apuntes tema 8_metabolismo oxidativo (1)
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Bioquímica. Carmen Martínez URJC Metabolismo oxidativo
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Tema 8. Oxidación del piruvato y ciclo de los ácidos tricarboxílicos. Transporte electrónico mitocondrial y fosforilación oxidativa.
� Aspectos generales del metabolismo respiratorio aerobio. Organización estructural de la
mitocondria y sus implicaciones metabólicas.
� Descarboxilación oxidativa del piruvato a acetil-CoA por el complejo multienzimático de la
piruvato deshidrogenasa. Enzimas y coenzimas participantes. Mecanismo de acción. Regulación.
� Ciclo de los ácidos tricarboxílicos. • Estrategia de la ruta. Reacciones y enzimas que intervienen. Balance global y
rendimiento energético. Regulación.
• Papel central y anfibólico del ciclo de los ácidos tricarboxílicos en el metabolismo
degradativo y biosintético.
• Reacciones anapleróticas para la reposición de metabolitos del ciclo de los ácidos
tricarboxílicos usados con fines biosínteticos.
� Cadena respiratoria transportadora de electrones. • Visión global de las reacciones redox a favor de caídas de potencial. Termodinámica del
transporte electrónico. Reoxidación de los coenzimas NADH y FADH2. Eficiencia del
transporte electrónico.
• Transportadores electrónicos, la lógica de su secuencia en la cadena respiratoria.
Potenciales redox de los distintos componentes.
• Descripción molecular de los distintos complejos, constitución proteica, grupos
prostéticos, iones y tipos de transferencia electrónica que llevan a cabo. Rutas
propuestas de transporte electrónico (grupos implicados) y bombeo de protones.
� Complejo I: NADH-ubiquinona reductasa.
� Complejo II: Succinato-ubiquinona reductasa.
� Complejo III: Ubiquinona-citocromo c reductasa.
� Complejo IV: Citocromo c oxidasa.
• Determinación de la secuencia de los transportadores electrónicos respiratorios.
Inhibidores respiratorios.
• Sistemas de transporte de poder reductor a través de la membrana interna mitocondrial:
lanzaderas metabólicas.
� Fosforilación oxidativa: • Síntesis de ATP acoplada al transporte electrónico mitocondrial. La relación P/O,
eficiencia de la fosforilación oxidativa.
• Mecanismo de la fosforilación oxidativa: hipótesis quimiosmótica de Mitchell.
Generación de un gradiente electroquímico de protones (∆µH).
• El complejo ATP sintasa: subunidades. Mecanismo de síntesis de ATP. Inhibidores de
la ATP sintasa.
• Desacoplamiento de la fosforilación oxidativa. Función fisiológica del desacoplamiento:
termogénesis. Control respiratorio.
• Utilización de la energía del transporte electrónico en procesos distintos a la síntesis de
ATP.
Bibliografía
Lehninger AL, Nelson DL y Cox MM (1993) Principios de Bioquímica. Caps.16 y19 Mathews CK y van Holde KE (1998) Bioquímica, Caps.14 y 15. Stryer L (1995) Bioquímica. Caps. 20 y 21. Voet D, Voet JG y Pratt CW (2007) Fundamentos de Bioquímica. Caps. 16 y 17.
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Tema 8. Oxidación del piruvato y ciclo de los ácidos tricarboxílicos. Transporte electrónico mitocondrial y fosforilación oxidativa.
En el tema anterior se vio cómo el piruvato, en condiciones anaeróbicas, es
reducido a lactato en células animales. En presencia de O2 el piruvato va a ser oxidado
completamente a CO2 y H2O. Los electrones liberados durante los múltiples pasos de
oxidación se transfieren a coenzimas (en su forma oxidada), principalmente NAD+,
generándose así transportadores electrónicos reducidos, NADH. Estos transportadores
se reoxidan posteriormente en la cadena respiratoria mitocondrial (de transporte de
electrones). Tales reacciones aportan la energía que impulsa la síntesis de ATP a
través de la fosforilación oxidativa.
Así pues, en condiciones aeróbicas el piruvato entra en la mitocondria y es
convertido en acetil-CoA (el coenzima A activa y transfiere grupos acilo). Esta
constituye la primera etapa de la respiración (la respiración mitocondrial se puede
considerar dividida en tres etapas). En una segunda etapa los dos átomos de carbono
del acetil-CoA se oxidan a CO2 en el ciclo de Krebs, generándose transportadores
electrónicos reducidos. La cadena de transporte electrónico y la fosforilación oxidativa
constituyen la tercera y última etapa.
El ciclo de Krebs está considerado como la ruta central del metabolismo aeróbico: es la ruta oxidativa central de la respiración, proceso mediante el cual se
catabolizan todos los combustibles metabólicos (hidratos de carbono, lípidos y
proteínas) en los organismos y tejidos aerobios. Además, el ciclo de Krebs es una
fuente importante de intermediarios de rutas biosintéticas y, acoplado a la fosforilación
oxidativa, la principal fuente de energía metabólica.
El ciclo de Krebs se llama así en honor de su descubridor (Hans Krebs).
También recibe el nombre de ciclo del ácido tricarboxílico (TCA), puesto que se
identificó a partir de los ácidos tricarboxílicos que actúan como intermediarios. O
también ciclo del ácido cítrico, dado que el citrato es un intermediario clave de esta
secuencia de reacciones.
El ciclo de Krebs consta de 8 reacciones catalizadas enzimáticamente y
transcurre en la matriz mitocondrial de células eucariotas. Básicamente, consiste en lo
siguiente: el grupo acetilo del acetil CoA se transfiere a un ácido orgánico de 4 C, el
OAA, para dar un ácido tricarboxílico de 6 C, el citrato. El citrato entra en una serie de
reacciones durante las cuales se liberan 2 C en forma de CO2 y los 4 C restantes se
regeneran en forma de OAA, que puede iniciar de nuevo el proceso. De ahí la
naturaleza cíclica de la ruta: el OAA está presente al inicio, para reaccionar con un
fragmento de 2 C activado, y está presente al final, después de que se hayan oxidado 2
C hasta CO2. De las ocho reacciones del ciclo, cuatro son deshidrogenaciones, que
generan 3 NADH y 1 FADH2.
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MITOCONDRIA: estructura, compartimentación y función.
Las mitocondrias son orgánulos del tamaño de una bacteria que se encuentran
en el citoplasma de todas las células eucariotas aeróbicas. Son los centros de la
respiración celular y donde tiene lugar la mayor parte de la producción de energía en
forma de ATP, para cubrir todas las necesidades celulares.
La mitocondria está limitada por dos membranas altamente especializadas, con
propiedades y funciones biológicas distintas. La membrana externa es permeable a
moléculas de bajo peso molecular (menor de 10000). La membrana interna, por el
contrario, es prácticamente impermeable a sustancias polares e iónicas. Estas
sustancias entran en la mitocondria únicamente por la mediación de proteínas
transportadoras específicas. Los complejos proteicos de la cadena respiratoria
transportadora de electrones están localizados en la membrana mitocondrial interna,
igual que la enzima que sintetiza ATP: la ATP sintasa.
La membrana interna mitocondrial está replegada en numerosas crestas que
aumentan considerablemente su superficie total.
El espacio entre las membranas externa e interna se conoce como el espacio
intermembrana. Como la membrana externa mitocondrial es permeable a moléculas
pequeñas, este espacio tiene prácticamente la misma composición iónica que el citosol.
La región limitada por la membrana interna es la matriz mitocondrial. La matriz
contiene una mezcla altamente concentrada de cientos de enzimas diferentes,
incluídas las necesarias para la oxidación del piruvato y de los ácidos grasos y para el
ciclo de Krebs. También posee varias copias idénticas del genoma de DNA
mitocondrial, ribosomas mitocondriales especiales y varias enzimas necesarias para la
expresión de los genes mitocondriales. La mitocondria no es, sin embargo,
genéticamente autónoma, y los genes que codifican para la mayoría de las proteínas
mitocondriales están en el DNA nuclear.
Complejo multienzimático de la piruvato deshidrogenasa (PDH)
El piruvato procedente de la oxidación de los hidratos de carbono es tan sólo
uno de los principales suministradores de acetil CoA para la oxidación en el ciclo de
Krebs. La degradación de las grasas, mediante la β-oxidación de los ácidos grasos, y
algunas rutas del catabolismo de los aminoácidos también generan acetil CoA.
Antes de entrar en el ciclo de Krebs el piruvato ha de sufrir una descarboxilación
oxidativa para formar acetil CoA. Esta reacción está catalizada por un complejo
multienzimático denominado piruvato deshidrogenasa (PDH), que está localizado en la
matriz mitocondrial. Puesto que la glucólisis transcurre en el citoplasma, el piruvato
tiene que entrar al interior de la mitocondria, y lo hace gracias a un transportador
específico que existe en la membrana interna mitocondrial.
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En la reacción global catalizada por la PDH el grupo carboxilo del piruvato se
pierde como CO2, mientras que los dos carbonos restantes forman la porción acetilo
del acetil CoA.
Pyr + NAD+ + CoA-SH → Acetil CoA + NADH + CO2 ∆Gº’= - 33.5 kJ/mol
La reacción es altamente exergónica e, in vivo, es básicamente irreversible.
La PDH es un complejo multienzimático formado por 3 enzimas diferentes:
E1 Piruvato deshidrogenasa (PDH)
E2 Dihidrolipoil transacetilasa (DLT)
E3 Dihidrolipoil deshidrogenasa (DLDH)
Y por 5 coenzimas, 3 de los cuales están unidos a las enzimas y no aparecen en la
reacción ajustada:
E1-TPP (pirofosfato de tiamina)
E2-ácido lipoico
E3-FAD
Y los 2 restantes sí aparecen en la reacción ajustada:
CoA-SH
NADH
Veamos ahora cómo actúan todos estos componentes de manera conjunta para
producir la conversión del piruvato en acetil CoA. En la figura se muestra la secuencia
de reacciones.
1) Descarboxilación E1
Pyr + TPP hidroxietil-TPP + CO2
En una primera etapa el enzima PDH (E1), con la participación de TPP,
descarboxila el piruvato. El pirofosfato de tiamina (TPP) es el coenzima para
todas las descarboxilaciones de los α-cetoácidos. El mecanismo de esta
reacción es semejante al de la pyr descarboxilasa (en la fermentación
alcohólica). El átomo de carbono en posición 2 del anillo de tiazol del TPP
reacciona con el grupo carbonilo del piruvato para dar CO2 y un derivado
hidroxietil unido al TPP.
2) El derivado hidroxietil origina tras esta segunda reacción el grupo acetilo del
acetil-CoA. El ácido lipoico se une covalentemente, mediante enlace amida, a un
residuo de lisina de la DLT, formando un grupo lipoil-lisilo que actúa como un
largo “brazo” que oscila entre la PDH y la DLDH. En primer lugar el grupo
hidroxietil se transfiere a la lipoamida (unida a DLT) y se oxida simultáneamente
a grupo acetilo, en tanto que la lipoamida se reduce a su forma ditiol.
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S E1 S-acetil
Hidroxietil-TPP + Lip TPP + Lip
S SH
3) A continuación la DLT (E2) (una transferasa de grupos acetilo) transfiere el grupo
acetilo al grupo tiol del CoA, formándose acetil CoA, que ya puede entrar en el
ciclo de Krebs para ser oxidado.
S-acetil E2 SH
Lip + CoA-SH acetil CoA + Lip
SH SH
4) La lipoamida se vuelve a oxidar a expensas de la tercera enzima del complejo, la
DLDH (E3), para completar el ciclo. Transfiere los electrones al coenzima FAD
(unido a DLDH).
SH E3 S
Lip + FAD Lip + FADH2
SH S
5) El FADH2 producido en esta reacción es entonces reoxidado por el NAD+
generando NADH, que junto con el acetil CoA y el CO2 son los productos finales
de la reacción del complejo PDH.
E3
FADH2 + NAD+ FAD + NADH + H
+
El complejo PDH de eucariotas, con un peso molecular superior a los 8 millones,
contiene múltiples copias de cada una de las actividades enzimáticas E1, E2 y E3, así
como pequeñas cantidades de dos enzimas reguladoras: PDH quinasa y PDH
fosfatasa.
Regulación de PDH
La regulación de la oxidación del piruvato por el complejo PDH es un punto
fundamental de la regulación del metabolismo de los hidratos de carbono. De ahí que la
PDH esté sometida a distintos tipos de regulación.
La actividad de este complejo está controlada por una modulación alostérica y
por una modificación covalente que se controla, a su vez, por el estado energético de la
célula.
E2 (DLT) y E3 (DLDH) están reguladas alostéricamente:
• E2 se inhibe por acetil CoA y se activa por coenzima A libre.
• E3 se inhibe por ATP y NADH y se activa por AMP y NAD+
Así pues, la actividad de la PDH está coordinada con la carga energética, la
relación NAD+/NADH y la relación entre la forma de coenzima A acetilada y libre.
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El estado energético neto de la célula influye directamente en la producción de
acetil CoA: cuando el nivel energético de la célula es bajo, el piruvato es oxidado por
PDH en la mitocondria, pero según aumenta el nivel energético de la célula, la
combinación de ATP y NADH inhiben el ciclo de Krebs, por lo que se acumula acetil
CoA.
El acetil CoA y el NADH son activadores alostéricos de la PDH quinasa, que es
la enzima que está involucrada en la modificación covalente y en la regulación de la
PDH de mamíferos. La modificación covalente consiste en una fosforilación/
defosforilación de residuos de serina de E1.
Cuando dentro de la mitocondria aumenta la concentración de NADH y acetil-
CoA, éstos activan alostéricamente a la PDH quinasa, que fosforila residuos de serina
de E1, dando lugar a una pérdida de actividad PDH.
Una PDH fosfatasa específica elimina hidrolíticamente el Pi unido y reactiva el
complejo. La fosfatasa se activa por Ca2+ y Mg2+.
Dado que el ATP y el ADP difieren en sus afinidades por Mg2+ (ATP tiene más
afinidad por Mg2+ que ADP), la concentración de Mg2+ libre refleja la relación ATP/ADP
dentro de la mitocondria.
Así pues, la PDH responde a las [ATP], quedando desactivada cuando el ATP es
abundante y no es necesaria una mayor producción de energía.
La proteína quinasa es parte integrante del complejo PDH mientras que la
fosfatasa sólo está unida de forma laxa.
CICLO DE KREBS
La función primaria del ciclo de Krebs consiste en oxidar los grupos acetilo que
entran en el ciclo en forma de acetil CoA. Al entrar en el ciclo, el grupo acetilo de 2C se
combina con un compuesto de 4C, el oxalacetato (OAA), para formar otro de 6C, el
citrato, un ácido tricarboxílico. En el curso de este ciclo, 2 de los 6C se oxidan a CO2 y
se regenera el OAA, completándose así el ciclo. El CO2 producido en estas reacciones
sale de la mitocondria por difusión y abandona la célula.
En cada vuelta el ciclo utiliza un grupo acetilo y regenera una molécula de OAA,
que queda lista para volver a iniciar el proceso. A lo largo de estos pasos, parte de la
energía liberada en la oxidación de los átomos de carbono se utiliza para convertir ADP
en ATP (aunque el paso de succinil CoA a succinato produce GTP en lugar de ATP,
todos los nucleósidos trifosfato son energéticamente equivalentes, debido a reacciones
de intercambio tales como ADP + GTP ↔ ATP + GDP). El resto de la energía de
oxidación se utiliza para transformar NAD+ en NADH (3 moléculas por ciclo) y FAD en
FADH2 (una molécula por ciclo).
Las moléculas de NADH y FADH2 van a transferir sus electrones ricos en
energía a la cadena respiratoria, al final de la cual los electrones se utilizan para reducir
el O2 a H2O. En estas reacciones se libera una gran cantidad de energía que es
utilizada por la ATP sintasa para generar ATP (fosforilación oxidativa).
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La reacción global del ciclo de TCA es:
Acetil CoA + 3NAD+ + FAD + GDP + Pi + 2H2O → 2CO2 + CoA-SH + 3NADH + 3H
+ + FADH2 + GTP
De la misma forma que consideramos dos fases en la glucólisis, también
conviene considerar dos fases diferenciadas en el ciclo de Krebs. La primera fase
(reacciones 1 a 4) se emplea fundamentalmente para oxidar 2C a CO2, mientras que la
segunda fase (reacciones 5 a 8) sirve fundamentalmente para regenerar el OAA.
TCA-1 La primera reacción del ciclo es similar a una condensación aldólica entre el
grupo ceto del OAA y el grupo metilo del acetil CoA, catalizada por la citrato sintasa.
Acetil CoA + OAA + H2O → citrato + CoA-SH + H+
El mecanismo de reacción es el siguiente: un residuo básico de la enzima extrae
un H+ del grupo metilo del acetil CoA, creando un carbanión nucleófilo que ataca al
carbono ceto del OAA. Esta reacción genera el compuesto enormemente inestable
citroil CoA, que espontáneamente se hidroliza mientras está unido al enzima para dar
los productos: citrato y coenzima A.
Como es de prever en el primer paso de entrada a una ruta, la reacción es
altamente exergónica (la hidrólisis del tioéster libera energía) ∆Gº’= -32.2 kJ/mol, y se
ha considerado que constituye un lugar de regulación para el conjunto de la ruta. La
actividad de la citrato sintasa está determinada en gran manera por la disponibilidad de
sustratos: acetil CoA y OAA. Además se inhibe alostéricamente por NADH y succinil-
CoA (compite con acetil CoA).
La citrato sintasa es un dímero. Cada subunidad tiene dos dominios; el centro
activo está situado en una hendidura entre los dos dominios. La unión de los sustratos
provoca un cambio conformacional en la enzima que hace que los sustratos queden
ocultos, protegiendo así al anión intermediario, el carbanión, del H2O y, por tanto, de
una rápida protonación. (ver modelo del ajuste inducido de la catálisis enzimática)
TCA-2 La siguiente reacción, catalizada por la aconitasa, isomeriza el citrato a
isocitrato, con el objetivo de obtener un grupo hidroxilo secundario capaz de ser
oxidado (pues el hidroxilo terciario no puede serlo).
La reacción comporta una deshidratación e hidratación consecutivas, a través
del cis-aconitato como intermediario deshidratado, que se mantiene unido a la enzima.
Citrato ↔ cis-aconitato ↔ isocitrato
Es una reacción endergónica, su ∆Gº’ es positivo (∆Gº’ = + 6.3 kJ/mol), sin
embargo se encuentra desplazada hacia la formación de isocitrato porque la siguiente
reacción es muy exergónica.
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La aconitasa contiene hierro no hemo y azufre que forman un centro hierro-
azufre en el centro activo. El hierro forma un complejo con el citrato, a través de 2
grupos carboxilo y un grupo hidroxilo de la molécula de citrato. Cuando una enzima se
une al sustrato en tres puntos o más, el lugar de fijación es asimétrico y puede unir al
sustrato tan sólo en una dirección. Esto hace que el citrato, una molécula simétrica
(tiene un plano de simetría, que pasa por C3) se haga asimétrica tras la unión a la
superficie asimétrica de la aconitasa.
Por eso se dice que el citrato es una molécula proquiral. La aconitasa convierte
el citrato, proquiral, en isocitrato, quiral. (una molécula quiral es aquella que contiene un
carbono asimétrico, un C con 4 sustituyentes distintos, y en consecuencia tiene
enantiómeros, es decir, isómeros que son imágenes especulares no superponibles
entre sí).
La aconitasa es, pues, estereoespecífica e introduce el grupo –OH en el carbono
que no proviene del acetil CoA recién incorporado.
Un inhibidor específico de la aconitasa es el fluorocitrato, que se forma por la
condensación de OAA y fluoroacetato (fluoroacetil-CoA) catalizada por la citrato
sintasa. El fluoroacetato se encuentra en las hojas de una variedad de plantas
venenosas y se utiliza como veneno para ratas.
El fluoroacetato por sí mismo no es tóxico para la célula, pero cuando se
convierte en fluorocitrato, éste se une y bloquea el centro activo de la aconitasa,
inhibiendo así el ciclo de Krebs.
TCA-3 La primera de las dos descarboxilaciones oxidativas del ciclo la cataliza la
isocitrato deshidrogenasa (dependiente de NAD+). En esta reacción se forma un
intermediario inestable, unido al enzima, que es el oxalsuccinato. Este se descarboxila
espontáneamente antes de ser liberado del enzima.
Isocitrato + NAD+ ↔ α-KG + NADH + CO2 ∆Gº’ = - 20.9 kJ/mol
La isocitrato deshidrogenasa cataliza, pues, la descarboxilación del isocitrato,
convirtiéndolo en α-cetoglutarato (α-KG). Es una enzima alostérica, que requiere Mg2+
como cofactor. Se activa por ADP (a medida que aumenta la [ADP] aumenta la afinidad
del enzima por el sustrato, disminuye la Km). Es fuertemente inhibida por ATP y NADH.
TCA-4 Es la segunda descarboxilación oxidativa del ciclo. Está catalizada por la
α-cetoglutarato deshidrogenasa, un complejo multienzimático análogo al de la PDH,
que contiene también tres actividades enzimáticas y sus coenzimas asociados.
El mecanismo de acción también es análogo. Una diferencia entre estos dos
complejos multienzimáticos es que las actividades reguladoras asociadas con el
complejo PDH no están presentes en el de la α-KG deshidrogenasa.
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α-KG + NAD+ + CoA-SH → succinil CoA + CO2 + NADH
La reacción, a semejanza de la catalizada por PDH, es altamente exergónica:
∆Gº’ = - 33.5 kJ/mol
Se inhibe por succinil CoA y NADH y se activa por AMP.
En este punto del ciclo se han introducido dos átomos de carbono en forma de
acetil CoA (por la citrato sintasa) y se han perdido otros dos en forma de CO2. Dada la
estereoquímica de la reacción de la aconitasa (capaz de distinguir entre las ramas
proquirales del citrato), los dos átomos de carbono perdidos no son los mismos que se
introdujeron al comienzo del ciclo.
Ya tenemos, pues, un intermediario de 4C: el succinil CoA, que ahora ha de ser
convertido en OAA para así completar el ciclo.
TCA-5 La energía almacenada en el grupo tioéster del succinil CoA, rico en energía, se
conserva acoplando la ruptura de este enlace con la síntesis de GTP. Esta reacción
está catalizada por la succinil CoA sintetasa.
Succinil CoA + Pi + GDP ↔ succinato + GTP + CoA-SH ∆Gº’= - 2.9 kJ/mol
El Pi terminal de alta energía del GTP puede ser transferido al ADP por la
nucleósido difosfato quinasa, produciéndose una molécula de ATP.
GTP + ADP ↔ GDP + ATP
Este es otro ejemplo de fosforilación a nivel de sustrato (transferencia de un
grupo fosfato desde un metabolito rico en energía al ADP) comparable a la generación
de ATP durante la glucólisis, en el sentido de que la síntesis de ATP ocurre como parte
de una vía catabólica y no como resultado de la reoxidación de coenzimas (fosforilación
oxidativa).
El succinato generado en esta reacción tiene una estructura idéntica al OAA
excepto en el átomo de carbono 2, que en el OAA es un grupo carbonilo (C=O) y en el
succinato un grupo metileno (-CH2-). Por lo tanto, para que el succinato se convierta en
OAA requiere dos reacciones oxidativas: una que convierta el metileno en hidroxilo y
otra que lo lleve al nivel carbonilo. Esto es lo que van a llevar a cabo las tres últimas
reacciones del ciclo.
TCA-6 La succinato deshidrogenasa (SDH) cataliza la oxidación del succinato a
fumarato (compuesto insaturado), acompañada de la reducción de FAD a FADH2
Succinato + E-FAD ↔ fumarato + E-FADH2 ∆Gº’ = 0 kJ/mol
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La SDH es una flavoenzima, el FAD está unido de forma covalente a la enzima a
través de un residuo de histidina específico.
Es una proteína integral de membrana interna mitocondrial (a diferencia del resto
de las enzimas del ciclo que están localizadas en la matriz mitocondrial). Es un
componente de la succinato-ubiquinona reductasa, un complejo multiproteico que
participa en la cadena respiratoria transportadora de electrones (lo que explica que el
FADH2 pueda ser reoxidado estando como está unido covalentemente a la enzima).
La reacción es estereoespecífica y el compuesto resultante insaturado es
siempre el isómero TRANS (fumarato), nunca el CIS.
Dado que en esta oxidación ambos electrones provienen de átomos de carbono
adyacentes (y no como de costumbre de un C y un O adyacente) y dado que la
oxidación de la unión C-C no es lo suficientemente energética para permitir la
transferencia de electrones al NAD+, el aceptor en este caso será FAD (un coenzima de
menor energía).
Reoxidación de NADH ∆Gº’ = - 220 kJ/mol 3 ATP
Reoxidación de FADH2 ∆Gº’ = - 181 kJ/mol 2 ATP
TCA-7 Una vez formado el doble enlace, se produce una hidratación estereoespecífica,
catalizada por la fumarasa, formándose el L-malato. Esta enzima realiza siempre la
adición en TRANS (el fumarato es una molécula plana y se añade OH y H por encima y
por debajo del plano).
Fumarato + H2O ↔L-Malato ∆Gº’ = - 3.8 kJ/mol
Al generar un enlace C-O se permite la más fácil oxidación de este carbono en el
siguiente paso.
TCA-8 Finalmente se regenera OAA a partir de malato, mediante la oxidación del grupo
hidroxilo a carbonilo, siendo en este caso el NAD+ el aceptor de electrones. La reacción
está catalizada por la malato deshidrogenasa.
L-malato + NAD+ ↔ OAA + NADH + H+ ∆Gº’ = + 29.7 kJ/mol
Es una reacción altamente endergónica en condiciones estándar, pero
transcurre en el sentido de formación de OAA debido a que la reacción de la citrato
sintasa es muy exergónica y mantiene las concentraciones intramitocondriales de OAA
extremadamente bajas.
El secreto del flujo de energía en los sistemas biológicos reside en que la
energía liberada en un proceso se encuentra acoplada a un segundo proceso que, de
otra manera, en las condiciones celulares no ocurriría espontáneamente. Así, la
energía producida en un proceso espontáneo no es desaprovechada, sino que
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constituye la fuerza motriz de otro proceso no espontáneo. La variación estándar de la
energía libre total de un conjunto de reacciones acopladas es igual a la suma de los
∆Gº’ de cada una de las etapas.
Balance del ciclo
Resumiendo:
1. El acetil CoA, de 2C, entra en el ciclo mediante su condensación con una
molécula aceptora de 4C: el OAA.
2. Hay dos reacciones de descarboxilación por cada ciclo, de manera que la
entrada de 2C en forma de acetil CoA se equilibra con la pérdida de 2C en
forma de CO2.
3. Hay 4 reacciones de oxidación: en 3 de ellas se utiliza NAD+ como aceptor
de electrones y en la otra se utiliza FAD.
4. En uno de los pasos del ciclo se genera 1 ATP (vía GTP).
5. El ciclo se completa tras la regeneración del aceptor original: el OAA.
Hasta aquí la producción de ATP por mol de glucosa metabolizada no ha
aumentado mucho respecto a la producción obtenida en la glucólisis: 2 moles de ATP
por glucosa en la glucólisis sola, frente a 4 moles en glucólisis más ciclo de Krebs. La
mayor parte del ATP generado durante la oxidación de la glucosa no se forma
directamente a partir de las reacciones de la glucólisis y del ciclo de Krebs, sino que se
forma a partir de la reoxidación de los transportadores electrónicos reducidos en la
cadena respiratoria. Estos compuestos, NADH y FADH2, son de por sí ricos en energía,
en el sentido de que su oxidación es altamente exergónica. Cuando los electrones se
transfieren desde estos transportadores reducidos hasta el O2 escalonadamente, se
produce de manera acoplada la síntesis de ATP a partir de ADP, con la formación de
alrededor de 3 moles de ATP por NADH oxidado a NAD+ y de alrededor de 2 moles de
ATP por FADH2 oxidado a FAD. De modo que por la oxidación completa de un mol de
glucosa a CO2 y H2O se generan alrededor de 38 moles de ATP.
∆Gº’ para la oxidación de la glucosa es – 2870 kJ/mol
∆Gº’ para la hidrólisis del ATP es – 31 kJ/mol
La eficiencia en condiciones estándar es de ~ 40 %. La eficiencia in vivo es
probablemente superior.
Regulación del ciclo de Krebs
Dado que el ciclo de Krebs es una fuente de intermediarios biosintéticos, así
como una ruta para la generación de energía metabólica, la regulación del ciclo es algo
más compleja que si se tratara solamente de una ruta de generación de energía. Al
igual que en la glucólisis, la regulación se produce a nivel de la entrada de combustible
al ciclo, y a nivel del control de las reacciones clave dentro del ciclo.
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El flujo a través del ciclo de Krebs se controla mediante interacciones
alostéricas, aunque las concentraciones de los sustratos desempeñan también un
papel crucial.
El factor más importante que controla la actividad del ciclo es la relación
intramitocondrial de [NAD+]/[NADH]. El NAD+ es un sustrato de 3 enzimas del ciclo, así
como de la PDH. En las condiciones en las que disminuye la relación NAD+/NADH,
como, por ejemplo, en presencia de una limitación del aporte de O2, la baja
concentración de NAD+ puede limitar las actividades de estas deshidrogenasas.
La citrato sintasa se inhibe por ATP, NADH y succinil CoA.
La isocitrato deshidrogenasa se activa por el ADP y se inhibe por NADH.
La actividad de la α-KG se inhibe por succinil CoA y NADH (los mecanismos son
comparables a los de la inhibición de PDH por acetil CoA y NADH).
En resumen, el flujo a través del ciclo de Krebs es sensible al estado energético
de la célula, al estado rédox de la célula, a través de la limitación de la velocidad de
flujo causada por el descenso de [NAD+] mitocondrial, y a la disponibilidad de
compuestos de alta energía, mediante la inhibición de enzimas relevantes por acetil
CoA o succinil CoA.
Reacciones anabólicas
Hasta el momento sólo hemos hablado de una de las funciones del ciclo de
Krebs: su función catabólica, de generación de energía. Ahora bien, el ciclo desempeña
otra importante función: proporciona intermediarios de rutas biosintéticas. La posibilidad
de utilizar el ciclo con una función catabólica o anabólica es lo que le da su carácter
anfibólico. En la figura se resumen las rutas anabólicas más importantes. Estas rutas
tienden a extraer carbono del ciclo mediante la utilización de algunos de sus
intermediarios.
• El succinil CoA se utiliza en la síntesis del grupo hemo y de otras porfirinas.
• El OAA y el α-KG son los análogos cetoácidos de los aminoácidos aspártico y
glutámico, respectivamente, y se utilizan en la síntesis de éstos y otros
aminoácidos mediante transaminación.
• En algunos tejidos, el citrato se transporta desde las mitocondrias al citosol, en
donde es fragmentado por la ATP citrato liasa para producir acetil CoA para la
biosíntesis de ácidos grasos.
Los intermediarios del ciclo de Krebs utilizados en las rutas biosintéticas deben
reponerse para mantener el flujo a través del ciclo. Las rutas anapleróticas sirven para
este fin.
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Reacciones anapleróticas (o de relleno) Son necesarias para reemplazar aquellos compuestos que han sido utilizados
con propósitos biosintéticos, así como para aumentar los niveles de intermediarios
cuando las necesidades celulares requieren una gran actividad del ciclo de Krebs.
Las más importantes son:
• La catalizada por la piruvato carboxilasa: se forma OAA a partir de piruvato y
CO2, con el gasto de una molécula de ATP. Es una enzima alostérica y se activa
por acetil CoA. Si disminuye la velocidad del ciclo porque no hay suficiente OAA,
el resultado es que aumentan los niveles de acetil CoA porque no puede ser
utilizado. El acetil CoA entonces activa la piruvato carboxilasa, que actúa
metiendo OAA, recuperándose así la velocidad del ciclo.
• En plantas y bacterias hay una ruta similar que conduce directamente desde el
PEP hasta el OAA. Está catalizada por la PEP carboxilasa. Dado que el PEP es
un compuesto de muy alta energía, esta reacción no requiere ATP.
• El enzima málico o malato deshidrogenasa dependiente de NADP+ rellena
metiendo piruvato en forma de malato. Esta enzima cataliza la carboxilación
reductora del piruvato para dar malato.
Pyr + CO2 + NADPH + H+ ↔ L-malato + NADP+
• Las reacciones de transaminación, de las que ya hemos hablado, también
funcionan en la dirección inversa para producir OAA y/o α-KG a expensas de los
aminoácidos análogos, dado que se trata de reacciones reversibles. Funcionan
así también como vías anapleróticas.
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CADENA RESPIRATORIA TRANSPORTADORA DE ELECTRONES
Es un sistema de complejos proteicos localizado en la membrana interna
mitocondrial que, mediante reacciones de óxido-reducción, van a llevar los electrones
desde el NADH y FADH2 hasta el último aceptor, el oxígeno, formándose H2O como
producto final. Se produce una serie de reacciones de oxidación y reducción acopladas,
con un paso de electrones a lo largo de una serie de transportadores: la cadena de
transporte electrónico o cadena respiratoria. El último paso es la reducción de O2 a
H2O.
El transporte de electrones tiene lugar a favor de gradiente electroquímico, a
favor de caída de potencial, es decir, los electrones son cedidos por transportadores
con potencial redox más negativo a transportadores de potencial más positivo (más
alto). El valor de Eo’ de cada transportador aumenta en el mismo orden que la
secuencia de su uso en el transporte electrónico. Este orden sugiere que cada una de
las reacciones de oxidorreducción del transporte electrónico es exergónica en
condiciones estándar (∆E > 0 ⇒ ∆G < 0). La secuencia global de transporte electrónico
es bastante exergónica. Un par de equivalentes reductores, generados a partir de un
mol de NADH basta para dar origen a la síntesis acoplada de unos 3 moles de ATP a
partir de ADP + Pi, mediante la fosforilación oxidativa. En la fosforilación oxidativa, el
potencial de reducción (o potencial de transferencia de electrones) del NADH (y del
FADH2) proporciona una fuente de energía libre para guiar las reacciones de
transferencia de grupo fosfato asociadas con la producción de ATP a partir de ADP+ Pi.
Durante la transferencia escalonada de electrones desde los coenzimas
reducidos al O2 se libera la energía libre que permite la síntesis de ATP.
La cadena de transporte electrónico es necesaria para la reoxidación de los
coenzimas reducidos, NADH y FADH2, regenerando así las moléculas aceptoras de
electrones que se requieren en las reacciones oxidativas dentro de la célula.
Dado que la reoxidación de los coenzimas se realiza a expensas del O2 se
pueden considerar las siguientes reacciones globales:
NADH + H+ + ½ O2 → NAD+ + H2O ∆Gº’= - 220 kJ/mol
FADH2 + ½ O2 → FAD + H2O ∆Gº’= - 181 kJ/mol
Así pues, durante la respiración se consume O2 y se genera H2O, que junto con
el CO2 que se generó en el ciclo de Krebs, constituyen los dos productos finales del
metabolismo energético aerobio.
Lo más importante de estas reacciones es la gran cantidad de energía libre que
se libera durante la oxidación del NADH y del FADH2, debido a que ambos coenzimas
tienen un potencial de reducción muy negativo.
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Podemos calcular la eficiencia del transporte electrónico. Experimentalmente
sabemos que la oxidación de 1 mol de NADH en la cadena respiratoria se produce
simultáneamente con la síntesis de unos 3 moles de ATP a partir de ADP y Pi. Dado
que ∆Gº’ para la hidrólisis del ATP es de –31 kJ/mol, la síntesis de 3 ATPs requiere 93
kJ/mol en condiciones estándar, con lo que se obtiene una eficacia de la fosforilación
oxidativa de ~ 40 %. Puesto que el ∆G de la hidrólisis de ATP en condiciones
intracelulares es significativamente mayor (- 40 kJ/mol o más), es probable que la
eficacia intracelular sea algo mayor de 40 %.
Como vemos, la variación de energía libre que se produce durante la oxidación
de NADH y FADH2 por O2 es lo suficientemente grande para permitir la síntesis de
varias moléculas de ATP. Se hace, pues, necesaria la existencia de una serie de
intermediarios para que la liberación de energía sea escalonada y optimizar así la
generación de ATP.
Para comprender el orden de los intermediarios en la cadena respiratoria hay
que observar los potenciales de reducción de cada uno de ellos. Los componentes de
la cadena transportadora de electrones están ordenados de acuerdo a sus potenciales
de reducción, en el sentido de una creciente afinidad por los electrones. Todos estos
intermediarios son componentes de la membrana interna mitocondrial y se requiere
lógicamente su proximidad física, por lo que van a estar organizados en complejos. El
flujo de electrones ocurrirá siempre en el sentido indicado en la figura mencionada. Los
electrones del NADH pasarán siempre primero al FMN, y luego al resto de la cadena en
el orden indicado. No es posible que el NADH transfiera sus electrones a otros
transportadores porque los intermediarios están físicamente ordenados en la
membrana en función de sus potenciales de reducción y la transferencia de electrones
sólo es posible entre transportadores contiguos.
En tres puntos de la cadena la transferencia de electrones de un transportador al
siguiente se acompaña de una variación de energía libre suficiente para generar ATP
(FMN→CoQ, cit b→cit c1 y cit a→O2), lo que coincide con la observación de que se
forman 3 moléculas de ATP por cada par de electrones que fluyen del NADH al O2.
Transportadores de electrones Excepto la ubiquinona o coenzima Q, todos los demás son proteínas con grupos prostéticos específicos, capaces de ser oxidados y reducidos reversiblemente, que están organizados en complejos: I NADH-ubiquinona reductasa: transfiere 2 electrones desde el NADH a UQ. II Succinato-ubiquinona reductasa: transfiere 2 electrones desde FADH2 a UQ. III Ubiquinona-cit C reductasa: transfiere electrones desde UQH2 hasta cit C. IV Cit c oxidasa: cataliza la reducción del O2 a H2O.
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La transferencia de electrones desde un complejo a otro se efectúa por las
formas reducidas de la ubiquinona y del citocromo c. Estos portadores de electrones,
más pequeños, son móviles y difunden fácilmente en la bicapa de la membrana.
Complejo I NADH-ubiquinona reductasa
Es probablemente el componente proteico más grande de la membrana interna
mitocondrial. Contiene unas 42 cadenas polipeptídicas distintas, una molécula de FMN
(mononucleótido de flavina) que actúa como grupo prostético y algunos centros hierro-
azufre (6 ó 7).
Los centros hierro-azufre están formados por un hierro no hemo que forma un complejo con azufre en 3 formas conocidas (ver figura). La forma más sencilla,
denominada FeS, contiene un Fe que forma un complejo tetraédrico con los S tiólicos
de 4 cisteínas. La segunda forma, Fe2S2, contiene 2 Fe, cada uno de los cuales forma
un complejo con 2 cisteínas y 2 sulfuros inorgánicos. La tercera forma, que es la más
compleja, Fe4S4, contiene 4 Fe, 4 sulfuros y 4 residuos de Cys.
La NADH-ubiquinona reductasa contiene centros Fe2S2 y Fe4S4. En todos estos
centros, el Fe puede experimentar una oxidorreducción cíclica entre los estados ferroso
y férrico:
Fe2+ ↔ Fe3+
Varías proteínas redox importantes contienen centros hierro-azufre. Se
denominan genéricamente proteínas sulfoférricas. Son componentes esenciales de
NADH-UQ reductasa (I), succinato-UQ reductasa (II) y ubiquinona-Cit c reductasa (III).
También las vamos a encontrar en otras cadenas transportadoras de electrones, como
la fotosintética.
En el complejo NADH-UQ reductasa la secuencia de cesión de electrones sería:
NADH + H+ FMN Fe2+S UQ
NAD+ FMNH2 Fe3+S UQH2
La flavina en FMN tiene tres estados redox –oxidado, semiquinona y reducido-
por lo que puede actuar como transportador de 1 ó 2 electrones, sirviendo así de
enlace entre NADH y FeS.
Este complejo proteico no sólo cataliza una reacción redox, sino que además
bombea protones desde la matriz mitocondrial al espacio intermembrana.
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UBIQUINONA
Es una pequeña molécula liposoluble (una benzoquinona ligada a diversas
unidades de isopreno, generalmente 10). También llamada coenzima Q (CoQ). La cola
isoprenoide proporciona a la molécula su carácter apolar, que permite a la ubiquinona
una difusión rápida a través de la membrana mitocondrial interna.
Dado que la ubiquinona pasa por un estado de semiquinona (como radical libre)
durante su ciclo de óxido-reducción, es una buena transición entre los transportadores
de 2 electrones (FAD, NAD+) y los de un único electrón (citocromos).
Complejo II Succinato-ubiquinona reductasa
En este caso el donador de electrones es el succinato, un intermediario del ciclo
de Krebs. El complejo II participa en la transferencia de electrones desde el succinato a
la ubiquinona (succinato + UQ ↔ fumarato + UQH2). El flujo de electrones desde el
succinato a la ubiquinona tiene lugar vía el FADH2 que es producido por la oxidación
del succinato a fumarato en el ciclo de Krebs.
Succinato FAD Fe2+S UQ Fumarato FADH2 Fe
3+S UQH2
La succinato-UQ reductasa contiene 4 polipéptidos, de los cuales los 2 mayores
son los que tienen el centro activo de la succinato DH (la enzima que oxida el succinato
a fumarato en el ciclo de Krebs), el grupo prostético FAD y 3 centros Fe-S.
El paso de los electrones desde el succinato hasta la ubiquinona no está
acompañado de un transporte de H+ de un lado a otro de la membrana (El ∆Eo’ de la
transferencia de electrones desde el succinato a la UQ es de + 0.069 v, mucho menor
que el ∆Eo’ de la reacción de la NADH-UQ reductasa que es de + 0.42 v. La pequeña
variación de energía no permite al complejo II bombear H+ a través de la membrana
interna mitocondrial), por lo tanto este complejo proteico no contribuye a la creación del
gradiente de H+. Por cada par de electrones que pasan desde el succinato a la cadena
transportadora de electrones se sintetizan ~ 2 moléculas de ATP (a diferencia de los 3
ATPs que se consiguen con la oxidación del NADH).
Complejo III Ubiquinona-citocromo C reductasa
Este complejo oxidorreductasa cataliza la transferencia de electrones desde la
UQH2 al citocromo c. Se trata de un oligómero de al menos 8 proteínas distintas,
incluyendo un citocromo c, 2 citocromos del tipo b (que tienen distinto Eo’) y una
proteína sulfoférrica.
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El complejo es transmembrana, atraviesa totalmente la membrana interna
mitocondrial, y bombea H+: una de las etapas de la transferencia de electrones implica
una gran disminución de la energía libre. La energía liberada en este paso es
conservada en la forma de un gradiente de H+.
CITOCROMO C
Es una pequeña proteína periférica de membrana, acepta los electrones de la
UQ-citocromo c reductasa, luego difunde lateralmente por la superficie de la membrana
y transfiere estos electrones a la citocromo c oxidasa.
Los citocromos son un grupo de proteínas que contienen un grupo
hemo y que actúan como portadores de 1 electrón en las cadenas
transportadoras de electrones respiratoria y fotosintética. El átomo de Fe del
grupo hemo del citocromo puede fluctuar entre el estado de oxidación
ferroso y férrico.
Hay 3 clases principales de citocromos, llamados a, b y c en función
de la naturaleza de las cadenas laterales de su grupo hemo. El grupo hemo
presente en el cit b es el tipo que se encuentra en la hemoglobina y en la
mioglobina. En el grupo hemo del cit a dos de las cadenas laterales están
modificadas. En el cit c el grupo hemo está ligado de forma covalente al
componente proteico a través de residuos de cisteína.
Los citocromos, debido al grupo hemo, tienen unos espectros de luz
visible característicos, con 3 picos principales de absorción (o bandas de
absorción): α, β y γ. Se puede distinguir entre los 3 tipos de citocromos por
las diferencias de sus espectros de absorción de luz.
Dentro de una misma clase, los citocromos pueden distinguirse entre
ellos por la longitud de onda de su banda de absorción α (está ausente en
los citocromos oxidados). Estas longitudes de onda se indican a veces con
subíndices (cit b560) o directamente se le pone un subíndice a la subclase: cit
a y a3.
En general son proteínas integrales de membrana, salvo el cit c que
es una proteína asociada débilmente al lado externo de la membrana
mitocondrial interna.
Complejo IV Citocromo c oxidasa
Es el componente final de la cadena transportadora de electrones. Cataliza la
reducción del O2 a H2O y bombea H+ al espacio intermembrana.
Para reducir una molécula de O2 tiene que oxidar 4 moléculas de citocromo c
consecutivamente, cada una de las cuales cede un electrón (son 4 los electrones que
se necesitan).
4 cit cred + O2 + 4 H+ → 4 cit cox + 2H2O
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Contiene entre 6 y 13 subunidades proteicas, 2 iones Cu2+ y los citocromos a y
a3 (estos dos citocromos tienen estructuras idénticas, pero están en diferentes entornos
en el oligómero y tienen diferentes Eo’).
Casi el 90% del consumo celular de O2 se debe a la acción de este complejo.
Determinación de la secuencia de los transportadores electrónicos respiratorios. Para establecer el orden de acción de los transportadores electrónicos en la
cadena respiratoria se han empleado una serie de técnicas que incluyen:
• Medidas espectrofotométricas: ciertas moléculas presentan distintos espectros
de absorción según se encuentren en su estado reducido u oxidado, es el caso
de NADH, FADH2 y citocromos.
• Utilización de inhibidores respiratorios específicos de algunos de los complejos
que participan en la cadena:
o Amital (barbitúrico) y rotenona (toxina vegetal que se utiliza como
insecticida) inhiben al complejo I
o Antimicina A (antibiótico) inhibe al complejo III
o Cianuro, azida y monóxido de carbono inhiben al complejo IV
Han sido de mucha utilidad para determinar la secuencia de los intermediarios
que transportan los electrones. Una vez que se conoce el sitio de acción de un
determinado inhibidor se puede deducir si un transportador está antes o después
de ese sitio dependiendo de si se acumula en su forma oxidada o reducida.
• Utilización de aceptores de electrones artificiales, como el azul de metileno, el
DCPIP (2,6 diclorofenolindofenol) y el ferricianuro, que captan electrones en
puntos específicos de la cadena (en función de sus respectivos potenciales de
reducción).
• Fraccionamiento de la membrana interna mitocondrial mediante el uso de
detergentes como la digitonina, que permite aislar los distintos complejos
proteicos sin desnaturalizarlos. El análisis de cada complejo con respecto a la
presencia de transportadores electrónicos, así como a las reacciones
catalizadas, ha ayudado a establecer la secuencia de transportadores aceptada
actualmente.
Lanzaderas metabólicas
Las lanzaderas son sistemas de transporte de poder reductor a través de la
membrana interna mitocondrial.
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El NADH generado en el citosol durante la glucólisis debe transferir los
equivalentes de reducción a la mitocondria, para su reoxidación por la cadena
respiratoria. Van a ser necesarios sistemas de transporte específicos, ya que el NADH
no puede atravesar por sí mismo la membrana interna mitocondrial. Las lanzaderas son
esos sistemas de transporte específico que transfieren los electrones del NADH
citosólico al interior de la mitocondria. Funcionan básicamente de la siguiente manera:
el NADH citosólico transfiere sus electrones a una molécula orgánica que es capaz de
atravesar la membrana mitocondrial y llevar así los electrones al interior de la
mitocondria. Allí, en la matriz mitocondrial, esta molécula es reoxidada, donando sus
electrones a un coenzima oxidado. La molécula oxidada atraviesa la membrana de
vuelta al citoplasma, en donde puede experimentar de nuevo el mismo ciclo.
Las dos lanzaderas principales conocidas son: Glicerol-3-P / DHAP y Malato /
aspartato.
Glicerol-3-P / DHAP
Es el sistema de lanzadera más primitivo que se conoce. Es especialmente
activo en el cerebro (y en el músculo de vuelo de los insectos).
Los electrones del NADH generado en el citosol se transfieren a la DHAP que
es, por tanto, reducida a glicerol-3-P. Esta reacción está catalizada por la glicerol-3-P
DH citoplásmica. El glicerol-3-P pasa a la mitocondria, donde es reoxidado por una
flavoproteína, la glicerol-3-P DH, unida a la cara externa de la membrana interna
mitocondrial. El FAD de esta flavoproteína es reducido a FADH2 mitocondrial y de allí a
la cadena respiratoria.
En este punto hay que tener en cuenta que el FADH2 tiene un potencial redox
menos negativo que el NADH, por lo que la generación de ATP será menor. Sólo se
sintetizarán 2 ATP por cada NADH citoplásmico que transfiera sus equivalentes de
reducción a la mitocondria por este sistema.
Malato / aspartato
Este sistema de lanzadera es especialmente activo en hígado y corazón. En este
caso, una isoenzima citosólica de la malato DH transfiere los electrones del NADH al
oxalacetato, que se reduce a malato, el cual pasa a la mitocondria a través de un
sistema de transporte específico de la membrana interna mitocondrial (antiporte con
α−KG). El malato es reoxidado a continuación por la malato DH del ciclo de Krebs, que
utilizará también NAD+. Se genera así OAA, que no puede atravesar la membrana
interna. Se requiere una reacción de transaminación: el OAA se transamina a
aspartato, que sí puede atravesar la membrana, y, una vez en el citosol, es de nuevo
transaminado para regenerar el OAA requerido como aceptor electrónico en el inicio del
ciclo. El aspartato sale de la mitocondria por un antiporte con glutamato.
El balance neto ha sido la transferencia de dos equivalentes de reducción del
NADH del citosol a la matriz mitocondrial.
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FOSFORILACIÓN OXIDATIVA
¿Cuál es el mecanismo por el cual la transferencia de electrones desde los
coenzimas al O2 se acopla a la generación de ATP?
Hablamos de fosforilación oxidativa porque el ATP se genera mediante
reacciones de fosforilación acopladas al transporte de electrones oxidativo y para
distinguirla de la fosforilación a nivel de sustrato.
Fosforilación y oxidación están estrechamente acopladas. Debido a este
acoplamiento existe una proporción entre el ATP generado y el oxígeno molecular
consumido, la llamada relación P/O, que es el número de moléculas de ATP sintetizadas por cada par de electrones transportado en la cadena. En mitocondrias
aisladas la relación P/O es próxima a 3 por cada molécula de NADH oxidada, aunque
la estequiometría aún no está muy clara. En cuanto al FADH2, la relación es próxima a
2, con un menor rendimiento, como corresponde a su potencial redox más positivo.
La relación P/O de 3 para la oxidación del NADH coincide con la observación de
que tres de las reacciones individuales de la cadena respiratoria son lo suficientemente
exergónicas como para impulsar la síntesis de una molécula de ATP cada una. Tres de
estas reacciones tienen unos valores de ∆Gº’ superiores a – 31 KJ/mol, la barrera
mínima que debe superarse (en condiciones estándar) para hacer que la síntesis de
ATP sea exergónica.
Estas tres reacciones son la oxidación del FMNH2 por la ubiquinona, la oxidación
del citocromo b por el citocromo c1 y la reacción de la citocromo c oxidasa.
Su identificación experimental reveló que cada una de estas tres reacciones es
capaz de dar, por sí sola, energía a la membrana para la síntesis de ATP a pesar de
que no actúe el conjunto de la cadena de transporte electrónico. Los experimentos
consistieron en limitar el transporte electrónico a determinadas partes de la cadena
mediante el empleo de aceptores y donadores electrónicos en presencia o ausencia de
inhibidores respiratorios específicos (fig. 15.12 Mathews). Para cada segmento aislado
de esta manera se determinaron las relaciones P/O.
En primer lugar, el succinato se oxida con una relación P/O de 2, no de 3, lo que
sugiere la existencia de un lugar de acoplamiento previo a la ubiquinona en la cadena
respiratoria. Este hecho se confirmó mediante el bloqueo del transporte electrónico
después del cit b con antimicina A. Se añadió ferricianuro como aceptor electrónico
artificial, de manera que pudiera continuar el flujo electrónico. En estas condiciones, los
sustratos ligados al NAD+ se oxidan con una relación P/O de 1, lo cual confirmaba la
existencia de un lugar previo al cit b.
Cuando se utiliza como donador electrónico artificial el par ascorbato/TMPD
(tetrametil-p-fenilen diamina), pueden introducirse los electrones en la cadena
respiratoria a nivel del cit c. La oxidación del cit c por la citocromo c oxidasa se produce
con una relación P/O de 1, con lo que se localiza otro de los lugares de acoplamiento,
más allá del cit c.
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La adición de un inhibidor de la citocromo c oxidasa, como el cianuro, fuerza la
salida de los electrones de la cadena respiratoria a la altura del cit c. En estas
condiciones, el succinato se oxida con una relación P/O de 1, lo que localiza un lugar
entre los citocromos b y c.
En resumen, estos experimentos demuestran que los complejos I, III y IV son
capaces de impulsar la síntesis de ATP, mientras que el complejo II no lo es.
Previamente se comentó que estos tres complejos proteicos de la cadena
respiratoria transportadora de electrones, I, III y IV, son bombas de H+ que translocan
H+ desde la matriz mitocondrial al espacio intermembrana, generando un gradiente de
H+ a través de la membrana interna mitocondrial, dado que ésta es impermeable a H+.
Este movimiento de H+ tiene 2 consecuencias principales:
1. Genera un gradiente de pH de ~ 1.4 unidades a través de la membrana
interna mitocondrial, siendo más ácido fuera que dentro.
2. Genera un gradiente de voltaje: la existencia de un gradiente de
concentración de una especie cargada, como es el H+, a través de la
membrana también crea un potencial eléctrico, llamado potencial de membrana, de aproximadamente 0.14 v. Como resultado del flujo neto de salida de iones positivos, el potencial será negativo en el interior y positivo en
el exterior.
Ambas fuerzas, el gradiente de pH y el potencial de membrana, van a actuar
atrayendo a los H+ hacia la matriz mitocondrial, y en conjunto constituyen un gradiente electroquímico de H+. El gradiente electroquímico de H+ ejerce una fuerza protón motriz (fpm), la cual puede medirse en unidades de voltio:
∆µH = ∆ψ − (2.3RT/F) ∆pH
Este gradiente electroquímico de H+ o fuerza protón motriz (∆µH o fpm o ∆p) se
puede descomponer en un potencial eléctrico (el potencial de membrana), ∆ψ, y un
componente puramente químico, de concentración, que es el gradiente de pH, ∆pH.
La fuerza protón motriz proporciona la energía necesaria para la síntesis de
ATP. La energía liberada por la descarga del gradiente electroquímico de H+ puede
acoplarse con la fosforilación de ADP para formar ATP.
Esta es la teoría quimiosmótica de Mitchell, el modelo que mejor explica el
acoplamiento de la síntesis de ATP con el transporte de electrones (es el que mayor
apoyo experimental tiene). Fue propuesta por el bioquímico británico Mitchell en 1961 y
le valió el Premio Nobel en 1978.
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Esta teoría quimiosmótica afirma que el acoplamiento de la oxidación con la
fosforilación es indirecto. Los H+ son translocados hacia el espacio intermembrana por
lo complejos de la cadena respiratoria transportadora de electrones. Estos H+ luego
fluyen de nuevo, debido a su gradiente, hacia la matriz mitocondrial, a través de un
canal de membrana formado por la enzima ATP sintasa. La fosforilación del ADP está
de esta forma acoplada al movimiento de los H+ hacia el interior.
La teoría quimiosmótica consta de 3 postulados:
1. La cadena transportadora de electrones mitocondrial transloca H+ a través de
la membrana interna mitocondrial conforme los electrones fluyen desde un
complejo de la cadena al siguiente.
2. La ATP sintasa utiliza la fuerza protón motriz para llevar a cabo la
fosforilación del ADP.
3. La membrana interna mitocondrial es impermeable a los H+. Si la membrana
es alterada no puede crearse una fuerza protón motriz y no se produce
síntesis de ATP.
Todavía no se conoce la estequiometría exacta de la translocación de H+ ni los
mecanismos por los que se rigen las bombas de H+. Los primeros experimentos de
Mitchell sugirieron que cada oxidoreductasa que bombea H+ transloca 2 H+ pero datos
recientes sugieren que el número de H+ translocados podría ser superior.
Si las proteínas respiratorias han de actuar como bombas de H+, los
transportadores electrónicos que bombean H+, como la NADH-UQ reductasa, deben
estar en contacto tanto con la cara interna como con la cara externa de la membrana,
han de ser proteínas transmembrana. Además, estos transportadores deben estar
situados de manera asimétrica en la membrana, con objeto de facilitar el transporte en
una dirección, hacia fuera. El transporte de H+ ha de ser unidireccional.
Uno de los postulados de la teoría quimiosmótica de Mitchell se refiere al papel
que desempeña la fuerza protón motriz en la síntesis de ATP. La validez de esta parte
del modelo se vio confirmada con unos experimentos en los que se demostraba que el
establecimiento de un gradiente de H+ en mitocondrias aisladas bastaba para impulsar
la síntesis de ATP, incluso en ausencia de transporte electrónico. Uno de estos
experimentos consistía en incubar las mitocondrias en un medio alcalino durante varias
horas y luego transferirlas rápidamente a un medio ácido. De este modo se conseguía
que el interior de la mitocondria estuviese a un pH más básico. Si entonces se añadían
ADP y Pi se producía síntesis de ATP, de manera simultánea con la disipación del
gradiente de pH.
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ATP sintasa (H+-ATPasa o complejo V)
Es el complejo enzimático que acopla la síntesis de ATP al transporte de H+ a
través de la membrana interna mitocondrial.
Consta de dos componentes F1 y F0, constituidos a su vez por varias cadenas
polipeptídicas.
• F1 tiene forma globular y está expuesto hacia la matriz mitocondrial. Posee la actividad catalítica de síntesis de ATP a partir de ADP y Pi.
• F0 es integral de membrana y constituye un canal o poro que permite el paso de H+.
F1, el componente catalítico de la ATP sintasa, puede ser aislado como una ATPasa muy activa. Cuando F1 está unido a F0 la enzima cataliza la síntesis de ATP.
Sin embargo, F1 puede liberarse fácilmente a la matriz (se asocia débilmente a la
membrana). Este componente F1 libre cataliza la hidrólisis de ATP, se comporta como
una ATPasa. Por esta razón la ATP sintasa se denomina también H+-ATPasa. F1 posee
5 tipos de cadenas polipeptídicas diferentes, denominadas: α, β (tres copias de cada
una), γ, δ, ε (una copia de cada una) → α3β3γδε
El componente F0 que forma el poro protónico está constituido por tres subunidades a, b y c, con la estequiometría ab2c10-12. Una de las proteínas del complejo
F0 es el lugar de unión del inhibidor de la síntesis de ATP: la oligomicina (un antibiótico
producido por Streptomyces). Las subunidades c, pequeñas y muy hidrofóbicas, se
disponen en forma de anillo.
La estructura de la ATP sintasa es la de una máquina rotatoria molecular. El
componente rotor (o giratorio) de esta máquina está formado por las subunidades c12, γ
y ε, mientras que las subunidades a, b2, δ, α3 ψ β3 forman el componente estátor (o
estacionario). La corriente de protones a través del “poro” F0 provoca que el cilindro
formado por las subunidades c y la subunidad γ anclada roten alrededor del eje mayor
de γ, que es perpendicular al plano de la membrana.
¿Cuál es el mecanismo mediante el que la energía potencial de la entrada de H+ a través del canal F0 se utiliza para impulsar la síntesis de ATP por F1?: los cambios
conformacionales inducidos por el paso de H+. F1 contiene 3 subunidades α y 3
subunidades β, y las 6 proteínas están dispuestas como los gajos de una naranja, de
forma alternada: α, β, α, β, α, β. Cada uno de los 3 complejos αβ posee una
conformación claramente diferente: L, T, O, de unión débil, fuerte o no unión a los
sustratos. El paso de H+ a través del canal F0 provoca un cambio conformacional que
se transmite a F1. El complejo αβ en conformación L (loose) une débilmente ADP + Pi y
al producirse el cambio conformacional pasa a conformación T (tight), que es la forma
catalíticamente activa, por lo que se genera ATP. Este ATP se libera en el siguiente
cambio conformacional (nuevo paso de H+), quedando así la subunidad αβ en
conformación O (open). Se requieren distintas conformaciones para la unión de ADP, la
síntesis de ATP y la liberación de ATP. El paso dependiente de energía no es la
síntesis de ATP sino su liberación de un lugar de unión fuerte. Cada rotación se
Bioquímica. Carmen Martínez URJC Metabolismo oxidativo
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produce por el paso de H+, y nunca coinciden dos subunidades en la misma
conformación. Los cambios de conformación, esenciales en este mecanismo, están
impulsados por el paso de protones a través de la porción F0 de la ATP sintasa. Así
pues, el proceso de fosforilación oxidativa es posible gracias a los cambios
conformacionales experimentados por la ATP sintasa.
Desacoplamiento de la fosforilación oxidativa.
El transporte electrónico (la oxidación de NADH y FADH2 mediante el O2) y la
fosforilación oxidativa (la síntesis de ATP) están por lo general fuertemente acoplados.
En estado de reposo, cuando la fosforilación oxidativa es mínima, el gradiente
electroquímico de protones a través de la membrana interna mitocondrial crece hasta el
punto que impide más bombeo de protones y, por tanto, inhibe el transporte
electrónico.
A lo largo de los años, no obstante, se han encontrado muchos compuestos que
desacoplan estos procesos, que son capaces de disociar el proceso de transporte de
electrones del proceso de generación de ATP. Entre estos compuestos se encuentran
el DNP (2, 4-dinitrofenol) y el FCCP (trifluorocarbonilcianuro fenilhidrazona). Son
llamados agentes desacoplantes. La presencia en la membrana interna mitocondrial de un agente que aumente la
permeabilidad de los protones hace que la fosforilación oxidativa se desacople del
transporte electrónico, proporcionando una vía para la disipación del gradiente
electroquímico de protones que no requiere de síntesis de ATP. El desacoplamiento,
por lo tanto, permite que el transporte electrónico continúe libremente, incluso cuando
se inhibe la síntesis de ATP.
El DNP y el FCCP son ácidos débiles lipofílicos que por lo tanto pasan a través
de las membranas. En un gradiente de pH unen protones en el lado ácido, difunden a
través de la membrana y los liberan en el lado alcalino, disipando así el gradiente.
Por lo tanto, estos desacoplantes son ionóforos transportadores de protones.
Disipan el gradiente protónico al transportar los protones al interior de las mitocondrias
a través de lugares distintos del canal F0 de la ATP sintasa.
El desacoplamiento de la fosforilación oxidativa tiene una función fisiológica: generar calor.
La disipación de un gradiente electroquímico de protones, generado mediante
transporte electrónico y desacoplado de la síntesis de ATP, produce calor.
Muchos mamíferos, en especial los que nacen sin pelo y los que hibernan
poseen un tejido adiposo especializado, denominado tejido adiposo marrón (grasa
parda), en la parte alta de la espalda. Las mitocondrias de este tejido están
especializadas en la generación de calor a partir de la oxidación de la grasa de forma
desacoplada de la fosforilación. El color marrón del tejido se debe a la presencia de
grandes cantidades de mitocondrias y, por tanto, de citocromos cuyos grupos hemo
absorben fuertemente la luz visible. En estas mitocondrias el transporte de electrones
Bioquímica. Carmen Martínez URJC Metabolismo oxidativo
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está parcialmente desacoplado de la fosforilación oxidativa al existir una proteína
transmembrana en su membrana interna, la termogenina (o proteína desacoplante,
UCP), que permite el paso de protones a favor de gradiente, disipando la energía
liberada en forma de calor, lo que contribuye a mantener la temperatura corporal del
recién nacido.
El proceso completo de generación de calor por la grasa parda, que se
denomina termogénesis sin tiritera (nonshivering thermogenesis) o termogénesis por
desacoplamiento viene regulada por vía hormonal. La noradrenalina inicia un
mecanismo en cascada que finalmente aumenta la hidrólisis de los triglicéridos. Los
ácidos grasos libres en el lado intermembrana de la mitocondria son quienes activan
directamente la UCP.
Existe otro tipo de termogénesis, la termogénesis con tiritera, en la que se
genera calor por contracción muscular involuntaria.
En el reino vegetal la producción de calor también es a veces necesaria. En el
caso de ciertas plantas sirve para volatilizar determinados compuestos olorosos que
atraen a los insectos, favoreciendo así la polinización.
Regulación de la fosforilación oxidativa. Control respiratorio.
Al igual que cualquier otro proceso metabólico, la fosforilación oxidativa sólo
puede producirse en presencia de cantidades adecuadas de sus sustratos. Se controla
no por mecanismos alostéricos, sino simplemente por la disponibilidad del sustrato.
Estos sustratos incluyen el ADP, el Pi, el O2 y un metabolito oxidable que pueda
generar transportadores electrónicos reducidos, NADH o FADH2. En diferentes
situaciones metabólicas cualquiera de estos cuatro sustratos puede limitar la velocidad
de la fosforilación oxidativa.
El factor más importante a la hora de determinar la velocidad de la fosforilación
oxidativa es el nivel de ADP. La velocidad de consumo de oxígeno por las mitocondrias
aumenta notablemente cuando se añade ADP y recupera su valor inicial cuando el
ADP añadido se ha convertido en ATP. El control de la respiración aerobia por el ADP
se denomina control respiratorio.
La dependencia que presenta la respiración del ADP revela una característica
general importante es este proceso: la respiración está fuertemente acoplada con la
síntesis de ATP. No sólo existe una dependencia absoluta de la síntesis de ATP con
respecto al flujo continuo de electrones de los sustratos al oxígeno, sino que el flujo
electrónico en las mitocondrias normales se produce tan sólo cuando se sintetiza
también ATP. Este control respiratorio tiene sentido desde el punto de vista biológico,
puesto que asegura que los sustratos no se oxiden de manera inútil, sino sólo cuando
exista una necesidad fisiológica de ATP.
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Si las demandas energéticas de una célula hacen que se consuma el ATP de
manera rápida, la acumulación resultante de ADP estimulará la respiración, con la
consiguiente activación de la resíntesis de ATP. Y a la inversa, en una célula relajada y
bien nutrida, el ATP se acumula a costa del ADP, y la depleción de ADP limita la tasa
de funcionamiento del transporte electrónico y de su propia fosforilación a ATP. Así
pues, la capacidad de generación de energía de la célula está armonizada con sus
demandas energéticas.
Experimentalmente, el control respiratorio se demuestra valorando la utilización
de O2 en mitocondrias aisladas. En ausencia de una adición de sustrato o ADP, la
captación de O2 causada por la oxidación de los sustratos endógenos es lenta (ver
figura). La adición de un sustrato oxidable, como el glutamato o el malato, sólo tiene un
efecto pequeño sobre la tasa de respiración. Sin embargo, si se añade ADP, la
captación de O2 se produce con una velocidad muy superior, hasta que todo el ADP
añadido se ha convertido en ATP, con lo que la captación de O2 vuelve a la situación
basal. Esta estimulación de la respiración es estequiométrica, es decir, la adición del
doble de ADP hace que aumente al doble la cantidad de captación de O2.
Transmisión de energía mediante gradientes de protones.
Los gradientes de protones guían muchos procesos celulares, además de la
síntesis mitocondrial de ATP. En células vegetales la fotofosforilación del ADP es
impulsada por un gradiente de protones transmembranal y ocurre mediante un
mecanismo notablemente parecido al de la fosforilación oxidativa mitocondrial. En
células bacterianas el gradiente de protones se utiliza para impulsar la rotación de los
flagelos que permite el movimiento de la célula.
Los gradientes de protones impulsan también el transporte activo mitocondrial:
• Intercambio de ATP/ADP a cargo de la nucleótido de adenina translocasa,
en el que se exporta el ATP generado y se importa su precursor, el ADP.
Dado que este sistema intercambia ATP, con una carga de -4, por ADP,
con una carga de -3, el proceso está dirigido por el potencial de
membrana.
• Intercambio de Pi por la fosfato translocasa, que puede actuar en modo
antiporte, acoplando la entrada de fosfato (H2PO4-) a la matriz con la
salida de un OH-, o en modo simporte, transportando HPO4
2- a la matriz
junto con 2 H+.
El efecto neto de los sistemas de transporte de nucleótido de adenina y de
fosfato es acoplar el transporte hacia el interior de los sustratos de la fosforilación
oxidativa, el ADP y el Pi, con la salida del producto, el ATP.
En cuanto a los sustratos de la oxidación, el principal en el catabolismo de los
hidratos de carbono es el piruvato que, como el fosfato, se intercambia por OH-.