Workshop sobre el rol de las mediciones microbiológicas trazables y confiables para asegurar la calidad y seguridad

de los alimentos.

Disertante: Dr. Celia PuglisiDepartamento de Metrología Cientíca e Industrial

La reunión se abrió con una presentación del Dr. Robert Kaarls quien dio la bienvenida y expuso sobre el rol y las actividades del CCQM.

La competitividad e innovación sostenida, el crecimiento la distribución global de las industrias y los servicios, requiere incrementar la exactitud y comparabilidad de las mediciones.

El movimiento de las personas alrededor del mundo, los productos alimenticios que se

trasladan en las diversas regiones, la diseminación global de enfermedades, los

cambios climáticos y ambientales, requieren nuevas áreas en la metrología tales como,

química, biotecnología, microbiología, materiales de avanzada, nanotecnología e información

tecnológica

La calidad de vida exige un crecimiento de las demandas metrológicas

•Seguridad de los alimentos y contenido nutricional

•Cuidado de la salud y protección.

•Ambiente, control de la contaminación y cambio climático.

•Seguridad y mediciones forénsicas.

•Antidoping.

•Metrología “sensorial” (olor, color, gusto, forma, etc.)

“Una vez medido, aceptado en todos lados” Requiere comparabilidad a través de la trazabilidad

Trazabilidad MetrológicaPropiedad del resultado de una medición, por el cual este resultado puede ser relacionado a una referencia a través de una cadena ininterrumpida de calibraciones, cada una de las cuales contribuye a la incertidumbre de medición.JCGM 200:2008 (VIM3)

Esquema para establecer la comparabilidad internacional

El VIM aclara luego que la “referencia” puede ser la definición de una unidad de medida a traves de su realización práctica, un procedimiento de medición incluyendo la unidad de medida, o un material de referencia

A continuación el Dr. Betts de la empresa Campden (Food and Drink Innovation) describió los problemas involucrados en las determinaciones microbiológicas.

• Algunos microorganismos pueden deteriorar la comida cuando crecen: color, defectos visuales, olor.

• Algunos organismos implican un riesgo para la salud humana, simplemente por estar presentes o por crecer a un numero importante.

•Deterioro de los alimentos: Se estima que un 20 a 30% del total de la producción de alimentos en el mundo se pierde debido al deterioro

microbiológico.

Gran parte de esto se debe a problemas con la materia prima para los alimentos. La tendencia a producir alimentos más “frescos” con menor contenido de sal, azúcar y preservantes, hace que los alimentos estén más propensos al ataque microbiológico. Se debe pagar un gran precio social y económico por el deterioro biológico de la comida.

Las estimaciones de los casos de envenenamiento por alimentos de la European Food Safety Authority se resumen en la siguiente tabla:

Microorganismo Europa 2009 USA 2011

Salmonella 108614 1027561

Campylobacter 198252 854024

Listeria 1645 255 muertos

VTEC E.coli 3573 2100 hospitalizados

Yersinia 7595Los futuros cambios que impactan en la contaminación de la comida están dados por la tendencia a usar menor cantidad de preservantes, reducir el procesamiento proveyendo comida más fresca y la distribución del suministro de alimentos en forma globalizada.

Que se requiere para el control:

• Poder evaluar en forma reproducible los indicadores de higiene, de microorganismos que deterioran los alimentos y los patógenos.

• Detectar patógenos en dosis bajas de infección.

• Métodos para organismos emergentes, para determinación de patógenos, toxinas, etc. Para todos los tipos de alimentos.

Para producir alimentos en forma saludable se utiliza el sistema de HACCP, pero los ensayos sirven para verificar que el diseño del control implementado esta funcionando correctamente.

Que se necesita

Un método debe considerar los siguientes aspectos:

•Muestreo

•enriquecimiento (crecimiento)

• enumeración de los microorganismos, detección, aislación, confirmación de la identidad y caracterización.

Importancia del Muestreo

Es difícil hacer un muestreo representativo de un alimento dado que la población microbiológica se distribuye en forma no homogénea, de modo que puede tomarse una porción del alimento en la que no se encuentran los microorganismos.

Otro problema es la lentitud de los ensayos microbiológicos debido a que en algunos casos se necesita un resultado rápido.

Los métodos de referencia se basan en el crecimiento de microorganismos y este crecimiento lleva tiempo.

Existen métodos rápidos pero no dan resultados equivalentes al del conteo en placa (impedancia, conductancia, turbidez y conteo de células).

Detección rápida

Los métodos de referencia requieren varios días para el crecimiento, los nuevos métodos disponibles son los de Inmunoensayo y métodos basados en ensayos de DNA (Ej: PCR)

Por PCR se puede detectar, teóricamente, una copia simple de DNA en menos de 4 horas.

En muchos ensayos de patógenos se trata de detectar la presencia de un microorganismo en 25 gramos, mientras que muchos ensayos de PCR requieren un volumen de reacción menos que 10 microL, por lo cual es difícil asegurar que el microorganismo se encuentra presente en ese volumen.

Se cuestiona que los nuevos métodos generen resultados equivalentes.

Por otro lado cabe cuestionarse que es necesario buscar, si el organismo o su toxina.

Los hongos y levaduras crecen más lentamente que las bacterias por lo cual los métodos basados en el crecimiento requieren más tiempo. Si hay microorganismos que son muy potentes como para deteriorar el alimento, una detección rápida previene mejor, pero hay muy pocos métodos rápidos.

Los virus son patógenos muy importantes, pero son parásitos intracelulares. Y los métodos de determinación son pobres.

Entre otros problemas que deben enfrentarse, se pueden mencionar, que el alimento tiene una estructura química, casi idéntica a la del microorganismo.

Que los microorganismos son todos diferentes, tienen un crecimiento diferente, pueden estar dañados o pueden estar vivos pero no reproducirse (estado de latencia). Para saber si un método funciona, se requeriría un material de referencia, pero no están disponibles.

Otro problema es la incertidumbre de medición en microbiología. Los usuarios nunca lo consideran y este problema es importante en el caso de la Legislación.

Se cuestiona si existen los métodos necesarios para encontrar patógenos, para encontrar organismos que deterioran el alimento, para establecer el estado de higiene, para establecer la fecha de vencimiento, y establecer si puede producir enfermedades o deterioro.

Incertidumbre de medición y cumplimiento de las especificaciones

Límite de

control superior

Resultado e incertidumbre

fuera del límite Resultado fuera

del límite Incertidumbre

dentroResultado dentro del límite pero

incertidumbre fuera

Resultado e incertidumbre

dentro del límite

www.ILAC.org Guia G8:1996

La Dra. Marie-Pierre Copin. de la empresa 3M. Francia, hizo una presentación de los kits para ensayos rápidos que involucran sólo 3 pasos:

•inoculación

•incubación

• interpretación.

Aclaró que debe mostrarse evidencia que el método rápido se comporta de manera equivalente al de referencia, pero con la ventaja práctica de su rapidez y fácil utilización. Los métodos tienen que estar validados y aceptados por las regulaciones y las directivas.

Los métodos alternativos deben compararse con los métodos de referencia siguiendo los protocolos internacionalmente aceptados. Debe establecerse si se sigue la norma ISO 16140 para la validación de su comportamiento u otro protocolo internacionalmente aceptado.

Referencia: Regulación de la Comunidad Europea Nro 2073/2005, art.5

Existen varias organizaciones que garantizan la validación de los métodos rápidos, como por ejemplo Microval, Afnor, la AOAC internacional entre otras. Pero se necesita armonización global, métodos de referencia y protocolos de validación armonizados.

Miembros de la Federación Internacional de Lecherías hicieron una presentación sobre las necesidades del sector con énfasis en el conteo de células somáticas.

Se mencionó la estadística del incremento de la producción mundial de lacteos y de la magnitud de las exportaciones.

Cuando las mercaderías se transportan los resultados analíticos deben ser comparables y equivalentes en todo el mundo y a lo largo del tiempo y deben establecerse las equivalencias de los diferentes métodos de medición.

Se mencionaron los métodos para hacer el conteo de células somáticas en leche y se destacó que los materiales de referencia tienen problema con la homogeneidad durante el almacenamiento y su fecha de vencimiento.

Se mostró un esquema del sistema de referencia para el conteo de las células somáticas.

Jean McClure de la firma Unilever hablo sobre la necesidad de mediciones microbiológicas confiables para el control del procesamiento de alimentos (HACCP).

Paul Cook de la Empresa Head Microb. Food SafetyBranch, UK, presentó la problemática de los alimentos para animales

Destacó la importancia de controlar los alimentos ya que posibles contaminaciones pueden pasar luego a la carne y por lo tanto generar un peligro para el consumidor.

Nuevamente se habló sobre la importancia del muestreo sobre todo para muestras con baja contaminación.

Thomas Hammack de la Food and Drug Administration de EEUU expuso sobre las regulaciones existentes en Estados Unidos y mencionó las áreas que regula la asociación.

Dió información de las estadísticas sobre intoxicaciones en Estados Unidos por contaminación de distintos alimentos. Nuevamente mencionó que los métodos que se exigen para aceptación o rechazo en EEUU son los de cultivo, que requieren mucho tiempo y mencionó las ventajas y desventajas de los métodos moleculares.

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Los métodos de referencia tampoco están armonizados en EEUU hay métodos de la Food and Drug Administration, de la USDA, de la EPA y los internacionales de la ISO.

Mencionó también las guías de validación. Destacó la necesidad de armonización para facilitar el comercio internacional y la mayor confianza en los resultados.

Arlene Fox de la AOAC hizo una presentación sobre la organización (AOAC) y el desarrollo de normas y metodologías de validación.

Mencionó las tareas de armonización que ellos realizan y destacó la cantidad de métodos de referencia que existen para alimentos.

Para la validación de métodos mencionó que se requiere cultivos internacionalmente reconocidos, como por ejemplo ATCC u otra fuente “trazable” equivalente.

No explicó el significado de la palabra trazable, aunque se sobreentiende que esta trazabilidad está relacionada a un reconocimiento comercial.

R Smith del LGC, UK, hizo una presentación de los ensayos Interlaboratorio que ellos realizan.

Describió como preparan las muestras, como evalúan la estabilidad y la homogeneidad, y como evalúan los resultados.

J. Anthony de ATCC hizo un resumen de lo discutido anteriormente, mencionando que alguno de los objetivos a tener en cuenta son los siguientes:

• Mejorar la calidad y credibilidad de las mediciones microbiológicas.

• Entender cómo puede ayudar la metrología para lograr este fin.

• Lograr cooperación entre la metrología y los expertos microbiólogos.

• Definir las necesidades de trazabilidad en mediciones microbiológicas.

Agregó que basandose en las discusiones mantenidas en este Workshop es imposible cuestionar que es necesario afrontar los aspectos metrológicos, teniendo en cuenta que del 20 al 30% de la producción de alimentos se destruye por deterioro microbiológico.

Hay un esfuerzo y recursos considerables dedicados a este tema, tal como fueron presentados aquí y se está gastando considerable cantidad de dinero en esta área.

• Existe un gran deseo de lograr el desarrollo de un enfoque más globalizado para la estandarización de métodos microbiológicos.

• En este momento se puede decir que hay 2 desafíos claves para los microbiólogos, uno es la enumeración (cuanto hay) y el otro es la identificación. La complejidad de este tema se debe a que estamos trabajando con un sistema vivo y por lo tanto inherentemente variable, por lo cual hay un apreciable desafío metrológico.

• Hay una importante actividad en la industria, tendiente a encontrar nuevas maneras de medir los 2 parámetros antes mencionados. Pero compararlos con los métodos tradicionales genera grandes desafíos.

• Hay diferentes opiniones respecto de lo que representa un método estándar para la comparación, ejemplo: las células somáticas pueden considerarse como microbiología? Y como podemos generar materiales de referencia para estas mediciones? Qué organismos estamos tratando de detectar: esporas?, virus?, toxinas?, patógenos específicos?

• Cómo explicar los diferentes parámetros que cada ensayo mide?, ejemplo: unidades formadoras de colonias versus número real de células. En este caso se usan logaritmos pero 11=99 y en cambio 101 no lo es… lo cual complica la evaluación de la incertidumbre.

• Las experiencias en ensayos de aptitud muestran las discrepancias en respuestas de distintos laboratorios.

Al final del Workshop, se les pidió a los laboratorios nacionales de 6 países entre ellos, Australia, China, EEUU, Corea, Argentina e Inglaterra que hagan una presentación muy corta de la problemática en ese país.

En la discusión final se concluyó que el problema es tan serio que para enfrentarlo el CCQM generará un grupo de trabajo específico.

MUCHAS GRACIAS !!!