Protocolo para la propagación in vitro de de Calla (Zantedeschia spp.) en Sistemas de Inmersión Temporal (SIT).

J J. E. Sánchez1, M. Daquinta2 & I. Capote2

1Universidad Técnica de Machala, Machala, El Oro, Ecuador2Centro de Bioplantas, Universidad Ciego de Ávila, Ciego de Ávila, Cuba

jacksaenz100@yahoo.com

RESUMEN: Las Callas (Zantedeschia sp) son plantas de la familia Araceae de gran interés como plantas ornamentales en maceteros y como flores de corte. El objetivo del presente trabajo fue obtener un protocolo de propagación in vitro de una variedad comercial (Treasure) de esta especie. Se evaluaron diferentes tiempos de desinfección de las yemas con bicloruro de mercurio (HgCl2) a 0,2% (m/v), distintos niveles de BAP (0, 1, 2, 3 y 4 mg/L) para el establecimiento de las yemas brotadas de los tubérculos, bajo condiciones de luz y oscuridad, así como el manejo de las explantes y diferentes concentraciones de BAP, para la proliferación de los brotes. Se evaluaron diferentes manejos realizados a esta especie, físicos, químicos y biológicos en Sistemas de Inmersión Temporal. Se logro el establecimiento in vitro a partir de yemas brotadas de los tubérculos, en medio cultivo MS (1962) con 2 mg/L de BAP en estado semisólido y condiciones de oscuridad. El BAP a distintas concentraciones, permitió la proliferación de brotes, así como las diferentes formas de cultivo. La aclimatización se realiza en un sustrato compuesto de cachaza en casa de cultivo, con riego por microaspersión. Se evaluó altura de plantas, numero de hojas y tasa de multiplicación. La tasa de multiplicación obtuvo los mejores resultados en los Sistemas de Inmersión Temporal (SIT) con una tasa del 7,9 hasta una máxima de 23,6 en los diferentes manejos que se le dio al cultivo . Es recomendable seguir con la investigación en los SIT, en lo que incluye variación somaclonal mediante técnicas de identificación molecular.

1. INTRODUCCION

Las callas son monocotiledóneas ornamentales originarias del Sur de África. Las especies de Zantedeschia (familia Araceae) y sus híbridos tienen flores con una variabilidad de colores que van desde rojo oscuro pasando por rosa, a naranja, amarillo y blanco (Funnell, 1993). Como flor cortada estas plantas son muy populares en todas partes del mundo, y una multitud de cultivares e híbridos están disponibles (Kritzinger, et al., 1998)

La propagación del género Zantedeschia se realiza a través de semillas (en programas de mejoramiento), por desgajado (permite la formación del tubérculo y separar los tallos una vez que tienen raíz) y por división del tubérculo (practicada para incrementar el número y el tamaño de la floración). Sin embargo, los cultivos con división de tubérculos, están sujetos a la infección pudrición blanda de Erwinia, la cual causa serias pérdidas (Chen et al., 2000). Este género es muy susceptible a esta bacteria que pueden causar perdidas de hasta el 100% en la plantación (Etcheverría, 2002). La literatura señala que el uso de la multiplicación in vitro permite una producción inmediata de plantas homogéneas libres de virosis (Funnell, et al. 1998).

Se han propagado callas por micropropagación convencional en el medio Murashige y Skoog (1962) con la utilización de reguladores de crecimiento, como 6-benzyladenina y tidiazuron (Chang et al., 2003) en Zantedeschia albomaculata.

Las técnicas de cultivo de tejido se han desarrollado como una vía alternativa de plantación para la producción de tubérculos de Zantedeschia aethiopica (Cohen, 1981; Clemens y Welsh, 1993; Fang et al., 1999).

El efecto positivo de los sistemas de inmersión temporal en la micropropagación de plantas se ha informado en la proliferación de meristemos, cultivo de microestacas, desarrollo de embriones a partir de callos, así como también en la germinación y conversión de embriones somáticos. Por lo general, la calidad del desarrollo de los brotes es mejor que la obtenida con el empleo de medio líquido o semi-sólido (Santos et al., 2006). Buscando una mayor propagación clonal de esta planta se evaluó el sistema de inmersión temporal como método más eficiente.

2. MATERIALES Y METODOS

2.1. Implantación de yemas

Se utilizaron yemas activadas obtenidas de tubérculos previamente aviverados, se procedió a seleccionar las yemas brotadas que tengan 1-5 cm de tallo. Se realizó una desinfección con bicloruro de mercurio a 0.25% durante 10 minutos, después del lavado con detergente comercial, y se estableció en el medio de implantación compuesto por las sales de Murashige y Skoog (1962), 1 mg/L de tiamina, 100 mg/L de mio-inositol, 30 g/L de sacarosa y 2 mg/L de BAP en la oscuridad. A las cuatro semanas se realiza el primer subcultivo. La temperatura de la cámara de penumbra es de 25±2ºC.

2.2. Multiplicación de los brotes

Los brotes con una altura de 2-3 cm se les realiza un corte longitudinal para romper la dominancia apical y los mismos quedan divididos en dos partes, en algunos casos en dependencia del tamaño de los brotes y grosor de su base (mayor de 0.5 cm de tallo y base) se pueden cortar en cuatro secciones. Las partes seccionadas se colocan en frascos convencionales en el medio MS + 1-4 mg/L BA (dependiendo de la variedad) y son transferidos a la luz. El resto de los brotes axilares pequeños se individualizan y son subcultivados en el mismo medio de cultivo. Se evaluaron tres formas de cultivo (Sistema de Inmersión Temporal (SIT), Semi-sólido y Líquido en movimiento). A los 28 días se evaluó el coeficiente de multiplicación.

2.2.1 Experimento 1: Evaluación del efecto de la forma de cultivo en el coeficiente de multiplicación y calidad de los brotes de tres variedades comerciales de Callas.

Se subcultivaron brotes de Callas (Treasure) en un medio MS con la adición de 1-4 mg/L BAP en diferentes formas de cultivo, semi-sólido, líquido en movimiento y en Sistemas de Inmersión Temporal (SIT). Se utilizaron cinco explantes por frasco y tres repeticiones por tratamiento. La inmersión temporal es una nueva técnica de cultivo in vitro y consiste en la inmersión de los explantes en el medio de cultivo durante un período de tiempo corto (4 minutos) y después el medio regresa para el frasco de reserva de medio de cultivo, esta operación se repitió cada tres horas, durante cuatro semanas.

2.2.2 Experimento 2: Evaluación de la frecuencia de inmersión en el coeficiente de multiplicación y calidad de los brotes de la Calla variedad Treasure.

Se subcultivaron brotes de Treasure en un medio MS con la adición de 4 mg/L BAP en (SIT). Se utilizaron cinco explantes por frasco y tres repeticiones por tratamiento. Se probaron tres frecuencias de inmersión de los explantes, cada 3, 4 y 6 horas en el medio de cultivo durante un período de tiempo de tres minutos y después el medio regresa para el frasco de reserva de medio de cultivo, esta operación se repitió durante cuatro semanas.

2.2.3 Experimento 3: Evaluación del efecto del Paclobutrazol (PBZ) en el coeficiente de multiplicación y calidad de los brotes de Calla variedad Treasure en SIT.

En este experimento se evaluó el efecto de diferentes concentraciones de PBZ en el coeficiente de multiplicación y la calidad de los brotes a la mejor frecuencia de inmersión determinada en el experimento anterior. Se utilizaron cinco explantes por frasco y tres repeticiones por tratamiento. Se probaron tres concentraciones de PBZ, 0.0, 0,30 y 0,6 mg/L en el medio de cultivo, esta experimento duro cuatro semanas.

2.2.4 Experimento 4: Evaluación del efecto del GA3 en la elongación de los brotes de Calla variedad Treasure en SIT.

Este experimento tuvo como objetivo evaluar el efecto del GA3 en la elongación de los brotes proliferados con la mejor concentración de PBZ del experimento anterior y a la mejor frecuencia de inmersión determinada anteriormente. Se utilizaron cinco explantes por frasco y tres repeticiones por tratamiento. Se probaron tres concentraciones de GA3, 0.0, 0,50 y 1,0 mg/L en el medio de cultivo, esta experimento duro cuatro semanas.

2.2.5 Experimento 5: Evaluación del efecto de distintos sustratos en la aclimatización de vitroplantas de Calla variedad Treasure propagadas en SIT

Para el desarrollo de este experimento se emplearon brotes de Zantedeschia variedad Treasure de 3 a 4 cm de altura con al menos una raíz. Al finalizar la fase de elongación todos los brotes se agruparon y se clasificaron en competentes (brotes de 3 a 4 cm de longitud) y no competentes (menores de 3 cm de longitud), solo pasaron a la fase de aclimatización los brotes competentes. Se evaluaron tres tipos de sustratos: Zeolita, Zeolita + Cachaza (1:1) y Cachaza.

3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

3.1. Evaluación del efecto de la forma de cultivo en el coeficiente de multiplicación y calidad de los brotes de Zantedeschia var. Treasure.

En la tabla 1 se observa el comportamiento de la variedad Treasure en cuanto al número de hojas por brote, altura y coeficiente de multiplicación en dependencia de la forma de cultivo. En los Sistemas de Inmersión Temporal se obtuvo coeficientes de multiplicación de 7,93 con diferencias significativas con respecto al medio de cultivo semisólido y líquido en movimiento.

En altura y número de hojas no existieron diferencias significativas con respecto al medio semi-sólido y liquido en movimiento.

Tabla 1. Comportamiento del numero de hojas por brote, altura de los brotes y coeficiente de multiplicación de Calla variedad Treasure en diferentes formas de cultivo.

Forma de cultivo # de hojas/brote Altura (cm) Coeficiente Multiplicación

Semi-sólido 1,91 2,53 3,63 b

Líquido en movimiento 1,86 3,33 3,96 b

SIT 1,90 2,29 7,93 a

*Medias con letras iguales no difieren (KW, C Dunnett, p>0.05)

Las técnicas de cultivo in vitro han sido muy utilizadas en las Aráceas con el objetivo de la adquisición de conocimiento sobre la fisiología del cultivo entre ellos el estudio de los requerimientos nutricionales, la producción endógena de reguladores del crecimiento y otros aspectos del desarrollo de estas plantas. Las respuestas morfogenéticas de los explantes ante las propiedades físicas del medio de cultivo se relaciona con el potencial hídrico (osmótico y matricial) y es indicativo de la disponibilidad de agua que tienen las plantas en el cultivo in vitro (Debergh et al., 1981; George, 1996).

La efectividad de la técnica de inmersión temporal en el aumento de la proliferación y calidad de los brotes ha sido demostrada en otras especies de plantas (Etienne y Berthouly, 2002). También el empleo de esta técnica ha sido efectivo en la proliferación de Aráceas ornamentales (Daquinta et al.; 2007)

Dentro de las ventajas que ofrece esta técnica, el estrecho contacto del medio de cultivo con los explantes durante cada inmersión, estimula y facilita una forma más eficiente de suministro de los nutrientes y reguladores del crecimiento, en comparación con el cultivo en medio convencional (Etienne y Berthouly, 2002).

3.2. Evaluación de la frecuencia de inmersión en el coeficiente de multiplicación y calidad de los brotes de la Calla variedad Treasure.

En la tabla 2 se observa el comportamiento de la variedad Treasure en cuanto al número de hojas por brote, altura y coeficiente de multiplicación en dependencia de la frecuencia de inmersión. Aunque no hubo diferencia significativa en el número de hojas por brotes y la altura, en el coeficiente de multiplicación si se observo; con una frecuencia de inmersión realizada cada 4 horas se obtuvo un promedio de 12,53 este es superior en 1,2 al obtenido con la frecuencia de inmersión con que se inicio la investigación y 2,0 mayor que la otra variante de este experimento. En el cultivo en inmersión temporal, la frecuencia de inmersión es uno de los factores que tiene mayor incidencia en la respuesta morfogenética de los explantes ya que es el proceso mediante el cual los mismos se ponen en contacto con el medio de cultivo líquido y de esa forma se toman los nutrientes, se logra la aireación e intercambio gaseoso del vaso de cultivo y se regula el nivel de hiperhidricidad de los brotes.

Tabla 2. Comportamiento del numero de hojas por brote, altura de los brotes y coeficiente de multiplicación de Calla variedad Treasure en diferentes frecuencias de inmersión.

Frecuencia de inmersión # de hojas/brote Altura (cm) Coeficiente Multiplicación

Cada 3 horas 1,75 1,98 11,30 b

Cada 4 horas 1,59 1,69 12,53 a

Cada 6 horas 1,9 2,29 9,30 c

*Medias con letras iguales no difieren (KW, C Dunnett, p>0.05)

En el cultivo en inmersión temporal, la frecuencia de inmersión es uno de los factores que tiene mayor incidencia en la respuesta morfogenética de los explantes ya que es el proceso mediante el cual los mismos se ponen en contacto con el medio de cultivo líquido y de esa forma se toman los nutrientes y reguladores del crecimiento, se logra la aireación e intercambio gaseoso del vaso de cultivo y se regula el nivel de hiperhidricidad de los brotes (Rademacher, 2000). La eficacia de la inmersión temporal radica en que en esta técnica se combinan la ventilación de los tejidos de las plantas y el contacto intermitente entre la superficie del tejido y el medio líquido (Etienne y Berthouly, 2002) lo cual favorece la tasa de multiplicación. Bajo las condiciones que se experimentaron se logra aumentar la tasa de proliferación de brotes en SIT, al igual que los obtenidos en bromelias y otras aráceas por Daquinta et al., (2001, 2007) respectivamente.

3.3. Evaluación del efecto del Paclobutrazol (PBZ) en el coeficiente de multiplicación y calidad de los brotes de Calla variedad Treasure en SIT.

En la tabla 3 se observa el comportamiento de la variedad Treasure en cuanto al número de hojas por brote, altura y coeficiente de multiplicación en dependencia de la concentración de PBZ presente en el medio de cultivo. Hubo diferencia significativa en el número de hojas por brotes, altura y coeficiente de multiplicación; los mejores resultados en coeficiente de multiplicación se obtuvieron con 0,3 mg/L de PBZ con un promedio de 15,7 brotes por explante, este es superior en 8,3 frente al testigo y 6,3 mayor que 0,6 mg/L de PBZ.

Tabla 3. Comportamiento del numero de hojas por brote, altura de los brotes y coeficiente de multiplicación de Calla variedad Treasure en presencia de diferentes concentraciones de Paclobutrazol (PBZ) en el medio de cultivo.

Dosis de PBZ # de hojas/brote Altura (cm) Coeficiente Multiplicación

0,0 mg/L 1,93 a 1,67 a 7,40 c

0,3 mg/L 1,52 ab 0,88 b 15,70 a

0,6 mg/L 1,38 b 0,60 b 9,60 b

*Medias con letras iguales no difieren (KW, ANOVA, C Dunnett, p>0.05)

Los retardantes del crecimiento tales como el PBZ, bloquean la biosíntesis de las giberelinas a través de la inhibición competitiva de las enzima P450 mono-oxigenasa, la cual cataliza las reacciones de oxidación que conducen a la formación del ent-kaurenoico a partir del ent-kaureno (Rademacher, 2000). Por lo que la diferencias observadas en la altura del explante se justifica por la presencia o no del PBZ.

Un fuerte efecto sinérgico del BAP y PBZ sobre la multiplicación y la longitud de los brotes de Spathiphyllum floribundum fue observado por Werbrouck y Debergh (1996). La combinación de BAP con PBZ presentó un efecto sinérgico sobre la proliferación y crecimiento de los brotes de Zantedeschia. Un fuerte sinergismo fue observado en el tratamiento que incluye 4 mg.L-1 de BAP como base y 0,3 mg.L-1 de PBZ, en relación al número de brotes.

Tefera y Wannkrairoj (2006) encontraron que la adición de PBZ al medio de cultivo tiene un efecto considerable. Continúan señalando que este retardante del crecimiento a 3 mg.L-1

produjo el mayor número de brotes y peso seco en las plántulas de Aframomum corrorima (Braun) Cansen. El uso combinado de citoquininas y PBZ en el medio de cultivo tiene un efecto sinérgico sobre el número y longitud de los brotes, así como en la masa seca de las plantas concluyen estos autores. Recientemente Ziv (2008) logró incrementos en el numero de cluster meristemáticos de Ornithogalum dubium Hout con el empleo de 0,7 mg.L-1 de PBZ conjuntamente con las citoquininas.

3.4. Evaluación del efecto del GA3 en la elongación de los brotes de Calla variedad Treasure en SIT.

En la tabla 4 se observa el comportamiento de la variedad Treasure en cuanto al número de hojas por brote, altura y coeficiente de multiplicación en dependencia de la concentración de GA3 presente en el medio de cultivo. Hubo diferencia significativa en altura y coeficiente de multiplicación; los mejores resultados en coeficiente de multiplicación y altura del brote se obtuvieron con 0,5 mg/L de GA3 con un promedio de 15,8 brotes por explante, superior en 3,6 en cuanto a la altura del testigo y 2,92 mayor a la dosis de GA3 mayor que se probo; se observo un incremento de 3,6 en coeficiente de multiplicación frente al testigo y no se obtuvo diferencia significativa frente a la otra dosis de GA3. Al duplicar la concentración de GA3, se produjo una reducción considerable en la altura de los brotes, este nivel de regulador del crecimiento puede ser toxico.

Tabla 4. Comportamiento del numero de hojas por brote, altura de los brotes y coeficiente de multiplicación de Calla variedad Treasure en presencia de diferentes concentraciones de Acido Giberélico (GA3) en el medio de cultivo.

Dosis de GA3 # de hojas/brote Altura (cm) Coeficiente Multiplicación

0,0 mg/L 1,50 1,30 c 12,20 b

0,5 mg/L 1,40 4,90 a 15,80 a

1,0 mg/L 1,37 1,98 b 14,97 b

*Medias con letras iguales no difieren (KW, ANOVA, C Dunnett, p>0.05)

Una de las funciones más importantes de las giberelinas en la promoción del crecimiento es la inducción de la división celular en el meristemo apical. En las plantas en roseta, la aplicación exógena de GA3 incrementa el tamaño de la región meristemática y aumenta la proporción de células que entran en división celular (Salisbury y Ross, 1992).

Cuando el GA3 es adicionado a los medios de cultivo de plantas, este frecuentemente

produce efectos similares a las auxinas. Los brotes que reciben el efecto del GA3 incrementan la longitud. En muchas plantas, el uso de giberelinas en el medio de cultivo de brotes no es favorable ya que produce brotes elongados con hojas muy estrechas (George, 1993).

3.5. Evaluación de diferentes tipos de sustratos en la supervivencia de vitroplantas de Calla variedad Treasure propagadas en SIT durante la aclimatización.

En la Tabla 5 se muestran los porcentajes de supervivencia de las plantas de Zantedeschia durante los 28 días de crecimiento en la fase de aclimatización. A partir de los catorce días comienza a declinar este indicador y los niveles más bajos de supervivencia se presentaron al final de la evaluación a los 28 días. En todas las evaluaciones se encontraron diferencias significativas entre la supervivencia de las plantas en los distintos tipos de sustratos usados. Los porcentajes más bajos (32,5 %) lo presentaron las plantas que se adaptaron en una mezcla de Zeolita y Cachaza a partes iguales.

Tabla 5. Efecto de distintos tipos de sustratos en la supervivencia de vitroplantas de Zantedeschia spp. variedad Treasure propagadas en SIT durante la aclimatización.

Sustrato

Supervivencia (%)

7 días 14 días 28 días

Zeolita 95 a 65 b 52,5 b

Zeolita + Cachaza 85 b 47,5 c 32,5 c

Cachaza 97,5 a 97,5 a 85 a

E. T. 1,926 7,328 7,661

En el sustrato cachaza la retención de humedad es mayor, por lo que favorece la supervivencia de este tipo de planta. Hay que recordar que las Zantedeschia (familia Araceae) son muy exigente al agua y es frecuente la eliminación del riego cuando se desea detener el crecimiento de esta planta para la conservación de sus tubérculos. (Dekker, 2008).

Por otra parte, Rahman et al (2004, b) observaron que el 85% de las plantas de Kaempferia galanga, pueden ser establecidas bajo condiciones ex vitro cuando fueron transferidos a potes conteniendo una mezcla de suelo y abono orgánico.

Las plantas de Zingiber officinale aclimatizadas in vitro bajo alta humedad relativa y ambientes enriquecidos con CO2 crecen vigorosamente y se adaptan rápidamente a las condiciones ex vitro, resultando entre 90-100 % de supervivencia de las plantas al transplante (Cha-um et al., 2005). Evaluar estas condiciones de aclimatización in vitro en las plantas de Zantedeschia, sería muy interesante para trabajos futuros.

Las vitroplantas de Zantedeschia en este estudio no mostraron un comportamiento recalcitrante en la fase de aclimatización, siempre y cuando se garantizaron condiciones de alta humedad ambiental y una buena porosidad del sustrato con cachaza.

En la figura 1 se presenta el protocolo para la propagación in vitro de la Zantedeschia spp. var. Treasure. A partir de tubérculos seleccionados se colectaron las yemas brotadas. En el establecimiento in vitro se realizó una desinfección de los brotes con Bicloruro de Mercurio al 0,2% durante 10 minutos y se establece en el medio de cultivo MS (1962) suplementado con 4 mg.L-1 de BAP (Daquinta, 2008). A partir de los brotes obtenidos se comienza la multiplicación

en los Sistemas de Inmersión Temporal, con una frecuencia de inmersión cada 4 horas y un volumen de medio de 40 mL/explante, utilizando brotes seccionados en el medio de cultivo MS (1962) enriquecido con 4 mg.L-1 de BAP y 0,3 mg.L-1 de PBZ.

Figura 1. Protocolo propuesto para la propagación in vitro de la Zantedeschia spp. var. Treasure en Sistemas de Inmersión Temporal.

Una vez alcanzada la multiplicación de los brotes son transferidos para el medio de cultivo MS (1962) suplementado con 0,5 mg.L-1 de GA3 para su elongación y crecimiento de los brotes, bajo estas condiciones se logra el enraizamiento de los brotes. Los brotes elongados y enraizados son trasferidos para un sustrato compuesto de cachaza bajo condiciones de umbráculo (sarán) y un sistema de riego por microjet. A los 60 días las plántulas son trasferidas a bolsas de polietileno con una mezcla de suelo rojo y cachaza (1:1).

4. CONCLUSIONES

1. Se logró establecer un protocolo de propagación in vitro de Zantedeschia en Sistemas de Inmersión Temporal con mayor coeficiente de multiplicación. y calidad de los brotes en comparación con los métodos convencionales. El estudio de algunos factores que influyen

en los Sistemas de Inmersión Temporal permitió mejorar la respuesta de estas variables.

2. El empleo de frecuencias de inmersión intermedias (cada 4 horas), es decir seis inmersiones por día, en la multiplicación de brotes de Zantedeschia en SIT permitió un incremento en las tasas de multiplicación y calidad de los brotes.

3. Se comprobó el efecto sinérgico que presenta el Paclobutrazol con las citoquininas (BAP) en la estimulación de los brotes axilares. El sinergismo observado fue mayor en la menor concentración empleada del inhibidor del crecimiento.

4. Se logró incrementar el coeficiente de multiplicación de la Zantedeschia con el subcultivo en ácido Giberélico durante 28 días. Siendo la menor concentración utilizada del estimulador del crecimiento la de mayor incidencia sobre el coeficiente de multiplicación y la altura de los brotes, no sucediendo así en el número de hojas.

5. El volumen de medio de cultivo se presentó como una variable con una marcada incidencia en el coeficiente de multiplicación, aunque en el número de hojas y altura de los brotes de Zantedeschia no tuvo una notable influencia.

6. El seccionado de los brotes individuales de Zantedeschia previo al cultivo en el SIT aumentó la brotación axilar. Los brotes seccionados fueron los que dieron el mejor coeficiente de multiplicación.

7. En el proceso de aclimatización de las plantas de Zantedeschia provenientes de SIT, la cachaza resultó el sustrato de mejor comportamiento en la supervivencia de las plántulas.

5. REFERENCIASAlvard, D.; Cote, F.; Teisson, C. 1993. Comparison of methods of liquid medium cultures for banana

micropropagation. Effect of temporary immersion of explants. Plant Cell, Tissue and Organ Culture 32: 55-60.

Chang H.; Chakrabarty D.; Hahn E.; Paek; K. 2003. Micropropagaction of Calla Lily (Zantedeschia albomaculata) via in vitro shoot tip proliferation. In Vitro Cellular and Development Biology - Plant. 36:129-134.

Cha-um, S.; Tuan, N.; Phummakong, K.; Kirdimanee, C. 2005. The ex vitro survival and growth of Ginger (Zingiber officinale Roscoe) Influence by in vitro acclimatization under high relative humidity and CO2 enrichment conditions. Asian Journal of Plant Sciences. 4 (2): 109-116.

Clemens, J.; Welsh, T. 1993. An overview of the New Zealand calla industry, research direction and year round tuber production. Acta Horticulturae 337:161-316.

Cohen, D.1981. Micropropagation of Zantedeschia hybrids. Combined Proc. Int. Plant Pro. Soc. 31:312-316.

Daquinta, M.; Espinosa, P.; Escalona M.; Rodríguez R, Guerra M. 2001. Bromeliad micropropagation in Temporary Inmersion System. Journal of the Bromeliad Society.51 (2):80-85.

Daquinta, M.; Mosqueda, O.; Gonzalez, M. T.; Benega, R.; Texeira da Silva, J. A. (2007). Shoot Proliferation of Caladium x hortulanum in a Temporary Immersion System. Floriculture and Ornamental Biotechnology. 1(1): 70-72.

Daquinta, M. 2008. Instructivo Técnico para la micropropagación de Zantedeschia. Centro de Bioplantas. 6 p.

Debergh P.; Harbaooui, Y.; Lemeur. 1981. Mass propagation of globe artichoke (Cynara scolymus) evaluation of different hypotheses to overcome vitrification wtih special reference to water potential. Physiology Plant. 53: 181–187.

Dekker, F. 2008. Comunicación personal. Iribov B. V. Holanda.Etienne, H.; Berthouly, M. 2002. Temporary immersion systems in plant micropropagation. Plant Cell

Tiss. Org. Cult. 69: 215–231.Fang, W. L. ; Xiong, L. ; Qu, Y. H.; Qu, S. P. 1999. Tissue culture of colored common calla lily. J. South

West Agricultural University. 21:423-426.George, E. F. 1996. Plant propagation by tissue culture. Part 1. 2da Edition. Exergetics 1.Kritzinger, E.; Cansen Van Vuuren, R.; Wood-War, B.; Rong, I.; Spreeth, M.; and Slabbert, M. 1998.

Elimination of external and internal contaminants in rhizomes of Zantedeschia aethiopica with

commercial fungicides and antibiotics. Plant Cell, Tissue and Organ Culture 52: 61-65.Murashige, T. y Skoog F. 1962. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue

culture. Physiologia Plantarum.15:473-487.Rademacher, W. 2000.Growth retardants: Effects on Giberellins biosynthesis and Other Metabolic

Pathways.Rahman, M.; Amin, M.; Ahamed, T.; Ali, M.; Habib, A. 2004. Efficient plant regeneration through

somatic embryogenesis from leaf base-derived Callus of Kaempferia galanga L. Asian Journal of Plant Sciences 3 (6): 675-678.

Ruffoni, B. y M. Savona. 2005. The temporary immersion system (TIS) for the improvement of micropropagation of ornamentals plants. Acta Horticulturae 683: 445-453.

Salisbury, F. B.; Ross, W. 1992. Photosynthesis: Environmental an Agricultural Aspects. Plant Physiology. Fourth edition. Pp 257.

Santos, R.; González-Olmedo, J.; De Feria M.; Cornide, M.; Torres, W. 2006. Biotecnología Vegetal. En colectivo de autores (eds.). Las Investigaciones Agropecuarias en Cuba, cien años después. La Habana, Cuba. Ed. Científico-Técnica, pp 207-221.

Tefera, W. y Wannakrairoj, S. (2006). Synergistic effects of some plant growth regulators on in vitro shoot proliferation of korarima (Aframomun corrorima (Braun) Jansen). African Journal of Biotechnology. 5(10): 1894-1901 pp.

Teisson, C. y Alvard, D. 1995. A new concept of plant in vitro cultivation liquid médium: Temporary Immersion. In: M Terzi, R Cella, A Falavigna (eds). Current Issues in Plant Molecular and Cellular Biology. Pp 105-109 Kluwer Academic Publishers.

Werbrouck, S., Debergh, P. 1996. Imidazole fungicides and paclobutrazol enhance cytokinin-induced adventitious shoot proliferation in Araceae. Journal Plant Growth Regulator. 15:81-85.

Ziv, M. (2008). Paclobutrazol and Xantahn Gum involvement in proliferation and stress response of Ornithogalum dubium Houtt bud clusters cultutred in bioreactors. Propagation of Ornamental Plants. 8(1): 28-32