), Sub extracto

Clorofrmico (III), Sub extracto Butanlico (IV) con solvente de recorrido: C6H6, CHCl3,

EtOH; (3:5:2) y Revelador: Rosentaler. (CCF N2)

2.3.8.2 Separacin de metabolitos secundarios del sub extracto etreo II

El sub extracto etreo fue de 0.15g de color verde amarillento, mucilaginoso con olor

caracterstico al solvente.

Separacin por Cromatografa en Columna del Sub Extracto Etreo (II)

- De las fracciones #1 a #7 con C6H6

- 43 -

- De #8 al #11 con C6H6, EtOH; ( 90:10)

- De #12 a #16 con CHCl3 (100)

- De #17 a #22 con CHCl3, EtOH; (100:10)

Las fracciones se cromatografian para comprobar la presencia de metabolitos.

En las fracciones 1-6 se utiliz solvente de recorrido: C6H6 y revelado con Rosentaler las

muestras 4 y 5 presentan 3 manchas redondeadas con Rf 0,0; 0,59 y 0,9 se purifican en

placa preparativa corrida en y EtOAc (10:5) y revelado con Rosentaler.( CCF N4)

Las fracciones 7 a 22 corridas en C6H6 (100) y revelado con I2 tienen los mismos

metabolitos, se renen y se cromatografan en micro columna con tolueno; cido actico

93:3.7 revelado con Rosentaler da bandas coloreadas las fracciones de la 1 a la 3 es

transparente y tiene dos manchas redondas con Rf 0.53 y 0.94 posiblemente siendo

terpenos. (CCF N6)

Las fracciones 4-7 corridas con EtOAc tienen un Rf entre 0.36 a 0.40 ,la fraccin 8 corrida

en acetato de etilo presenta un compuesto a Rf 0.81, la fraccin 9 Rf 0.73; la fraccin 10

Rf 0.67 estas fracciones no se pudieron leer en el espectrofotmetro debido a que no exista

suficiente muestra.( CCF N7)

La fraccin 11 corrida con EtOAc 100% da 2 manchas se purifican en CCFP da un

compuesto 11a con Rf 0.58 max 284 y 11b Rf 0.67 max 304 nm .(CCF N8)

En las fracciones 13 a16 corridas en Tolueno, CH3COOH; (93:3.7) y revelado con KOH,

la fraccin 13 presenta un compuesto puro con Rf 0.68 posiblemente siendo una

cumarina.(CCF N9)

- 44 -

CUADRO N3 TRATAMIENTO DE LAS FRACCIONES 7-22

2.3.8.3 Tratamiento del Sub extracto Clorofrmico III

El sub extracto clorofrmico fue amarillo slido, corrido en CHCl3, MeOH ;(6:2) tenemos los

Rfs: 0.46, 0.48 y 0.93 (CCF N10).

No se pudo purificar debido a que no exista suficiente muestra.

2.3.8.4 Tratamiento del Sub extracto Butanlico IV

Separacin por cromatografa en columna

- El sub extracto butanlico 0.72g se fracciona; las fracciones 1-5 eludas con Hexano, B

Acetona ;(50:40).

- La 6 -10 con Acetona 100 %.

- La 11 a #13 con Acetona, MeOH; (5:10)

- La 14 a #19 con MeOH 100%

Comprobacin en CCF de las fracciones de la columna

- 45 -

En las fracciones 1-4 se utiliz como solvente de corrido Acetona, EtOAc; (2:1) y revelado

con Rosentaler dndonos manchas redondas de color rosado con valores de Rf1=0.42,

Rf2=0.43, Rf3=0.40, Rf4=0.43 se uni las que presentan igual valor de Rfs. (CCF N 11)

La cromatografa de las fracciones 5 a 9 en acetona, acetato de etilo 2:1 y revelada con

Rosentaler las fracciones 5 y 6 tienen un Rf tienen un Rf 0.42-0.41 se unen. Las fracciones

7 a 9 presentan Rf 0.19 y 0.42 se unen y separan en capa fina en las mismas condiciones.

(CCF N 12)

Las fracciones de 10 y 11 corridas con acetato de etilo, metanol 95:5 dan Rf de 0.25 y 0.44

se unen y separan en placa preparativa dan 3 bandas que se recuperan y se comprueba en

el mismo solvente dando banda 1 Rf 0.60 max 228 nm la 2 con Rf 0.46; la 3 con Rf 0.70

(CCF 13 y 14) al ser reveladas con Rosentaler son terpenos.

Las fracciones 15 y 18 corridas en MeOH y reveladas con Rosentaler dan Rf 0.24 y 0.61

purificadas en capa fina en acetato de etilo (100) dan Rf entre 0.25 y 0.91 con buena

resolucin cromatogrfica. (CCF 15 y 16).

La fraccin 19 corridas en Tolueno, EtOAc ;(80:20) y revelado con Rosentaler da 2

manchas que purificadas en capa fina la banda 1 Rf 0.75 max 227 nm y la banda 2 Rf 0.92

max 276 nm. (CCF N 17)

2.3.8.5 Purificacin de Metabolitos del Extracto Etanlico I

La cromatografa del extracto etanlico corrido en solvente de corrido en CH3COOH:H2O:

EtOAc: 1 propanol (1:30:40:40) y revelado con KOH alcohlico dan 6 manchas con Rf

definidos por lo cual se fragmenta en columna 1.37 g con el mismo solvente (CCF N18).

La cromatografa de las fracciones de 1-6 con solvente de corrido: CH3COOH, H2O,

EtOAc, 1 propanol; (1:30:40:40) y revelado con KOH alcohlico tenemos mezclas de

- 46 -

compuestos los que presentan Rf 0.50 y 0.70 son sensidos C y D.(CCF N19 ). En la

fraccin 6 tenemos un compuestos puro con Rf 0.42 con max 277, 283 y 302 nm.

Placa cromatogrfica de las fracciones de 7-12 con solvente de corrido: CH3COOH,

EtOAc, 1 propanol; (1:40:40) unir de la 10 -12 presentan similares Rfs y purificar para

realizar una microcolumna. (CCF N20).

La fraccin 2 corrido en EtOAc, MetOH; (45:15) con Rf 0.45 y 0.53 d a un compuesto

puro. (CCF N21). Para las muestras 3 y 4 se cambia el solvente con CH3COOH, EtOAc,

1 propanol; (1:40:40) en la que existe 1 compuesto puro con Rf = 0.24 a una max 227,

271 y 313 nm. (CCF N22).

- 47 -

Placa N1

Fase estacionaria de

Slica gel G F254

Muestra:

1. Extracto Etanlico del

Sen

2. Extracto etanlico

Senna multijuga

Solvente de recorrido: CH3COOH,H2O,EtOAc,1

propanol; (1:30:40:40)

Revelador: KOH

alcohlico

Placa N2


Slica gel G F254

Solvente de recorrido:

C6H6, CHCl3, EtOH;

(3:5:2) Revelador: Rosentaler Muestras:

Subextracto Etreo II

Subextracto

Clorofrmico III

Subextracto Butanlico

IV

Placa N3

Fase estacionaria de Slica

gel G F254

Muestras II : Fracciones 1-6

Solvente de recorrido: C6H6 Revelador: Rosentaler

1: Sen Rf1: 0.50

Rf2: 0.70

Rf3: 0.80

Rf4:0.82

Rf5:0.93

2: Senna multijuga

Rf1: 0.50

Rf2: 0.70

Rf3: 0.80

Rf4: 0.93

E: Etreo

C: Clorofrmico

B: Butanlico

Fraccin 4 y 5 Rf1: 0,0

Rf2: 0,59

Rf3; 0,90

- 48 -

Placa preparativa

II.4 y II.5


C6H6

Revelador:Rosentaler

Placa N4


gel G F254

Muestras: II.4 y II.5


C6H6 EtOAc; (10:5)

Revelador: Rosentaler

Placa N5

Fase estacionaria Slica

gel G F254

Muestra del Extracto:

Fraccin de la columna 7-

17


C6H6

Revelador: I2

Rf1: 0.0

Rf2: 0.23

Rf3:0.93

Rf1: 0.0

Rf2:0.58

Rf3:0.93

Fraccin 7 Fraccin 8 Rf1: 0.65 Rf1: 0.67 Rf2: 0.90 Rf2: 0.92

Fraccin 9 Fraccin 10 y 17 Rf1: 0.68 Rf1: 0.65 Rf2: 0.93 Rf2: 0.93

- 49 -

Placa N6


gel G F254

Muestra II: 22.1-22.2


Tolueno,

CH3COOH;(93:3.7)


Placa N7


gel G F254

Muestra II:22.4- 22.7


EtOAc


Placa N8

Fase estacionaria

de Slica gel G F254

Muestra II.: 22.8-

22.12

Solvente de

recorrido: EtOAc

(100%)

Revelador: CeSO4

# 1: Rf1= 0.53

Rf2= 0.94

#2: Rf1 = 0.53

Rf2= 0.92

# 4: Rf1= 0.38

#5: Rf1 = 0.40

#6:Rf1= 0.37

#7:Rf1= 0.36

#8: Rf1= 0.81

#9: Rf1=0.73

#10: Rf1= 0.67

#11: Rf1= 0.58

Rf2=0.67

#12: Rf1= 0.58

Rf2=0.67

- 50 -

Placa N9


Slica gel G F254

Muestra II: 22.13-22.16


Tolueno, CH3COOH;

(93:3.7)

Revelador: KOH

Placa N10


Slica gel G F254

Muestra de Subextracto:

Clorofrmico III


CHCl3,MeOH ;(6:2)

Revelador: KOH

alcohlico

Placa N11


Slica gel G F254

Muestra de Subextracto

IV: Fraccin 1-4


Acetona,EtOAC; (2:1)


# 13:Rf= 0.68

#14:Rf = 0.68

#15:Rf= 0.69

#16: Rf= 0.71

Rf: 0.46

0.48

0.93

# 1:Rf= 0.42

#2:Rf = 0.43

#3:Rf= 0.40

#4: Rf= 0.43

- 51 -

Placa N12


Slica gel G F254


IV: Fraccin 5-9


EtOAc


Placa N13


Slica gel G F254


IV: Fraccin de 10-14


EtOAc,MeOH; ( 95:5)


Placa N14


Slica gel G F254

Muestras IV

11.1,11.2,11.3,11.4


EtOAc,MeOH; ( 95:5)


#5:Rf= 0.42

#6:Rf = 0.41

#7:Rf= 0.18

0.42

#8: Rf= 0.19

0.40

#9: Rf= 0.19

0.38

#10:Rf= 0.25

0.44

#11:Rf= 0.25

0.44

#12: Rf=0.23

0.48

#13: Rf= 0.24

0.51

#14: Rf= 0.25

0.55

#1 Rf =0.60

#2 Rf =0.46

#3 Rf =0.70

#4 Rf =0.52

- 52 -

Placa N15


Slica gel G F254

Muestra de Sub extracto

IV: Fraccin 15-18


MeOH 100%


Placa N16


Slica gel G F254


IV : 18.1 ,18.2,18.3


EtOAc (100)


Placa N17


Slica gel G F254


IV: 19.1 ,19.2,19.3


Tolueno,EtOAc ;(80:20)


#15:Rf= 0.24

0.61

#16: Rf=0.24

0.61

#17: Rf=0.61

#18: Rf=0.61

#1 Rf=0.25

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