centro medico nacional siglo xxi
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CENTRO MEDICO NACIONAL SIGLO XXI
HOSPITAL DE ESPECIALIDADES LABORATORIO DE INVESTIGACION MEDICA EN BlOQUlMlCA
INFORME FINAL
DE
SERVICIO SOCIAL
C-B S
UNIVERSIDAD AUTONOMA METROPOLITANA
MEXICO D.F. A 20 DE OCTUBRE DE 1995
AGRADECIMIENTOS
DR. J.J. HICKS
Q. ALFONSO VELÁZQUEZ
BIOL. RAFAEL MEDINA
Q.F.I. YOLANDA VARGAS A.
Q. MARIPAZ REYNA FREGOSO
MUY ESPECIALMENTE AL DR. ALBERTO GUZMAN GRENFELL POR SU AYUDA, SUS CONSEJOS Y SU VALIOSO APOYO DE PRINCIPIO A FIN DE LA REALIZAC16N DE ESTE PROYECTO.
GRACIAS
ING. ROBERTO ESPINOSA GONZÁLEZ
/ El descubrimiento de que las células de mamífero generan oxido nítrico (NO), previamente
considerado como un contaminante atmosférico, esta proviendo de información importante
acerca de varios procesos biológicos que incluye relajación de musculo liso, inhibición de la
agregación plaquetaria, neurotransmisión, regulación inmune y erección peneana.
Las rutas bioquimicas en estos procesos tienen 2 puntos en común: la síntesis enzimática de NO
a partir de L-arginina y la formación de un complejo hierro-nitrosilo en una proteina acarreadora
para evocar la respuesta funcional.
El monóxido de nitrógeno es generado enzimaticamente en vertebrados por una familia de
enzimas llamadas NO-sintasas, las cuales, son homologas a la citocromo-p450 reductasa, la
enzima contiene el complejo Fe-protoporfirina, probablemente con cisteina como ligando axial al
ion férrico, la enzima tiene como cofactores a el NADPH, FAD,FLM,tetrahidro bioptulina y tioles,
dos moléculas de 0 2 insertan un par de átomos de oxígeno a el sustrato (arginina), se piensa que
existen varios intermediarios para luego llegar a NO y citrulina (4).
La química del oxido nítrico incluye a varias formas redox interrelacionadas: el cation
nitrosonium(NO+), oxido nítrico (NO.) y el anión nitroxilo (NO-) ( 1 1 ) .
El oxido nitrico es un gas incoloro que se disuelve en H z 0 y en ausencia de 0 2 es muy estable.
En el aire, el oxido nítrico reacciona rápidamente con el oxigeno para formar bióxido de nitrógeno,
un gas pardo capaz de inducir daño a tejidos.
Desde el punto de vista biológico las reacciones importantes del NO son aquellas que se dan con
el oxígeno y varias de sus formas redox y con iones de metales de transición, además el oxido
nítrico también puede participar en reacciones con otros radicales libres.
La reacción de el NO con 0 2 en fase acuosa es un proceso complicado de segundo orden.
El oxido nítrico tambien reacciona rápidamente con el anión superóxido (Oz-) en solución acuosa
produciéndose peroxinitrito (OONO-). Forma complejos con algunos iones de metales de
transición, incluyendo aquellos regularmente encontrados en metalproteinas. Las reacciones con
proteínas que contienen grupo hem0 han sido ampliamente estudiadas, particularmente el caso
de la hemoglobina. La constante de velocidad para acoplamiento y liberación de NO para Fe(ll)-
hemoglobina es de 5 a 6 ordenes de magnitud mayor que para el 0 2 ( 1 1 ) , lo que permite que el
N O pueda ser administrado por inhalación.
El complejo Fe(lll)NO- parece explicar una reacción de transferencia para formar Fe(lf)NO+, con
subsecuente perdida de NO+ por ataque en un ambiente nucléofilo.
En el contexto de la química del NO+ cada complejo metal-nitrosilo actúa como agente nitrosante
-transfiere NO+ a substratos ricos en electrones-, Los complejos son susceptibles de ataque por
electrófilos, además la conversión de NO a NO- es realizada por iones Fe(l1) y por el Fe(1l)
contenido en metaloenzimas, as1 la nitrosilación por metales provee una linea atravez de los
estados redox del N0.(3).
La química del NO+ es caracterizada por reacciones de adición y sustitución con nucleofilos
como bases ricas en electrones y compuestos aromáticos.
La nitrosilacion en fase acuosa puede ocurrir en -S, -N,-O y -C en moléculas orgánicas y parece
involucrar NO+. Hay abundante evidencia química para la existencia de NO+ en medio acuoso
bajo condiciones ácidas.
La relevancia biológica del NO+ bajo condiciones k idas y fisiológicas ha sido discutida hasta
ahora. Sin embargo una variedad de nitrosocompuestos se forman efectivamente bajo
condiciones neutras fisiológicas. Ejemplos importantes de algunos compuestos son los metal-
nitrosilo,nitrosotioles(RS-NO),nitrosaminas(RO-NO) ,alquil y arilnitritos (RO-NO) y di,tri,y
tetraoxidos de nitrógeno (N203,N204) (4).
La forma en que el NO es liberado de las celulas ha sido muy discutida. El EDRF (factor relajante
derivado de endotelio) es el mayor contenedor de NO junto con los nitrosocompuestos de vida
corta como los S-nitrosotioles, la cinetica de asociacibn y disociación de estas mokcuias retiene
o libera NO, por lo que se ha visto que pueden actuar como acarreadores o almacén biológico de
oxido nítrico, recientemente se han considerado al NO- y los complejos hierro-nitrosilo.
El estado redox del NO influye en su reactividad con diferentes grupos funcionales, esto es
ejemplificado en el caso de la hemoglobina, que reacciona con NO.para inactivarlo (NO) y entre
la forma redox alternativa del NO (NO+) con aminas intermoleculares y el NO+ y NO- con grupos
sulfidrilos ( 1 1 ) .
(‘ La forma predominante en plasma sanguíneo de los monóxidos de nitrógeno son los S-
nitrosotioles(RS-NO) donde R S es un grupo tilo, en su mayoría como S-nitrosoproteinas. De
estas proteínas S-nitrosiladas, la mas abundante es la albúmina serica, presente en
concentraciones micromolares en sujetos normales ( 1 O).
lmplicita en la estabilidad de los S-nitrosotioles es la relativamente baja reactividad del NO en
esta forma con 0 2 y especies reactivas de oxigeno, limitdndose la generación de NO tóxico, asi la
formación de RS-NO puede proveer de un control de toxicidad de NO. Ademas este “almacen” de
NO puede servir para facilitar el transporte, prolongar su vida media en sangre y tejidos entregar
NO a efectores específicos y mitigar el potencial citotoxico adverso (4),
La ación vasodepresora de los nitritos y nitratos orgdnicos se conoce desde hace alrededor de 30
años. Incluso un compuesto nitroso inorgdnico (nitroferricianida), se ha empleado
esporddicamente como droga hipotensiva por cerca de 50 años(l1).
La síntesis de NO por el endotelio vascular es responsable para el tono vascular que a su vez es
esencial para la regulación de la presión arterial. El oxido nítrico es generado a partir deí
aminoácido arginina, esta enzima es dependiente en calcio y calmodulina y libera picomoles de
oxido nítrico en respuesta a la estimularon por un receptor.
La identificación de un inhibidor competitivo de esta enzima, la N-monometil-L-arginina,provee
una ruta importante para investigar la relevancia del oxido nítrico en procesos biológicos, pues
este compuesto, es un potente vasoconstrictor (4).
Se ha descubierto también que el oxido nítrico liberado de terminales no adrenergicas y no
colinergicas puede contribuir a la regulación del flujo sanguíneo y la presión arterial.
A pesar del uso clínico extenso de estos Nitrovasodilatadores en el tratamiento de angina, fallas
cardiacas agudas y emergencia hipertensiva, sus mecanismos de acción resultan inciertos.
Un avance importante sobre los mecanismos de acción vasodilatadora del GTN (gliceriltrinitrato)
fue realizado por Needleman et. ak(1973). Estas investigaciones concluyeron que la relajación
de vena aorta precontraida, fue dependiente de la presencia en el tejido de grupos -SH. En
efecto, una disminución en la determinación del contenido de grupos -SH en el tejido resulto en
un decremento en la magnitud de la relajación por este nitrito orgánico y una repetida exposición
a grandes concentraciones del fgrmaco causo marcada reducción de los grupos -SH en el tejido y
tolerancia a la respuesta de la droga.
Estudios adicionales sugieren que la relajación vascular de musculo liso por acción directa de
grupos espasmoliticos requieren la presencia de grupos -SH.
La evidencia de que el GMPc debe estar incluido en el efecto relajante de musculo liso por ciertos
compuestos nitrogenados fue sugerido en 1975, cuando los relajantes de musculo liso como
asida de sodio, hidroxilamina y NaN02, fueron reportados por elevar los niveles de GMPc en
tejidos además de activar a la guanilato ciclasa bajo condiciones especificas.
Otras investigaciones reportaron que el nitroprusiato, GTN, NaN02 y otros agentes relacionados
elevan los niveles de GMPc en ciertos tejidos lisos vasculares y no vasculares. Estudios
posteriores relacionaron el NO gas y sustancias que contienen o liberan NO, estimulan la
formación de GMPc y fueron relajantes potentes de musculo vascular liso. De hecho, ciertos
análogos del GMPc relajaron arterias coronarias precontraidas de bovino y musculo liso no
vascular (8).
Los anteriores reportes apoyan la opinión de que el GMPc puede estar involucrado en la
relajación de arterias coronarías.
'Subsecuentes experimentos han revelado que el NO reacción con una variedad de tioles para
formar S-nitrosotioles estables, los cuales son activadores potentes de la guanilato ciclasa. Estos
descubrimientos ponen de manifiesto que los S-nitrosotioles pueden ser los responsables, al
menos en parte, de la activación de la guanilato ciclasa por medio de NO, Nitroprusiato, GTN.
Atravez de varios reportes (7,lO) se ha demostrado que la formación de S-nitrosotioles se lleva
mejor a pH ácido, aunque existen reportes (3) que muestran la formación de S-nitrosocisteina
incluso a pH 7, a partir de cisteina y nitroprusiato de sodio.
Una característica de los S-nitrosotioles es tener una banda de absorción alrededor de los 320
nm y otra de menor magnitud alrededor de los 540 nm, mientras que sus tioles correspondientes
no son detectables a esta longitud de onda (1,8).
La estabilidad de los S-nitosotoles en solución varia marcadamente dependiendo de la
temperatura, pH y de la presencia de oxigeno. La estabilidad Máxima fue observada de O a 4
grados centígrados en ausencia de oxigeno, mientras que la minima ocurrió a 37 grados en
presencia de oxigeno y la minima a 87 grados en presencia de oxigeno. La S-Nitrosocisteina y la
S-Nitrosoacetilpenicilamina fueron los mas estables de los S-Nitrosotioles estudiados, la
estabilidad de ambos fue mayor a pH 7.4 sin embargo a pH 8 sus estabilidades tuvieron un
decremento muy significativo. Un estudio mas reciente (6) se realizo buscando encontrar
tionitritos mas estables en base a la influencia de sustituciones en los carbonos a y I3 sobre la
estabilidad del enlace S-NO. El tionitrito mas estable fue el S-nitroso mercaptoetanol (ON-S-
C H Z H z O H ) , con una vida media de 44 horas.
Estudios realizados en plasma de conejo revelaron que la concentración de S-nitrosotioles tiene
un orden de magnitud 3 o 4 veces mas grande que la del NO, además se encontró que la fracción
de S-nitrosotioles esta compuesta en su mayoria por S-nitrosoalbumina serica, lo que sugirió la
hipótesis de que la proteína plasmatica sirva como reservorio de NO en las células endoteliales.
Finalmente se ha demostrado que los niveles de S-Nitrosoalbumina serica disminuyen al
realizarse la inhibición de la producción de oxido nitrico y conjuntamente se incrementa la presión
media de la sangre (8).
Otro estudio realizado por lgnarro et. al. (1980) en gatos anestesiados mostró que los
vasodilatadores que contienen NO reaccionan con la cisteina para formar S-Nitrosocisteina, que
es un activador en potencia de la guanilato ciclasa, estimula la acumulación de GMPc, relaja el
musculo vascular liso y disminuye la presión arterial. Estas observaciones son interpretadas
como una evidencia del efecto relajante (sobre el rnusculo vascular liso) de nitratos y nitritos
orgimicos, NaN02, nitroprusiato y NO puede ser atribuida a la formacidn en el musculo liso de
intermediarios activos y estables: los S-nitrosotioles.
CELULA VASCULAR LISA
EXTRACELULAR INTRACELULAR
R-SNO - ____) R-SNO
NO - -NO
M.B.
GMPc
NO - -NO
(CNp-FeNO - NO H+ I
R"SH fR-SS-R' 1 R-ON02 - R-ON02 D N02 + R-OH
CATECOLAMINAS
t ESTERES DE COLINA - R-//- NO2-
CANALES Can+
BLOQUEADORES
El descubrimiento de que las células cerebelares de rata, al ser estimuladas con N-metil-D-
aspartato,un agonista para un receptor especifico a glutamato, libera un factor relajante junto con
una oxido nítrico sintasa constitutiva en tejido cerebral de rata, estableció la existencia de la ruta
L-arginina oxido nítrico en el sistema nervioso central. El incremento en GMPc causado por la
estimulación al receptor es aumentada por L-arginina y bloqueada por inhibidores de la oxido
nítrico sintasa (ONS),confirmando que el NO esta realmente en los mecanismos de transdución
de la actividad neuronal inducida por glutamato para este receptor. La ONS ha sido detectada en
varias concentraciones en todas las Areas del cerebro animal y humano (4).
Evidencias acumuladas indican que el NO juega un papel importante en la formación de memoria.
In vitro, después de la estimulación a un receptor especifico, el NO es liberado de una fuente
postsinaptica para actuar presinapticamente sobre una o mas neuronas en alguna dirección. Esto
conduce a un posterior incremento en la liberación de glutamato y como resultado se establece
un incremento en transmisiones sinapticas, un fenómeno conocido como long-term-potentiation,
asociado a la formación de memoria. Otros experimentos en animales también sugieren que el
NO esta inmerso en memoria, porque la inhibición de la shtesis de NO en vivo daña el
comportamiento puede tener un rol fisiológico en la visión, comportamiento alimenticio, y
olfactación (4).
Los macrofagos activados sintetizan nitrito y nitrato. Esta generación es dependiente de L-
arginina, es inhibida por ciertos andlogos de la L-arginina y es responsable para la citotoxicidad
de aquellas células tumorales y bacterias. Después de que la generación de NO por L-arginina
fue demostrada, el intermediario en la síntesis de óxidos de nitrógeno por macrofagos también
probo ser NO.
Las bases bioquímicas para la citotoxicidad inducida por NO depende de la combinación de NO
con el hierro contenido en enzimas del ciclo respiratorio y de la sintesis de ADN en las c6lulas
blanco. La ruta L-arginina-NO en macrofagos constituye un mecanismo primario de defensa
contra cClulas tumorales y microorganismos intra y extracelulares.
Hace mas de un siglo, Fehleisen mostró que la resistencia al cáncer podia ser aumentada de
manera no especifica por productos bacterianos. Este fenómeno ha sido asociado a activación de
macrofagos. Evidencias posteriores sugieren que esa inmunidad no especifica esta asociada con
la inducción de la oxido nítrico sintasa (ONS). Si este es el caso, la inmunidad no especifica
dependiente de oxido nítrico es un fenómeno general que incluye no solo el sistema
reticuloendotelial, sino también a hepatocitos, musculo vascular liso y endotelio vascular, en los
cuales la ONS ha sido detectada.(4). El NO puede jugar un papel importante en daño a tejidos,
por lo que puede ser citostatico y citotoxico no solo para microorganismos invasores sino también
para la célula que lo produce y para células vecinas (4).
Un proceso biológico en el que participa el NO es la inhibición de la agregación plaquetaria,en
procesos in vitro la agregometria plaquetaria se ha utilizado extensamente en la investigación de
este proceso. La adición de un agonista de las plaquetas a una suspención de plaquetas en
movimiento conduce a la formación de agregados plaquetarios y a un incremento en la
transmisión de luz atravez de de la suspención opalescente de plaquetas. La adrenalina, la
colagena, la trombina y el ADP son cuatro agentes agregativos o agonistas bien caracterizados
(14).
El oxido nítrico inhibe la agregación plaquetaria por un mecanismo dependiente de GMPc,
sinergico con prostaciclina, que inhibe la agregación de plaquetas por incremento de su
concentracidn de AMPc, a diferencia de la prostaciclina, el oxido nítrico tambih inhibe la
adhesión de las plaquetas. Ademhs, las plaquetas mismas generan oxido nítrico, que actúa como
un mecanismo fed-back negativo para inhibir la activación de las plaquetas. Así, la agregación
plaquetaria en vivo puede ser regulado por oxido nítrico derivado de plaquetas, por endotelio
vascular. Así los nitrovasodilatadores en combinación con prostaciclina o análogos pueden
proveer una útil terapia antitrombotica.
Bajo condiciones normales la concentración de oxido nítrico en sangre y plasma llega a ser muy
baja ( 1 nM ) y su reactividad en presencia de 0 2 y metales reductores es alta. Esto hace que las
determinaciones de rutina sean dificultosas por métodos estándares de análisis como
espectroscopia quimioluminecente, espectroscopia quimioluminecente. Por métodos estándares
de análisis, sin embargo, las a ser analizadas son sujetas a pretratamiento químico que incluye
discriminación de oxido nitric0 libre o de nitrógeno con altos grados de oxidación, lo que presenta
una limitación importante. La simplicidad de La electroforesis capilar de alta resolución (HPCE)
sugiere que puede ser útil para el analisis cuantitativo y cualitativo de compuestos S-Nitrosotioles
en fluidos biológicos. Jonathan S. Stamler y Joseph Loscalzo (1992) han logrado separar S-
nitrosotioles por medio de HPCE. Cisteina, Homocisteina y glutation fueron separados incluso de
sus disulfuros en amortiguador de fosfatos a pH 2,5 , detección de absorbencia a 200 nm y con
tiempos de elucion de 5.92-16.15 minutos y para S-nitrosotioles, estos fueron separados
selectivamente a 320 nm y eluidos en 2.5-18.20 minutos.
El isonometro puede proveer de una rápida, adecuada y estable determinación de oxido nítrico
sobre un amplio rango de concentraciones en solución acuosa y en mezcla de gases. Este
aparato es similar con respecto al bien conocido electrodo de Clark para oxigeno. el final de el
tubo de acero inoxidable esta cubierto con una membrana polimerica. El NO difunde atravez de la
membrana y es oxidado en el electrodo, dando como resultado un cambio en la corriente
el6ctrica. El potencial redox es proporcional a la concentración de NO en la muestra. El sensor
puede expresar el NO en la muestra como concentración (nM, VM) o como corriente redox (PA o
nA) ( 1 2).
Para determinar S-nitrosotioles estos estudios no han sido realizados en muestras biológicas, de
ahí la importancia de poder aplicar la tCcnicas de HPCE e ISO-NO-METER en muestras
biológicas
OBJETIVOS
OBJETIVO GENERAL
1 .- SINTETIZAR, CARACTERIZAR Y CUANTIFICAR S-NITROSOTIOLES DONADORES
DE OXIDO NiTRICO.
OBJETIVOS ESPECiFlCOS
1 _ - REALIZAR LA SiNTESlS DE COMPUESTOS S-NITROSOTIOLES
PROTEICOS (S-NITROSOSEROALBUMINA SERICA) Y NO PROTEICOS
(S-NITROSOCISTEINA, S-NITROSOGLUTATION Y S-NITROSO-N-ACETIL-CISTEINA). L
2.- CARACTERIZAR A LOS ANTERIORES S-NITROSOTIOLES
ESPECTROFOTOMETRICAMENTE Y SEPARARLOS MEDIANTE
CROMATOGRAFIA DE FlLTRACldN EN GEL.
3.- EVALUAR LA HIDRdLISIS DE LOS S-NITROSOTIOLES SINTETIZADOS
4.- CUANTIFICAR S-NITROSOTIOLES MEDIANTE DIAZOTACION
Y AMPEROMETRICAMENTE (ISO-NO-METER)
5.- DETERMINAR LA CONCENTRACIdN DE S-NITROSOTIOLES EN FLUIDOS
BIOLdGICOS MEDIANTE ISO-NO-METER Y HPCE
6.- MEDIR LA INHlBlCldN DE LA AGREGACldN PLAQUETARIA POR ACCldN DE LOS
S-NITROSOTIOLES.
ACTIVIDADES Y METODOLOGíA UTILIZADA
-SíNTESIS DE S-NITROSOTIOLES.
Síntesis de BSA-S-NO.
Se preparo una solución 1 mM de albúmina de suero de bovino (BSA) de Sigma, en agua
destilada , esta se mezclo con un volumen igual de solución 1 mM de nitrito de sodio (Sigma) en
HCI 0.5 M. La mezcla se mantuvo a temperatura ambiente por 30 minutos para luego colocarse
en un baño de hielo (con la finalidad de evitar o moderar su degradación).
La HSA-S-NO (S-nitrosotiol de albúmina de suero humano) fue preparada de igual manera.
Síntesis de S-nitrosottioles no proteicos
Síntesis de S-nitroso cisteina
Fue preparada una solución de 40 mM de L-cisteina (Merck) en HCI 0.5 M la misma que se
mezclo con una solución equimolecular de nitrito de sodio en agua destilada. La presencia de un
color naranja apareció instantáneamente.
de la misma manera fueron preparados los S-nitrosotioles de N-acetil-L-cisteina y glutation.
-DETERMINACIóN DE ESPECTROS DE TIOLES Y S-NITROSOTIOLES
CORRESPONDIENTES.
Los espectros para cada uno de los S-nitrosotioles, fueron determinados desde 300 hasta 600
nm. con enfoque especial a las longitudes de onda de sus bandas características , en un
espectrofotometro DU-650 (Beckman), en el caso de la BSA-S-NO se realizaron también
espectros diferenciales entre BSA y BSA-S-NO para resaltar sus diferencias.
-SEPARACIóN DE S-NITROSOTIOLES.
Para la separación de los S-nitrosotioles del medio de reacción (tiol y nitrito que no reaccionaron)
la mezcla se hizo pasar atravez de una columna empacada con sephadex G-10 (Pharmacia Fine
Chemicals) y como eluyente se empleo amortiguador de fosfatos pH 2.3 y PBS pH 7.2-7.4 para
los ensayos a pH neutro.
Otra forma empleada para eliminar el nitrito que no reacciono, fue eliminarlo con sulfamato, de
acuerdo con el metodo descrito por Saville, 1958 (7)
Para eliminar el exceso de nitrito, en el caso de los nitrosotioles proteicos , una vez mezcladas las
soluciones correspondientes se adiciono acetona (Malinckrod) a fin de precipitar la proteína
nitrosilada. Fue necesario despues volverla a lavar con acetona y centrifugar para despues
eliminar el sobrenadante y finalmente secar con Nitrógeno el precipitado.Para resuspender la
proteína se utilizo una solución de guanidina 6 M en agua destilada.
-HIDRÓLISIS DE S-NITROSOTIOLES.
Para romper el enlace entre el -NO y el -S en el S-nitrosotiol, con el fin de liberar oxido nltrico
(NO), se empleo solución de mercurio ( 1 1 ) (7), un estudio preliminar se realizo para determinar la
concentración adecuada.
-CUANTIACION DE NO AMPEROMETRICAMENTE.
Estas determinaciones fueron realizadas en un Iso-NO-Meter (World Perfect Instruments) que
posee un electrodo sensible a NO ( 1 l), se realizaron algunas determinaciones para determinar si
todos los estados de oxidoreducción del NO generaban la respuesta por parte del sensor. Las
muestras (S-nitrosotioles) se adicionaron a un pequeAo contenedor con H2S04/KI 0.1 M para
determinar la liberación de oxido nítrico con el Iso-NO-Meter.
-CUANTIACION DE NO POR DIAZOTACION.
Estas determinaciones indirectas de NO fueron realizadas de la siguiente manera:
El S-nitrosotiol se hidrolizo adicionando una solución de mercurio ( 1 1 ) al 0.9 '/O a continuacion se
adiciono HCI 0.812 M y la mezcla se coloco sobre hielo enseguida se incorporo a la mezcla ácido
sulfanilico al 0.65% en agua destilada y se dejo que transcurrieran 10 minutos, a este tiempo se
retiro la mezcla del hielo para ponerse a temperatura ambiente para inmediatamente adicionar
una alicuota de solución al 0.325% de NEDA (naftil-etilen -diamina),30 minutos fueron necesarios
para que el color desarrollado se estabilizara y los ensayos realizados se leyeron a 543 nm para
determinar su absorbencia.
-PREPARACIóN DE OXIHEMOGLOBINA.
La preparacion de la oxihemoglobina se realizo a partir de metahemoglobina (Sigma). Se disolvib
la metahemoglobina en agua previamente gasificada con oxigeno a -5 grados centígrados y se
adiciono ditionito de sodio (Sigma), Se continuo gasificando durante 15 minutos, posteriormente
se centrifugo a 10,000 rpm durante 5 minutos, el sobrenadante se tomo para separarlo por
cromatografia de filtración en gel (Sephadex G-25), usando como eluyente amortiguador PES pH
7.3 - 7.4.
-MEDICION DEL GRADO DE INHIBICIÓN DE LA AGREGACIóN
PLAQUETARIA POR S-NITROSOTIOLES Y CAPTACIóN DE NO POR
OXIHEMOGLOBINA.
Este grupo de ensayos fueron realizados en el Area de coagulación del laboratorio de
hematologia especial.
Para determinar la inhibición de la agregación plaquetaria por S-nitrosotioles se utilizo un
agregómetro (chrono-log corp.), para el ajuste del 100 % de agregación se empleo plasma rico en
plaquetas (PRP)- (250,000 plaquetas/ml.) . Sangre obtenida previamente de pacientes normales
fue centrifugada por 5 minutos a 1500 rpm .Para ajustar el 0% de agregación se utilizo plasma
pobre en plaquetas(PPP) que se obtuvo centrifugando 25 minutos mas el PRP, como agonista,
se empleo ADP 0.1 mM. Las muestras se incubaron por 4 minutos a 37 grados centígrados con
agitación de 1100 rpm. Se utilizo PRP y solución salina inyectable (NaCI 0.9%) y ADP para el
control. Para los ensayos de S-nitrosotioles se realizo de la manera siguiente:
Grupo 1
PRP
S-nitrosotiol
sol salina
ADP
Grupo 3
PRP
oxihemoglobina
Sol. salina
ADP
Grupo 2
PRP
Metahemoglobina
sol salina
ADP
Grupo'4
PRP
S-nitrosotiol
Metahemoglobina
sol salina
ADP
Grupo 5
PRP
S-nitrosotiol
oxihemoglobina
sol salina
ADP
-CURVAS DE RECUPERACIóN PARA N02- Y VARIOS S-NITROSOTIOLES.
Para evaluar si existe interferencia del plasma sanguíneo al realizar las determinaciones por
diazotación y amperometricamente de NO , se realizaron curvas de recuperación para los
nitrosotioles y para nitrito, de la misma manera como se menciono.atras solamente que ahora
adem& se incorporo a los ensayos, plasma sanguíneo.
-DETERMINACIóN DEL VOLUMEN VACIó DE LA COLUMNA DE FILTRACIóN
EN GEL.
Para determinar el volumen vacío de la columna de filtración en gel se empleo una solución de
dextran azul (5 mg/lO ml de amortiguador de fosfatos pH 2.3, el cual se hizo pasar a traves de la
columna. Se obtuvieron fracciones de aproximadamente 1 ml. y ademas se determino el diametro
y altura de la columna.
a
RESULTADOS
SíNTESIS DE S-NITROSOTIOLES
La S-nitrosilacion de los tioles estudiados es una reacción instantánea en el caso de los tioles no
proteicos estudiados, es notoria a simple vista la aparición de un color naranja brillante, lo cual
luego puede probarse espectrofotometricarnente(ver espectros S-nitrosotioles), para el caso de la
albúmina de suero de bovino, se presenta en la gráfica 1 el curso de la reacción de S-
nitrosilacion, que como puede verse lleva mas de 3 minutos en completarse.
A continuación se presentan las fdrmulas químicas de los tioles y sus correspondientes derivados
S-nitrosotioles
1 CURSO DE LA REACCION DE S-NITROSILACION DE BSA J
0.8 --
0.7
0.6
a
0.2
15/111/95 PREVIA ELlMlNAClON DE HN02 CON NH4HS04
UIM-BIOQUIMICA GRAFICA 1
CH2-S-H CH2-S-NO
I I
N02
H + CH NH3 CH NH2
COOH COOH
L-CISTEINA S-NITROSO-CISTEINA
CH2S-H
H2NCH(CH2)2CONH L H-CONHCH2COOH
I COOH
CH2-S-NO
GLUTATION
CH2 - S -H
H2NCH(CH2)CONHCH-CONHCH2COOH
I COOH
S-NITROSOGLUTATION
CH2 - S -NO
- O=C C - NH2 - O=C - C - NH3
N02
I I H + H3C COO H3C COO
N-ACETIL-CISTEINA S-NITROSO-N-ACETIL-CISTEINA
P-S- H P - S-NO
PROTEINA (BSA,HSA) S-NITROSO-PROlEINA
ESPECTROS DE S-NITROSOTIOLES
En las siguientes paginas se muestran los espectros de los S-nitrosotioles sintetizados, dando
marcada importancia a las bandas de absorcion alrededor de 320 y 540 nm.
Date: 15!06/95 Tine: 13:04
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S-NITROS0 GLUTATION
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GLUTATION-SH
Date: 1 5 / 0 b / ? S Tine: 0?:5?
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S-NITROS0 CISTEINA
M A N DU-608 Date: 26/'03/95 Time: 14:53
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S-NITROS0 ClSTElNA
:CKMAN DU-688 Date: 20/03/95 Time: J.@: 5(d
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S-NITROS0 ClSTElNA
Date: 2 0 / 0 3 / 9 5 Time: 11:05
S-NITROSO CISTEINA Hg2'
Date: 15/06/95 Time: 12:24
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DU-600 Date: 17/03/85 Tine: 1 k 3 4
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EECKlíAN DU-bo? Date: ?3/0!;/?5
HlDROLISIS DE S-NITROS0 ALBUMINA POR Ha"
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Albúmina Serica de Bovino, 0.5mM HgCI, 1.8mM
HlDROLlSlS DE S-NITROS0 ALBUMINA POR Hg2'
+ Urea (1.86M) ! ...................................... . . ......................
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Date: 16/83/95 Time: 11:36
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MBM @U-b??
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I
S-NITROS0 BSA
DU-600 l a t e : 17/03/93 Tine: 10:46
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S-NITROS0 BSA
Date: 17/01/95 Time: 12:26
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11, I
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S-NITROSO-N-Ac-CYS
Date: 17ir!4/95 Time: 1?:28
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S-NITROSO-N-Ac-CYS
D a b : 17!04/95 Time: 12:37
I I
S-NITROSO-N-Ac-CYS pH 7.0 , Hg2'
Date: 17/04/95 Time: l1:SQ
S-NITROSO-N-Ac-CYS
SEPARACIóN DE S-NITROSOTIOLES
En la gráfica 2 se muestra un cromatograma realizado para separar albúmina de suero de bovino
-S nitrosilada de el nitrito que no reacciono, las fracciones que se colectaron fueron de 1 ml. y la
velocidad de elucion de 15 gotas I 5 min. Se determino la absorbencia de las fracciones a 3
longitudes de onda diferentes, pero muy características para S-nitrosotioles. Puede observarse
que en la fracción numero 1 1 se obtuvo un máximo en las absorbencias de las 3 longitudes de
onda evaluadas, lo cual significa que en esa fracción eluyó la BSA-S-NO, lo anterior pudo
corroborarse al hacer un barrido en el espectrofotometro.
A continuación se presentan los mecanismos de reacción determinados por Saville, 1958 para la
eliminación de nitrito por medio de una solución de sulfamato (7) .
ELlMlNAClON DEL NlTRlTO CON SULFAMATO
noL AC. NITROSO NITROSOTIOL AGUA
EL ACID0 NITROSO QUE NO REACCIONO PUEDE SER ELIMINADO CO
SULFAMATO
SULFAMATO
I
CROMATOGRAMA DE BSA-NO (SEPHADEX G-10)
O v) m a
O 5 10 15 20 25
NUMERO DE FRACCION (ml)
30
9 o z W
a
+280 nm
" 336 nm
*543 nm
1/06/95 FRACCIONES 11,12,13 DILUIDAS 1:5 PARA As A 280nm UIM-BIOQUIMICA GRAFICA 2
f CURVA DE EL IMINACION DE HN02 CON UREA 1
1
0 . 5
O b A
---"-I I O 10 20 30 4 0 50 60 70
concentraclon de urea (rnrnol/rnl)
c
UIM-BIOQUIMICA GRAFICA 3 ConcentraCion de HN03 (generado con NaN02 en solucion acida) 50 mmoles/ml.
1 7/11/95
En la grafica 3 se presenta una curva de eliminación de nitrito con sulfamato y una mas (gráfica
4) para la eliminación de nitrito con urea. La urea sin embargo no se empleo después porque
presenta interferencia en las determinaciones de NO por diazotacion.
HIDRÓLISIS DE S-NITROSOTIOLES
En la grafica 5 se aprecia la liberación de NO de la S-nitrosocisteina por parte de mercurio y zinc.
Como se observa el zinc no tiene la propiedad de hidrolizar el S-nitrosotiol, no así el mercurio ( 1 1 )
que a concentraciones mayores a 0.6 mM lo hidrolizan.
La gráfica 6 muestra la hidrólisis por mercurio de la BSA-S-NO.
Para observar la estabilidad de los S-nitrosotioles, se determino liberación de NO por parte de la
S-nitrosocisteina preparada en fresco y una muestra preparada 24 horas antes. En la gráfica 7
puede verse una marcada diferencia, lo cual coincide con reportes al respecto.
f \ [ CURVA ESTANDAR EN PRECENClA DE SULFAMATO 1
O.
o. I
E e: m o.: Ln P
a 5 o z W m a 0 0.2
m a v)
o. 1
O
O
I
o. 1 o. 2 0.3
m1 DE NaN02 40 mM
O. 4 O. 5
* SOLUCION A u SULFAMATO O. 1 %
U/M-B/OQU/M/CA
14 131 95 G RA FICA 4
0.8
0.7
0.6
E c) 0.5 C
In d
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5 0.4 o
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0.1
O
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HlDROLlSlS S-NITROSO ClSTElNA POR MERCURIO Y ZINC
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. . . . . . .
A h u
0.125 0.25 0.625 1.25 2.5 3.5
CONCENTRACION DEL METAL (mM)
17/11/95 [S-NITROS0 Cys]=40pm
UIM-BIOQUIMICA GRAFICA 5
5.0
0.2
0.1 5
0.1
0.05
O
i '1 HlDROLlSlS DE S-NITROS0 BSA POR MERCURIO
I
O 10 20 30 40 50 60
MINUTOS
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2 2 2 1 8 1
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WU EPS W Wl3N38tlOS8W
b
o a
CUANTIACION DE NO AMPEROMETRICAMENTE
En la figura siguiente puede observarse un diagrama de la determinación experimental de NO
mediante el Iso-NO-Meter:
allbration of the Instrument )
paw O
1 n Purge
O Magnetic Slirrer
I I
Iso-NO Calibration Setup
3 1 Record Ihe value of the probe current elore removing il from h e distilled water
In which the tip has been Immersed during storage.
5Jlrnrnerse the tip 01 the prohe in a strong salirle solution ( 1 M), and alter wailing a lew m M e s for the current I o stabilize rword its value. If the current is offscale er unstable after several nlitwleg ir1 solulicn, ; it Is likely that the menlbrane has hwm ' damagsd and the sleeve rlrwls to be cllsnged (rafer lo the seclion on "Changing the Membrane Sleeve").
3. Place a small smooth magnetic stirring bar into the arnher glass inr wt+:ll
El liquido contenido en el recipiente es la solucibn reductora HzS04/KI 0.1 M
Por otra parte la generación de NO a partir de nitrito puede describirse:
2NaN02 + 2 4 + 2H2S04 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2N0 + 12 + 2H20 + K2S04 + Na2 S04
y para S-nitrosotioles:
2R-S-NO + 2KI + H2S04 ________L_____________ 2NO + 12 + K2SO4 + 2R-S-H
De acuerdo con lo anterior al colcar una alicuota conteniendo S-nitrosotioles (o nitrito), en el
recipiente con la mezcla reductora, se libera NO que es permeable a la membrana del electrodo
del Iso-NO-Metro, puesto que el equipo se maneja con un software (DUO-18) en la pantalla
aparecerá el registro de NO con respecto al tiempo. En la grhfica siguiente puede verse una
curva de calibración con nitrito de sodio.
CUANTIACION DE NO POR DIAZOTACION
De acuerdo con lo reportado para la hidrolisis de S-nitrosotioles por mercurio (7 ) , el mecanismo
es el siguiente:
HlDROLlSlS DE NITROSO TIOLES CATALIZADA POR Hg 2+
R \ +
R S +=O + Hg2+ d -N=o
Hg'
11 HONO
+ H+
Febrero de 1995 Guzmán-Grenfell AM UIM-Bioquírnica CMN-Siglo XXI
HONO + NHz +
acido sulfanilico
+ N E N
+ N z N
2 Hz0
NHCH2flHg
ION DlAZONlO N-(1naftil)etilen diamin
COMPLEJO COLORIDO
El ácido nitroso, producto de la hidrolisis del S-nitrosotiol, puede formar un diazocompuesto al
reaccionar con ácido sulfanilico, en presencia de ácido:
El complejo colorido puede leerse a 543 nm de longitud de onda y así determinar NO.
INHIBICIÓN DE LA AGREGACIóN PLAQUETARIA POR S-NITROSOTIOLES
En las siguientes gráficas se muestra la actividad de los S-nitrosotioles como donadores de NO el
cual inhibe la acción del agente agregativo plaquetario, el ADP en este caso.
En la grafica 8 se observa la inhibición de la agregación plaquetaria por parte de la HSA-S-NO,
además puede verse como el por ciento de agregación disminuye cuando un compuesto con alta
afinidad por el NO como la oxihemoglobina es adicionado al adicionado al medio.
En la grhfica 9 la inhibición en la agregación es notoria y la agregación disminuye al aumentar la
concentración del S-nitrosotiol.
El efecto del S-nitrosoglutation sobre la agregación plaquetaria se ve claramente en la grAfica 10
lo mismo que la capitación del NO por parte de la oxihemoglobina, aunque la inhibición no es
totalmente revertida. Lo mismo puede verse en la gráfica 11 para S-nitrosocisteina.
En la gráfica 12 la actividad del S-nitrosoN-acetil-cisteina sobre la agregación plaquetaria queda
de manifiesto y se ve que su efecto es revertido casi en su totalidad por la oxihemoglobina y no
as1 por la metahemoglobina.
CURVAS ESTANDAR Y DE RECUPERACIóN
Las graficas que a continuación se presentan (13-23) son curvas p a t h y de recuperación para
nitrito, S-nitroso-N-Acetil-cisteina, S-nitrosoalbumina humana (HSA-S-NO) . las anteriores curvas
fueron realizadas por el método amperometrico y por diazotacion.
La sensibilidad reportada para el Iso-NO-Meter (12) es de 1.5 pNnM (r=0.999) mientras que en
los estudios realizados fue de 0.37 pAlnM, es decir una sensibilidad menor en 4 ordenes de
magnitud esto quizá debido al ajuste del aparato y las condiciones en las que se hicieron las
determinaciones.
OD
AGREGACION (%)
O h, O
P m O
OD O O
A
O O
o D
AGREGACION (%)
O P O O
cn W O
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* .- k
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i i CURVA ESTANDAR DE S-NITROSO-NAc-CYS (AMPEROMETRICA CON ISO-NO-METER)
PA 400
300
200
1 O0
O
O 0.2 0.4 0.6
CONCENTRACION (pM)
0.8 1
I
4/07/95 PROMEDIO DE 5 DETERMINACIONES
UIM-BIOQUIMICA
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(Wd) ON-WS8 N013WUN33N03
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O
O r
z O o o
C Q K LL w
- a
n
w
z
O a
COLUMNA DE FILTRACIóN EN GEL
DETERMINACIóN DEL VOLUMEN VACIó
vt = vx + vo = volumen total de la columna
r = 1.4 cm = radio de la columna
h = 25 cm = altura de la columna
vx = volumen ocupado por el soporte
vo = volumen ocupado por la fase móvil.
v t = n * r * r * h
v t = ~ * 1 . 4 c m * 1 . 5 c m * 2 5 c m
vt = 153.94 cm
vo = 1 I ml (VER GRAFICA 28 DE ELUCION DE DEXTRAN AZUL)
despejando
vx = vt - vo
vx = 153.94 - 11 (ml) = 142.94 ml
OBJETIVOS Y METAS ALCANZADAS
De acuerdo con los objetivos planteados para este proyecto, el objetivo 1 fue desarrollado y
pudieron sintetizarse los S-nitrosotioles propuestos.
En el caso del objetivo 2 este se cubrió parcialmente (espectros de S-nitrosotioles), pues para la
separacion considero que debe determinarse en que fracción eluye el nitrito.
De los objetivo 3,4,6 puedo decir que pudieron realizarse satisfactoriamente.
Hablando del objetivo 5, los experimentos finales no llegaron a realizarse, solamente se llego
hasta la realización de curvas de recuperacion para S-nitrosotioles en plasma sanguine0
humano.
Los experimentos planteados en un principio para determinar S-nitrosotioles mediante HPCE
fueron pospuestos para después.
Sin embargo espero que este trabajo pueda ser de utilidad para la realizacion de lo que restante y
para estudios posteriores dentro de este laboratorio.
CONCLUSIONES
En lo que respecta a la síntesis y determinación de espectros de los S-nitrosotioles considero que
estos experimentos fueron realizados satisfactoriamente, puesto que los resultados obtenidos
coinciden ampliamente con lo reportado. Puedo ademas comprobarse que la S-nitrosilacion de
proteína se realiza por completo alrededor de los 10 minutos de reacción y se completa después
de los 20 minutos.
La inhibición. de la agregación plaquetaria por S-nitrosotioles quedo de manifiesto por lo
reproducible de los resultados, sin embargo en todos los experimentos debiera haber sido
separado el exceso de nitrito.
En lo que se refiere a las curvas de recuperación y curvas patron los coeficientes de correlación
variaron de 0.989 a 0.999,~ todas las curvas se realizaron por quintuplicado. Por lo cual
considero que serán útiles para posteriores estudios.
La menor sensibilidad obtenida en el Iso-NO-Metro quizá debiera verse con mas detenimiento a
fin de que esta pudiera en experimentos subsecuentes ser aumentada.
RECOMENDACIONES
Considero importante sugerir la realización de los siguientes experimentos a fin de obtener los
resultados que durante el proyecto no fueron obtenidos y obtener información adicional acerca de
los S-nitrosotioles y el NO..
Para el caso de la separación del nitrito no reaccionante de los S-nitrosotioles, además de la
separación en la columna de exclusión molecular, las fracciones debieran analizarse en
presencia y ausencia de mercurio a fin de conocer mas detalles de la separación.
En lo que respecta a la hidrólisis de S-nitrosotioles seria interesante ver la influencia del hierro ylo
proteínas con grupo hemo. Existen reportes de que el No tiene alta afinidad por la
oxihemoglobina (incluso pudimos comprobarlo para S-nitrosotioles). Quizá seria importante
monitorear mas de cerca esta inactivacion.
Por supuesto es necesario continuar y determinar S-nitrosotioles en plasma sanguíneo y
evaluarlo ademas en otros fluidos biológicos.
I
BIBLIOGRAFíA
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S-nitrosothiol formation by nitrite action on sulphydryl grups. J.Agric. Food chem. , 1983,31,523-
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