APLICACIONES DE LA PCR A TIEMPO REAL CON EL TERMOCICLADOR Mx3005P

Y MxPRO DETERMINACIÓN DEL TÍTULO DE VECTORES LENTIVIRALES EXPRESIÓN RELATIVA DE GENES DE INTERÉS

POR MIGUEL GARCÍA TOSCANO, PhD

CENTRO DE GENÓMICA Y ONCOLOGÍA (GENYO) GRANADA

CONCEPTO

AMBAS APLICACIONES ESTÁN BASADAS EN LA CAPACIDAD DE CUANTIFICAR QUE PERMITE LA PCR A TIEMPO REAL

OBTENCIÓN DE UN VALOR DADO POR EL Ct (threshold cycle)

EL VALOR DEL Ct SE DETERMINA EN LA INTERSECCIÓN DE LA LÍNEA UMBRAL CON LA CURVA DE AMPLIFICACIÓN

Threshold

Ct

DETERMINACIÓN DEL TÍTULO DE VECTORES LENTIVIRALES (LV)

Los vectores lentivirales son partículas virales basadas en el HIV-1 utilizados para la expresión estable, en células diana, de elementos genéticos de interés, como genes marcadores, genes terapéuticos o pequeños RNA de interferencia.

(293T)

Integrativos

PROCESO EXPERIMENTAL PARA OBTENER EL TÍTULO

1) 100ul

10ul

1 ul

neg 1x10e5 células 293T por pocillo en placa de 24 pocillos

2)

4-5 días en cultivo

Purificación de DNA genómico

3) Cuantificación

IMP: En cada tubo de PCR se utiliza para amplificar 0.6 ug de DNA genómico, cantidad de DNA que corresponde al DNA genómico de 10e5 células, cantidad inicial de células transducidas.

Sobrenadante células empaquetadoras

EL PROCESO EN EL MxPRO

PREPARACIÓN DE LAS MUESTRAS

La curva estándar se compone de diluciones seriadas de cantidades de plásmido vector conocidas Principio: 1 ug de un plásmido de unas 12.000 bp contiene 2.15 x 1011 moléculas o copias

293T genómico DNA DNA plásmido (copias)

RESULTADOS

LA CURVA ESTÁNDAR

ANÁLISIS RESULTADOS

DETERMINACIÓN FINAL DEL TÍTULO

Punto de 10 ul de vector → 4,5x10e5 copias EQUIVALEN a 4,5x10e5 unidades de transducción (UT) Título (UT/ml) = 4,5x10e5 UT / 10ul = 4,5x10e7 UT / ml

EXPRESIÓN RELATIVA DE GENES DE INTERÉS

La PCR a tiempo real permite cuantificar de forma relativa la expresión de nuestro gen de interés en determinadas condiciones Principio: utilizar un gen de referencia cuya expresión es constante durante las condiciones del experimento (gen constitutivo). El proceso consta de dos partes: La expresión del gen de interés será normalizada con la expresión del gen constitutivo. La expresión del gen de interés en las condiciones experimentales será relativizada con la expresión del mismo gen en las condiciones control.

PROCESO EXPERIMENTAL

Condición control Condición experimental 1

Condición experimental 2

Aislamiento de RNA total

Obtención de DNA complementario 2ug

Reacción de PCR

Importante

PROGRAMA DE EXPRESIÓN RELATIVA EN EL MxPRO

LA PLANTILLA

Condición control

Sobre-expresión Expresión bloqueada

LA PLANTILLA

NORMALIZADOR: GAPDH, BETA-ACTINA

GEN DE INTERÉS

RESULTADOS

Condición control

Sobre-expresión

Expresión bloqueada

CALCULAR LA EXPRESIÓN RELATIVA “MANUALMENTE”

PASO 1 Primer diferencial ( Ct)

Ct = Ct muestra - Ct normalizador PASO 2 Segundo diferencial ( Ct)

Ct = Ct muestra – Ct control PASO 3 2^-( Ct)