ANÁLISIS DE

AZÚCARES EN

ALIMENTOS

1. INTRODUCCIÓN:

Los CH, constituyen la mayor parte de los componentes vegetales.

CH son los diferentes azúcares, almidones, celulosa, hemicelulosa, pectinas y gomas.

G-F y S; se acumulan especialmente en el jugo celular.

Almidones: son CH de reserva y se encuentran en forma de plastidios.

La Hemic. Y Pectinas; son polisacáridos (material estructural)

Gomas; productos de deshechos.

ANÁLISIS DE AZÚCARES EN ALIMENTOSANÁLISIS DE AZÚCARES EN ALIMENTOS

2. MÉTODOS DE DETERMINACIÓN

2.1. Métodos Químicos basados en la reducción del Cu

2.2. Métodos Físicos

-Polarimetría

-Refractometría

2.3. Métodos Enzimáticos

2.4. Métodos Cromatográficos

-Cromatrografía de Gases (CG)

-Cromatografía Líquida (HPLC)

CARBOHIDRATOS

Pertenecen al grupo de nutrientes

básicos

Cx(H2O)y

Polihidroxicetonas o polihidroxialdehídos y derivados.

Interés de su análisis: - Control de etiquetado

(diabéticos...)- Determinación contenido en Energía- Calidad y adulteraciones en jugos de frutas- Controlar el azúcar de

remolacha- Perfiles de fermentación- Hidrólisis del almidón...

-Monosacáridos-Oligosacáridos-Polisacáridos

Funciones:- Edulcorantes (glu, fru,sac...)- Modificadores de viscosidad- Estimulantes de insulina- Fte de E en dieta- Influencia en textura- Sabor y olor (Maillard)

Azúcares más importantes: - Monosacáridos:

- glucosa- fructosa

- Disacáridos:- sacarosa- lactosa - maltosa

Mezcla= Azúcar invertido

1.- INTRODUCCIÓN

OH

OHOH

CH2OH

OH

O

-D-glucosa

OH

OOH

CH2OH

OH

OOHOH2C

CH2OHOH

OHSacarosa

OHOH2C CH2OH

OH

OH

-D-fructosa

1.- INTRODUCCIÓN

OH

1.- INTRODUCCIÓN

Disacárido o Trisacárido Monosacáridos formados por hidrólisis

Sacarosa Glucosa y fructosa

Lactosa Glucosa y galactosa

Maltosa Glucosa (dos moléculas)

Rafinosa Galactosa, glucosa y fructosa

Melizitosa Glucosa (dos moléculas) y levulosa

Azúcar Poder Edulcorante Relativo Rotación específica (º circulares)

Lactosa 16 +52.5

Rafinosa 22 +104.0

Galactosa 32 +80.2

Ramnosa 32 +8.3

Maltosa 32 +137.0

Xilosa 40 +18.8

Glucosa 74 +52.5

Sacarosa 100 +66.5

Azúcar invertido 130 -20.1

Fructosa 173 -92.3

Reac DISOLUCIÓN DE AZÚCARES

DISOLUCIONES DE FEHLING (CuSO4 + tartrato Na/K, NaOH)

MonosacáridosAlgunos disacáridos

-C=O; -C=O = Agentes reductores

H

R-C=O [ox] R-C=O + 2H+

OH

Cu+2 + 1e- [red] Cu+ Q/OH- Cu2O (rojo ladrillo)

2.-MÉTODOS DE DETERMINACIÓN

2.1.- Métodos químicos basados en la reducción del Cu

No reductores: hidrólisis = monosacáridos.

Cu2O (rojo ladrillo

Determinación del precipitado de óxido cuproso

2.1.-Métodos químicos basados en la reducción del Cu

A) Secar y pesar directamente (si no hay precipitados, ej: Ca...)

C.2) Valoración con KI: Cu+2 + 1e- Cu+ I- + 2e- I2 (yodometría con tiosulfato)

C.1) Electrolisis del cobre: Cu+2 + 2e- Cuº (metálico)

(diferencia de lo que pesa el cátodo antes y después)

- reacción de reducción: NO-3 + 4H+ + 3e- NO + 2H2O

- reacción de oxidación: Cu+ Cu+2 + 1e-

C) Disolución de Cu2O en HNO3 (oxidante):

B) Disolución de Cu2O en Fe2(SO4)3 y valoración con KMnO4 (Mét. de Bertrand)

-Felhing A:

34,64 g CuSO4 500 mL H2O

-Felhing B:

173 g tartrato sódico potásico + 50 g NaOH 500 mL H2O

5 mL A + 5 mL B + 40 mL H2O son reducidos por 0.05 g de glucosa

a. Método de Felhing:

2.1.- Métodos químicos basados en la reducción del Cu

Procedimiento más clásico

Imprescindible operar siempre en las mismas condiciones

Concentraciones entre 0.5 y 1 %

-Felhing A:

69,278 g CuSO4 1 L H2O

-Felhing B:

346 g tartrato sódico potásico + 100 g NaOH 1 L H2O

2.1.- Métodos químicos basados en la reducción del Cu

b. Método de Lane y Eynon:

Uso de azul de metileno 1%

Se trabaja con 10 mL o con 25 mL de solución de Felhing

Tablas para 10 mL y tablas para 25 mL

Azúcar (mg / 100 mL disolución) = (Factor x 100) / Título

Título(mL de disol.

gastados)

Factor

Glucosa

Factor

Fructosa

Factor

Sacarosa

10 50 65 90

12 55 80 92

14 60 88 93

b. Método de Lane y Eynon:

2.-MÉTODOS DE DETERMINACIÓN

2.2.- Métodos físicos

a. POLARIMETRÍA

Azúcar actúa sobre la luz polarizada desviación =

f([az])

Poder rotatorio = desviación en º del plano de luz polarizada debido a la presencia de una sustancia determinada

[20D=.V/l.p

Determinación cuantitativa de sacarosa, azúcar invertido, glucosa y

fructosa

Azúcar Rotación específica (grados

circulares) Lactosa Rafinosa Galactosa Rammnosa Maltosa Xilosa Glucosa Sacarosa Azúcar invertido Fructosa

+ 52.5º + 104.0º +80.2º +8.3º

+137.0º +18.8º +52.5º +66.5º -20.0º -92.3º

2.2.- Métodos físicos

a. POLARIMETRÍA

Muy usado para el control rápido de

fábrica

Con un refractómetro se mide el índice de refracción

Los azúcares en disolución se expresan en % de sólidos solubles (Brix)

2.2.- Métodos físicos

B. REFRACTOMETRÍA

2.-MÉTODOS DE DETERMINACIÓN

2.3.- Métodos cromatográficos

Bala de gas

portador

Inyect. Horno Columna Detect

Cromatografía de Gases

CG

Cromatografía Líquida de Alta Resolución

HPLC

Ventajas:

Rápida y muy sensible

Aplicación:

Identificación y cuantificación de monosacáridos y oligosacáridos

Inconvenientes:

Transformación preliminar de los glúcidos en compuestos volátiles

Cada monosacárido suele dar numerosos picos (anómeros y , etc)

CROMATOGRAMAS COMPLEJOS

A. CROMATOGRAFÍA DE GASES

Trimetilsililación

Azúcar (no volátil) Eter trimetilsililo (volátil)

Analizable por CG con detector FID

Agentes sililantes:

- Hexametildisilazano (HMDS)- Clorotrimetilsilano (TMCS)- Piridina

2:1:10 vol/vol

R-OH + CH3 -Si-NH-Si- CH3 R-O- Si- CH3

CH3

CH3

CH3

CH3

CH3

CH3

Azúcar HMDS Eter trimetilsililo

La elección del procedimiento a emplear dependerá de:- matriz de muestras- analitos de interés- resolución requerida- presencia de sustancias interferentes- requerimientos de velocidad de análisis

Ventajas:

No requiere derivatización previa

No existe un procedimiento universal para la determinación de todos los carbohidratos por HPLC

Inconvenientes:

El detector de IR que es el más comúnmente utilizado no es específico, es sensible a cambios en la temperatura, le afecta la composición de los disolventes y por tanto no se puede trabajar con él en gradiente.

B. CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA RESOLUCIÓN (HPLC)

Desalado de la muestra:

Esquema general de la preparación de la muestra

Extracción de la grasa con disolventes orgánicos:- Eter de petróleo- Tetracloruro de carbono- Hexano

Desproteinización por extracción de la muestra:

- Mezcla de alcohol (EtOH) y agua- Etanol, HClO4 dil., seguido por acetonitrilo, 2-propanol- Agua caliente (¡ojo! con la temperatura r. de hidrólisis)

- Resinas anión / catión

- Columnas resina-base especiales- Solución TEPA en CH3CN/H2O (remedio temporal)

- Precolumnas “on-line” de intercambio iónico

PROCESO CROMATOGRÁFICOPROCESO CROMATOGRÁFICO

•INYECCIÓN: Se inyecta la muestra en la corriente de la f.m., que es un disolvente o una mezcla de disolventes

•SEPARACIÓN: Pasan a una columna que contiene la fe (líquido o sólido) adecuada para que efectúe la separación, retardando el flujo de los componentes de la muestra.

•DETECCIÓN: Los compuestos separados salen a diferentes intervalos, pasan a través de un detector, y se registran en papel, obteniéndose así el cromatograma.

TR

Area

Análisis Cualitativo

Análisis Cuantitativo

BA

S

ttrB trA

CROMATOGRAMA

ANÁLISIS CUALITATIVO

tR o t’R f(Tª, f.e., f.m., flujo,etc) pequeñas fluctuaciones en cualquiera de las condiciones experimentales da lugar a resultados erróneos

1º

BA

S

tRB tRA

P1P2

Cromatograma de los patrones

Cromatograma de la muestra

Tiempo de Retención Relativo

2ºANÁLISIS CUALITATIVO

Se reducen los errores anteriores tRA – t0 = tRS – t0

BA

S

tRB tRA

P1P2

tRS

S

SCromatograma de la muestra con la sustancia de referencia

Cromatograma de los patrones con la sustancia de referencia

ANÁLISIS CUALITATIVO

Adición del patrón a la muestra

3º

A

S

A + P

P

Cromatograma de la muestra

Cromatograma de la muestra con el patrón

tRA

A

Indice de Retención de Kovats

4ºANÁLISIS CUALITATIVO

*Muy reproducible incluso en muestras cromatografiadas en distintos cromatógrafos

tRZ+1 tRA tRZ

S

ZA

Z+1

IA = 100 z + 100

log tRA - log tRZ

log tRZ+1 - log tRZ

PROBLEMA * Analitos con el mismo tR

SOLUCIÓN * Cambiar condiciones

experimentales Cambio en los tR

ANÁLISIS CUANTITATIVO

* Altura del pico* Altura del pico * Area del pico* Area del pico

Forma de medir Áreas

* Triangulación

* Cuadratura

* Planímetro

* Recorte y pesada

* Integración Electrónica

PARÁMETROS DE MEDIDA

MÉTODOS CUANTITATIVOS

* Método del Estándar Externo

* Método del Estándar Externo

* Método del Estándar Interno

* Método del Estándar Interno

ANÁLISIS CUANTITATIVO

1ºMÉTODO DEL ESTÁNDAR EXTERNO

P4P3P2P1 M

A

Concentración de analito

P1 P2 P3 P4M

A4

A3

AMA2

A1

2º MÉTODO DEL ESTÁNDAR INTERNO

E EE E E

P4P3P2P1M

M’ P’1 P’2 P’3 P’4

P1 /E

A1 /AE

P3 /E P4 /E

Concentración de analitoConcentración de estándar

A2 /AE

A3 /AE

A4 /AE

AanalitoAestándar

M/E

P2 /E

AM /AE

*

*