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Curso PCR 2007-08

Otras PCR: PCR en tiempo real (cuantitativa)

Curso PCR2007-08

Inma Martín Burriel

Curso PCR 2007-08

Programa:

• Miércoles 23 de enero (11h):– PCR en Tiempo Real (teoría)– PCR en Tiempo Real (video)– Ventajas e inconvenientes de los distintos

tipos de PCR-TR.• Miércoles 23 de enero (15h):

– Aplicaciones de la PCR en Tiempo Real:• Diagnóstico, expresión génica, análisis

mutaciones.

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Programa:

• Jueves 24 de enero (9:30h):– Protocolo experimental:

• Diseño de primers y sonda (Primer express).• Validación de primers.• Optimización de la reacción:

– Matriz de primers– Matriz de sonda

• Curva standard.

– Práctica

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Programa:




mutaciones.

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PCR clásico• La cantidad de producto

no está relacionada con la cantidad de DNA inicial

• Herramienta cualitativa (presencia o ausencia)

• El bromuro de etidio es poco sensible, cuando se detecta ya se ha sobrepasado la fase exponencial

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Necesidad de PCR en tiempo real

• Necesidad de cuantificar diferencias de expresión de un mRNA

• Disponibilidad de muy pequeñas cantidades de mRNA en algunas prácticas laboratoriales:– Células obtenidas de microdisección por láser– Pequeñas cantidades de tejido– Biopsias embrionarias– Especimenes de gran valor

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Técnicas de cuantificación• Northern Blot

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Early expression of p53 responsive genes (24h)

Bax

CD95/Fas

GAPDH

L C 6 8 10 12 M

PCR Competitivo o PCR “Mimic”

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Overexpression of antiapoptotic and carcinogenic related markers

Bcl-2

Tgf-b1

c-myc

L C 6 8 10 12 M


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Martín-Burriel et al. Toxicologic Pathology, 32:202–211, 2004


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PCR en Tiempo Real

Detección de productos PCR en tiempo real

Permite observar la cinéticade la reacción

Nuevos químicos

Nuevas plataformas instrumentales

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Fases de la PCR

• Exponencial: En cada ciclo se dobla el producto.

• Lineal: enlentecimiento, consumo de componentes, principio de degradación.

• Meseta: Parada de la reacción, agotamiento de componentes, degradación de productos.

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Fases de la PCR

Lineal

Logarítmica

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Detección en la fase exponencial

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Detección en la fase de meseta

Problemas de cuantificación en la fase de meseta

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PCR en Tiempo Real

• Toma los datos mientras se producen.• Cuantificación más exacta sin necesidad

de métodos laboriosos.• Existe una relación cuantitativa entre la

cantidad inicial y la cantidad de producto PCR en un ciclo dado.

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Programa:




mutaciones.

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Flurocromos: SYBR Green

• Se intercala en el surco menor del ADN de doble cadena y emite fluorescencia.

• No es equimolecular.• Necesaria curva de

disociación.

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Ventajas e inconvenientes

• PCR con SYBR Green:– Más barato– Los mismos reactivos sirven para analizar

cualquier fragmento– La especificidad viene dada únicamente por

los primers– No es equimolecular– Se necesita realizar una curva de disociación

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Curva de disociación

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Curva de disociación

Muestras problema Controles negativos y sin RT

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Sondas TaqMan• Actividad 5’ exonucleasa de la Taq polimerasa.• Reporter: FAM, VIC.• Quencher: TAMRA.• Importante tªm (~70ºC).• Equimolecular.

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Ventajas e inconvenientes

• PCR con Sondas TaqMan:– Más caro– Utilización de sondas específicas para cada

fragmento a analizar– La especificidad viene dada por los primers y

la sonda– Es equimolecular– No necesita curva de disociación

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Especificidad

Diseño de sondas entre dos exones

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Equimolaridad

TaqMan SYBR Green

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Sondas MGB• NFQ:

Quencher oscuro, no emite fluorescencia.Disminuye Baseline.Aumenta sensibilidad.

• MGB:Se une al surco pequeño.Aumenta la Tªm.Aumenta la eficiencia.

R NFQMGB

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CTG TGT TCC CTG TGT GTG TGC AAT GGT GTG GCC GTG GC TCC AAC

CAA GAT CTC ATT ACT GAG AAC TTG CTG CCT GGC CGC

Sonda 1

Metodología

Reverse

Forward

ryr-1:

Protocolo:

25Total

---9,875H2O

1-20 ng2DNA

1X0,62540X Assay Mix(Mescla de cebadores y sondas)

1X12,5TaqMan® Universal PCRMaster Mix, No AmpErase®UNG (2X)

Final concentraciónVolumen / Reacción

(μl)

Componentes de la reacción Pre-lectura:60ºC 1min

Post-lectura:60ºC 1min

PCR:95ºC 10min92ºC 15sec60ºC 1min (x50)

Sonda 2 FAMVIC

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Resultados

CC

CT

TTNTC

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Programa:




mutaciones.

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Aplicaciones de la PCR-TR

• Glosario de términos.• Cuantificación:

– Absoluta– Relativa

• Determinación de mutaciones.• Ensayos +-

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• Cuantificación:– Absoluta:

• Resultado final con unidades (carga viral, copias de mensajero, copias de un gen,...).

• Se necesita una curva patrón absoluta.– Relativa:

• Resultado sin unidades. Proporciona un porcentaje de incremento o disminución (expresión génica).

• Se necesita curva patrón (al menos para prueba de primers).

Glosario de términos

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Glosario de términos• Referencia:

– Señal utilizada para normalizar el experimento.• Pasiva: Fluorocromo en todos los tubos (ROX).• Activa: endógena (housekeeping) o exógena (construcción).

• Calibrador:– Muestra que usamos para comparar las demás.

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• Standard (patrón):– Muestra de concentración conocida que

nos permite construir la curva de calibrado.

• Threshold (umbral):– Ct es el ciclo en el cual se detecta un

incremento significativo de ΔRn(fluorescencia). El sistema empieza a detectar la señal asociada al incremento exponencial de producto PCR

Glosario de términos

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Curva estándar

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Curva Patrón

• y=ax+b. Y=Ct, X=log [DNA].• Relaciona cada concentración con su Ct.• Propia de cada pareja de primers.• La pendiente depende de la eficiencia de los

primers y no debería cambiar entre experimentos:– 100% (a=-3.32).– 75% (a=-4).– Aceptable:-3 ≤ -4.– a> -3 contaminación por fluorescencia.

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• Correlación (R2):– R2=1 (perfecta).– R2≥0.97.– Seleccionar el umbral donde R2 sea máxima.– Mantener el umbral entre experimentos.

• Nº de réplicas:– Al menos 2 réplicas por muestra.– Desviación estándar ≤ 0.38

• Muestra:– Curva absoluta: muestra de [] conocida.– Diluciones 1/5.

Curva Patrón

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1. Cuantificación Absoluta• Validación de la curva patrón:

– La precisión de la cuantificación dependerá de la precisión de los patrones.

– Patrones:• DNA plasmídico.• DNA genómico.• Productos PCR.• Grandes oligonucleótidos comerciales.

– Resultado final relativo a una unidad de interés:• Copias/ng de RNA• Copias/g tejido, copias/ml sangre.• Copias/genoma.• Copias/ célula.

ATENCIONDENOMINADOR

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• Posibles curvas de calibrado (Expresión génica):– Productos de RT-PCR u oligonucleótidos:

• Rápido, conocimiento preciso de [DNA].• Inestable, problemas en la reamplificación.

– DNA recombinante:• Muy estable, sin problemas de amplificación, talla

similar a transcritos.• Construcción del DNArec, no tiene en cuenta la

eficacia de la RT.– RNA recombinante:

• Mimetiza la situación real de retrotranscripción (añadir RNA background).

• Muy inestable, clonación complicado, purificación, problemas de almacenamiento.

1. Cuantificación Absoluta

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1. Cuantificación Absoluta

• Puntos críticos de la curva patrón:– DNA o RNA puro y muy concentrado.– Exactitud en la medida de la concentración

inicial (7 veces).– Pipeteo apropiado: dilución del DNA o RNA

original hasta concentraciones similares a las muestras biológicas (106-1012).

– Estabilidad de las muestras patrón (RNA).

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• Curva patrón:– Sencillez en la preparación.– La cantidad de producto (n veces) se refiere a

la obtenida en el calibrador (1x).– No hay unidades.– Se puede utilizar cualquier tipo de patrón para

la obtención.

2. Cuantificación Relativa

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• Puntos críticos de la curva patrón:– Dilución adecuada del RNA o DNA patrón.– La utilización de las mismas muestras en

placas distintas permite comparar resultados.– Se pueden utilizar patrones DNA para análisis

de RNA.– Se necesitan curvas patrón para el gen de

estudio y el control endógeno.

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• Ejemplo: cuantificación de SPP1 en cultivos celulares de células mesenquimales en diferenciación


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Polimorfismo de SNPs

• Sondas alelo-específicas.• Utilización de sondas MGB/NFQ: Mayor

discriminación.• Utilización de oligos alelo-específicos y

SYBR Green. • Las curvas de disociación discriminan

alelos.

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• Determinación de mutaciones.• Ensayos +/-

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Ensayos +/-

• Se marca el ensayo con sonda TaqMan o SYBRGreen.

• Adición de un control interno positivo (control de amplificación).

Eliminar Falsos Negativos

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Programa:

• Jueves 24 de enero (9:30h):– Protocolo experimental:

• Diseño de primers y sonda (Primer express).• Validación de primers.• Optimización de la reacción:

– Matriz de primers– Matriz de sonda

• Curva standard.

– Práctica

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Diseño primers

• Tamaño amplicon: 50-150pb• %GC: 20-80%• Máximo 2/5 G o C en el extremo 3’• Longitud: 9-40pb (mejor 20pb, no se

recomiendan longitudes <18pb)

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Diseño de primers y sonda (Primer express).

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Diseño de primers

• Tm: 58-60ºC– Tm: Tª en la que el 50% de las cadenas está

unida y el 50% despegada– Si se pega más del 50% más posibilidad de

inespecificidades– En tiempo real: Tª=Tm

• Diferencia de Tm entre los dos primers < 2ºC

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Diseño de primers

Primer F: Tm 58ºC Primer R: Tm 60ºC

PCR: 60ºC

[Primer F]

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Matriz de Primers

2X2X2X900nM

2X2X2X300nM

2X2X2X50nM

900nM300nM50nM

Prim

er Reverse

Primer Forward

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Matriz de primers< Ct > Sensibilidad> Rn primers no limitantes

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Diseño de sondas

• Tm sonda 10ºC > Tm primers• Tm 70ºC la sonda se une inmediatamente

antes de la mayor eficiencia de la polimerasa• GC: 20-80%• Longitud: 9-40b (si >30b sonda MGB)• Nunca puede haber G en el extremo 5’

(quencher natural)• <4G continuas• Procurar [C]>[G]

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Matriz de sonda

• Se realiza tras la optimización de los primers (para ello sonda a 250nM)

• Utilizar distintas [sonda]: de 25nM a 225nM

900/300/50 nM1Reverse

900/300/50 nM1Forward

---8,25H2O

25Total

50 ng1DNA

250 nM1,25Sonda

1X12,5TaqMan® Universal PCRMaster Mix, No AmpErase®UNG (2X)

Final concentraciónVolumen / Reacción(μl)

Componentes de la reacción

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250 nM

200 nM

150 nM

100 nM

50 nM

Matriz de sonda< Ct > Sensibilidad> Rn no limitante

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Recta patrón Gen Referencia

Nos muestra la eficiencia de los primers:

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Recta Patrón: Gen de estudio

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Referencia ActivaExpresión génica:

0.52ratio162Control endógeno

84Gen problema

Muestra 2Muestra 1

Control de la eficiencia de la Retro-transcripción.Control de la eficiencia de la extracción de RNA.Buscar referencias bibliográficas.Utilizar tres endógenos.

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Etapas del análisis de expresión

• Extracción de RNA• Retrotranscripción• Análisis de la expresión del gen (genes)

de referencia• Análisis de la expresión del gen de estudio• Normalización• Análisis de los resultados

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Retrotranscripción• El paso más delicado por la baja eficiencia de la

enzima• Distintas retrotranscriptasas en función del

experimento: – Expresión génica (MLMv o modificaciones)– rTth DNA polimerasa (virus y fragmentos de RNA

difíciles)• Primers:

– Random Hexamers expresión– Poly(dT)– Específico (la eficiencia de la RT dependerá del

primer) virus

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Análisis de expresión CON curva patrón

Gen Referencia: GAPDH Gen Estudio: SPP1

T0T7

27.36

-0.2

0.627 Cantidad relativa

27.68

-0.3

0.49

-0.42

0.38 Cantidad relativa

-1.92

0.0121

16.62

21.58

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• Ejemplo: cuantificación de SPP1 en cultivos celulares de células mesenquimales en diferenciación


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• Método de comparación de Ct• Se basa en la eficiencia de los primers• Se refiere a la muestra con mayor cantidad de

gen de estudio (o menor Ct)• Q = e(menor Ct- Ct muestra)

• e =10-1/pendiente

• Si la eficiencia es del 100% e=10-1/-3.32=2

Análisis de expresión SIN curva patrón

Ejemplo

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• Método de comparación de Ct= 2-ΔΔCt

ΔΔCt= ΔCt , muestra-ΔCt, calibrador

ΔCt , muestra: Valor de Ct para una muestra normalizado con el del control endógeno.

ΔCt , calibrador: Valor de Ct para el calibrador normalizado con el del control endógeno.

=2-ΔΔCtExpresión gen/ Expresión basal del gen

Expresión endógeno/ Expresión basal endóg

Análisis de expresión SIN curva patrón

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2. Cuantificación RelativaLa eficiencia de la PCR puede enmascarar resultados.

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• PCR Múltiple:– Amplificación del gen de interés y el

endógeno en el mismo tubo.– Reporter: 6-FAM y JOE.– Evitar competición en la reacción:

• Limitar la concentración de primers del gen más abundante.

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Cuantificación Relativa• Elección del método:

– Estudio del gen de interés y del endógeno en tubos distintos y usar curva patrón:

• Rápida optimización y validación.

– Utilización del método 2-ΔΔCt : • Se necesitan eficiencias de amplificación similares.• No necesita curva patrón. • Elimina los errores de dilución de la curva patrón.

– PCR Múltiple: • Más puesta a punto.• Mayor rapidez de análisis.

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