detección de bacterias patógenas: aislamiento y...
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Detección de Bacterias Patógenas:
Aislamiento y Confirmación de Resultados
Detección de Salmonella
Interpretación del crecimiento
Día
1
Día
2
Día
3
Día
4
Día
5
Día
6
Para confirmación: tome 5 colonias sospechosas de cada
plato y plaquee en Agar Nutritivo 18 - 24 h / 35 - 37 °C
Pruebas Bioquímicas/Serológicas de Confirmación
25 gr muestra
en 225 ml Agua Peptonada
16 - 20 h / 35 - 37 °C
1 ml Agua Peptonada
a 10 ml Caldo MKTT
24 h a 37°C
0.1 ml Agua Peptonada
a 10 ml Caldo RVS
24 h a 41.5°C
Agar XLD
24 h / 35-37°C
1 plato 14 cm /
2 platos 9 cm
Cualquier otro
Salmonella Agar
1 plato 14 cm /
2 platos 9 cm
4 días
11 medios
Agar XLD
24 h / 35-37°C
1 plato 14 cm /
2 platos 9 cm
Cualquier otro
Salmonella Agar
1 plato 14 cm /
2 platos 9 cm
Norma ISO 6579 para la Detección de Salmonella
Día
1
Día
2
Día
3
Día
4
Día
5
Día
6
25 g/ml de muestra
en 225 ml Caldo Lactosa
16 - 20 h / 35 - 37 °C
1 ml de Caldo Lactosa a
10 ml Caldo TT
24 h a 35°C
1 ml de Caldo Lactosa a
10 ml selenito Cisteina
24 h a 35°C
Método FDA-BAM
para la Detección de Salmonella
4 días
9 medios
Agar XLD 24± 2 h a 35 °C
Agar Bismuto Sulfito 24± 2 h a 35 °C
Agar Hecktoen 24± 2 h a 35 °C
3 platos de cada
Caldo selectivo
Interpretación del crecimiento
Para confirmación: tome 5 colonias sospechosas de cada
plato y plaquee en Agar Nutritivo 18 - 24 h / 35 - 37 °C
Pruebas Bioquímicas/Serológicas de Confirmación
25 g/ml de MUESTRA
en Caldo SALMOSYST®
6 h / 35 - 37 °C
Agregar 1 tableta de
SALMOSYST® SUPLEMENTO
A 10 ml de Caldo SALMOSYST®
y continúe incubando
18 h / 35 - 37 °C
AISLE EN AGARES PARA
SALMONELLA
Día
1
Día
2
Sólo 1
Medio
Enriquecimiento en 24 horas:
Caldo Salmosyst ®
Los medios de cultivo tradicionales para
Salmonella se basan en la producción de H2S:
Desventaja:
Citrobacter y Proteus enmascaran la Salmonella
Alto número de falsos - positivos
Agar Rambach®
Salmonella
Coliformes Proteus
Rojo Salmonella
Violeta Coliformes
Incolora Otras bacterias
Sistema Diferencial
Ssitema Selectivo
1. Salmonellae degrada el propilenglicol produciendo ácido.
El Rojo Neutro da el color rojo de las colonias
2. Las bacterias galatosidasa positivo degradan el sustrato
cromogénico produciendo colonias azul-violeta
Desoxycolato de Sodio
Principio
Agar Rambach®
AGAR XLT4
Tergitol 4: inhibe Proteus
Citrobacter
Salmonella
Sistema Diferencial
Sistema Selectivo
Principio
Negro Salmonellae
Negro con halo amarillo Citrobacter
Incoloras con halo amarillo Bacterias Xilosa-Lactosa-Sucrosa positivo
Incoloras Otras bacterias ej. Shigella
Formación de H2S via tiosulfato
y hierro produce colonias negras
Disimilación de los azúcares produce ácido (rojo fenol cambia de rojo a amarillo
Día
1
Día
3
Día
4
25 g/ml de muestra
en 225 ml Agua Peptonada 35-37 °C por 16-20 h
SEMBRAR
EN RAMBACH 37 °C POR 24 h
Día
2
NO Salmonella
presente
Si es positivo, se requiere confirmación por
cultivo y pruebas bioquímicas
0.1 ml AP a 10 ml Caldo RVS 42°C por 24 h
Calentar por 15 min a 95°C
Prueba Rápida Immunológica Singlepath® Salmonella para la Detección de Salmonella en
Alimentos
sólo 2 medios
sólo 2 días
SI Salmonella
presente
Principio : Singlepath® Salmonella
Evaluación de Singlepath® Salmonella:
aprobación AOAC
Evaluada con 105 especies de Salmonella y 58 no Salmonella
Demostró la detección de Salmonella sp a niveles bajos de contaminación: 1-10 ufc/25 gr, a partir de las siguientes matrices:
- Leche descremada en polvo
- Pimienta negra
- Alimento deshidratado de mascotas
- Coco deshidratado
- Langostinos congelados
- Carne cruda molida de res
- Carne cruda molida de pavo
Sensibilidad y especificidad: >98%
Certificate of Performance Tested Status : Certificate N° 060401
Metodologías: Patógenos/Bacterias
Muestra
Caldo enriquecimiento Caldo enriquecimiento selectivo
= Patógeno
PCR Tiempo Real
1.- 2.-
3.- Aislamiento/identificación
Comienzo 20 min 40 min 100 min
90 min
PCR-set up PCR
Preparación
muestra
Cultivo
enriquecido o
colonia aislada
Detección
y Análisis
En solamente 100 minutos desde el comienzo hasta el resultado
Introducción del qPCR (cuantitativo PCR)
Caldo de Enriquecimiento + muestra
(metodología tradicional, FDA, ISO)
Convencional
Enriquecimiento No-selectivo
16 – 20h
Enriquecimiento Selectivo
24h
1. Medio Sólido
24h
2. Medio Sólido
24h
Aislamiento/Incubación
24h
Baterias Bioquímicas
4h
Verificación
Serológica 4h
Enriquecimiento No-
selectivo
16 – 24h
Preparacion Muestra
0.5h
Amplificación/Detección
1h
PCR
Tiempo ahorrado: neg. result > 2 d
pos. result > 4 d
De la Muestra al Resultado - Salmonella
Métodos de Detección para
Listeria y L. monocytogenes
Medios para el aislamiento de Listeria
• Agar PALCAM
– Listeria spp.
• Agar OXFORD
– Listeria spp.
• Agar Selectivo para Listeria acc. to AGOSTI & OTTAVIANI
– Listeria monocytogenes
– Medio cromogénico
– Nuevo medio obligatorio en el ISO Standard 11290 ( 2004 )
* Los Agares PALCAM y OXFORD se basan en el desarrollo del
color negro por la hidrólisis de la esculina.
* El Agar PALCAM contiene manitol
para diferenciar Enterococci por la
fermentación del manitol (color amarillo)
Medios para el aislamiento de Listeria
Agar Base Selectivo para Listeria ChromoCULT ALOA
Principio de funcionamiento
• Formulado bajo norma ISO 11290 (2004) y FDA-BAM 2003
• Principio de detección de Listeria monocytogenes:
1. “sustrato definido” o “sustrato cromogénico” :
detección de la enzima -D-glucosidasa
2. sustrato L-alfa fosfatidilinositol:
detección del factor de virulencia de L. monocytogenes (PI-PLC)
PI-PLC
- D Glucosidasa
L. innocua
L. monocytogenes
Agar Chromocult® para Listeria
Listeria spp. Listeria monocytogenes.
Agar Chromocult ALOA acc. a la Norma ISO
Día
1
Día
3-6
25 g/ml MUESTRA
EN 225 ml CALDO FRASER A ½
CONCENTRACIÓN
30°C POR 24h
SEMBRAR
EN ALOA® + PALCAM
37°C POR 24 - 48h
Día
3-4
Método ISO 11290-Parte 1
Día
4-7
0.1 ml EN 10 ml FRASER
35 ó 37°C POR 48h
Todas las colonias que muestran color azul verdoso con halo opaco y/o color gris/verdoso con una
zona negra, son presuntivas de L. monocytogenes (colonias típicas).
Las colonias sospechosas deben ser confirmadas.
SEMBRAR
EN ALOA® +
PALCAM
37°C POR 24 - 48h
CONFIRMACIÓN BIOQUÍMICA: GRAM (+), CATALASA (+), MOVILIDAD (+),
CAMP (+), HEMOLISIS (+), GLUCOSA (+), RHAMNOSA (+), XYLOSA (-)
Día
1
MUESTRA
Contar todas las colonias azul-
verdoso con halo opaco
Día
2 - 3
Método para Recuento ISO 11290-Parte 2
L. monocytogenes en Alimentos
Confirmación Bioquímica
0,1 ml
Día
4 - 5
37°C 24 - 48 h
Inocule en AgarALOA®
Día
1
Día
3-5
Día
6
25 g/ml MUESTRA
EN 225 ml Buffered LEB
30 °C por 4 h
SEMBRAR
EN ALOA®
37 °C
Por 24 – 48 h
TOMAR 5 COLONIAS TIPICAS Y SUBCULTIVAR EN AGAR TSYE, 35 ó 37°C POR 24 h
Día
2-3
CONFIRMACIÓN BIOQUÍMICA
SEMBRAR
EN ALOA®
37 °C
por 24 – 48 h
SEMBRAR
EN OXFORD
35°C
po 24 –48 h
Después 24 h Después de 48 h
Método FDA-BAM
Agregar agentes
selectivos
30 oC por 44 h
SEMBRAR
EN OXFORD
35°C
Por 24 – 48 h
Día
1
Día
3-5
Día
6
SEMBRAR
EN AGAR
OXFORD
30, 35 ó 37 °C
por 24 – 48 h
ó Día
2
Método IDF-FIL para leche y productos lácteos
SEMBRAR
EN AGAR
PALCAM
30, 35 ó 37 °C
por 24 – 48 h
25 g/ml MUESTRA
en 225 ml LEB 30 °C por 48h
TOMAR 5 COLONIAS TIPICAS Y SUBCULTIVAR EN AGAR TSYE, 35 ó 37°C POR 24 h
CONFIRMACIÓN BIOQUÍMICA
Día
1
Día
3-5
Día
6
25 g/ml de MUESTRA
en 225 ml Caldo UVM I
30 °C por 24 h
0.1 ml a 10 ml de
Caldo UVM II ó FRASER
35 oC por 24 h
Día
2
SEMBRAR EN
AGAR OXFORD
35 °C por 24-48h
Método USDA para carnes rojas, pollo, huevos y
medio ambiente
CONFIRMACIÓN BIOQUÍMICA
TOMAR 5 COLONIAS TIPICAS Y SUBCULTIVAR EN AGAR TSYE, 35 ó 37°C POR 24 h
Singlepath® L´mono
- Primera prueba rápida en el mundo para la detección específica de Listeria monocytogenes
- Para el tamizaje de muestras ambientales y de alimentos, como productos lácteos, salmón ahumado, hígado de ganso
- Para la confirmación de colonias sospechosas de Listeria,
aisladas de agares selectivos como PALCAM, Chromocult®
Listeria Agar, ALOA
- Límite de Detección: 2x 106 ufc/ml
- Medio de enriquecimiento usado: Fraser, LEB, UVM
Día
1
Día
3
25 g/ml muestra en 225 ml LEB o UVM II
a 30 °C por 21-24 h
0,1 ml en 10 ml LEB,
UVM II 30oC por 21- 24h
ALOA
30, 35 o 37 °C
por 24 h
Día
2
Si es positivo, se requieren
confirmación por cultivo o pruebas bioquímicas
Detección Rápida Immunológica de Listeria mono-
cytogenes en Alimentos con Singlepath® L ´ mono
NO Listeria mono
presente
SI Listeria mono
presente
Solo en 20
minutos
Suspender 1 - 5 colonias
sospechosas en 250 µl de Caldo BHI
L. monocytogenes
confirmada
Agar PALCAM Agar OXFORD Agar ALOA®
L. monocytogenes
no confirmada
180 µl
1 h at 37°C
Singlepath L’ Mono® y Chromocult ALOA
Confirmación perfecta
Enriquecimiento No-
selectivo
24 – 48h
Preparacion Muestra
0.5h
Amplificación/Detección
1h
PCR
Tiempo ahorrado: neg. result > 2 d
pos. result > 4 d
De la Muestra al Resultado – Listeria monocytogenes
Convencional
Enriquecimiento No-selectivo
24 h
Enriquecimiento
Selectivo
24 – 48 h
1. Medio Sólido
24 h
Aislamiento/Incubación
24 h
Baterias
Bioquímicas
4 h
Verificación
Serológica 4 h
Comienzo 20 min 40 min 100 min
90 min
PCR-set up PCR
Preparación
muestra
Cultivo
enriquecido o
colonia aislada
Detección
y Análisis
En solamente 100 minutos desde el comienzo hasta el resultado
Introducción del qPCR (cuantitativo PCR)
Caldo de Enriquecimiento + muestra
(metodología tradicional, FDA, ISO)