BACTERIAS

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Escherichia coli o Gram o Morfologa celular: Bacilo pequeo no esporulado o Agrupaciones: Cadenas o Movilidad: Movimiento ondulante o Antibiotico + eficaz: Amoxicilina o Crece en Agar Enterico Ektoen Fermenta lactosa

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Enterobacter cloacae o Gram o Morfologa celular: Bacilo o Agrupaciones: Sin agrupacin o Movilidad: Movimiento giratorio

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Serratia marcescens o Gram o Morfologa celular: Bacilo pequeo no esporulado o Agrupaciones: o Movilidad: o Crece en Agar Enterico Hektoen Fermenta Lactosa

o Degrada Caseina, Tween-80 y DNA

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Proteus vulgaris o Gram o Morfologa: Bacilo o Agrupaciones: Parejas o Movilidad: Muy rapidos, movimiento flagelar o Antibiotico + eficaz: Amoxicilina o Kanamicina

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Salmonella typhimurium o Gram o Morfologa celular: o Agrupaciones: o Movilidad: o Crece en Agar Glucosa puede vivir con glucosa como unica fuente de carbono o Crece en Agar Enerito Hektoen Reduce el S2O3 a H2S precipita SFe (negro)

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Pseudomonas fluorescens o Gram o Morfologa celular: Bacilo o Agrupaciones: o Movilidad: Poca movilidad o Ligero crecimiento en Agar manitol Sal

o Crece en Agar Glucosa puede vivir con glucosa como unica fuente de carbono o Crece en Agar Enterico Hektoen no le afectan los acidos biliares

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Alcaligenes faecalis o Gram o Morfologa celular: o Agrupaciones: o Movilidad: o Crece en Agar Enterico Hektoen crecimiento leve

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Aeromonas hydrophila o Gram o Morfologa celular: Espirilo o Agrupaciones: o Movilidad: o Antibiotico + eficaz: Estreptomicina o Degrada Caseina, Almidon, Twen-80 y DNA

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Micrococcus luteus o Gram + o Morfologa: coco o Agrupaciones: Tetradas

o Movilidad: o Antibiotico + eficaz: Cefalexina o Ligero crecimiento en Agar manitol sal

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Bacillus sp. o Gram + o Morfologa: Bacilo grande esporulado o Agrupaciones: Cadenas o Movilidad: por vibracion o Antibiotico + eficaz: Cloranfenicol o Degrada Caseina y DNA

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Enterococcus faecalis o Gram + o Morfologa: Coco o Agrupaciones: Cadenas o Ligero crecimiento en Agar manitol sal

-

Staphylococcus aureus o Gram +

o o o o

Morfologa: Coco Agrupaciones: Racimos irregulares Antibiotico + eficaz: Amoxicilina Crece en Agar Manitol - Sal

HONGOS - Levaduras:

o Saccharomyces cerevisiae Hongos filamentosos:

o

Penicillum sp.

o

Aspergillus sp.

o Helminthosporium sp.

o Pestallotia sp.

MEDIOS DE CULTIVO UTILIZADOS: Definiciones: o Medio sinttico o definido: Aquel medio que contiene cantidades conocidas de compuestos qumicos. o Medio complejo: Contienen compuestos de composicin qumica poco definida de forma que no podemos precisar qu cantidad exacta y qu especies qumicas poseen o Medio lquido (caldo): Suspensiones o soluciones acuosas de los componentes. Los organismos crecen dispersos en el seno del quido. o Medio slido (agar): Contiene un agente gelificante que solidifica la solucin acuosa, creando un sustrato nutritivo donde se pueden inmovilizar las celulas microbianas. Crecimiento en csped: Masa uniforme de cultivo superficial. Las clulas inmovilizadas estn muy cercanas Colonias aisladas: Clulas inmovilizadas estn dispersas Agar-agar: Polisacarido complejo obtenido a partir de algas marinas Agente gelificante ms utilizado porque: Alta resistencia a hidrlisis microbiana Produce geles transparentes y resistentes a baja concentracin Solidifica a temperaturas inferiores a 45 o Medio semislido: Baja concentracin de agente gelificante, consistencia intermedia entre un medio lquido y n medio slido. Las clulas estn parcialmente inmovilizadas, pueden desplazarse si poseen amovilidad flagelar activa. o Medio general: Permite el crecimiento de una gran variedad de microorganismos, sin requerimientos especiales para crecer. o Medio enriquecido: Permite el crecimiento de microorganismos con necesidades particulares (sangre, factores de crecimiento etc.)

o Medio diferencial: Se le ha incluido componentes que producen un efecto en el medio cuando el organismo realice una determinada actividad, permitindonos DIFERENCIAR los microorganismos que pueden realizar esta actividad d lo que no. o Medio selectivo: Debido a su composicin y/o condiciones de incubacin, el medio selectivo inhibe el crecimiento de un gran nmero de microorganismos para que pueda crecer uno o pocos microorganismos minoritarios que quedarn selectivados por las condiciones el medio. -

TSA: Agar Triptona Soja.o o o o o Peptona de casena 15g/L Peptona de soja 5 NaCl 5 Agar 15 pH = 7,2 Medio general, sinttico, slido. Crecen todas las bacterias utilizadas

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Agar Malta:o o o o o Glucosa 20 g/L Extracto de malta 20 Peptona 1 Agar 15 pH = 5,4 . Medio sinttico, slido. Selectivo para hongos: pH ms cido que para bacterias Extracto de malta como componente principal NaCl 5 g/L MgSO4 0,2 NH4H2PO4 1 K2HPO4 1 pH = 7,0. Medio sinttico, lquido Selectivo para organismos no hetertrofos Sin compuestos qumicos orgnicos No crece ningn microorganismo utilizado

- Caldo inorgnico sinttico (CIS)o o o o o

- Caldo glucosa sales (CGS)o Glucosa 5 g/L o CIS 1L o pH = 7,0. Medio sinttico, lquido

Selectivo para organismos hetertrofos que tengan la glucosa como UNICA fuente de carbono. Unico compuesto quimico organico: glucosa

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Caldo extracto de levadura (CEL)

o Peptona

5 g/L

o Extracto de carne 3 o Extracto de levadura 5 o pH = 7,0. Medio sintetico, liquido, enriquecido Tiene muchos nutrientes organicos.

- Agar Manitol Salo o o o o o o o Extracto de carne 1 g/L Peptona de casena 5 Peptona de carne 5 NaCl 75 D-manitol 10 Rojo fenol 0,02 Agar 15 pH = 7,4 Medio solido, complejo Selectivo para bacterias halofilas : Staphylococcus aureus Diferencial por el rojo fenol : cambia a amarillo si baja el pH (fermentacin)

- Agar Enterico Hektoeno o o o o o o o o o o o o Proteosa-peptona 12 g/L Extracto de levadura 3 Sales biliares 9 Lactosa 12 Sacarosa 12 Salicina 2 NaCl 5 NaS2O3 5 Citrato frrico-amnico 1,5 Fucsina cida 0,1 Azul de bromotimol 0,06 Agar 15 pH = 7,5. Medio solido, complejo Selectivo para enterobacterias Fucsina acida: toxico para gram+ Sales biliares: enterobacterias son resistentes a las sales biliares Diferencial para enterobacterias que metabolicen lactosa, o no.

Azul de bromotimol cambia de color al acidificarse el medio (lactosa ac. lactico, x ej.) NaS2O3 precipita junto con citrato ferrico en presencia de Salmonella pequeos puntos negros en la placa. Crece E.Coli, S.Marcescens, Salmonella, Pseudomonas (pero no fermentan), A.faecalis (pero no fermentan)

- L-Agaro o o o o Triptona Extracto de levadura NaCl Agar pH = 7,0 10 g/L 5 5 15

- Top-Agaro o o o Triptona 10 g/L KCl 5 Agar 7 pH = 7,0. Medio sinttico, semislido, general.

- Agar Mueller-Hintono o o o o Peptona 17,5 g/L Extracto de carne 5 Almidn soluble 1,5 Agar 17 pH = 7,4. Medio complejo, slido, general Utilizado en antibiograma:

- Agar Tween-80o o o o o o Peptona 10 g/L CaCl2 0,1 NaCl 5 Tween-80 10 ml Agar 15 pH = 7,2. Medio complejo, slido. Diferencial para bacterias que metabolicen Tween-80 (Ac. graso) Crecen Aeromonas y Serratia.

- Agar Casenao Peptona o NaCl o Extracto de carne 10 g/L 5 3

o Agar 15 o pH = 7,0. o Una vez estril y antes de verter en placa, se le aade un 10% de leche descremada. Medio complejo, slido Diferencial para bacterias que metabolicen proteinas Crecen Serratia, Bacillus y Aeromonas

- Agar almidno o o o o o Peptona 10 g/L NaCl 5 Extracto de carne 3 Almidn soluble 2 Agar 15 pH = 7,0. Medio complejo, slido Diferencial para bacterias que metabolicen polisacaridos Crecen Aeromonas y Serratia, levemente

- Agar DNAsao o o o o o Peptona de casena 15 g/L Peptona de soja 5 NaCl 5 cido desoxirribonucleico 2 Agar 15 pH= 7,3. Medio sinttico, slido Diferencial para bacterias que metabolicen ac. nucleicos Crecen serratia, Bacillus y Aeromonas

- Medio de oxidacin fermentacin (O/F) segn Hugh y Leifsono o o o o o o Peptona 2 g/L Glucosa 10 NaCl 5 K2HPO4 0,3 Azul de bromotimol 0,03 Agar 3 pH = 7,1. Medio sinttico, semislido, no selectivo Diferencial para organismos aerobios y anaerobios Indicador: azul de bromotimol Color azul: pH bsico: o La bacteria no utiliza la glucosa, sino la peptona o Utilizacin de la peptona liberacin de NH4 pH Color verde: pH neutro: o La bacteria no crece, no metaboliza ningun componente.

Color amarillo: pH cido: o La bacteria crece, utilizando la glucosa o Metabolismo de glucosa libera ac. Lctico pH Tubo aerobio/Tubo anaerobio: V/V no hay crecimiento. Algunas gram+ no crecen. A/A hay siempre crecimiento: Anaerobio facultativo A/V no hay crecimiento en anaerobiosis: Aerobio estricto Z/V no hay metabolismo de glucosa, sino de peptona Glucosa en poca cantidad para que no absorba todo el agua

- Caldo Rojo Metilo- Voges-Proskauer (MR-VP)o o o o Peptona 7g/L K2HPO4 5 Glucosa 5 pH = 7,0. Medio sinttico, liquido, no selectivo Diferencial para organismos fermentativos RM: determina fermentacin acido mixta VP: determina fermentacin butanodioica

TIPOS DE TINCIONES Tinciones simples: Se utiliza un solo colornte que tie por igual a todas las celulas. Se utilizan para observar la morfologa, tamao celular y agrupaciones caracteristicas de las celulas. Dos tipos: o Positivas: El colorante tie a la celula; el contraste se realiza con el medio, que ser blanco. o Negativas: El colorante tie el medio, dejando a las clulas sin teir Azul de lactofenol: Slo para hongo, colorante vital. Nigrosina Tinciones diferenciales: Permiten distinguir entre varios tipos de celulas o entre varios tipos de estructuras de una misma clula en funcion de su respuesta a los colorantes o a la decoloracion. o Tincion de Gram Primer colorante: violeta cristal Gram +: Colorante violeta cristal se queda en la celula no puede traspasar la pared Gram -: Colorante violeta cristal se intercambia por alcohol blanco.

Segundo colorante: fucsina basica Gram +: violeta+fucsia violeta Gram -: blanco+fucsia fucsia

o Tincion de cpsulas Primer colorante: fucsina basica: tie todo menos la capsula Segundo colorante: nigrosina: tie el medio capsula queda contrastada en blanco. o Tincion de esporas Primer colorante: verde de malaquita: tie las esporas Segndo colorante: fucsina basica: tie el resto de la celula se observan endosporas dentro de la celula.

RECUENTOS MICROBIANOS Directos: Contar al microscopio las celulas y sacar una media: o o o o o o NT/n de cuadrados Cada cuadrado = 1/51/41mm = 1/20mm Superficie = 1/400mm2 Volumen = 1/4000,1mm = 1/4000 mm3 1mm3 = 10-3cm3 = 10-3 mL Ecuacin total: (NT/n de cuadrados) 1/4000 10-3 organismos por mL (u.f.c/mL)

Indirectos: Recuento de viables en placa o Hacer aprox. 5 diluciones y sembrar en placas o Seleccionar las placas que tengan entre 30 y 300 org. o Ejemplo: sembramos en una placa 0,1 mL de diluciones 10-1, 10-2, 10-3, 10-4 mL Aparecen 223 org en la placa de 10-3 mL 223 103 (por la dilucion) 10(por la cantidad de volumen en la placa) o Inconvenientes: Slo contamos los org que han crecido: No se cuentan los daados o muertos No se cuentan los que no han tenido sitio que colonizar

-

Indirectos: Recuento de fagos

o El mismo procedimiento que el recuento de viables o Unidades: u.f.p/mL calvas por mL (plaque en ingles)

9.2.1.- RECUENTO DE BACTERIAS VIABLES EN PLACA (POR EXTENSIN, SPREAD PLATE). El recuento en placa en superficie se basa en el recuento de las unidades formadoras de colonia que aparecen tras dispersar una alicuota o dilucin de la muestra problema en la superficie de una placa de medio slido: las clulas viables quedan inmovilizadas en distintos puntos de la superficie del medio, donde crecern dando lugar a colonias aisladas, si estn lo suficientemente dispersas (ejemplos en las fotos siguientes), o a un csped si hay muchas y quedan muy juntas. Existe un lmite de fiabilidad establecido para los recuentos en placa de modo que, para que el recuento sea vlido, las placas deben contener entre 20 y 200 colonias (30 a 300 en el caso de pour plates). El lmite superior se establece porque pueden haber viables en la placa cuyo crecimiento quede inhibido o enmascarado por el desarrollo de otras ms rpidas o ms eficaces en la captacin de nutrientes. El resultado de un recuento de colonias se expresa siempre en nmero de unidades formadoras de colonia (u.f.c) por mililitro o gramo de muestra, especificando el valor como una sola cifra con uno o dos decimales multiplicado por el orden de magnitud del recuento: INCORRECTO 245.000 clulas/m 84,9 x 10 ufc/g CORRECTO 2,5 x 10 ufc/ml 8,5 x 10 ufc/g

Adems, hay que especificar el tipo de recuento de viables en cada caso: medio y

condiciones empleadas. La estrategia a seguir queda reflejada en el siguiente esquema, que puede ser vlido para la muestra de agua que procesaremos:

10.3.- METABOLISMO FERMENTATIVO DE CARBOHIDRATOS: RUTAS FERMENTATIVAS EN ENTEROBACTERIAS, PRUEBA MR-VP. El tipo de fermentacin que lleva a cabo un microorganismo es tambin un carcter importante en identificacin. De las mltiples fermentaciones que llevan a cabo las bacterias, en la Familia Enterobacteriaceae la fermentacin se da por una de dos posibles rutas alternativas. La determinacin de cual de ellas se usa es importante para distinguir los gneros (Escherichia, Klebsiella, Proteus, Serratia, ...). En la prctica, se analizan los productos finales de la fermentacin de la glucosa, despus de haber incubado la bacteria en un medio lquido glucosado, para averiguar si: a) La produccin de cidos variados ha rebajado el pH por debajo de 4,2. Esta bajada de pH es caracterstica de la fermentacin cido-mixta y se puede comprobar aadiendo el indicador de pH Rojo de Metilo a una alcuota del caldo glucosado crecido. El Rojo de Metilo es amarillo o anaranjado a pHs superiores a 4,2 y rojo a pHs inferiores (prueba Rojo Metilo, RM) b) En el medio hay butanodiol, el subproducto caracterstico de la fermentacin butanodilica, que se puede revelar mediante una reaccin coloreada, aadiendo KOH al 40% (p/v en agua) y ?naftol (5% p/v en etanol) a otra alcuota del caldo glucosado crecido. En presencia de KOH concentrado el butanodiol se oxida a diacetilo, que en esas condiciones dar un color rojo cereza al tubo: (prueba Voges Proskauer, VP) 10.4.- ENZIMAS RELACIONADOS CON EL OXGENO: DETERMINACIN DE LAS ACTIVIDADES CITOCROMO OXIDASA Y CATALASA. La presencia de estos dos enzimas es crucial en la identificacin de varios grupos de bacterias: la citocromo oxidasa, o simplemente, oxidasa, es una determinacin habitual en el proceso de

identificacin de bacterias Gram-negativas heterotrofas. La determinacin de la actividad catalasa es habitual en la identificacin de Gram-positivas. Citocromo-oxidasa: Forma parte de la cadena de transporte electrnico de multitud de bacterias y corresponde a un citocromo de tipo c. Su presencia se puede poner de manifiesto de forma simple haciendo uso del cambio de color que presenta un reactivo especfico (Reactivo de la oxidasa-ver Anexo), que pasa de incoloro a violeta oscuro cuando es oxidado especficamente por este tipo de citocromos. Los citocromos de tipo a o b no son reducidos por el reactivo por lo que el cambio de color slo se observa cuando la bacteria sometida a la prueba posee citocromos tipo c. En la determinacin es conveniente usar asas de vidrio o palillos de madera estriles para recoger el crecimiento bacteriano, pues el uso de asas metlicas puede dar lugar a falsos positivos. Tambin es conveniente usar cultivos obtenidos en medios sin carbohidratos. Catalasa: la catalasa es uno de los enzimas que intervienen en el proceso de detoxificacin de las clulas expuestas a condiciones aerobias y, en particular, descompone el perxido de hidrgeno (H2O2) en agua y oxgeno. Es un enzima hmico que est presente en muchas (pero no todas) de las bacterias capaces de desarrollarse en presencia de O2. 2 H2O2 2 H2O + O2 Es fcil de detectar por la produccin de burbujas de oxgeno que acompaa a la actividad.

PRCTICA 12. IDENTIFICACIN DE MICROORGANISMOS MEDIANTE SISTEMAS MINIATURIZADOS. La identificacin microbiana puede realizarse atendiendo a dos tipos de determinaciones: a) Caracterizacin fenotpica: pruebas morfolgicas, estructurales, enzimticas, nutricionales, composicin de cidos grasos celulares, etc... b) Caracterizacin genotpica: hibridacin con sondas filogenticas especficas, determinacin de perfiles de resticcin y/o amplificacin de su DNA genmico, etc... La identificacin requiere siempre la existencia de una clasificacin previa y la disponibilidad de una base de datos lo suficientemente amplia y slida como para ofrecer resultados fiables. En muchos laboratorios, la identificacin de aislados microbianos es una tarea rutinaria que ha de aplicarse a cientos de cepas continuamente, de manera que el volumen de materiales y procedimientos implicados en esta actividad hacen necesario disponer de sistemas rpidos, miniaturizados y estandarizados para identificar eficazmente los microorganismos problema. La mayora de estos mtodos realizan una identificacin basada en la caracterizacin del fenotipo del microorganismo y consisten en placas o galerias de pequeos tubos o pocillos que contienen cantidades mnimas de medios de cultivo adecuados para la determinacin de una o varias caractersticas concretas y pueden ser incubados en condiciones aerobias o anaerobias con facilidad. Se inoculan con suspensiones preparadas a partir de colonias aisladas y ofrecen resultados vlidos en plazos de tiempo que van desde un mximo de 24 h hasta mnimos de 4 h de incubacin.

Para utilizar estos sistemas es necesario conocer algunas caracteristicas bsicas del microorganismo que se pretende identificar: si se trata de una bacteria o un hongo, si la bacteria es Gram-positiva o Gram-negativa, y, a veces, su morfologa celular o la reaccin a la prueba de la oxidasa o del O/F. Los resultados obtenidos mediante estos mtodos se suelen codificar con una clave numrica abreviada que se introduce en la base de datos y ofrece un resultado de identificacin, con la fiabilidad de la misma y recomendando pruebas adicionales si la identificacin no es concluyente. Algunos de los sistemas comprenden tambin lectores automatizados de las placas. Todos estos sistemas suelen estar muy orientados a especies microbianas de importancia clnica, pues es ste el mbito que ms uso hace de la identificacin miniaturizada. No cualquier tipo de bacteria se puede identificar con estos sistemas. Como ilustracin del uso de tales mtodos, llevaremos a cabo la identificacin de cuatro cepas bacterianas haciendo uso del sistema EnteroSystem 18R. Este sistema permite la identificacin rpida de bacterias Gram-negativas, oxidasa negativas (presuntas enterobacterias) de inters sanitario, incluyendo: Escherichia, Shigella, Edwardsiella, Citrobacter, Salmonella, Klebsiella, Enterobacter, Serratia, Proteus, Providencia, Morganella y Yersinia. Contiene 18 pruebas que se realizan en una placa con 18 pocillos que se inoculan con una suspensin bacteriana y ofrece resultados tras 8-24 h de incubacin a 35-37C. Pruebas: 1.-galactosidasa: Es el enzima que hidroliza el disacrido lactosa en glucosa y galactosa. Se ensaya con un sustrato artificial, el orto-nitro-fenil ?-galactopiransido (ONPG), que, al ser hidrolizado por el enzima, produce un compuesto de color amarillo, el orto-nitrofenol. 2.- Lisina descarboxilasa. 3.- Ornitina descarboxilasa 4.- Arginina descarboxilasa. Estos tres enzimas actan sobre los correspondientes aminocidos descarboxilandolos y convirtindolos en diaminas, que tienen un efecto alcalinizante en el medio. Esta alcalinizacin se detecta con un indicador que vira de amarillo a rojo. 5.- Fenilalanina desaminasa: Este enzima desamina la fenilalanina, produciendo cido fenilpirvico, que otorga al medio un color marrn oscuro-negro. 6.- Citrato: El uso de citrato como nica fuente de carbono y energa produce una alcalinizacin del medio que se registra por la presencia de azul de bromotimol. 7.- Ureasa: +El enzima ureasa hidroliza la urea formando CO2 y NH4 , lo que produce una intensa alcalinizacin del medio que se traduce en el viraje del indicador de pH a fucsia. 8.- Produccin de H2S a partir de tiosulfato.

Al igual que en el medio Hektoen (ver prctica 5), la produccin de H2S se detecta por la formacin de SFe, negro, que aparece como consecuencia de la presencia de sales de hierro en el medio. 9.- Malonato La utilizacin de malonato produce los mismos efectos que la de citrato. 10.- Voges-Proskauer. Permite detectar la formacin de butanodiol en la fermentacin de la glucosa por el mtodo que se ha visto en la pgina 65. 11.- Produccin de indol a partir de triptfano. Mediante la triptofanasa, el triptfano es degradado, formndose indol como residuo. Este compuesto puede detectarse usando el reactivo de Kovac para el indol (p-dimetil aminobenzaldehido en isoamlico-HCL, ver anexo), que produce color rojo en su presencia. 12-18.- Fermentacin de carbohidratos En estos pocillos se puede observar la acidificacin que se produce cuando los carbohidratos que contienen son fermentados, virando el indicador a amarillo. Los resultados, en grupos de tres, se codifican numricamente del siguiente modo: - Prueba negativa 0 puntos - Primera prueba del tro positiva 1 punto. - Segunda prueba del tro positiva 2 puntos - Tercera prueba del tro positiva 4 puntos. A continuacin se suman los puntos de cada tro de pruebas y se obtiene un nmero de 6 cifras que ser el cdigo para buscar la identificacin que le corresponda a la cepa en la base de datos.