nc-iso 6579 guia para detección de salmonella ssp

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 NOTA IMPORTANTE: La entidad sólo puede hacer uso de esta norma para si misma, por lo que este documento NO puede ser reproducido, ni almacenado, ni transmitido, en forma electrónica, fotocopia, grabación o cualquier otra tecnología, fuera de su propio marco. ININ/ Oficina Nacional de Normalización

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NOTA IMPORTANTE:

La entidad sólo puede hacer uso de esta norma para simisma, por lo que este documento NO puede ser reproducido, ni almacenado, ni transmitido, en formaelectrónica, fotocopia, grabación o cualquier otratecnología, fuera de su propio marco.

ININ/ Oficina Nacional de Normalización

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NORMA CUBANA

NCISO 6579: 2008

(Publicada por la ISO en 2002)

MICROBIOLOGÍA DE ALIMENTOS DE CONSUMO HUMANO YANIMAL — MÉTODO HORIZONTAL PARA LA DETECCIÓN DESALMONELLA SPP — MÉTODO DE REFERENCIA(ISO 6579:2002, IDT)

Microbiology of Food and Animal Feeding Stuffs-Horizontal — Method for the

Detection of Salmonella spp — Reference Method

ICS: 07.100.30 1. Edición Mayo 2008REPRODUCCIÓN PROHIBIDA

Oficina Nacional de Normalización (NC) Calle E No. 261 Vedado, Ciudad de LaHabana. Cuba. Teléfono: 830-0835 Fax: (537) 836-8048; Correo electrónico:[email protected]; Sitio Web: www.nc.cubaindustria.cu

Cuban National Bureau of Standards

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Prefacio

La Oficina Nacional de Normalización (NC), es el Organismo Nacional de Normalizaciónde la República de Cuba y representa al país ante las organizaciones internacionales yregionales de normalización.

La elaboración de las Normas Cubanas y otros documentos normativos relacionados serealiza generalmente a través de los Comités Técnicos de Normalización. Su aprobaciónes competencia de la Oficina Nacional de Normalización y se basa en las evidencias delconsenso.

Esta Norma Cubana:

• Ha sido elaborada, por el Comité Técnico de Normalización NC/CTN 61 de Microbiología de los Alimentos, integradopor las siguientes Instituciones:

Ministerio de Salud Pública (UNSA)Instituto de Nutrición e Higiene de los AlimentosCentro Nacional de Higiene de los AlimentosCentro Nacional de Inspección de la CalidadLaboratorio de Cuba-Control S.A.Oficina Nacional de Normalización

Centros Provinciales de Higiene y EpidemiologíaCentro Nacional de sanidad AgropecuariaLaboratorio de Alimentación SocialALIMPORTEscuela de Hotelería y Turismo

• Es una adopción idéntica por el método de traducción de la versión en inglés de la Norma Internacional ISO6579:2002 Microbiology of Food and Animal Feeding Stuffs- Horizontal Method for the detection of Salmonella spp.

• Se aplicará para todos los alimentos para consumo humano y animal, con independencia de la existencia de NormasISO para productos específicos.

• Se empleará como método de referencia para la detección de Salmonella spp. en alimentos, lo cual se especificaademás en el título de la misma.

• Sustituye a la NC-ISO 6579: 2004 Microbiología de Alimentos de Consumo Humano y Animal – Guía general para ladetección de salmonella y a la NC 74-42:1986 Ganadería. Alimentación animal. Determinación de salmonella.

En esta norma se han adicionado en los apartados B.6.a y B.8.a respectivamente, los medios agar hierro Kligler y agar hierro lisina (LIA), para la confirmación bioquímica, como medios opcionales para las pruebas confirmativas. Lo anterior está avalado por literatura internacional reconocida, como:

-American Public Health Association (APHA). 1992. Compendium of Methods of Microbiology Examination of Food.Chapter 25, Third Edition, Washington DC.

-Association Official of Analytical Chemistry (AOAC) and Food and Drug Administration (FDA). 1995. Bacteriological

Analytical Manual (BAM). Chapter 5. 8

th

Edition, USA.

© NC, 2008 Todos los derechos reservados. A menos que se especifique, ninguna parte de estapublicación podrá ser reproducida o utilizada en alguna forma o por medioselectrónicos o mecánicos, incluyendo las fotocopias, fotografías y microfilmes, sinel permiso escrito previo de:Oficina Nacional de Normalización (NC)Calle E No. 261, Vedado, Ciudad de La Habana, Habana 4, Cuba.

Impreso en Cuba. 

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Índice

Página 

0. Introducción  4

1. Objeto 5

2. Referencias normativas 5

3. Términos y definiciones 5

4. Principio 6

5. Medios de cultivo, reactivos y antisueros 7

6. Aparatos y cristalería 87. Muestreo 9

8. Preparación de la muestra de ensayo 9

9. Procedimiento (ver diagrama en Anexo A)  9

10. Expresión de los resultados 17

11. Informe del análisis 17

12. Aseguramiento de la calidad 17

Anexo A (normativo) Diagrama del procedimiento 18Anexo B (normativo) Composición y preparación de mediosde cultivo y reactivos.

19

Anexo C (informativo) Resultados de la pruebainterlaboratorio.

33

Bibliografía 36

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0 Introducción

Dada la gran variedad existente de productos alimenticios destinados al consumo humano yanimal, este método horizontal puede no ser apropiado en todos los detalles para determinadosproductos. En este caso, se pueden usar diferentes métodos, específicos para estos productos, siestá absolutamente justificado por razones técnicas. Sin embargo, se debería intentar aplicar estemétodo horizontal siempre que sea posible.

Cuando se revise nuevamente esta norma cubana, se tendrá en cuenta toda la informacióndisponible en ese momento, sobre la aplicación de este método y las razones que han originadodesviaciones para productos concretos.

La armonización de los métodos de ensayo no puede ser inmediata y para ciertos grupos deproductos pueden existir ya normas nacionales que no se ajusten a este método horizontal. Se

espera que cuando estas normas sean revisadas, se cambien para que se ajusten a esta normacubana y que solo se conserven las divergencias inevitables justificadas por razones técnicas. 

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MICROBIOLOGÍA DE ALIMENTOS DE CONSUMO HUMANO Y ANIMAL — MÉTODOHORIZONTAL PARA LA DETECCIÓN DE SALMONELLA SPP — MÉTODO DE REFERENCIA

AVISO – Con el fin de proteger la salud del personal del laboratorio, es esencial que losanálisis para detectar Samonella, y en especial Salmonella ypha y Salmonella Paratyphi,se realicen exclusivamente en laboratorios con equipamiento adecuado, bajo lasupervisión de un microbiólogo calificado, y que se tome gran cuidado en la eliminación detodos los materiales que han sido incubados.

1 Objeto

Esta Norma Cubana describe un método horizontal para la detección de Salmonella, incluyendoSalmonella ypha y Salmonella Paratyphi.

Atendiendo a las limitaciones discutidas en la introducción, esta norma cubana es aplicable a:

- Productos para consumo humano y animal;

- Muestras ambientales en el área de la producción y manipulación de alimentos.

AVISO – Este método puede no recuperar todas las Salmonella ypha y SalmonellaParatyphi.

2 Referencias normativas

Esta norma incorpora disposiciones de las cuales se hacen referencia en este texto. En elmomento de la publicación estaban en vigor las ediciones indicadas. Toda norma está sujeta arevisiones, por lo que las partes, de acuerdo a los basamentos de esta norma cubana deben

estudiar la posibilidad de aplicar la edición más reciente de los documentos normativos indicadosa continuación. La Oficina Nacional de Normalización de Cuba posee registros actualizados de lasnormas en vigor, en cada momento.

NC ISO 6887-1:2003, Microbiología de los alimentos para consumo humano y animal –Preparación de las muestras de ensayo, suspensión inicial y diluciones decimales para examenmicrobiológico. Parte I: Reglas generales para la preparación de la suspensión inicial y dilucionesdecimales.

ISO 7218: 1996, Microbiología de los alimentos para consumo humano y animal – Reglasgenerales para los exámenes microbiológicos.

ISO 8261, Leche y productos lácteos – Guía general para la preparación de muestras paraanálisis, suspensiones iniciales y diluciones decimales para análisis microbiológicos

3 Términos y definiciones 

Para los propósitos de esta norma cubana, se aplican los siguientes términos y definiciones.

3.1 Salmonella: microorganismos que forman colonias típicas o menos típicas en medio selectivosólido y que muestran las características bioquímicas y serológicas descritas cuando los análisisse realizan acorde con esta norma.

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3.2 Detección de Salmonella: determinación de la presencia o ausencia de Salmonella (3.1), enuna masa o volumen determinada de producto, cuando los análisis se realizan acorde con esta

norma.

4 Principio

4.1 Generalidades

La detección de Salmonella necesita cuatro etapas sucesivas (ver también anexo A).

NOTA- Salmonella puede estar presente en números pequeños y a menudo está acompañada de númerosconsiderablemente mayores de otras Enterobacteriaceae  o de otras familias. Por consiguiente, esnecesario el pre-enriquecimiento para permitir la detección de números bajos de Salmonella o de Salmonella dañada.

4.2 Pre-enriquecimiento en medio líquido no selectivo

Se inocula en agua de peptona buferada a temperatura ambiente con la porción de ensayo, luegose incuba a 37 0C ± 1 0C durante 18 h ± 2 h.

Para ciertos productos alimenticios es necesario emplear otros procedimientos de pre-enriquecimiento. Ver el apartado 9.1.2.

Para grandes cantidades, se debe calentar el agua de peptona buferada a 37 0C ± 10C antes deinocular la porción de ensayo.

5.5 Enriquecimiento en medio líquido selectivoSe inoculan los medios Rappaport-Vassiliadis con soya (caldo RVS) y el caldo Muller –Kauffmanntetrationato/novobiocina (caldo MKTTn) con el cultivo obtenido en 4.2.

El caldo RVS se incuba a 41,5 0C ± 1 0C por 24 h ± 3 h, y el caldo MKTTn a 37 0C ± 1 0C por 24 h ± 3h.

4.4 Siembra en placa e identificación.

Se inoculan dos medios sólidos selectivos, a partir de los cultivos obtenidos en 4.3.

-

agar xilosa lisina desoxicolato (agar XLD);- cualquier otro medio sólido selectivo complementario al agar XLD y que sea especialmente

adecuado para el aislamiento de cepas de Salmonella lactosa positiva y Salmonella ypha y Salmonella Paratyphi; el medio se deja a la elección del laboratorio.

El agar XLD se incuba a 37 0C ± 1 0C y se examina después de 24 h ± 3 h. El segundo agar selectivo se incuba según las recomendaciones del fabricante.

NOTA- Para información, el agar verde brillante (AVB), agar sulfito de bismuto, etc., podrían ser utilizadoscomo el segundo medio en placa.

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4.5 Confirmación

Las colonias presuntivas de Salmonella, obtenidas después de sembrar en placas según sedescribió en 4.4, se subcultivan y su identificación se confirma mediante pruebas bioquímicas yserológicas apropiadas.

5 Medios de cultivo, re activos y antisueros

5.1 Generalidades

Para las prácticas habituales de laboratorio, ver ISO 7218.

5.2 Medios de cultivo y reactivos

NOTA – Ya que existe gran número de medios de cultivo y reactivos, se consideró preferible paramayor claridad del texto, dar su composición y preparación en el anexo B.

5.2.1 Medio de pre-enriquecimiento no selectivo: Agua de peptona buferada 

Ver B.1.

5.2.2 Primer medio de enriquecimiento selectivo: Medio de Rappaport- Vassiliadis con soya(caldo RVS). 

Ver B.2.

5.2.3 Segundo medio de enriquecimiento selectivo: Caldo de Muller- Kauffmann tetrationatonovobiocina (caldo MKTTn).

Ver B.3.

5.2.4 Medios sólidos selectivos en placa

5.2.4.1 Primer medio: Agar xilosa lisina desoxicolato (agar XLD) 

Ver B.4.

5.2.4.2 Segundo medio.

La elección del segundo medio adecuado se deja al criterio del laboratorio de análisis. Esconveniente seguir de manera precisa las instrucciones del fabricante en lo referente a supreparación.

5.2.5 Agar nutriente.

Ver B.5.

5.2.6 Agar triple azúcar/ hierro (agar TSI) o agar hierro Kligler 

Ver B.6 y B.6.a

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5.2.7 Agar urea (Christensen) 

Ver B.7.

5.2.8 Medio para la descarboxilación de la L-lisina o agar hierro lisina (LIA)

Ver B.8 y B.8.a

5.2.9 Reactivo para detección de la β-galactosidasa (o discos de papel preparados para utilizar según las instrucciones del fabricante).

Ver B.9.

5.2.10 Reactivos para la reacción de Voges-Proskawer (VP)

Ver B.10.

5.2.11 Reactivos para la reacción de indol

Ver B.11.

5.2.12 Agar nutriente semisólido.

Ver B.12.

5.2.13 Solución salina fisiológica

Ver B.13.

5.3 Antisueros

Se encuentran disponibles comercialmente varios tipos de antisueros que contienen anticuerpospara uno o varios antígenos O; es decir, antisueros que contienen anticuerpos para uno o másgrupos “O” (denominados antisueros O monovalentes o polivalentes), antisuero Vi, y antisuerosque contienen anticuerpos para uno o varios factores H (denominados antisueros H monovalenteso polivalentes).

Conviene hacer el máximo esfuerzo con el fin de asegurar que los antisueros empleados sean

adecuados para la detección de todos los serotipos de Salmonella. Con este objetivo, se puedenemplear solo antisueros preparados por un suministrador competente reconocido (por ejemplo, por un organismo gubernamental adecuado).

6 Aparatos y cristalería

Se puede emplear material desechable, como una alternativa aceptable a la cristalería reutilizable,si las especificaciones son similares.

Equipamiento habitual del laboratorio microbiológico (Ver ISO 7218) y en particular los siguientes.

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6.1 Aparato para esterilización en seco (horno) o esterilización húmeda (autoclave). Ver ISO 7218.

6.2 Cabina de secado u horno, ventilado por convención, capaz de operar entre 37˚C y 55˚C.

6.3 Incubadora, capaz de operar a 37˚C ± 1ºC.

6.4 Baño de agua, capaz de operar a 41.5ºC ± 1ºC, o incubadora, capaz de operar entre 41.5ºC± 1ºC.

6.5 Baños de agua, capaz de operar de 44ºC a 47ºC.

6.6 Baño de agua, capaz de operar a 37 ºC ± 1 ºC.

Se recomienda emplear un baño de agua (6.4, 6.5 y 6.6) que contenga un agente antibacterianodebido a la baja dosis infectiva de Salmonella.

6.7 Asas estériles, de 3mm de diámetro aproximado o de 10μl, o pipetas estériles.

6.8 pH-metro, con una precisión de calibración de ± 0.1 unidad de pH a 20 ºC – 25 ºC.

6.9 Tubos de ensayo o frascos, de capacidad adecuada.

Pueden emplearse botellas o frascos con tapas de rosca. Las tapas pueden ser plásticas o demetal no tóxico.

6.10 Pipetas graduadas o pipetas automáticas de capacidades nominales de 10 mL y de 1 mL,graduadas en divisiones de 0,5 mL y de 0,1 mL, respectivamente.

6.11 Placas de Petri, de tamaño pequeño (90 mm a 100 mm de diámetro) y/o de tamaño grande(de 140 mm de diámetro).

7 Muestreo

Es importante que el laboratorio reciba una muestra que sea verdaderamente representativa y queno haya sido dañada o alterada durante el transporte o el almacenamiento.

El muestreo no constituye una parte del método especificado en esta norma. Vea la norma

específica referente al producto de que se trate. Si no existe una norma cubana o internacionalespecifica, se recomienda que las partes interesadas adopten un acuerdo sobre este punto.

8 Preparación de la muestra de ensayo

Prepare la muestra de ensayo de acuerdo con la norma cubana específica referente al producto deque se trate. Si no existe una norma cubana o internacional específica, se recomienda que laspartes interesadas adopten un acuerdo sobre este punto.

9 Procedimiento (ver diagrama en el Anexo A)

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9.1 Porción de ensayo y suspensión inicial

9.1.1 Generalidades

Vea la NC ISO 6887-1 y la Norma Cubana específica referente al producto de que se trate. Vea laISO 8261 para leche y productos lácteos.

Para la preparación de la suspensión inicial, en el caso general utilice como diluente el medio depre-enriquecimiento especificado en 5.2.1 y en 4.2 (agua de peptona buferada).

Si la masa especificada para la porción de ensayo no fuera 25 g, utilice la cantidad necesaria demedio de pre-enriquecimiento para obtener una dilución 1/10.

Con el fin de reducir la carga de trabajo cuando haya que analizar más de una porción de ensayo

de 25 g para un lote de alimento específico y, cuando exista evidencia de que su mezcla (juntandolas porciones para análisis) no afecta al resultado de ese alimento en particular, las porciones deensayo pueden ser mezcladas. Por ejemplo, si deben analizarse 10 porciones de análisis de 25 g,se combinan las 10 unidades para constituir una porción de ensayo compuesta de 250 g y seañaden 2.25 L de caldo de pre-enriquecimiento. Una alternativa sería, reunir las porciones de 0.1mL (en 10 mL de caldo RVS) y 1mL (en 10 mL de caldo MKTTn) de los caldos de pre-enriquecimiento provenientes de 10 porciones de ensayo separadas (ver 9.3.1) para enriquecerlasen 100 mL del medio de enriquecimiento selectivo.

9.1.2 Preparaciones específicas de la suspensión inicial para ciertos productos alimenticios

NOTA- Las siguientes preparaciones específicas se refieren solo al caso de Salmonella. Las preparaciones

específicas aplicables a la determinación de cualquier microorganismo se describen en las NormasInternacionales ISO 6887-2, ISO 6887-3, ISO 6887-4 e ISO 8261.

9.1.2.1 Cacao y productos que contienen cacao (por ejemplo, más del 20%).

Añada al agua de peptona buferada (5.2.1), preferiblemente 50 g/L de caseína (evite el empleo decaseína ácida), o 100 g/L de leche descremada en polvo estéril y añada, después de cerca de 2 hde incubación, 0,018 g/L de verde brillante si es probable que el producto alimenticio esté muycontaminado con microbiota Gram positiva.

9.1.2.2 Productos alimenticios ácidos y acidificantes 

Se ha de asegurar que el pH no baja de 4,5 durante el pre-enriquecimiento.

NOTA- El pH de los productos alimenticios ácidos y acidificantes es más estable si se empleaagua de peptona buferada de doble fuerza.

9.2 Pre-enriquecimiento no selectivo

Incube la suspensión inicial (9.1) a 37 ºC ± 1 ºC durante 18 h ± 2 h.

9.3 Enriquecimiento selectivo

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9.3.1 Transfiera 0.1 mL del cultivo obtenido en 9.2 a un tubo que contenga 10 mL de caldo RVS(5.2.2); transfiera 1 mL del cultivo obtenido en 9.2 a un tubo que contenga 10 mL de caldo MKTTn

(5.2.3).

9.3.2 Incube el caldo RVS inoculado (9.3.1) a 41,5 ºC ± 1 ºC por 24 h ± 3 h y el caldo MKTTninoculado a 37 ºC ± 1 ºC por 24 h ± 3 h. Debe evitarse que no se supere la máxima temperatura deincubación permitida (42,5 ºC).

9.4 Siembra en placa e identificación

9.4.1. Utilizando el cultivo obtenido en el caldo RVS (9.3.2), después de la incubación por 24 ± 3h,inocule con un asa (6.7) la superficie de una placa de Petri de tamaño grande (6.11) que contengael primer medio selectivo (agar XLD, ver 5.2.4.1), de tal forma que se obtengan colonias bienaisladas.

Si no se dispone de placas grandes, emplee dos placas pequeñas una después de la otra,utilizando la misma asa.

Proceda de la misma manera con el segundo medio selectivo en placa (5.2.4.2), empleando unasa estéril y placas de Petri, como se explicó anteriormente.

9.4.2 Después de incubar durante 24 ± 3h, utilizando el cultivo obtenido en el caldo MKTTn (9.3.2),se repite el procedimiento descrito en el apartado 9.4.1 con los dos medios selectivos en placa.

9.4.3 Invierta las placas (9.4.1 y 9.4.2) tal que el fondo quede hacia arriba, y colóquelas en laincubadora (6.3) regulada a 37º C para el primer medio en placa (5.2.4.1). Para el segundo medio

en placa (5.2.4.2) deben seguirse las instrucciones del fabricante.

9.4.4 Después de la incubación por 24 ± 3h, examine en las placas (9.4.3) la presencia decolonias típicas de Salmonella y de colonias atípicas que pudieran ser  Salmonella (ver nota).Marque su posición en el fondo de la placa.

Las colonias típicas de Salmonella que crecen en agar XLD tienen un centro negro y una zonaligeramente transparente de color rojizo debido al cambio de color del indicador.

NOTA- Las variantes de Salmonella H2S negativas (por ejemplo S. Paratyphi A) que crecen en agar XLDson rosadas con su centro rosado más oscuro. Las cepas Salmonella lactosa positivas que crecen en agar XLD son amarillas con o sin ennegrecimiento.

Incube el segundo medio sólido selectivo a la temperatura adecuada y examine después deltiempo apropiado para comprobar la presencia de colonias que, por sus características, seconsideran presuntivas de Salmonella.

9.5 Confirmación

9.5.1 Generalidades 

Los sistemas de identificación que están comercialmente disponibles para el examen bioquímicode Salmonella pueden ser empleados. El uso de los sistemas de identificación concierne a la

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confirmación bioquímica de las colonias. Estos sistemas deben emplearse siguiendo lasinstrucciones del fabricante.

NOTA- Para el reconocimiento de colonias de Salmonella se requiere experiencia ya que su aparienciapuede variar en algo, no solo de serovariedad a serovariedad, sino también de lote a lote del medio decultivo selectivo utilizado.

9.5.2 Selección de colonias para la confirmación

Para la confirmación, tome de cada placa (dos placas de tamaño pequeño o una placa de tamañogrande) de cada medio selectivo (ver 9.4) al menos una colonia considerada como típica osospechosa y tome luego otras cuatro colonias si la primera es negativa.

Se recomienda que se identifiquen al menos cinco colonias en el caso de estudios

epidemiológicos. Si en una placa hubiera menos de cinco colonias típicas o sospechosas, tomepara la confirmación todas las colonias típicas o sospechosas.

Estríe las colonias seleccionadas en la superficie de la placa de agar nutriente (5.2.5) previamentesecado, de manera que permita el desarrollo de colonias bien aisladas. Incube las placasinoculadas (9.4.3) a 37 ºC ± 1 ºC durante 24 h ± 3 h.

Utilice cultivos puros para la confirmación bioquímica y serológica.

9.5.3 Confirmación bioquímica

9.5.3.1 Generalidades 

Inocule con una aguja los medios especificados en 9.5.3.2 a 9.5.3.7 con cada uno de los cultivosobtenidos a partir de las colonias seleccionadas en 9.5.2.

9.5.3.2 Agar TSI o agar hierro Kligler (5.2.6)

Puncione el fondo del agar y estríe la superficie inclinada de la cuña. Incube a 37 ºC ± 1 ºCdurante 24 h ± 3 h.

Los cambios del medio se interpretan de la siguiente manera:

Para Agar TSI:

a) Fondo- amarillo glucosa positiva (utilizó la glucosa)- rojo o sin cambio glucosa negativa (no utilizó la glucosa)- negro formación de sulfuro de hidrógeno (H2S)- burbujas o fisuras formación de gas a partir de la glucosa

b) Parte inclinada- amarilla lactosa y/o sacarosa positiva (utilizó la lactosa y/o la

sacarosa)- rojo o sin cambio Lactosa y sacarosa negativa (no utilizó la lactosa ni la

sacarosa).

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Para Agar Hierro Kligler:

a) Fondo- amarillo glucosa positiva (utilizó la glucosa)- rojo o sin cambio glucosa negativa ( no utilizó la glucosa)- negro formación de sulfuro de hidrógeno (H2S)- burbujas o fisuras formación de gas a partir de la glucosa

b) Parte inclinada- amarilla lactosa positiva (utilizó la lactosa)- rojo o sin cambio lactosa negativa (no utilizó la lactosa)

Los cultivos típicos de Salmonella muestran la parte inclinada alcalina (roja) y el fondo ácido(amarillo), con formación de gas (burbujas) y (en aproximadamente el 90% de los casos) formación

de sulfuro de hidrógeno (ennegrecimiento del agar) (9.5.3.8).

Cuando se aísla una Salmonella lactosa positiva (ver 4.4), la parte inclinada del TSI o del Kligler es amarilla. Por eso, la confirmación preliminar de los cultivos de Salmonella no debe estar basada solo en los resultados de la prueba del TSI o del Kligler (ver 9.5.3).

9.5.3.3 Agar urea (5.2.7)

Estríe la superficie inclinada del agar. Incube a 37 ºC ± 1 ºC durante 24 h ± 3h y examine aintervalos.

Si la reacción es positiva, la descomposición de la urea libera amonio, que cambia el color del rojo

fenol a rosa-rosado y luego a cereza oscuro. La reacción es a menudo visible al cabo de 2 h a 4 h.

9.5.3.4 Medio para la descarboxilación de la L- lisina (5.2.8).

Inocule justo por debajo de la superficie del medio líquido. Incube a 37ºC ± 1ºC durante 24 h ± 3h.

La turbidez y un color púrpura después de la incubación indican una reacción positiva. Un color amarillo indica una reacción negativa.

Como alternativa se puede emplear también agar hierro lisina (LIA)

Puncione el fondo del agar y estríe la superficie inclinada de la cuña. Incube a 37ºC ± 1ºC durante24 h ± 3h.

Los cambios del medio se interpretan de la siguiente manera:a) Fondo

- amarillo fermentó la glucosa y no descarboxiló la lisina- púrpura descarboxilación de la lisina a cadaverina- negro formación de sulfuro de hidrógeno (H2S)- burbujas o fisuras formación de gas a partir de la glucosa

b) Parte inclinada- púrpura descarboxilación de la lisina a cadaverina- pardo-rojizo desaminación de la lisina

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9.5.3.5 Detección de la β- galactosidasa (5.2.9).

Suspenda una asada de la colonia sospechosa en un tubo que contenga 0.25 mL de soluciónsalina (5.2.13).

Añada una gota de tolueno y agite el tubo. Coloque el tubo en un baño de agua (6.6), regulado a37ºC y déjelo por algunos minutos (5 min. aproximadamente). Añada 0,25 mL del reactivo para ladetección de la β- galactosidasa y mezcle.

Vuelva a colocar el tubo en el baño de agua regulado a 37 ºC y déjelo durante 24 h ± 3h, examineel tubo a intervalos.

Un color amarillo indica una reacción positiva. La reacción es con frecuencia visible después de20 min.

Si se emplean discos de papel listos para su uso (5.2.9), siga las instrucciones del fabricante.

9.5.3.6 Medio para la reacción de Voges-Proskawer (VP) (5.2.10)

Suspenda una asada de la colonia sospechosa en un tubo estéril que contenga 3 mL del medioVP.

Incube a 37 ºC ± 1 ºC durante 24 h ± 3h.

Después de la incubación, añada 2 gotas de solución de creatina, 3 gotas de solución etanólica de1-naftol y luego 2 gotas de solución de hidróxido de potasio; agite después de la adición de cadareactivo.

La formación de un color rosado a rojo brillante en 15 min. Indica una reacción positiva.

9.5.3.7 Medio para la reacción del indol (5.2.11)

Inocule un tubo que contenga 5 mL del medio de triptona/ triptófano con la colonia sospechosa.

Incube a 37 ºC ± 1 ºC durante 24 h ± 3 h. Después de la incubación añada 1 mL del reactivo deKovacs.

La formación de un anillo rojo indica una reacción positiva. Un anillo amarillo-marrón indica unareacción negativa.

9.5.3.8 Interpretación de las pruebas bioquímicas

Generalmente Salmonella muestra las reacciones que aparecen en la Tabla 1.

9.5.4 Confirmación serológica y serotipaje

9.5.4.1 Generalidades

La detección de la presencia de los antígenos de Salmonella O, Vi y H se realiza a partir de lascolonias puras (9.5.2) mediante aglutinación en láminas con los sueros adecuados, y después de

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que las cepas autoaglutinables hayan sido eliminadas. Utilice los antisueros según lasinstrucciones del productor si difieren de las descritas a continuación.

9.5.4.2 Eliminación de las cepas autoaglutinables 

Deposite una gota de solución salina (5.2.13), en una lámina de vidrio perfectamente limpio.Disperse con un asa, parte de la colonia a probar (6.7) en la gota, de manera que se obtenga unasuspensión homogénea y turbia.

NOTA También es posible dispersar parte de la colonia a analizar en una gota de agua, y luego mezclar esta solución con una gota de la solución salina (5.2.13).

Rote suavemente la lámina por 30 a 60 segundos. Observe el resultado sobre un fondo oscuro,preferiblemente con la ayuda de una lupa.

Si las bacterias se agrupan en unidades más o menos distintas, la cepa se considera comoautoaglutinable y no debe someterse a las siguientes pruebas, porque la detección de losantígenos no es factible.

Tabla 1Interpretación de las pruebas bioquímicas

Cepa de Salmonella S. Typhi S. Paratyphi A S. Paratyphi 

BS. ParatyphiC

Otras cepasPruebaa (9.5.3.2 a 9.5.3.7)

Reacción % b Reacción % b Reacción % c Reacción % c Reacción % b 

Ácido de glucosa en TSI o Kligler + 100 + 100 + + + 100

Gas de glucosa en TSI o Kligler - d 0 + 100 + + + 92

Ácido de lactosa en TSI o Kligler - 2 - 100 - - - 1

Ácido de sacarosa en TSI o Kligler - 0 - 0 - - - 1

Producción de H2S en TSI o Kligler + 97 - 10 + + + 92

Hidrólisis de la Urea o Kligler - 0 - 0 - - - 1

Descarboxilación de la Lisina o Kligler + 98 - 0 + + + 95

Reacción de  β-galactosidasa o Kligler - 0 - 0 - - - 2 e 

Reacción de Voges-Proskawer. o

Kligler 

- 0 - 0 - - - 0

Producción de Indol o Kligler - 0 - 0 - - - 1

a Desde la referencia [5].b Estos porcentajes indican que no todos los aislamientos de serotipos de Salmonella dan las reacciones marcadas

como + ó - . Estos porcentajes pueden variar dentro de un mismo serotipo y entre un serotipo y otro de los causantesde enfermedades alimentarias de diferentes procedencias.

c Los porcentajes no son conocidos según la literatura disponible.d   Salmonella Typhi no produce gas. 

eSalmonella enterica  subespecie arizonae  da una reacción lactosa positiva o negativa, pero es siempre  β-

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galactosidasa positiva. Para el estudio de estas cepas puede ser útil realizar pruebas complementarias. 

9.5.4.3 Detección de los antígenos O

Empleando una colonia pura no autoaglutinable, proceda según 9.5.4.2, empleando una gota delantisuero O (5.3) en lugar de la solución salina (5.2.13).

Si se produce aglutinación, la reacción se considera positiva.

Use el antisuero polivalente y después el monovalente.

9.5.4.4 Detección de los antígenos Vi

Proceda según el apartado 9.5.4.2, pero empleando una gota del antisuero Vi (5.3), en lugar de lasolución salina.

Si se produce aglutinación, la reacción se considera positiva.

9.5.4.5 Detección de los antígenos H

Inocule el agar nutriente semisólido (5.2.12) con una colonia pura no autoagutinable.

Incube el medio a 37 ºC ± 1 ºC durante 24 h ± 3 h.

Utilice este cultivo para el examen de los antígenos H, proceda según 9.5.4.2, pero empleando unagota del antisuero H (5.3), en lugar de la solución salina.

Si se produce aglutinación, la reacción se considera positiva.

9.5.5 Interpretación de las reacciones bioquímicas y serológicas 

La Tabla 2 ofrece la interpretación de las pruebas confirmatorias (9.5.3 y 9.5.4) realizadas a lascolonias seleccionadas (9.5.2).

Tabla 2 - Interpretación de las pruebas de confirmación

Reacciones

bioquímicas

Autoaglutinación Reacciones serológicas Interpretación

Típicas No Antígeno O, Vi o H positivo Cepas consideradascomo Salmonella 

Típicas NoTodas las reacciones

negativas

Típicas Sí No analizado (ver 9.5.4.2)

Reacciones no típicas No/Sí Antígeno O, Vi o H positivo

Puede ser Salmonella 

Reacciones no típicas No/SíTodas las reacciones

negativasNo se considera que sea

Salmonella 

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9.5.6 Confirmación definitiva

Las cepas que se consideran que son Salmonella o que pueden ser Salmonella (ver Tabla 2),deben enviarse a un centro reconocido de referencia de Salmonella para el tipaje definitivo.

Este envío debe acompañarse de toda la información posible concerniente a la(s) cepa(s) y siproceden de un brote o de un alimento aislado.

10 Expresión de los resultados

De acuerdo con la interpretación de los resultados, se indica la presencia o ausencia deSalmonella en la porción de ensayo de x g o x mL de producto (ver ISO 7218).

Ver anexo C para los resultados de precisión obtenidos del análisis interlaboratorio.

11 Informe del análisis

El informe del análisis debe especificar lo siguiente:

- El método de toma de muestra empleado, si se conoce;

- Cualquier desviación en el medio de enriquecimiento o en las condiciones de incubaciónempleados;

- Todos los detalles operativos no especificados en esta norma cubana o considerados

opcionales, junto con los detalles de todo tipo de incidencias que pudieran haber afectadolos resultados.

- Los resultados obtenidos.

El informe del análisis debe hacer constar si un resultado positivo se obtuvo exclusivamente conlos medios planificados (5.2.4) no especificados en esta norma cubana.

12. Aseguramiento de la calidad

Para comprobar la capacidad del laboratorio para detectar  Salmonella con los métodos y mediosdescritos en esta norma cubana, introduzca muestras de referencia en frascos de control del

medio de preenriquecimiento (ver 5.2.1). Proceda con los frascos de control de la misma maneraque con los cultivos de ensayo.

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Anexo A(normativo)

Diagrama del procedimiento

Agua de peptona buferada atemperatura ambiente

Incubación (9.2) por 18h ± 2h a 37ºC ± 1ºC

0,1 mL de cultivo+

10 mL de caldo RVS (9.3.1)Incubación por 

24h ± 3h a 41,5ºC ± 1ºC

1mL de cultivo+

10 mL de caldo MKTTn (9.3.1)Incubación por 

24h ± 3h a 37ºC ± 1ºC

Medio XLD y el segundo agar deelección (9.4.1)Incubación por 24h ± 3h a 37ºC ± 1ºC 

De cada placa se estudia una coloniacaracterística. Si es negativa se estudian

las otras cuatro colonias marcadas(9.5.2)

Agar nutriente, incubación por 24h ± 3ha 37ºC ± 1ºC (9.5.2)

Confirmación bioquímica (9.5.3) Confirmación serológica (9.5.4)

Expresión de los resultados (cláusula 10)

   P   R   E  -

   E   N   R   I   Q   U   E   C   I   M   I   E   N   T   O 

   E   N   R   I   Q   U   E   C   I   M   I   E   N   T   O 

   S   E   L   E   C   T   I   V   O 

   S   I   E   M   B   R   A   E

   N

   P   L   A   C   A

   C   O   N   F   I   R   M   A   C   I   O   N

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Anexo B(normativo) 

Composición y preparación de medios de cultivo y reactivos

B.1 Agua de peptona buferada

B.1.1 Composición

Digerido enzimático de caseína 10,0g

Cloruro de sodio 5,0g

Hidrógeno fosfato disódico dodecahidratado (Na2HPO4.12H2O) 9,0g

Dihidrógeno fosfato de potasio (KH2PO4) 1,5gAgua 1 000mL

B 1.2 Preparación

Disuelva los componentes en el agua, calentando si fuera necesario.

Ajuste el pH, si fuera necesario, de manera que después de la esterilización sea de 7,0 ± 0,2 a.25°C.

Dispense el medio en frascos (6.9) de capacidad adecuada para obtener las porciones necesariaspara el análisis.

Esterilice durante 15 min. en autoclave (6.1) a 121°C.

B.2 Medio de Rappaport- Vassiliadis con soya (caldo RVS)

B.2.1 Solución A

B.2.1.1 Composición

B.2.1.2 Preparación

Disuelva los componentes en el agua calentando a unos 70°C, si fuera necesario.

La solución debe prepararse en el mismo día que se prepara el medio RVS completo.

Digerido enzimático de soya 5,0g

Cloruro de sodio 8,0gDihidrógeno fosfato de potasio (KH2PO4) 1,4gHidrógeno fosfato dipotásico (K2HPO4) 0,2gAgua 1 000 mL

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B.2.2 Solución B

B.2.2.1 Composición

B.2.2.2 Preparación 

Disuelva el cloruro de magnesio en el agua.

Como esta sal es muy higroscópica, se aconseja disolver todo el contenido de MgCl2. 6H2O de unrecipiente recién abierto, de acuerdo con la formulación. Por ejemplo, 250g de MgCl 2.6H2O seañaden a 625 mL de agua, dando una solución con un volumen total de 788 mL y unaconcentración en peso de 31,7 g por 100 mL de MgCl2.6H2O.

La solución puede mantenerse en frascos de vidrio ámbar, bien cerrados y a temperaturaambiente, durante al menos 2 años.

B.2.3 Solución C

B.2.3.1 Composición

B.2.3.2 Preparación 

Disuelva el Verde malaquita oxalato en el agua.

La solución puede mantenerse en frascos de vidrio ámbar, a temperatura ambiente, durante almenos 8 meses.

B .2.4 Medio completo

B .2.4.1 Composición

Solución A (B.2.1) 1 000 mLSolución B (B.2.2) 100 mLSolución C (B.2.3) 10 mL

Cloruro de magnesio hexahidratado (MgCl2 . 6H2O) 400,0gAgua 1 000 mL

Verde malaquita oxalato 0,4gAgua 100 mL

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B.2.4.2 Preparación

Añada a 1000 mL de la solución A, 100 mL de la solución B y 10 mL de la solución C.

Ajuste el pH, si fuera necesario, de manera que después de la esterilización sea de 5,2 ± 0,2.

Antes de su uso, dispense en tubos de ensayo (6.9) en cantidades de 10 mL.

Esterilice durante 15 min. en autoclave (6.1) ajustado a 115°C.

Almacene el medio preparado a 3°C ± 2°C. Utilice el medio el día de su preparación.

NOTA- La composición final del medio es: digerido enzimático de soya, 4,5g/L; cloruro de sodio 7,2 g/L;

dihidrógeno fosfato de potasio (KH2 PO4 + K2HPO4), 1,44 g/L; cloruro de magnesio anhidro (MgCl2), 13,4g/Lo cloruro de magnesio hexahidratado (MgCl2.6H2O), 28,6 g /Ll, verde malaquita oxalato, 0,036 g/L.

B.3 Caldo de Muller- Kauffmann tetrationato novobiocina (MKTTn)[7] 

B .3.1 Medio base

B .3.1.1 Composición

B.3.1.2 Preparación 

Disuelva los componentes básicos deshidratados o el medio completo deshidratado en el agua,mediante ebullición durante 5 min.

Ajuste el pH, si fuera necesario, de manera que sea 8,2 ± 0,2 a 25°C.

Mezcle el medio completamente.

El medio base puede almacenarse durante 4 semanas a 3°C ± 2°C.

Extracto de carne 4,3gDigerido enzimático de caseína 8,6g

Cloruro de sodio (NaCl) 2,6gCarbonato de calcio (CaCO3) 38,7gTiosulfato de sodio pentahidratado (Na2S2O3 . 5H2O) 47,8gBilis de buey para uso bacteriológico 4,78gVerde brillante 9,6mgAgua 1 000 mL

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B.3.2 Solución de Yodo Yoduro

B.3.2.1 Composición

B.3.2.2 Preparación 

B.3.2.1 Preparación

Disuelva completamente el yoduro de potasio en 10 mL de agua, luego añada el yodo y diluyahasta 100 mL con agua estéril. No caliente.

Almacene la solución preparada en la oscuridad a temperatura ambiente en un recipienteherméticamente cerrado.

B.3.3 Solución de novobiocina

B.3.3.1 Composición

B.3.3.2 Preparación 

Disuelva la sal sódica de novobiocina en el agua y esterilice por filtración.

Almacene hasta 4 semanas a 3°C ± 2°C.

B.3.4 Medio completo

B.3.4.1 Composición

B.3.4.2 Preparación 

Añada asépticamente 5 mL de la solución de novobiocina (B.3.3) a 1000 mL del medio base(B.3.1). Mezcle y luego adicione 20 mL de la solución yodo-yoduro (B.3.2). Mezcle bien.

Dispense el medio asépticamente en frascos estériles (6.9) de capacidad adecuada para obtener las porciones necesarias para el análisis.

El medio completo debe utilizarse el día de su preparación.

 

Yodo 20,0gYoduro de potasio (KI) 25,0gAgua 100 mL

Sal sódica de novobiocina 0,04gAgua 5 mL

Medio base (B.3.1) 1000 mL

Solución yodo- yoduro (B.3.2) 20 mLSolución de novobiocina (B.3.3) 5 mL

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B.4 Agar xilosa lisina desoxicolato (agar XLD) [7] 

B.4.1 Medio base

B.4.1.1 Composición

Extracto de levadura en polvo 3,0gCloruro de sodio (NaCl) 5,0gXilosa 3,75gLactosa 7,5gSacarosa 7,5gHidrocloruro de L-Lisina 5,0g

Tiosulfato de sodio 6,8gCitrato amónico de hierro (III) 0,8gRojo fenol 0,08gDesoxicolato de sodio 1,0gAgar de 9g a 18g1 Agua 1 000 mL

B.4.1.2 Preparación 

Disuelva los componentes básicos deshidratados o el medio base completo deshidratado en el

agua mediante calentamiento, con agitación frecuente hasta que el medio comience a hervir. Eviteel sobrecalentamiento.

Ajuste el pH, si fuera necesario, de manera que después de la esterilización sea 7,4 ± 0,2 a 25°C.

Vierta el medio en tubos o frascos (6.9) de capacidad adecuada.

Caliente con agitación frecuente hasta que el medio hierva y se disuelva el agar. No sobrecaliente.

B.4.2 Preparación de las placas de agar 

Transfiera inmediatamente a un baño de agua (6.5) ajustado entre 44ºC a 47ºC, agite y vierta en

las placas. Deje solidificar.

Inmediatamente antes de su uso, seque las placas de agar cuidadosamente (preferiblemente sinlas tapas y con la superficie del agar hacia abajo) en el horno (6.2) regulado entre 37ºC y 55ºChasta que la superficie del agar esté seca.

Almacene las placas preparadas hasta 5 días a 3ºC ± 2ºC.

B.5 Agar nutriente

1 Dependiendo de la capacidad de gelificación del agar. 

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B.5.1 Composición

B.5.2 Preparación

Disuelva los componentes o el medio completo deshidratado en el agua, calentando si fueranecesario.

Ajuste el pH, si fuera necesario, de manera que después de la esterilización sea 7,0 ± 0,2 a 25°C.

Transfiera el medio de cultivo a tubos o frascos (6.9) de capacidad adecuada.

Esterilice en autoclave (6.1) a 121°C durante 15 min.

B.5.3 Preparación de las placas de agar nutriente

Transfiera alrededor de 15 mL de medio fundido a placas de Petri pequeñas estériles (6.11) yproceda según B.4.2.

B.6 Agar triple azúcar hierro (agar TSI)

B.6.1 Composición

Extracto de carne 3,0gPeptona 5,0gAgar de 9g a 18g1 Agua 1 000 mL

Extracto de carne 3,0 gExtracto de levadura 3,0 gPeptona 20,0 gCloruro de sodio (NaCl) 5,0 gLactosa 10,0 gSacarosa 10,0 gGlucosa 1,0 gCitrato de hierro (III) 0,3 g

Tiosulfato de sodio 0,3 gRojo fenol 0,024 gAgar de 9 g a 18 g 1 Agua 1 000 mL

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B.6.2 Preparación

Disuelva los componentes o el medio completo deshidratado en el agua, calentando si fueranecesario.

Ajuste el pH, si fuera necesario, de manera que después de la esterilización sea 7,4 ± 0,2 a 25°C.

Dispense el medio en tubos de ensayo en cantidades de 10 mL.

Esterilice en autoclave (6.1) a 121°C durante 15 min.

Deje reposar en posición inclinada de manera que se obtenga una parte profunda de unos 2,5 cma 5 cm.

B.6. a. Agar Hierro Kligler 

B.6.a.1. Composición

B.6. a.2 Preparación

Ver B.6.2

Peptona 15,0 gProteasa peptona 5,0gExtracto de levadura 3,0gLactosa 10,0gDextrosa 1,0gCloruro de sodio 5,0g

Sulfato de Hierro (II) 0,2gTiosulfato de sodio 0,3gRojo fenol 0,024gAgar de 9g a 18g 1 Agua 1 000mL

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26 

B.7 Agar urea (Christensen)

B.7.1.1 Composición

B.7.1.2 Preparación

Disuelva los componentes o la base completa deshidratada en el agua, calentando si fueranecesario.

Ajuste el pH, si fuera necesario, de manera que después de la esterilización sea 6,8 ± 0,2 a 25°C.

Esterilice en autoclave (6.1) a 121°C durante 15 min.

B.7.2 Solución de urea

B.7.2.1 Composición

B.7.2.2 Preparación 

Disuelva la urea en el agua. Esterilice por filtración y compruebe la esterilidad.

Ver ISO 7218: 1996, 7.3.2.

B.7.3 Medio completo

B.7.3.1 Composición

Peptona 1,0gGlucosa 1,0gCloruro de sodio (NaCl) 5,0gDihidrógeno fosfato de potasio (KH2PO4) 2,0gRojo fenol 0,012gAgar de 9g a 18g1 Agua 1 000 mL

Urea 400gAgua, para un volumen final de 1 000 mL

Base (B.7.1) 950 mLSolución de urea (B.7.2) 50 mL

 

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B.7.3.2 Preparación Añada, bajo condiciones asépticas, la solución de urea a la base, previamente fundida y luego

enfriada de 44°C a 47°C.

Dispense el medio completo en tubos estériles (6.9) en cantidades de 10 mL.

Deje reposar en posición inclinada.

B.8 Medio para la descarboxilación de la L-lisina

B.8.1 Composición

B.8.2 Preparación

Disuelva los componentes en el agua, calentando si fuera necesario.

Ajuste el pH, si fuera necesario, de manera que después de la esterilización sea 6,8 ± 0,2 a 25°C.

Transfiera el medio en cantidades de 2 mL a 5 mL en tubos de cultivo estrechos (6.9) con tapasde rosca.

Esterilice en autoclave (6.1) a 121°C durante 15 min.

B.8.a Agar Hierro Lisina (LIA)

B.8.1.a Composición

Monohidrocloruro de L-Lisina 5,0g

Extracto de levadura 3,0gGlucosa 1,0gPúrpura de bromocresol 0,015gAgua 1000 mL

Extracto de levadura 3,0gPeptona bacteriológica 5,g

Glucosa 1,0gL-lisina 10,0gCitrato férrico de amonio 0,5gHiposulfito sódico 0,04gPúrpura de bromocresol 0,02gAgar de 9g a 18g 1 Agua 1 000 mL

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B.8.2.a PreparaciónDisuelva los componentes o el medio completo deshidratado en el agua, calentando si fuera

necesario.

Ajuste el pH, si fuera necesario, de manera que después de la esterilización sea 6,7 ± 0,2 a 25°C.

Dispense el medio en tubos de ensayo en cantidades de 10 mL.

Esterilice en autoclave (6.1) a 121°C durante 15 min.

Deje reposar en posición inclinada de manera que se obtenga una parte profunda de unos 2,5 cma 5 cm.

B.9 Reactivo para la detección de  β-galactosidasa

B.9.1 Solución tampón

B.9.1.1 Composición

B.9.1.2 Preparación 

Disuelva el hidrógeno fosfato de sodio en aproximadamente 45 mL de agua en un frascovolumétrico.

Ajuste el pH a 7,0 ± 0,2 a 25°C con la disolución de hidróxido de sodio.

Añada agua para un volumen final de 50 mL.

B.9.2 Solución de ONPG

B.9.2.1 Composición

Dihidrógeno fosfato de sodio (NaH2PO4) 6,9gHidróxido de sodio, solución de 10 mol/L cerca de 3 mLAgua, para un volumen final de 50 mL

o- Nitrofenil  β-D-galactopiranósido (ONPG) 0,08gAgua 15 mL

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B.9.2.2 Preparación 

Disuelva el ONPG en el agua a 50°C aproximadamente.

Enfríe la solución.

B.9.3 Reactivo completo

B.9.3.1 Composición

B.9.3.2 Preparación

Añada la solución tampón a la solución de ONPG.

B.10 Reactivos para la reacción de Voges-Proskauer (VP)

B.10.1 Medio VP

B.10.1.1 Composición

B.10.1.2 Preparación 

Disuelva los componentes en el agua, calentando si fuera necesario.

Ajuste el pH, si es necesario, de manera que después de la esterilización sea 6,9 ± 0,2 a 25 ºC.

Transfiera el medio a tubos (6.9) en cantidades de 3 mL.

Esterilice en autoclave (6.1) a 121ºC durante 15 min.

Solución tampón (B.9.1) 5mLSolución de ONPG (B.9.2) 15mL

Peptona 7,0gGlucosa 5,0gHidrógeno fosfato dipotásico (K2HPO4) 5,0gAgua 1 000 mL

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B.10.2 Solución de creatina (N- amidinosarcosina) 

B.10.2.1 Composición

B.10.2.2 Preparación 

Disuelva el monohidrato de creatina en el agua.

B.10.3 1-Naftol, solución etanólica

B.10.3.1 Composición

B.10.3.2 Preparación 

Disuelva el 1-naftol en el etanol.

B.10.4 Solución de hidróxido de potasio

B.10.4.1 Composición

B.10.4.2 Preparación 

Disuelva el hidróxido de potasio en el agua.

B.11 Reactivos para la reacción del indol

B.11.1 Medio triptona/triptófano

Monohidrato de creatina 0,5gAgua 100mL

1-Naftol 6gEtanol, 96% (fracción volumen) 100mL

Hidróxido de potasio 40gAgua 100 mL

Triptona 10gCloruro de sodio 5gDL-Triptófano 1gAgua 1 000mL

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B.11.1.2  Preparación 

Disuelva los componentes en el agua hirviendo.

Ajuste el pH, si es necesario, de manera que después de la esterilización sea 7,7 ± 0,2 a 25 ºC.

Dispense 5mL del medio en los tubos (6.9).

Esterilice en autoclave (6.1) a 121ºC durante 15 min.

B.11.2 Reactivo de Kovacs

B.11.2.1 Composición

B.11.2.2 Preparación 

Mezcle los componentes.

B.12 Agar nutriente semisólido

B.12.1 Composición

B.12.2 Preparación 

Disuelva los componentes en el agua, calentando si fuera necesario.

Ajuste el pH, si es necesario, de manera que después de la esterilización sea 7,0 ± 0,2 a 25 ºC.

Transfiera el medio a frascos (6.9) de capacidad adecuada.

Esterilice en autoclave (6.1) a 121ºC durante 15 min.

B.12.3 Preparación de placas de agar  

Vierta cerca de 15 mL del medio recién preparado en placas de Petri pequeñas (6.11). No hay quedejar que las placas se sequen.

4-Dimetilaminobenzaldehído 5g

Ácido hidroclorhídrico,  ρ =1,18g/mL a 1,19g/mL 25mL2-metilbutano-2-ol 75mL

Extracto de carne 3,0gPeptona 5,0gAgar de 9g a 18g1 Agua 1 000mL

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B.13 Solución salina fisiológica

B.13.1 Composición

B.13.2 Preparación

Disuelva el cloruro de sodio en agua.

Ajuste el pH, si es necesario, de manera que después de la esterilización sea 7,0 ± 0,2 a 25 ºC.

Dispense cantidades de la solución en frascos o tubos (6.9) de manera que contengan de 90 mL a100 mL después de la esterilización.

Esterilice en autoclave (6.1) a 121ºC durante 15 min.

Cloruro de sodio (NaCl) 8,5gAgua 1 000mL

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Anexo C(informativo)

RESULTADOS DE LA PRUEBA INTERLABORATORIOS

En el año 2000 AFSSA Ploufragan en Europa, y Biocontrol Systems en Estados Unidos,organizaron un estudio colaborativo en el marco del proyecto europeo SMT CT 96 2098 [6].Participaron en el mismo, 11 laboratorios de 9 países europeos y 10 laboratorios de EstadosUnidos, se realizó en cuajada de queso fresco, huevo deshidratado en polvo, carne cruda depollo y un material de referencia. Se analizó cada muestra de alimento para dos nivelesdiferentes de contaminación, además de un control negativo.

Las Tablas C.1 a C.4 ofrecen los valores obtenidos por tipo de muestra de este estudiocolaborativo. Los resultados obtenidos por algunos laboratorios han sido excluidos de los

cálculos exclusivamente por razones técnicas identificadas claramente (desviaciones delprotocolo).

Tabla C.1- Resultados de los análisis de los datos obtenidos con muestras de cuajada dequeso fresco

Cuajada dequeso fresco

(blanco) 

Cuajada dequeso fresco

(nivel decontaminación

bajo)

Cuajada dequeso fresco

(nivel decontaminación

alto)

Número de laboratorios que enviaron losresultados

23 23 23

Número de muestras por laboratorio 5 5 5

Número de laboratorios excluidos 2 2 2

Número de laboratorios retenidos despuésde la exclusión

21 21 21

Número de muestras aceptadas 105 105 105

Presición (especificidad), % 100 - -Presición (sensibilidad), % - 74.3 83.8

Conformidad, % 100 83.8 95.2

Concordancia, % 100 60.5 71.7

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Tabla C.2- Resultados de los análisis de los datos obtenidos con muestras de huevo

deshidratado en polvo

Huevodeshidratado

en polvo(blanco) 

Huevodeshidratado en

polvo(nivel de

contaminaciónbajo)

Huevodeshidratado

en polvo(nivel de

contaminaciónalto)

Número de laboratorios que enviaron losresultados

26 26 26

Número de muestras por laboratorio 5 5 5Número de laboratorios excluidos 5 5 5

Número de laboratorios retenidos despuésde la exclusión

21 21 21

Número de muestras aceptadas 105 105 104Precisión (especificidad), % 100 - -Precisión (sensibilidad), % - 98.1 99Conformidad, % 100 96.2 98.1Concordancia, % 100 96.2 98.1

Tabla C.3- Resultados de los análisis de los datos obtenidos con muestras de carne crudade pollo

Carne crudade pollo(blanco) 

Carne cruda depollo(nivel de

contaminaciónbajo)

Carne cruda depollo(nivel de

contaminaciónalto)

Número de laboratorios que enviaron losresultados

25 25 25

Número de muestras por laboratorio 5 5 5Número de laboratorios excluidos 5 5 5Número de laboratorios retenidos despuésde la exclusión

20 20 20

Número de muestras aceptadas 100 99 100

Precisión (especificidad), % 100 - -Precisión (sensibilidad), % - 98 100Conformidad, % 100 96.9 100Concordancia, % 100 96 100

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Tabla C.4- Resultados de los análisis de los datos obtenidos con materiales de referencia

Material de referencia(cápsulas conteniendo cerca de 5 ufc de

S. Typhimurium)Número de laboratorios que enviaron losresultados

26

Número de muestras por laboratorio 5Número de laboratorios excluidos 1Número de laboratorios retenidos después dela exclusión

25

Número de muestras aceptadas 125Precisión (especificidad), % -Precisión (sensibilidad), % 94.4Conformidad, % 88.8Concordancia, % 89.1

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Bibliografía 

[1] ISO 6887-2- Microbiología de los alimentos para consumo humano y animal. Preparación deensayo, suspensión inicial diluciones decimales para examen microbiológico. Parte 2, Reglasespecificas para la preparación de las muestras de ensayo y la suspensión inicial para carne yproductos cárnicos

[2] ISO 6887-3- Microbiología de los alimentos para consumo humano y animal. Preparación deensayo, suspensión inicial diluciones decimales para examen microbiológico. Parte 3, Reglasespecificas para la preparación de las muestras de ensayo y la suspensión inicial para leche yproductos lácteos.

[3] ISO 6887-4- Microbiología de los alimentos para consumo humano y animal. Preparación deensayo, suspensión inicial diluciones decimales para examen microbiológico. Parte 3, Reglasespecificas para la preparación de las muestras de ensayo y la suspensión inicial para pescadoy la suspensión para productos de pescado.

[4] ISO/TR 11133-1 Microbiología de los alimentos para consumo humano y animal. Guía para lapreparación y producción de medios de cultivo. Parte 1: directrices generales para elaseguramiento de la calidad para la preparación de medios de cultivo en el laboratorio.

[5] Ewing, W. H. And Ball, M..M. The biochemical reactions of the genus Salmonella .National

Center Ford Disease Control and Prevention, Atlanta, Georgia, USA, 1996. 

[6] Feldsine, P. Et al. Recovery of  Salmonella in Selected Food by the ISO 6579. Salmonella.Culture Procedure and the AOAC International Official Method of Analysis: Collaborative Study,J , AOAC Int, 2001. 

[7] Culture media for Food Microbiology. In: Progress in Industrial Microbiology, vol. 34. (Eds.Corry, J.F., Curtis, G. D. W. And Baird, R.M.). Elsevier, Amsterdam, 1995.