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Mtodos directosa). Aislamiento viral - Cultivos celulares

b). Deteccin de antgenos _ Tcnicasinmunolgicas

- Inmunouorescenciadirecta- !adioinmunoensa"o #!IA)-$n%imoinmunoan&lisis-Tesr de 'i(acin alcomlemento-!eacciones de*reciitacin-+eutrali%acin-Aglutinacin

c). Tcnicas de ,iologa Molecular- ondas de &cidos

nuclicos- *C!- An&lisis electroortico del

AD+ " */'!

Mtodos Indirectosa). Inmunouorescencia indirecta

b). $n%imoinmunoan&lisis indirectoc). Test de aglutinacin

d). 0estern ,lot

e). *roduccin de anticueros invitro

Diagnstico virolgico r&idoa). Microscoa electrnicab). Tincin 1isto2umica

- T%an3- 4iemsa- *aanicolau

/os mtodos utili%ados ara reconocer las inecciones or virus 1umanosueden clasi5carse en DI!$CT6 e I+DI!$CT6

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/as ruebas vricas de laboratorio retenden7

8) Con5rmar el diagnstico identi5cando elagente vrico de la ineccin

9) eleccionar un tratamiento antivrico

adecuado:) De5nir el cuadro atolgico

;)

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I. !ecoleccin> transorte "I. !ecoleccin> transorte "rocesamiento de lasrocesamiento de las

muestrasmuestras

TIMA+A C6!D6?A

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!$C6/$CCI6+> T!A+*6!T$ @*!6C$AMI$+T6 D$ /A M$T!A

$l diagnstico clnico orientar& 1acia la rueba aroiadaa reali%ar.

/as me(ores muestras or lo general son las 2ue seobtienen en un estadio temrano de la enermedad .

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/as muestras deben obtenerse de orma astica .

$l volumen de la muestra debe ser su5ciente.

/as muestras ueden obtenerse a artir de 7

!$C6/$CCI6+> T!A+*6!T$ @*!6C$AMI$+T6 D$ /A M$T!A

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/as muestras deben transortarse a ;BC .

*ara enviar virus de alta transmisibilidad> deber& colocarse el reciiente2ue contiene la muestra dentro de un contenedor de reerencia met&licocon taa de rosca " rotularse como eligro biolgico.

!$C6/$CCI6+> T!A+*6!T$ @*!6C$AMI$+T6 D$ /.A M$T!A

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$(emlos de recoleccin " transorte de muestras clnicas 7

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II. *rinciales TcnicasII. *rinciales Tcnicas

II.8. Mtodos directos7 II.8. Mtodos directos7*ersiguendemostrar la resencia del virus o de alguno de susconstitu"entes #antgeno o genoma viral)

a). Aislamiento virala). Aislamiento viral

@6?$!A IM$+$ De"Ei

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AislamientoAislamientoviralviral

Cultivos celulares

togavirus> coFa2uie A)

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Desventa(as en el aislamiento delDesventa(as en el aislamiento delvirus7virus7

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Cultivo celularCultivo celular

6btencin

Disociacin> con en%ima#trisina)

Clulaslibres

Ad1ieren "multilicanM6+6CA*A C$//A!

AlbGmina> vitaminas>sales> glucosa ensolucinamortiguadora " un 1eresClulas rimarias de rin de mono7 virus de la grie>

aramiFovirus> muc1os enterovirus " algunos adenovirus.

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b) Cepas de clulas diploides

Derivadas de te(idos normales Cultivos de un Gnico tio de clula !etienen su nGmero cromosmico diloide originale uede 1acer un gran nGmero de ases.

Ejemplos:

/a M!C=> lnea diloide 5brobl&stica de ulmn embrionario1umano> 2ue se utili%a ara el aislamiento de Citomegalovirus#CM?)> ?!> $c1o virus> etc./a MDCJ> es una lnea celular diloide de rin canino 2ue serecomienda ara el aislamiento del virus Inuen%a> 1eres "

arainuen%a.

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b) Lneas celulares continuas

Clulas inmortali%adas en el laboratorio> clulas de un solotio Derivan de te(idos normales o de tumores malignos !esisten #n) nGmero de ases Tienen un nGmero variable de cromosomas7 1eteroloides

Ejemplos:

Clulas ?ero #rin de mono verde aricano). ? enterovirus,C-8 #tambin de te(ido normal de rin de mono) los adenovirus " los ? los adenovirus " los?

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Deteccin vricaDeteccin vrica e incuba a :=-:KB C> or un erodo de 1asta 8; das

romedio. e observa al microscoio a las 9;> ;L> K91s " luego 9

veces or semana. e usan cultivos celulares no inoculados ara control

" comaracin.

$l virus se uede detectar mediante el eectocitoatolgico #$C*)

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Cuando los virus no roducen eecto cito&tico> seuede recurrir a tcnicas 2ue onen en evidencia laresencia de a2uel en el cultivo.

8. Intererencia ?iral

$(emlo7 ?irus de la rubeola inter5ere con $C* lticode los ec1ovirus.

9. *roduccin de 1emaglutinina

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II.8. Mtodos directos7II.8. Mtodos directos7

b). Deteccin de antgenos Tcnicasb). Deteccin de antgenos Tcnicasinmunolgicasinmunolgicas

-- InmunofuorescenciaInmunofuorescencia

directadirecta

@6?$!A IM$+$ De"Ei

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InmunouorescenciaInmunouorescencia

$s una rueba de diagnstico serolgico 2ue tiene dosvariedades rinciales7

a) Inmunofuorescencia directa (IF) alicadaundamentalmente a la deteccin de antgenos en unamuestra clnica.

b) Inmunofuorescencia indirecta (IFI) alicada a ladeteccin de anticueros esec5cos en el suero del

aciente rente a un determinado antgeno o a ladeteccin de un antgeno en una muestra clnica.

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InmunouorescenciaInmunouorescencia

directadirecta

rincipio:InteraccinAntgeno Anticuero

Muestras clnicas se colocansobre ortaob(etos donde se

de(an secar " 5(ar. e agregan anticueros

esec5cos marcados conisotiocianato deuorescena.

/a reaccin antgenoanticuero se visuali%a conel microscoio deuorescencia> or laaaricin de uorescencia

de color verde man%ana.

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Alicaciones7 Diagnostico r&ido7 inecciones virales del tracto

resiratorio en nios.

Con5rmar 1alla%gos del cultivo viral $sta tcnica se sigue ara el diagnstico del virus de

inuen%a> el !?> aeras> saramin> coronavirus>AD?>

arainuen%a 8> 9> : " adenovirusN as como arasubti5car esecies virales7 ?

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I'D en adenovirus

+egativo *ositivo

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I'D en inuen%a A

+egativo *ositivoI'D en inuen%a ,

+egativo *ositivo

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I'D en $bstein- ,arr

+egativo *ositivoI'D en virus sincitial resiratorio

+egativo *ositivo

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A/M+67 A++$! '$/IA!D6 I/?A 4A!CIA

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!ADI6I+M+6$+A@67

$sta tcnica ue desarrollada or alomn A.,erson " !osal"n @aloE en 8PQH aradeterminar la concentracin de insulina en ellasma sanguneo. *or ese motivo> !. @aloErecibi el +obel de Medicina en 8PKK #,ersonmuri en 8PK9).

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!ADI6I+M+6$+A@67

$sta tcnica se utili%a ara detectar !cuanti"car sustancias 2ue seencuentran en cantidades mu" e2ueas" me%cladas con muc1as otras. $s or

tanto una tcnica mu! sensible ! mu!espec"ca. tili%ando anticueros degran a5nidad se ueden detectar 1astaico gramos de antgeno. #8 g R 8H-89

g).

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!ADI6I+M+6$+A@67

/ a rueba es con suero de un aciente con un virus SF

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!ADI6I+M+6$+A@67

e basa en la cometencia 2ue se establece> araunirse a anticueros esec5cos> entre lasustancia a cuanti5car " cantidades conocidas dela misma sustancia marcada con un istoo. Al

establecerse esta competicin resulta 2ue ama"or cantidad de sustancia a cuanti5car> menorser& la cantidad de sustancia radiactiva 2ue seune al anticuero " viceversa.

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!ADI6I+M+6$+A@67

*rueba ara determinar los antgenos de un determinado

virus

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!ADI6I+M+6$+A@67

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!ADI6I+M+6$+A@67

Inconvenientes7

*osee algunos inconvenientes 2ue derivan dela necesidad de utili%ar istoos. Adem&s desu eligrosidad " la obligatoriedad de disonerde instalaciones adecuadas ara suutili%acin> eFisten istoos 2ue tienen elinconveniente de su ronta caducidad.

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$+IM6I+M+6A+A/II

on tcnicas inmuno2umicas cuantitativasbasadas en reacciones antgenoanticuerocomo en el !IA> " siguiendo un rotocolo

eFerimental similar. /a dierencia consiste en2ue> en este caso> el marcaje se #ace conun en$ima en ve% de con un istooradiactivo.

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T$C+ICA D$

$+IM6I+M+6A+A/IITras la ormacin del comle(o antgeno-anticuero> en el momento adecuado> seaade un sustrato# sustancia sobre la 2ue

actGa una en%ima) 2ue es catali%ado or elen%ima transorm&ndose en un comuestocoloreado lo 2ue ermite la medida de laactividad en%im&tica con a"uda de un

esectrootmetro. $sta medida de la actividadnos servir& ara calcular la concentracin de lamolcula roblema #antgenos virales ).

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T$C+ICA D$

$+IM6I+M+6A+A/II$IA

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T$C+ICA D$$+IM6I+M+6A+A/IIEI% #etero&neo!e2uiere la searacin de las racciones ligada " libreresultantes de la reaccin inmunolgica. $n esta

modalidad> los reactivos son el anticuero " elantgeno marcado con el en%ima.

'undamento7 $l antgeno de la muestra roblema " el

marcado comiten or el anticuero> de orma 2uecuanto ma"or sea la cantidad de antgeno resenteen la muestra roblema> ma"or cantidad de antgenomarcado con el en%ima 2uedar& sin unirse alanticuero. $n este caso la actividad del en%ima no seanula or la unin antgeno-anticuero. e searan

los comle(os antgeno #marcado " no marcado)-anticuero> se aade el sustrato de la en%ima ara2ue se rodu%ca la reaccin en%im&tica " se mide suactividad. /a actividad ser& inversamenteroorcional a la cantidad de antgeno en la muestra.

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*!$,A D$ $/IA7$/IA #en%"me lin3ed immunosorbent assa") >

se basa en el uso de antgenos " anticueros marcados con unaen%ima > de orma 2ue los con(ugados resultantes tenganactividad tanto inmunolgica como en%im&tica.

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*!$,A D$ $/IA7

/os dierentes tios de $/IA son los 2ue seenumeran a continuacin7

$/IA Directo$/IA Indirecto$/IA s&ndEic1

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*!$,A D$ $/IA7$/IA DI!$CT6 > $/IA I+DI!$CT67

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*!$,A D$ $/IA7$/IA D$/ A+D0IC

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*!$,A D$ $/IA7

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FIJACIN DE COMPLEMENTO

Fundamento: la activacin (fijacin) del complemento por el

anticuerpo unido al antgeno hace que se generen complejos de

ataque de membrana. i el anticuerpo se une a eritrocitos!

"stos se destru#en # sobreviene hemlisis.

irve para cuantificar la cantidad de antgeno o anticuerpopresente.$uede detectar anticuerpos a concentraciones inferiores a %

ug&d'

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2 sistemas

Sistema de PRUEBA Sistema INDICADOR

uero problemantgeno especfico

*omplemento

+ritrocitos

,emolisina (c. anti

eritrocitos)

C CO O

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CEritrocitos

Ac atieritrocitos

!

!! !At"#eo

S$ero %ro&'ema Com%'emeto

S$ero %ro&'ema

(

SIN

EMLISIS

POSITI*O

CoEMLISIS

Ne#ati+o

!

C

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II.8. Mtodos directos II.8. Mtodos directos

b). Deteccin de antgenos Tcnicasb). Deteccin de antgenos Tcnicas

inmunolgicasinmunolgicas

-- 'eacciones de'eacciones deprecipitacinprecipitacin

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PRUEBA DE PRECIPITACION

-no de los primeros descubrimientos acerca de lareaccin antgenoanticuerpo fue su capacidad para darlugar a precipitados cuando se combinan en proporcionesiguales o pr/imas al punto de equivalencia.

*uando estas reacciones se llevan a cabo en geles deagarosa es posible probar diversos antgenos en una solamuestra de suero.

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Pruebas de PrecipitacinPruebas de Precipitacin

e reali0an en medios lquidos # en medios semislidos. 1ebe e/istir equivalencia entre ambos reactivos: antigeno #

anticuerpo. +n medios lquidos se me0clan ambos componentes!

dejando reposar # se formara un anillo en la interfase delos lquidos.

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2nmunodifusin en gel:

e enfrentan antgenos # anticuerpos coloc3ndolos en ho#os

o po0os circulares ad#acentes hechos en la agarosa! para quese formen lneas de precipitacin entre ellos

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2nmunodifusin radial:

$ara cuantificar se incorpora al gel cierta cantidad de de losanticuerpos correspondientes! con lo que al aplicar la muestraal ho#o # dejarla difundir libremente! se forma un precipitadocircular! en forma radial

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PRUEBAS DE PRECIPITACIONPRUEBAS DE PRECIPITACION

4+567 +/isten varias pruebas. e observan f3cilmente. 8u# 9tiles.

5o se requiere equipo costoso. $ueden ser cuali o

cuantitativas

1+4+567 $oseen baja sensibilidad..

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%&lutinacin %&lutinacin

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A4/TI+ACIV+

Involucra la interaccin Ag-Ac e resentan tres %onas7

De eFceso de antgeno De e2uivalencia De eFceso de anticuero

tili%a un antgeno particulado ?enta(as7

encillas de reali%ar +o re2uieren ningGn e2uiamiento ara su lectura on &ciles " r&idas de imlementar

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Clasi5cacin

ACTI?A *artcula aglutinante Antgeno

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Clasi5cacin

*AI?A so de una artcula aglutinante inerte

unida a un antgeno

$s necesaria una etaa e incubacin entre laartcula inerte " el Ag sensibili%ante

A4/TI+ACIV+ *AI?A

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A4/TI+ACIV+ *AI?AClasi5cacin

DI!$CTA ensibili%acin de la artcula con el Ag

!$?$!A Inmovili%acin del Ac #AcMo)

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TWT/6

Incubacin de diluciones seriadas desuero con cantidades constantes deAg.

TWT/67 Inversa de la m&Fimadilucin roductora de aglutinacinvisible.

$ecto Sro%ona

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A*/ICACI6+$

!otavirus ?aricela %oster

?$,

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b). Deteccin de antgenos Tcnicasb). Deteccin de antgenos Tcnicas

inmunolgicasinmunolgicas

In#ibicin de la In#ibicin de la%&lutinacin%&lutinacin

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D$'I+ICIV+

*ermite calcular la concentracin de Ag en unamuestra.

*asos Incubar cantidades constantes de la artcula

aglutinante sensibili%ada con el Ag de inters #Agparticulado)> con cantidades constantes " aglutinantesdel Ac eseci5co.

A esta me%cla> caa% de aglutinar> se la enrenta concantidades variables de Ag libre como cometidor.

A artir de una determinada concentracin de Ag libre>se roducir& una in1ibicin de la aglutinacin orcometicin del Ag libre or el Ac #2ue de esta manerano odr& unirse alAg particulado ara aglutinar).

I+

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I+

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I+ etc) 2ue in1ibe la aglutinacin.

/uego> determinando 2u dilucin de Aglibre resente en una muestra biolgica

roduce dic1a in1ibicin de la aglutinacin>ser& osible calcular la concentracin deAg libre en la muestra roblema.

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A*/ICACI6+$

Togavirus 'lavivirus 6rtomiFovirus *aramiFovirus #?irus de la

arainuen%a)

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eutrali$acin eutrali$acin

+$T!A/IACIV+

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+$T!A/IACIV+.D$'I+ICIV+

$s la 1abilidad 2ue osee elanticuero ara eliminar o reducirsigni5cativamente la actividad

biolgica de un antgeno.

*ueden ocurrir in vivo o in vitro.

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$$M*/6

V

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T$T D$ +$T!A/IACIV+

Caracteri%ada in vitro or la rdidade la actividad biolgica.

/lamadas reacciones deneutrali%acin7 !eaccin toFina-antitoFina

$n estudio de virus Desaaricin de la actividad cito&tica

sobre cultivos.

V

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T$T D$ +$T!A/IACIV+

e emlea en Identi5cacin Medir el ttulo de Ac esec5cos en

sueros mediante diluciones eroneutrali%acin vrica

on altamente esec5cos "

sensibles

V

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T$T D$ +$T!A/IACIV+

!$ACCI6+$ D$ *!6T$CCIV+ *roteccin activa

Caacidad vacunante de una rearacin

antignica *roteccin asiva

*oder rotector de un suero inmune

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A*/ICACI6+$

Adenovirus *oFvirus $c1ovirus *aramiFovirus ?irus de la rabia

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c). Tcnicas de ,iologa Molecularc). Tcnicas de ,iologa Molecular

*ondas de +cidos nuclicos *ondas de +cidos nuclicos

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*,D%* DE %CID,* -CLEIC,*

DE.E'/I%CI, DE %CID,*-CLEIC,* 0I'%LE* ,' *,D%*I.E.IC%

ondas de cidos 5ucleicos

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-na nueva herramienta para el diagnstico # la investigacin

'as sondas de 3cido nucleico son poderosasherramientas aportadas por la biotecnologa que se emplean

tanto en la investigacin b3sica como en el campodiagnstico.

'a posibilidad de utili0arlas con el fin de detectar diversosagentes patgenos! sea en el ser humano! en plantas o

animales! #a ha tenido importantes repercusioneseconmicas.

1efinicin

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Fragmentos de 3cidos nucleicos ADN ARN

8arcados con alg9n elemento que les permite revelar medianteuna se;al su presencia

$uede cumplir su tarea como sonda debido a que tiene la

capacidad de unirse a fragmentos complementarioseventualmente presentes en la muestra que se desea anali0ar

'a estructura de los 3cidos nucleicos nos llevar3 a comprenderhasta qu" punto es inherente a ellos el unirse a un complemento.

cidos 5ucleicos

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bases nitrogenadas

Fosfato

a09car(1eso/irribosa! ribosa)

Una determinada secuencia slo ser reconocida por otra complementaria

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+l uso de las sondas se basa en el descubrimiento (d"cada del >?)

es posible hibridar 3cidos nucleicos en funcin de la complementariedad de sussecuencias

de nucletidos


'a doble cadena del 15ha sido abierta

(desnaturali0ada)

la sonda se va uniendo por reconocimiento de las bases complementarias.

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%ctualmente es posible e1traersecuencias espec"cas de un2ra&mento de %D por medio de las

endonucleasas de restriccin3 Lue&oestas secuencias e1tradas4 se puedendesnaturali$ar ! marcar !a sea conuna en$ima o con un istopo

radioactivo3 % estas cadenas marcadas! 5ue tienen una secuencia conocidase llaman sondas de +cidos nucleicos3

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*!6C$6 D$

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*!6C$6 D$

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Es un ensa!o de #ibridacinmolecular con una sonda marcada3Las #ibridaciones pueden ser: D%

D%4 '%'% ! '%D%3rimero se trata a muestras conreactivos 5ue solubili$an !desnaturali$an los +cidos nucleicos3

osteriormente se a6ade un D%marcado4 complementario del D%del virus ! se incuba en condicionespara 5ue se produ$ca la #ibridacin

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%7LI*I* ELEC.',F,'8.IC,%7LI*I* ELEC.',F,'8.IC,DELDEL %D 9 LF'%D 9 LF'

%7LI*I* ELEC.',F,'8.IC, DEL

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%7LI*I* ELEC.',F,'8.IC, DEL%D

9 LF' e ueden distinguir ceas esec5cas de microorganismosa artir de su AD+ o A!+> o or los ragmentos de AD+

endonucleasas de restriccin

esec5casreconocen secuencias concretas de AD+#estr.alindrmica)

escinden el AD+ en dierentes sitios

ragmentos de dierenteslongitudes.

atacado

%7LI*I* ELEC.',F,'8.IC, DEL

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%D9 LF' /os ragmentos de AD+ o A!+ de dierentes tamaos

o estructuras se ueden distinguir or su movilidadelectroortica en un gel de agarosa o oliacrilamida.

-tilidad: *or e(emlo> ara distinguir las distintas ceas del

?

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II. *rinciales TcnicasII. *rinciales TcnicasII.8. Mtodos directos II.8. Mtodos directos


C' C'

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'eaccin en Cadena de

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eacc e Cade a dela olimerasa Constitu"e una de las tcnicas m&s modernas de

an&lisis gentico ensibilidad tan alta 2ue uede amli5car 8 Gnica

molcula de D+A " 8 sola coia de genes uede ser

eFtrada %mpli"cacin de secuencias espec"cas del D%

E -E *E ;%*%< utili%acin de secuencias cortas de nuclet. sintt.

*!IM$! -E *E -*%< en%ima> Ta2 ol deoFinucletidos triosatos tamones

'eaccin en Cadena de

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la olimerasa e sinteti%a as una cadena simle de D+A>

comlemt. " alineada a cX Yrimer S $l roceso se reite #de 9H a ;H) con el 5n de

amli5car la secuencia del AD+ original demanera eFonencial. e uede amli5car unmilln de veces en unas ocas 1oras

erie reetida de ciclos 7: asos b&sicos7

=3 Desnaturali$acindel AD+ doble cadena>3 %coplamiento de los rimers

?3 Elon&acin del rimers.

C' :

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C' :

-tilidad

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-tilidad

$secialmente Gtil ara detectarsecuencias de virus latentes eintegrados #retrovirus> virus del1eres> ailomavirus" otros virusde AD+)

.cnica C'.I

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.cnica C'.I

e utili%a la TI de los retrovirus convertir elA!+ vrico o el A!+ mensa(ero en AD+

8PP: 7 se emlearon secuencias de 1antaviruscomo cebadores ara la *C!-TI

/a C' a tiempo real se concibi con el 5n decuanti5car la cantidad de AD+ o A!+ resente en

una muestra tras su conversin a AD+ or la TI. cuanto Z sea la cantidad de AD+ resente en una

muestra>Z ser& la velocidad de sntesis de nuevo AD+

-tilidad

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-tilidad

Cuanti5car el nGmero de genomas del?I< resente en la sangre de un aciente

al evaluar el desarrollo de la enermedad "la e5cacia de los &rmacos antivricos.

%n+lisis con %D de

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cadena rami"cada

e emlea en la deteccin de e2ueas cantidadesde secuencias esec5cas de A!+ o AD+.

-tilidad: cuanti5car las concentraciones

lasm&ticas de A!+ del ?I ero este AD+ est&

unido a una cadena AD+ arti5cialmente rami5cada. rama7 caa% de iniciar una seal detectable durante la rueba

se amli5ca la seal de la muestra inicial.

En resumen

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En resumen33

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/E.,D,* IDI'EC.,*

*ALENCIA *AR,AS Es'" A#$st"

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METODOS IDIRE!TOS Son "os #ue reconocen "a respuesta

in$une %&u$ora" o ce"u"ar' por parte de"&u(sped)

Se identi*icaDeteccin de ,c espec-*icos anti.ira"es)

T(cnicas in$uno"/icas

In$uno*"orescencia Indirecta %I0I' En1i$oin$unoana"isis Indirecto %EI,' 2estern 3"ot %23'

Produccin de ,c in-vitro

IM4O05ORES!E!I,

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IM4O05ORES!E!I,IDIRE!T, %I0I' 04D,METO

Mo"(cu"as irradiadas con ener/-a e"ectro$a/n(ticade "on/itud de onda adecuada6 e$iten radiacin de"on/itud de onda caracter-stica per$itiendo su

cuanti*icacin 7 054ORO!ROMO !ada *"uorocro$o tiene un espectro de e$isin y

e8citacin caracter-sticos 4nin de ,nti9I/G %$arcado con un *"urocro$o' con

I/G a "a .e1 unido a un ,/ especi*ico)

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4TI5I:,!IO ;irus de "a in*"uen1a , y 36 Parain*"uen1a 6

,deno.irus entre otros

PRO!EDIMIETO Incubar e" ,/ con un ,c espec-*ico en uncubreob?etos)

,@adir anti9,c $arcado con e" *"uorocro$o

%isotiocianato de *"uoresce-na' 4na nue.a incubacin y un "a.ado ;isua"i1acin en un $icroscopio con "A$para

u"tra.io"eta)

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*resencia de anticueros en el citolasma " suer5cie de las clulas inectadas

E:IMOIM4O,,5ISIS

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E:IMOIM4O,,5ISISIDIRE!TO %EI,' 04D,METO

Espectro*oto$etr-a E$p"eo de en1i$as co$o $arcadores

in$uno#u-$icos #ue per$iten .a"orar "as unionesant-/eno9anticuerpo #ue se producen tras un periodode incubacin6 con "a adicin posterior de un sustrato)

Tres pie1as constantes ana"ito %ant-/eno o anticuerpo' e" con?u/ado %de ant-/eno o de anticuerpo' e" sustrato

E5IS,6 EI,6 MEI,6 EMIT

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DeteccinBcuanti*icacin de co$ponentes #ue seencuentran a $uy ba?a concentracin en "-#uidosbio"/icos)

Di.ersas c"asi*icaciones)

;enta?as $(todo .ersAti"6 re"ati.a$ente econ$ico6sensib"e y de "ectura ob?eti.a %instru$enta"')

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PRO!EDIMIETO EI, 5os ,/ .ira"es se in$o.i"i1an sobre una *ase s"ida

%es*erita6 po"icubetas para $icrotitu"acin u otros

e"e$entos de p"Astico' y se a/re/an "os sueros enestudio Se incuban6 se "a.an y se re.e"a "a reaccin ,/9,c

por e" a/re/ado de una in$uno/"obu"ina antiespeciecon?u/ada con una en1i$a

Se a/re/a un substrato apropiado para "a en1i$a) Resu"tados se pueden "eer con un espectro*ot$etro)

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2ESTER 35OT %23' 04D,METOS

E"ectro*oresis6 transporte de prote-nas ba?o "a accinde un ca$po e"(ctrico en /e"es de po"iacri"a$ida6separacin de (stas .a a depender de "a densidad de

su car/a y de su ta$a@o) Se ""e.a a cabo en presencia de beta9$ercaptoetano"y SDS %condiciones desnatura"i1antes' con e" *inro$per "os puentes disu"*uro y dar a "as prote-nas unacar/a ne/ati.a neta proporciona" a" nC$ero de

a$inoAcidos #ue "as co$ponen) 4na .e1 *ina"i1ada "a e"ectro*oresis6 "as prote-naspueden ser detectadas $ediante tincin de" /e"6 o sise desea detectar una prote-na espec-*ica$ente6$ediante estern b"ot)

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PRO!EDIMIETO Se produce en cu"ti.os ce"u"ares /randes cantidades

de .irus #ue "ue/o son tratados #u-$ica$ente parasu dis/re/acin e inacti.acin) 5os ant-/enosresu"tantes de" "isado .ira" se separan pore"ectro*oresis en /e" de Po"iacri"a$ida)

Trans*erencia %b"ottin/ o e"ectrotrans*erencia' de "os,/ separados a $e$branas de nitroce"u"osa)

Se co"oca e" suero de" paciente sobre "a $e$branade nitroce"u"osa)

Se a@aden anticuerpos anti9in$uno/"obu"ina &u$anaunida a una en1i$a %pero8idasa o *os*atasa a"ca"ina'

Se a/re/a e" substrato en1i$Atico para "a.isua"i1acin de "as bandas reacti.as con un producto*ina" co"oreado)

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E"ectro*oresis

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PROD4!!I DE

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PROD4!!I DE,TI!4ERPOS I ;ITRO T(cnica nue.a 7 dia/nstico de "a in*eccin

perinata") Re.e"a "a presencia de anticuerpos anti.ira"es

producidos in vitro a partir de "os "in*ocitos 3e8tra-dos de san/re tota"6 "o #ue indicar-a #ue e"siste$a in$une de" paciente &a sido esti$u"adopor e" .irus)

5a produccin de ,c anti.ira"es in vitro pro$eteser de /ran .a"or en e" dia/nstico te$prano deni@os in*ectados por ;IF)

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*onente7 Denisse Carolina Timan& Cura"

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Microscoios electrnicos utili%an esiralesmagnticos ara dirigir un 1a% de electrones desdeun 5lamento de tungsteno a travs de una muestra" 1acia una antalla.

Muestras teidas de iones met&licos.

*ermite observar artculas vricas individuales.

$s osible observar la morologa de los virionesresentes en muestras clnicas.

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.ipos de microscopio electrnico

Microscoio de transmisin de electrones

Microscoio electrnico de barrido

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Limitaciones

@ Costo del microscoio

@ !e2uiere de ersonal eseciali%ado@ +ecesita de una alta concentracin de

viriones

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$l microscoio electrnico nos ermite> obtener resultados ositivos

r&idos de muestras de materias ecales de acientes con diarrea> "a2ue tanto los !otavirus> como los Adenovirus> Coronavirus " Calcivirusueden ser visuali%ados e identi5cados como causantes deenermedad.

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Inmunoelectromicroscopa

Agregado de anticueros esec5cos antivirales" ormacin de agregados de artculas 2ue sonm&s &cilmente visibles 2ue las artculas solas.

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*rueba diagnstica r&ida.

Mtodo de diagnstico en inecciones or

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Test de Tzanck mostrando lasclsicas clulas gigantesmultinucleadas en un frotis delesin ulcerosa genital de

paciente seropositivo parainfeccin por VIH (!!!"#.

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$ecoleccin

e reali%a el rasado de la lesin. $l rotis deber& sertomado del borde de la lesin desus de 1aber eroradola amolla.

Almacenamientoecadas al ambiente " 5(adas con alco1ol.

%ontraindicaciones

$l uso de alicadores de algodn odra rovocar la

obtencin de ocas clulas.

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&todo

/os rotis secos son 5(ados con alco1ol " luego soncoloreados or *aanicolaou> 4iemsa o 0rig1t.

'imitaciones

+o a"udan a dierenciar entre

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A la citologa cervical se le conoce tambin como test de*aanicolau or2ue se considera a *aanicolau como eladre de la citologa eFoliativa.

'rotis de *aanicolau

Detectar la ineccin or ailomavirus.

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.oma de lamuestra

se toma una muestrade clulas del eiteliodel cuello uterino "se eFtienden en unal&mina de vidrio 2uees la 2ue se coloreacon *aanicolaou.

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Colorantes empleados: $Fisten variassoluciones de *aanicolau> ero todas sonvariantes de los siguientes colorantes

$A:Q) +aran(a 4 $osina

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$esultado de las tinciones celulares7

nGcleos---------------------en a%ulclulas acid5las------------ro(o a naran(aclulas bas5las----------verde o a%ul verdoso

clulas o ragmentos de te(ido imregnadosde sangre----------naran(a o naran(a verdoso

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$n los rotis de *aanicolau se uede detectar laineccin or ailoma virus or la resencia de

clulas eiteliales escamosas coilocticas#citolasma vacuolado)> las cuales tienen ormaredondeada " aarecen agruadas

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Clulas normales

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"tendido crvico vaginal (/apanicolaou# con signos de infeccin por papiloma virusumano (H/V# (coilocitosis#.

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MC

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