cuestionario de bacterias

7/23/2019 cuestionario de bacterias

1/20

Inhibicin de la Actividad de la Ureasa y el Succinato DeshidrogenasaBioqumica

PRCTICA DE LABORATORIO N 03

INHIBICIN DE LA ACTIVIDAD DE LA UREASA ( E.C. 3.5.1.5) YDEL SUCCINATO DESHIDROGENASA (E.C. 1.3.99.1)

I. INTRODUCCIN.En la presente experiencia de prctica investigaremos la inhibicinde la actividad en!imtica por productos qumicos espec"cos# losllamados Inhibidores$ El inhibidor espec"co usado ser bisul%atode sodio y el malonato$ Se conoce que el bisul"to se combina conla ureasa inhibiendo la actividad en!imtica de modo reversible$

Una mol&cula inhibidora a%ecta la actividad en!imtica de dosmodos' por Inhibicin competitiva e inhibicin no competitiva$ (ainhibicin competitiva tiene lugar cuando una mol&cula que es

estructuralmente similar al sustrato para una reaccin particular#compite por una posicin en el sitio activo de la en!ima$ Esto haceque la en!ima no est& disponible al sustrato$ (a inhibicincompetitiva puede invertirse si se eleva la concentracin delsustrato a niveles su"cientemente altos mientras la concentracindel inhibidor se mantiene constante$

En la inhibicin no competitiva# el inhibidor se une a la en!ima enun sitio que no es el sitio activo$ Siendo as# cambia la naturale!ade la en!ima para que pierda sus propiedades catali!adoras$ Estosucede de dos maneras$ El inhibidor no competitivo bloquea%sicamente el acceso al sitio activo# o causa un cambiocon%ormacional en la protena# inactivndola$ )orque las mol&culasdel sustrato no pueden invertir la posicin de un inhibidor nocompetitivo y aumentar la concentracin del sustrato no invertirla inhibicin$

El ob*etivo de la presente experiencia es demostrar el e%ectoinhibidor de algunas sustancias sobre la velocidad de reaccin

en!imtica# utili!ando para ello bisul"to de sodio y malonato#como inhibidores de la ureasa y succionato deshidrogenasa#respectivamente$

II. MATERIALES. +radillas$ Ba,o -ara a ./01$ 2ubos de ensayo 34x 354 mm$

Ingeniera Agroindustrial )gina 3


2/20

Inhibicin de la Actividad de la Ureasa y el Succinato DeshidrogenasaBioqumica

2ubos de ensayo 3. x 366 mm$ 7uego de pipetas 36# 4# 5 y 3 ml$

Espectro%otmetro$ 8otocolormetro$ Bu9er %os%ato de

sodio 6$3- p: /$ 5$;

dicloro%enolindo%enol6$65


3/20

III. PROCEDIMIENTO.

)repare el siguiente esquema de tubos y siga las indicaciones quese muestra a continuacin'

A. INHIBICIN DE UREASA.1. SISTEMA DE INCUBACIN.

COMPONENTES (L)

Y PROCESO

T

T

T

T

Bu9er 2ris

6$64 - ):/$6

5

3

>>

3

=rea 6$3 -en bu9er2ris 6$64 -p: /$6

5

5

.

5

Bisul"to deSodio 6$3 -

>>

3

3

3

)re Incubar a ./01 por 4 minutos$ Ureasa 6$3<

6

6

6

>>

Incubar a ./01 por 34 minutos$

A,adir dos gotas de :g1l5 a cada tubo paradetener la reaccin$

Ureasa 6$3< >>

>>

>>

6

-e!clar# preparar y seguir con el siguientesistema$


4/20

5$ Evaluacin del e%ecto inhibidor del bisul"to de sodio'1uanti"cacin del producto %ormado por colorimetra

?@eaccin de essler$ 2rans%erir 6$3 m( de cada uno de los tubos de ensayode la parte 3 a sus correspondientes en la parte 5$


5/20

COMPONENTE

S

B

I

II

II

IV

2UBC3?)arte3

>

6

>>>

>>

>>>>

2UBC5?)arte5

>

>>

6$

>>

>>>>

2UBC

.?)arte

.

>

>>

>>>

6

>>>>

2UBC?)arte

>

>>

>>>

>>

6$

Aguadestilada

.

.$

.

.$

@eactivodeessler

6

6

6$

6

6$


6/20

De*ar en reposo por 4 minutos$ (eer en %otocolormetro con"ltro verde o bien en espectro%otmetro a 46 nn$ @estar lalectura del tubo de las lecturas de los otros tubos$ Determinarla actividad en!imtica en cada uno de los tubos de incubacin$)ara lo cual deber multiplicar la lectura de cada tubo por un%actor'

!R ./ mg :.F ml# para espectro%otmetro y 6$66; mg :. F ml# para %otocolormetro$

B. INHIBICIN DE SUCCINATO DESHIDROGENASA.1. SISTEMAS DE INCUBACIN Y EVALUACIN DEL E!ECTO

INHIBIDOR DEL MALONATO.

COMPONENTES (")

TUBO1

TUBO#

TUBO 3

TUBO $

TUBO 5

Bu9er %os%ato deSodio 6$3 - p: /$

3$4

3$5

3$6

6$G

6$.

5$;dicloro%enolindo%enol

3$6

3$6

3$6

3$6

3$6

Succinato 6$4 - >>>>

>>>>

>>>>

>>>>

6$/

-alonato 6$3 - >>>>

>>>>

:omogeni!adoheptico

>>>>

6$4

6$4

6$4

6$4

-e!clar y de*ar en reposo a temperatura ambiente$ Cbservary anotar los resultados segHn el color de cada un de los tubos$

IV. CUESTIONARIO.

1. %&' * *+,-*+* / -24* * "4 4,--4*+6-7,-48


7/20

MODI!ICADORES DE LA ACTIVIDAD ENIMTICA

T-/:

4) T*/*4,'4' (as en!imas son inactivadas por e calor a

temperaturas de 461>;61 inactivan rpidamente la mayorparte de las en!imas$ Esta inactivaron es irreversible# pues alen%riar no se obtiene actividad otra ve!$ Esto explica que casitodos los organismos resulten muertos a una exposicin atemperatura elevada' Sus en!imas se inactivan y resultanincapaces de reanudar su metabolismo$

(as En!imas no son inactivadas por la congelacinJ lasreacciones que producen tienen a lugar muy lentamente atemperaturas ba*as# o se detienen# pero la actividad cataltica

reaparece si la temperatura vuelve a su estado normal

;) A-*6:(as en!imas son sensibles a los cambios de ): o seade acide! o alcalinidad en el medio$

(a mayor parte de en!imas intracelulares tienen ): ptimoscerca de la neutralidad# por lo que no actHan en medioscidosni alcalinos# los cidos y bases en&rgicos las inactivanirreversiblemente$

) C+*+,4-


8/20


9/20

&l por acceder al centro activo# pero que no posee ningHnenlace susceptible de ser atacado por el en!ima$

.@ %&' *?*, ,-*+* *" 4'*+, * "4 +*+,4-


10/20

comple*o en!ima>sustrato ?ES$ En la catlisis# este comple*o serompe para liberar el producto ?) y la en!ima ?E$ El inhibidor?I puede unirse tanto a ?E como a ?ES con las constantes dedisociacinKio KiN# respectivamente

.@ E-,* -*+,**+,* 4"+ ,-/ * *"4-


11/20

Este tipo de inhibicin es el de la inhibicin de la succinatodeshidrogenasa# en!ima que tiene por sustrato el cidosuccnico# por otras sustancias estructuralmente parecidas alcido succnico# como el cido malnico# el cido oxlico# y elcido glutrico

10.@ %D* F'* ?4,* */*+* *" 4 * -+-;--


12/20

11. %E+ F'* -'+,4+-4 /'** *" ',4, * '+4*+6-4 4,'4 -+-;- /*,-,- * "4 -4*+6-48

El sustrato y el inhibidor no se pueden unir a la mismaen!ima al mismo tiempo# como se muestra en la "gura de laderecha$ Esto generalmente ocurre cuando el inhibidor tienea"nidad por el sitio activo de una en!ima en el que tambi&n seune el sustratoJ el sustrato y el inhibidor compitenpara el acceso al sitio activo de la en!ima$ Este tipode inhibicin se puede superar con concentracionessu"cientemente altas del sustrato# es decir# de*ando%uera de competicin al inhibidor$ (os inhibidorescompetitivos son a menudo similares en estructura

al sustrato$

1#.@ %&' ,-/ * -+-;- * *";-'"2, * - 0.1M8

Es un inhibidor no competitivo

13.@ %&' ,-/ * -+-;- * *" 4"+4, 0.1M8

Es un inhibidor competitivo

1$. %&'* * *+,-*+* / -+-;- +/*,-,-8

I+-;--


13/20

2ienen a"nidades id&nticas por ?E y ?ES ?Ki KiN$ (ainhibicin no competitiva no cambia la Km?es decir# no a%ecta ala unin del sustrato pero disminuye la Vmax?es decir# la unindel inhibidor obstaculi!a la catlisis$

15. %&' *?*, ,-*+* *" 4'*+, * "4 +*+,4-


14/20

1.@P&'* /4 *- */*, 4 "4 */*-2-4 *

" -+-;-* + /*,-,-.

(as mol&culas del sustrato se unen a un sitio particular en la

super"cie de la en!ima# denominada -,- 4,-# donde tienelugar la catlisis$ (a estructura tridimensional de este sitioactivo# donde solo puede entrar un determinado sustrato ?nisiquiera sus ismeros es lo que determina la especi"cidad delas en!imas$ El acoplamiento es tal que E$ 8isher ?3GQenunci' "el sustrato se adapta al centro activo ocataltico de una enzima como una llave a una

cerradura"

1. %E-,* -*+,**+,* 4"+ ,-/ * --"-,' *+,*"4 *,','4 F'-4 *" -+-;- + /*,-,- > "4*" ',4, +4,'4" * "4 *+6-48 %J,4 * '+4+--


15/20

1.@ %C


16/20

2ubo

63

blanco

Si hubo reaccinpor ausencia de

inhibidor

2ubo65

blanco

o hubo reaccinpor inhibidor

2ubo6.

Blanco

Si hubo reaccinpor mayor

concentracin desustrato

2ubo6

Blanco

o hubo reaccinpor inhibidor

Al anali!ar los resultados utili!ando el m&todo de colorimetra

observamos di%erencia de color en las muestras 3 y .$ En elprimer caso el color indica %ormacin de producto debido a queno hay presencia de inhibidorJ en el otro caso tambi&n seproduce reaccin pues al aumentar la cantidad de sustrato nose despla!a al inhibidor# solo se disminuye la velocidad dereaccin$

(os tubos 5 y presentan el mismo color que el tubo blancodebido a que en el segundo tubo el inhibidor bloquea lareaccin impidiendo as la %ormacin de productoJ en el tubo nohay %ormacin de producto debido a que no hay presencia deen!ima durante la reaccin$


17/20

INHIBICION DE SUCCINATO DESHIDROGENASA

TUBO

EKPLICACIN

2ubo

63

Solo presenta el color del indicador nohay variacin

2ubo6

5

Solo observa el color del indicador nohay cambio$

2ubo6.

Este tubo presenta sustrato# en!ima yel indicador y se observa cambiode color

2ubo6

Este tubo presenta sustrato# en!ima eindicador pero el color no varia ya quese presenta un inhibidor que bloquea yhace que el color se mantenga igual alindicador


18/20

2ubo64

Este tubo presenta sustrato en!ima eindicador pero tambi&n presenta elinhibidor pero es muy ba*o compradocon el Succinato y no existe unbloqueo por eso el color varia

)odemos observar cambio de color en las muestras . y 4' En elprimer caso la muestra no contiene malonato ?inhibidor# por lo

tanto se ha producido reaccinJ en la segunda muestra seincrement la concentracin de sustrato y se produce Ku*o de e>que son absorbidos por el indicador# el inhibidor es despla!adodebido a que es competitivo$

En los tubos 3#5 y las muestras mantienen el color a!ul delindicador lo cual indica que no se produ*o reaccin debido a que enel tubo 3 no hay sustrato# el segundo tubo no contiene en!ima yen el tubo la reaccin es bloqueada por la presencia delinhibidor$

V. ANEKOS.

A. INHIBICIN DE UREASA.


19/20

A. INHIBICIN DE SUCCINATO DESHIDROGENASA.

!-. #S* ,4+2-< 0.1 L *' * " ,'; * "4/4,* 1 4 '*/+-*+,* *+ "4

!-. 1S-,*4

D* I+';4-


20/20

!-. S* "* 44* *"H*+-64H*/7,- / * *",'; 3 > 5 4;-4+ *

!-.5S-,*4 * -+';4- *4"'4-

cuestionario de bacterias

Documents