sÍntesis de pÉptidos con y sin restricciÓn...

SÍNTESIS DE PÉPTIDOS CON Y SIN RESTRICCIÓN CONFORMACIONAL DE

LAS PROTEÍNAS HPV16 L1 Y HPV16 E7, PARA SU POSTERIOR ESTUDIO DE

REACTIVIDAD

ERIKA MARYORI NIÑO VEGA

UNIVERSIDAD DISTRITAL FRANCISCO JOSÉ DE CALDAS

FACULTAD DE CIENCIAS Y EDUCACIÓN

LICENCIATURA EN QUÍMICA

GRUPO DE INVESTIGACIÓN PROTEOMA

BOGOTÁ, D.C., 19 DE ENERO 2016

SÍNTESIS DE PÉPTIDOS CON Y SIN RESTRICCIÓN CONFORMACIONAL DE

LAS PROTEÍNAS HPV16 L1 Y HPV16 E7, PARA SU POSTERIOR ESTUDIO DE

REACTIVIDAD

ERIKA MARYORI NIÑO VEGA

Trabajo de grado para optar al título de Licenciada en Química

Director, investigador:

Julio Cesar Calvo Mozo

Universidad Distrital

Grupo Investigación Proeoma

UNIVERSIDAD DISTRITAL FRANCISCO JOSÉ DE CALDAS

FACULTAD DE CIENCIAS Y EDUCACIÓN

LICENCIATURA EN QUÍMICA

GRUPO DE INVESTIGACIÓN PROTEOMA

NOTA DE ACEPTACIÓN

Números Letras

_______________________________________

Jurado (Nombre/firma) )

_________________________________________

Jurado (Nombre/firma) )

DEDICATORIA

Dedico este trabajo en primer medida a Dios quien siempre me ha guiado permitiéndome

llegar a este momento tan importante de mi formación profesional. A mi madre Amanda

Vega quien ha sido mi mayor apoyo, motivación y ejemplo. A mis hermanos Julián y

Felipe, puesto que por ellos lucho cada día. A mi abuelita Estrella quien me ha apoyado

incondicionalmente en todo momento. A mi tino Alex que en muchas ocasiones ha sido

como mi padre y me ha sabido aconsejar cuando lo he necesitado. A mi tía Gloria por

brindarme su ayuda y amor A Efraín por su gran apoyo, por creer en mí y darme lo mejor

de sí en cada momento que estuvo a mi lado. A mis amigos y compañeros Milena Gómez,

Adriana Molina, Juan Vanegas, Schneider Bárcenas, Mateo Álvarez y demás que me

acompañaron y apoyaron en este gran camino.

AGRADECIMIENTOS

Agradezco al profesor Julio Cesar Calvo por permitirme entrar en su grupo de investigación,

trabajar a su lado, compartirme sus conocimientos, por su orientación y apoyo en cada

momento y la enorme confianza que deposito en mí. A cada una de las personas del grupo

de investigación Proteoma quienes me apoyaron para culminar este trabajo.

A la doctora Fanny Guzmán de la Pontificia Universidad Católica de Valparaíso, por

recibirme en el laboratorio de síntesis de péptidos y permitirme continuar y finalizar allí mi

trabajo, por su hospitalidad brindada y por la calidez con la que me transmitió sus

conocimientos y me aportó lo necesario para culminar este proceso, así como a cada una de

las personas que se convirtieron en mi familia temporal en Chile.

Al personal del CERI y el CIDC por su gran ayuda para poder continuar este trabajo de

investigación en el exterior.

LA UNIVERSIDAD DISTRITAL FRANCISCO JOSÉ DE CALDAS

No se hace responsable de las ideas, ni del contenido del presente trabajo, aquí

expuesto por sus autores

CONTENIDO

1. INTRODUCCIÓN 16

2. PROBLEMA 17

2.1. DEFINICIÓN 17

2.2. DESCRIPCION Y DELIMITACIÓN 17

3. ANTECEDENTES Y JUSTIFICACIÓN 18

4. OBJETIVOS 20

4.1. GENERAL 20

4.2. ESPECIFICOS 20

5. HIPÓTESIS 21

6. MARCO TEÓRICO 22

6.1. Aminoácidos 22

6.1.1. Aminoácidos con cadena lateral apolar 22

6.1.2. Aminoácidos con cadenas laterales polares sin carga 23

6.1.3. Aminoácidos con cadenas laterales polares cargadas 24

6.2. Péptidos 26

6.2.1. Generalidades 26

6.2.2. Enlace peptídico 26

6.2.3. Estructura 27

6.2.3.1. Conformación α hélice 27

6.2.3.2. Conformación lamina beta o loop 28

6.2.4. Aplicaciones de los péptidos 30

6.2.4.1. Estudio del plegamiento de proteínas 30

6.2.4.2. Péptidos miméticos 30

6.2.4.3. Neuropéptidos funcionales 30

6.2.4.4. Antigenicidad e inmunidad 31

6.2.4.5. Fármacos peptídicos 31

6.2.4.6. Epítopes B 31

6.2.4.7. Péptidos como vacunas 31

6.2.5. Síntesis de péptidos. 32

6.2.5.1. Síntesis de péptidos por estrategia Fmoc/tBu 34

6.2.5.1.1. Soportes sólidos o Resinas 34

6.2.1.5.2. Conector o Espaciador 35

6.2.1.5.3. Grupos Protectores 35

6.2.1.5.4. Desprotección 40

6.2.1.5.5. Activación y acople 41

6.2.1.5.6. Desanclaje 43

6.3. Proteínas 44

6.3.1. Generalidades de las Proteínas. 44

6.3.2. Estructura de las proteínas 45

6.3.3. Clasificación de las Proteínas 46

6.4. Inmunogenicidad 46

6.4.1. Respuestas inmunes 46

6.4.2. Linfocitos 47

6.4.3. Antígeno 49

6.4.4. Reacción antígeno anticuerpo 49

6.5. Virus del Papiloma Humano 50

6.5.1. Generalidades del HPV 51

6.5.2. Clasificación del HPV 51

6.5.3. Genoma del HPV 52

6.5.4. Patogenia del HPV 53

6.5.5. Métodos de identificación del HPV 53

6.5.6. Vacunas contra HPV 55

7. METODOLOGÍA 57

7.1. Determinación de las secuencias a sintetizar. 57

7.2. Síntesis de péptidos 57

7.3. Desanclaje 61

7.4. Liofilización 61

7.5. Purificación 61

7.5.1. Desalinización mediante G-10 62

7.6. Caracterización del péptido 62

7.6.1. HPLC 62

7.6.2. Espectroscopía de masas 63

7.6.3. Espectroscopía de masas (MALDI-TOF) 63

7.6.4. Dicroísmo Circular 64

8. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 66

8.1. Determinación de las secuencias a sintetizar 66

8.2. Diseño de los péptidos 69

8.3. Resultados estructurales 70

8.3.1. Hélice 1 de HPV16 E7 70

8.3.3. Hélice 2 de HPV16 L1 78

8.3.4. Hélice 4 de HPV 16 L1 82

8.3.5. Loop FG de HPV16 L1 86

8.3.6. Loop HI de HPV16 L1 90

7.1. Rendimiento de la síntesis 93

7.1.2. Hélice 3 de HPV 16 E7 94

7.1.3. Hélice 2 de HPV 16 L1 95

7.1.4. Hélice 4 de HPV 16 L1 95

7.1.5. Loop FG de HPV 16 L1 96

7.1.6. Loop HI de HPV16 L1 96

9. CONCLUSIONES 98

10. RECOMENDACIONES. 99

11. REFERENCIAS 100

LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Fórmula estructural de los aminoácidos con cadenas laterales no polares. 23

Figura 2. Fórmula estructural de los aminoácidos con cadenas laterales polares no cargadas

Figura 3. Oxidación de dos cisteínas para formar un enlace disulfuro 24

Figura 4. Formula estructural de los aminoácidos con las cadenas laterales cargadas 24

Figura 5. Pentapéptido serilgliciltirosilalanil-leucina, en donde los enlaces peptídicos se

encuentran sombreados. 27

Figura 6. Interacciones de resonancia en el grupo peptídico 27

Figura 7. a. Estructura secundaria α hélice. b. Puentes de hidrógeno de la estructura α hélice.

Figura 8. a. Estructura secundaria hoja plegada β. b. conformación de lámina β. 28

Figura 9. Esquema de la síntesis de péptidos secuencial 32

Figura 10. Esquema de la síntesis de péptidos convergente 33

Figura 11. Esquema general de la síntesis de péptidos en fase sólida. 34

Figura 12. Resina Rink amide fmoc. Usado en la síntesis. 35

Figura 13. Protección de un aminoácido por cloruro de carbobenzoxilo. 36

Figura 14. Grupo protector temporal Fmoc 36

Figura 15. Grupo protector temporal Boc 36

Figura 16. Lisina protegida en el α-amino con el grupo Fmoc y en el ε-amino con un grupo

Boc. 37

Figura 17. Arginina protegida en el α-amino con el grupo Fmoc y en el grupo guanidino con

el grupo pbf. 38

Figura 18. Acido aspártico protegido en el α-amino por el grupo Fmoc y en la cadena lateral

con el grupo tBu 38

Figura 19. Cisteína protegido en el α-amino con el grupo Fmoc y en el grupo tiol de la cadena

lateral con el grupo Trt. 39

Figura 20. Serina protegido en el grupo α-amino por el grupo Fmoc y en la cadena lateral el

grupo tBu. 39

Figura 21. Histidina protegida en el grupo α-amino por el grupo Fmoc y en anillo imidazol

el grupo Trt. 40

Figura 22. Desprotección del grupo Fmoc de un aminoácido con piperidina, generando como

co-producto el aducto de la piperidina y el fluorenil meteno. 41

Figura 23. Estructura de activadores usados en la síntesis de péptidos, carbodiimidas (DCC,

DIPCDI), sales de fosfonio (BOP, PyBOP) y sales de uronio (HBTU, TBTU). 42

Figura 24. Estructura del aditivo oxyma 42

Figura 25. Mecanismo de activación del aminoácido a acoplar mediante HBTU y posterior

unión al péptido-resina. 43

Figura 26. Niveles estructurales de una proteína. 45

Figura 27. Componentes del sistema inmune. 47

Figura 28. Linfocito B. 48

Figura 29. Estructura de un anticuerpo 48

Figura 30. Funciones de un linfocito T 49

Figura 31. Tipos de unión entre antígeno anticuerpo 50

Figura 32. A. Representación de HPV. B. Micrografía electrónica del HPV 51

Figura 33. Conformación del HPV 52

Figura 34. Patogenia del VPH en la piel. 53

Figura 35. Esquema general de la síntesis por estrategia de bolsitas de Houghten. 57

Figura 36. Listado de la secuencias a sintetizar generada por el programa peptide.exe 58

Figura 37. Documento del primer acople generado por el programa peptide.exe 58

Figura 38. A. Azul de bromofenol positivo para aminas libres. B. Azul de bromofenol

negativo para aminas libres. 61

Figura 39. Péptido precipitado y lavado con éter frio. 61

Figura 40. Purificación mediante G-10 62

Figura 41. Equipo HPLC 63

Figura 42. Equipo de masas 63

Figura 43. A. Placas de acero para MALDI-TOF. B. Equipo MALDI-TOF 64

Figura 44. Equipo de dicroísmo circular 65

Figura 45. Secuencia de la proteína L1 de HPV genotipo 16 obtenida en PDB 66

Figura 46. Secuencia de la proteína E7 de HPV genotipo 16 obtenida en PDB 66

Figura 47. A. Fórmula estructural de la proteína HPV16 E7 B. Fórmula estructural de la

proteína HPV16 L1. Generadas en I-TASSER 67

Figura 48. Esquema de antigenicidad de la proteína HPV16 E7 68

Figura 49. Estructura terciaria de la proteína HPV 16 E7 generada en I-TASSER con los

fragmentos seleccionados a sintetizar 68

Figura 50. Esquema de antigenicidad de la proteína HPV16 L1 68

Figura 51. Estructura terciaria de la proteína HPV 16 L1 generada en I-TASSER con los

fragmentos seleccionados a sintetizar 69

Figura 52. Fórmula estructural de la secuencia lineal de hélice 1 HPV16 E7 70

Figura 53. Espectro cromatográfico de la secuencia lineal de hélice 1 HPV16 E7 71

Figura 54. Espectro de masas de la secuencia lineal de hélice 1 de HPV16 E7 72

Figura 55. Fórmula estructural de la hélice 1 de HPV 16 E7 72

Figura 56. Espectro cromatográfico de la hélice 1 de la proteína HPV16 E7 72

Figura 57. Espectro de masas de la hélice 1 de la proteína HPV16 E7 73

Figura 58. A. Dicroísmo circular de la secuencia lineal de la hélice 1 de HPV16 E7. B.

dicroísmo circular de la hélice 1 de HPV16 E7. C. Comparación del dicrísmo circular lineal

y restringido de la hélice 1 de HPV16 E7. 74

Figura 59. Fórmula estructural de la secuencia lineal de la hélice 3 de HPV16 E7 74

Figura 60. Espectro cromatográfico de la secuencia lineal de la hélice 3 de HPV16 E7 75

Figura 61. Espectro de masas de la secuencia lineal de la hélice 3 HPV16 E7 75

Figura 62. Formula estructural de hélice 3 de HPV16 E7 76

Figura 63. Espectro cromatográfico de la hélice 3 de la proteína HPV16 E7 76

Figura 64. Espectro de masas de la hélice 3 de la proteína HPV16 E7 77

Figura 65. Espectro de MALDI-TOF de la hélice 3 de la proteína E7 77

Figura 66. A. Dicroísmo circular de la secuencia lineal de la hélice 3 de HPV16 E7. B.

dicroísmo circular de la hélice 3 de HPV16 E7. C. Comparación del dicroísmo circular lineal

y restringido de la hélice 3 de HPV16 E7. 78

Figura 67. Fórmula estructural de la secuencia lineal de la hélice 2 de HPV16 L1 78

Figura 68. Espectro cromatográfico de la secuencia lineal de hélice 2 de HPV16 L1 79

Figura 69. Espectro de masas de la secuencia lineal de hélice 2 de HPV16 L1 79

Figura 70. Fórmula estructural de la hélice 2 de HPV16 L1 80

Figura 71. Espectro cromatográfico de la hélice 2 de HPV 16 L1 80

Figura 72. Espectro de masas de hélice 2 de HPV 16 L1 81

Figura 73. A. Dicroísmo circular de la secuencia lineal de la hélice 2 de HPV16 L1. B.

dicroísmo circular de la hélice 2 de HPV16 L1. C. Comparación del dicroísmo circular lineal

y restringido de la hélice 2 de HPV16 L1. 81

Figura 74. Fórmula estructural de la secuencia lineal de la hélice 4 de HPV16 L1 82

Figura 75. Espectro cromatográfico de la secuencia lineal de la hélice 4 de HPV16 L1 83

Figura 76. Espectro de masas de la secuencia lineal de la hélice 4 de HPV16 L1 83

Figura 77. Fórmula estructural de la hélice 4 de HPV16 L1 83

Figura 78. Espectro cromatográfico de la hélice 4 de HPV16 L1 84

Figura 79. Espectro de masas de la hélice 4 de HPV16 L1. 84

dicroísmo circular de la hélice 4 de HPV16 L1. C. Comparación del dicroísmo circular lineal

y restringido de la hélice 4 de HPV16 L1. 85

Figura 81. Fórmula estructural de la secuencia lineal de la loop FG de HPV16 L1 86

Figura 82. Espectro cromatográfico de la secuencia lineal de la loop FG de HPV16 L1 86

Figura 83. Espectro cromatográfico de la secuencia lineal de la loop FG de HPV16 L1 87

Figura 84. Fórmula estructural de la loop FG de HPV16 L1 87

Figura 85. Espectro cromatográfico de la loop FG de HPV16 L1 88

Figura 86. Espectro de masas de la loop FG de HPV16 L1 89

Figura 87. Dicroísmo circular de la secuencia lineal de la loop FG de HPV16 L1. B.

dicroísmo circular de la loop FG de HPV16 L1. C. Comparación del dicroísmo circular lineal

y restringido de la loop FG de HPV16 L1. 89

Figura 88. Fórmula estructural de la secuencia lineal de la loop HI de HPV16 L1 90

Figura 89. Espectro cromatográfico de la secuencia lineal de la loop HI de HPV16 L1 90

Figura 90. Espectro de masas de la secuencia lineal de loop HI de HPV16 L1 91

Figura 91. Fórmula estructural de la loop HI de HPV16 L1 91

Figura 92. Espectro cromatográfico de la loop HI de HPV16 L1 92

Figura 93. Espectro de masas de la loop HI de HPV16 L1 92

Figura 94. Dicroísmo circular de la secuencia lineal de la loop HI de HPV16 L1. B.

dicroísmo circular de la loop HI de HPV16 L1. C. Comparación del dicroísmo circular lineal

y restringido de la loop HI de HPV16 L1 93

LISTA DE TABLAS

Tabla 1. Convenciones y propiedades de los aminoácidos indispensables. 25

Tabla 2. Frecuencias relativas con las que se encuentra a los distintos aminoácidos en las

estructuras secundarias de las proteínas. 29

Tabla 3. Tipos de HPV y su correlación clínica 52

Tabla 4. Características generales de las vacunas contra HPV 56

Tabla 5. Secuencias de las proteínas HPV16 E7 y HPV16 L1 escogidas para sintetizar 70

RESUMEN

En la actualidad, se han generado alrededor de 500.000 muertes anuales a nivel mundial

debido al cáncer de cuello uterino, problemática de salubridad que llegó además al ámbito

social, junto con su precursor, el virus del papiloma humano, por lo cual se hace necesario

empezar a generar nuevos métodos de tratamiento y diagnóstico de estos.

Los diversos estudios en péptidos han llevado a creer que el diseño de secuencias claves de

proteínas nativas, pueden ser la solución para generar mimos estructurales que generen una

gran respuesta inmune frente a virus que generan enfermedades graves.

La mayoría de investigaciones realizadas del virus del papiloma humano han sido con las

proteínas L1 por conformar el 95% de la cápside del virus y la E7 puesto que es una de las

responsables de inmortalizar la célula hospedero y del proceso cancerígeno.

De acuerdo a lo anterior se realizó esta investigación, empezando con la búsqueda de las

proteínas L1 y E7 del virus del papiloma humano genotipo 16 en la base de datos Protein

Data Bank (PDB), estos datos se trabajaron en I-TASSER, en donde se realizó un blast de

estas y se generó una aproximación de la estructura terciaria, esta se analizó y se determinaron

los fragmentos con restricción conformacional que se encuentran expuestos y presentan una

alta antigenicidad.

De la proteína HPV16 E7 se eligieron las hélices 1 y 3 presentes entre los residuos 7 a 16 y

74 a 84 respectivamente. De la proteína HPV16 L1 se eligieron las hélices 2 y 4 presentes

entre los residuos 385 a 394 y 414 a 425 respectivamente y las loops FG y HI siendo los

residuos 273 a 284 y 348 a 360 respectivamente. Obteniendo así un total de 6 péptidos, los

cuales se sintetizaron con su respectiva restricción conformacional y su homólogo lineal

mediante la estrategia de síntesis de péptidos en fase sólida Fmoc.

Para generar las debidas restricciones conformacionales de cada una de las secuencias se

utilizó el sitio de nucleación JAZ (en proceso de patente por parte de la Universidad Distrital

y grupo Poteoma), el cual logró estabilizar las conformaciones alfa-hélice y loop de las

diferentes secuencias cortas.

De cada uno de los péptidos sintetizados se realizó análisis por HPLC, masas y dicroísmo

circular, mediante los cuales se evidencia la obtención de los péptidos deseados al igual que

la formación y estabilización de las restricciones conformacionales correspondientes, la

mayoría con niveles de pureza y porcentajes de rendimientos altos.

1. INTRODUCCIÓN

Este Trabajo de Grado, se realizó en el Grupo de Investigación Proteoma de Licenciatura en

Biología de la Universidad Distrital Francisco José de Caldas con colaboración del Núcleo

Biotecnología Curauma de la Pontificia Universidad Católica de Valparaíso, Chile. En donde

se utilizó la síntesis de péptidos como estrategia para imitar la estructura de fragmentos de

proteínas nativas, teniendo en cuenta que este es un punto importante para la comprensión de

las interacciones de las proteínas [1].

Por lo anteriormente mencionado se realizó el diseño y la síntesis de fragmentos con y sin

restricción conformacional a alfa- hélice y loop de las proteínas L1 y E7 del virus del

papiloma humano (VPH) tipo 16, para lo cual se desarrolló una metodología que permitió

obtener los fragmentos más expuestos de las proteínas simulando de la mejor manera su

forma natural, siendo esta última el punto clave, teniendo en cuenta que los determinantes

antigénicos son reconocidos por el anticuerpo siempre y cuando se considere la conformación

y distribución espacial relativa de los segmentos constituyentes de la proteína nativa, debido

a que la especificidad del reconocimiento es el resultado de la complementariedad física y

química de las superficies interactuantes [2].

Con esta síntesis se esperó realizar un análisis inmunológico en donde se demuestre la posible

respuesta inmune inducida por los fragmentos sintetizados y así proponer en un futuro, una

metodología como posible candidato a método de diagnóstico del VPH, y con este aumentar

los índices de detección temprana del virus, contrastando con la prueba de detección actual,

Papanicolaou Frotis, la cual tiene una baja aceptación por parte de las pacientes debido a la

incomodidad que presenta su metodología y además manifiesta una baja sensibilidad para la

detección de precursores de cáncer de cuello uterino, siendo ésta alrededor del 50% [3].

2. PROBLEMA

2.1. DEFINICIÓN

¿Es posible diseñar y sintetizar péptidos con restricción conformacional, que imiten de la

mejor manera regiones helicoidales que se encuentran expuestas en las proteínas HPV 16 L1

y HPV 16 E7, para poder proponer métodos de diagnóstico en un futuro?

2.2. DESCRIPCION Y DELIMITACIÓN

En la década de 1990 el principal tipo de cáncer que provocó muertes a nivel mundial fue el

cáncer de cuello uterino; en este momento, la mayor tasa de mortandad corresponde al cáncer

de mama, pero el cáncer de cuello uterino sigue representando un nivel de riesgo muy alto,

estimándose que causa alrededor de 500.000 muertes al año en todo el mundo.

Algunos tipos de VPH son precursores del cáncer de cuello uterino, entre estos los tipos 16,

18 y 31, los cuales se encuentran muy presentes en las mujeres colombianas, por lo cual la

detección tardía de cualquiera de estos tipos del virus aumenta notablemente los índice de

mortalidad por cáncer de cuello uterino, por esto se ha visto la necesidad de buscar y revisar

métodos de diagnóstico que presenten nuevas estrategias para la predicción y prevención de

la enfermedad, generando nuevos métodos más eficientes en tiempo, calidad y aceptación

del paciente.

Este proyecto busca diseñar y la sintetizar péptidos que imiten de la mejor manera epítopes

de la proteína nativa, logrando un incremento en la especificidad y en la energía de unión en

la reacción antígeno-anticuerpo en sitios específicos de las proteínas VPH 16 L1 y VPH 16

3. ANTECEDENTES Y JUSTIFICACIÓN

Emil Fisher desarrollo la síntesis de péptidos en 1901, al sintetizar químicamente un

dipéptido con el concepto de que esto era análogo a sintetizar una amida; luego fue necesario

empezar a generar grupos protectores para los grupos amino y las cadenas laterales de los

aminoácidos, destacándose Bergmann y Zervas al desarrollar protección mediante el grupo

carbobenzoxilo en 1932 [4]. Posteriormente, en 1986, Merrifield realiza la síntesis de

péptidos en fase sólida, consolidándose como uno de los padres de la síntesis de péptidos al

generar un procedimiento mucho más sencillo, rápido y con buenos rendimientos [5]

En 1995 se empiezan a desarrollar métodos para generar restricción conformacional en los

péptidos sintetizados, de manera que estos imiten estructuralmente a la proteína nativa,

puesto que de esta manera se aumentan las posibilidades de que el péptido sintetizado

reaccione con anticuerpos neutralizantes antiproteína [6]. Posteriormente, en 1999, se realiza

la síntesis de oxitocina, (primera molécula sintetizada por síntesis de péptidos en fase líquida

en 1952) determinándose que al usar la estrategia de síntesis de fase sólida Fmoc se obtienen

buenos resultados para la ciclación del péptido, inclusive superando el rendimiento obtenido

mediante la estrategia t-boc [7].

En el año 2003 se implementa la restricción conformacional al realizar la comparación de

reacción antígeno anticuerpo por pruebas de Elisa de un suero de conejo antigameto con

presencia del anticuerpo 4B7 contra un péptido sintético de 10 residuos de la proteína Pfs 25

de falciparum (proteína principal de la malaria) tanto lineal como con conformación loop,

determinándose que los anticuerpos mostraron baja reacción con el péptido lineal y por el

contrario, alta reacción con el péptido restringido conformacionalmente [8].

Para el año 2003 era muy alto el número de mujeres afectadas por el cáncer de cuello uterino,

por lo cual este se volvió un punto importante de investigación tanto para encontrar mejores

métodos de identificación como vacunas, sintetizando varios epítopes de una proteína de

cáncer de cuello uterino con restricción conformacional de hélice y realizar pruebas de Elisa,

con estos se determinó que tenían una reacción positiva muy fuerte con sueros de mujeres

con carcinoma invasor del cuello uterino y por el contrario no se generó reacción con los

sueros de pacientes con otro tipo de cáncer, niños o mujeres sanas, lo cual nos muestra que

al restringir los péptidos, estos pueden ser reconocidos por otros anticuerpos que de manera

lineal no se reconocerían [9].

Para este mismo año se sabía que el virus del papiloma humano tipo 16 era el que más

afectaba a las mujeres colombianas y uno de los más invasivos, mediante la búsqueda de

epítopes de la proteína E7 de este virus, se determinó que varios fragmentos presentaron alta

reactividad contra sueros de mujeres infectadas, sobre todo si estos fragmentos presentaban

restricción conformacional, entre estas se determinó la hélice 1 y una loop, por el contrario

la hélice 2 no presentó ninguna reactividad [10].

Para el 2004 se determinó que la complementariedad entre el anticuerpo y el antígeno, y la

afinidad depende de la sumatoria de las fuerzas atractivas y repulsivas entre ellos, esto se

logró mediante la utilización de secuencias cortas de aminoácidos que se corresponden con

secuencias de proteínas con importancia funcional en una forma que sea fácil y libremente

accesible. Esto se puede lograr en el caso de presentar la secuencia unida a un brazo ligando

que le permite estar libre en un medio fluido con acceso por todos los costados de la molécula,

este método se implementó con el uso de las proteínas albúmina sérica bovina (BSA) y ovo-

albumina (OVA), con brazos ligantes de maleimida, que permite unir el péptido a este quedar

expuesto para su reconocimiento por los anticuerpos; para esto se utilizaron péptidos control

fijados directamente a platos de ELISA. Los resultados obtenidos en este estudio

determinaron la mejora del reconocimiento de los antígenos hacia los anticuerpos al estar

ligados con un brazo y fijados directamente [11]

4. OBJETIVOS

4.1. GENERAL

Diseñar y sintetizar péptidos con y sin restricción conformacional que imiten de la mejor

manera la estructura de las proteínas nativas HPV16 L1 y HPV16 E7 para posteriormente

determinar la reactividad antígeno-anticuerpo.

4.2. ESPECIFICOS

Analizar los datos estructurales de las proteínas HPV16 L1 y HPV16 E7

Seleccionar secuencias correspondientes a los fragmentos con restricción conformacional

que se encuentren expuestos en las proteínas HPV16 L1 y HPV16 E7

Sintetizar péptidos con y sin restricción conformacional ya reportados y otros propuestos a

en este trabajo, mediante la metodología F-moc

Caracterizar los péptidos sintetizados con y sin restricción conformacional de las proteínas

HPV16 L1 y HPV 16 E7

5. HIPÓTESIS

Al sintetizar péptidos que imiten de la mejor manera fragmentos de la proteína nativa HPV16

L1 y HPV16 E7 es posible identificar anticuerpos contra epítopes conformacionales,

presentes solo en la estructura nativa de la proteína.

6. MARCO TEÓRICO

Cada uno de los conceptos teóricos que se encuentran a continuación, están enmarcados en

el interés de esta investigación, puesto que desde los péptidos, las proteínas, sus funciones y

formas son fundamentales para realizar su síntesis y determinar su reactividad antígeno

anticuerpo

6.1. Aminoácidos

Los aminoácidos son compuestos orgánicos característicos por poseer un grupo amino ya sea

primario o secundario y un grupo ácido que en su mayoría es un grupo carboxilo, lo que le

confiere un carácter anfotero. En la naturaleza existen más de 500 aa, pero en los diferentes

organismos solo se presentan de forma común 20 aa indispensables para la vida, por lo que

son conocidos como aa fundamentales, en los cuales el grupo amino se encuentra en la

posición α y los radicales que se pueden unir a este son muy variados, como alifáticos o

aromatocos, no polares de diversa longitud y ramificación, grupos polares sin carga

(hidroxilo, tiol, amida) o cargados positiva o negativamente (aminoácidos dibásicos o

dicarboxílicos) [12, 13]

El método más sencillo y común de clasificación de los aminoácidos es mediante la polaridad

de sus cadenas laterales o grupos radicales, puesto que las proteínas se pliegan de manera

que las cadenas laterales hidrófilas queden expuestas y las cadenas laterales hidrofóbicas

queden al interior de esta manera alejándolas del contacto con el agua. De acuerdo con esto

se encontrarían 3 grupos de aa: 1) con cadena lateral apolar, 2) con cadena lateral no cargada

y 3) con cadenas laterales polares cargadas [14].

6.1.1. Aminoácidos con cadena lateral apolar

Se presentan nueve aa con cadenas laterales apolares, comenzando con glicina el cual al

poseer de cadena lateral un átomo de hidrógeno es el de menor tamaño, la alanina, valina,

leucina e isoleucina presentan cadenas laterales hidrocarbonadas alifáticas las cuales varían

su tamaño entre el grupo metilo de la alanina y los grupos butilo isoméricos de la leucina e

isoleucina. La metionina posee una cadena lateral tiol éter que presenta gran semejanza de

propiedades físicas con un grupo n-butilo, esto debido a la similitud de electronegatividad de

C y S y de tamaño entre S y el grupo metileno. La prolina se caracteriza por ser un aa cíclico

gracias a la pirrilodina que posee por cadena lateral, esto le genera restricción

conformacional. La fenilalanina presenta un radical bencilo y el triptófano un grupo indol,

siendo aa con cadenas laterales aromáticas.

Debido a que son aa con cadenas laterales apolares, tienden a esconderse en el interior de las

estructuras de las proteínas, alejándose de esta manera del medio acuóso [14, 15, 16].

Figura 1. Fórmula estructural de los aminoácidos con cadenas laterales no polares.

Tomado de: [14]

6.1.2. Aminoácidos con cadenas laterales polares sin carga

Figura 2. Fórmula estructural de los aminoácidos con cadenas laterales polares no cargadas

Tomado de: [14]

En este grupo se encuentran seis aa, la serina y la treonina poseen cadenas laterales hidroxilo

de diferentes tamaños. La asparagina y glutamina poseen cadenas laterales amidas de

distintos tamaños, la tirosina posee un grupo fenólico, el cual es responsable de la absorción

en UV junto con fenilalanina y triptófano. La cisteína posee un grupo tiol muy característico,

puesto que mediante la oxidación de este grupo puede formar un puente disulfuro con otra

cisteína (Figura 3), este enlace es de gran importancia puesto que puede generar restricciones

en las proteínas o unión de varias de estas.

Figura 3. Oxidación de dos cisteínas para formar un enlace disulfuro

Tomado de: [14]

6.1.3. Aminoácidos con cadenas laterales polares cargadas

En este grupo se encuentran cinco aa, de los cuales tres presentan carga positiva a valores de

pH fisiológico, estos son la lisina que posee un butilamonio por cadena lateral, la arginina

que posee un grupo guanidinio y la histidina, una de cuyas mitades es el imidazol. Por otro

lado se presentan los dos aa ácidos, siendo el ácido aspártico y el ácido glutámico con cadenas

laterales carboxílicas de diferentes tamaños, estas presentan carga positiva por encima de un

Figura 4. Formula estructural de los aminoácidos con las cadenas laterales cargadas

Tomado de: [14]

Debido a esto los aminoácidos presentan propiedades o características diferentes, las cuales

se encuentran en la tabla 1.

Tabla 1. Convenciones y propiedades de los aminoácidos indispensables.

6.2. Péptidos

Los péptidos están formados por la unión de varios aminoácidos. Son sustancias orgánicas,

que se diferencian de las proteínas al ser más pequeñas y livianas, pero muy similares en su

estructura y se encuentran presentes en la mayoría de tejidos incluyendo hormonas,

antibióticos y antimicrobianos. Los seres vivos poseen una enorme cantidad de proteínas que

participan en diversos procesos del cuerpo que son necesarios para el mantenimiento de la

vida [7, 17].

6.2.1. Generalidades

Además de que los péptidos son más pequeñas y presentan menor peso molecular que las

proteínas, estas últimas pueden estar formadas por la unión de varios polipéptidos. Puesto

que están formados de la unión de varios aminoácidos, también presentan un grupo amino

termina un grupo carboxilo terminal y varios grupos radicales ionizables, por lo cual los

péptidos también presentan un comportamiento anfótero el cual permite la regulación

homeostática de los diferentes organismos.

La mayoría de las propiedades de los péptidos dependen en gran medida de su composición,

puesto que a pesar de que todos están compuestos por los 20 aminoácidos esenciales, no se

encuentran en las mismas proporciones, por lo cual la presencia de un aminoácido en una

posición particular influye en gran medida, todo esto genera que los péptidos tomen

diferentes conformaciones tridimensionales, además de las diferentes fuerzas

intramoleculares entre residuos, normalmente, los residuos hidrófobos se juntan en el interior

del péptido fuera del contacto con el agua, mientras que las cadenas hidrófilas tienden a

ocupar la superficie de la proteína. [17, 18].

6.2.2. Enlace peptídico

Los péptidos están formados por la unión de varios aminoácidos, al unirse un aminoácido

con otro se genera un enlace covalente llamado enlace peptídico (Figura 5). Este enlace se

genera por la reacción que se presenta entre el grupo carboxilo de un aminoácido con el grupo

amino de otro formando una amida mediante la perdida de una molécula de agua. Debido al

enlace peptídico, se presenta una estructura plana rígida (Figura 6), la cual es consecuencia

de las interacciones de resonancia que le dan al enlace peptídico un carácter del 40% de doble

enlace [15, 18].

Figura 5. Pentapéptido serilgliciltirosilalanil-leucina, en donde los enlaces peptídicos se

encuentran sombreados.

Tomado de: [19]

Figura 6. Interacciones de resonancia en el grupo peptídico

Tomado de: [15]

6.2.3. Estructura

Los péptidos presentan una estructura primaria la cual es una descripción de los enlaces

covalentes, principalmente los enlaces peptídicos y disulfuros, que unen cada aminoácido,

esta determina su forma y función general. Esta estructura es muy importante puesto que el

cambio de un solo aminoácido puede generar un cambio total en la función del péptido.

Sin embargo, los péptidos y proteínas se doblan de manera que los segmentos de la cadena

se orientan y forman patrones regulares, llamadas estructuras secundarias. Las más comunes

y conocidas que se generan son la α hélice y la loop

6.2.3.1. Conformación α hélice

Es la estructura más frecuente en péptidos y proteínas, en donde la estructura del esqueleto

polipeptídico se encuentra enrollado en una espiral helicoidal la cual está estabilizada por la

formación de puentes de hidrógeno entre el grupo N-H de un aminoácido y el grupo C-O de

otro aminoácido a cuatro residuos de distancia (Figura 7). Cada vuelta de hélice tiene 3.6

residuos de aminoácidos.

Figura 7. a. Estructura secundaria α hélice. b. Puentes de hidrógeno de la estructura α

hélice.

Tomado de: [19, 20]

6.2.3.2. Conformación lamina beta o loop

Esta conformación se genera cuando una cadena se dobla hacia atrás sobre sí misma después

de tener un doblez de horquilla y las dos secciones a cada lado de esta se alinean de manera

paralela unido por puentes de hidrogeno (Figura 8) [20, 21].

Figura 8. a. Estructura secundaria hoja plegada β. b. conformación de lámina β.

Tomado de: [20, 21]

Tabla 2. Frecuencias relativas con las que se encuentra a los distintos aminoácidos en las

estructuras secundarias de las proteínas.

Tomado de: [22]

Aminoácido Hélice Hoja Giro

Ala 1'29 0'90 0'78

Cys 1'11 0'74 0'80

Leu 1'30 1'02 0'59

Met 1'47 0'97 0'39

Glu 1'44 0'75 1'00

Gln 1'27 0'80 0'97

His 1'22 1'08 0'69

Lys 1'23 0'77 0'96

Val 0'91 1'49 0'47

Ile 0'97 1'45 0'51

Phe 1'07 1'32 0'58

Tyr 0'72 1'25 1'05

Trp 0'99 1'14 0'75

Thr 0'82 1'21 1'03

Gly 0'56 0'92 1'64

Ser 0'82 0'95 1'33

Asp 1'04 0'72 1'41

Asn 0'90 0'76 1'28

Pro 0'52 0'64 1'91

Arg 0'96 0'99 0'88

6.2.4. Aplicaciones de los péptidos

Debido a la naturaleza de las proteínas y su gran ayuda para la investigación, se han

desarrollado diferentes métodos de síntesis de estos, teniendo una gran variedad de campos

de estudio.

6.2.4.1. Estudio del plegamiento de proteínas

Debido a la relación directa entre la secuencia del péptido y la estructura secundaria que

toma, se han dedicado estudios en determinar que estructura va a tomar un péptido con una

secuencia determinada. Y por tanto, también se busca saber que secuencias son compatibles

con determinada restricción conformacional.

Los esfuerzos en este campo se han dirigido en tres direcciones distintas. La primera consiste

en generar péptidos que reproduzcan las estructuras presentes en los primeros plegamientos.

La segunda estrategia es encontrar péptidos de la menor complejidad para que se plieguen de

una forma deseada. Y finalmente se han generado proteínas artificiales que adopten

plegamientos complejos similares o análogos a los de proteínas naturales

6.2.4.2. Péptidos miméticos

La implicación de los péptidos en un gran rango de procesos fisiológicos, desempeñando

funciones hormonales y neurotransmisoras, hace que la modulación con antagonistas de los

receptores peptídicos asociados a la superficie celular o la inhibición de las enzimas

implicadas en su biosíntesis o degradación.

Sin embargo, la utilización de péptidos como posibles fuentes de fármacos ha tenido

diferentes problemas como la baja estabilidad metabólica, escasa disponibilidad oral por el

alto peso molecular y la baja selectividad de acción. Para solucionar esto surgen los péptidos

miméticos siendo estructuras no peptídicas capaces de mimetizar o bloquear el efecto

biológico del péptido en cuestión.

6.2.4.3. Neuropéptidos funcionales

Se han sintetizado gran variedad de péptidos funcionales principalmente neuropéptidos los

cuales han sido clasificados según la función que regulan, destacando el metabolismo

energético en donde se regulan los niveles glúcidos y lípidos en cuerpo graso, equilibrio

iónico y regulación de funciones musculares [23].

6.2.4.4. Antigenicidad e inmunidad

La identificación y caracterización estructural y funcional de las regiones de un antígeno que

interacciona con anticuerpos, denominadas epítopes B, son de gran relevancia para entender

y tratar de manipular la respuesta del sistema inmune frente a agentes patógenos como

bacterias y virus. En los estudios realizados se han utilizado péptidos sintéticos como

antígenos en el reconocimiento de una proteína por anticuerpos inducidos frente a ésta, o

como inmunógenos inductores de anticuerpos que reconocen una proteína nativa

6.2.4.5. Fármacos peptídicos

En la actualidad son pocos los fármacos que poseen un punto de acción y una frecuencia

adecuada, por lo cual, se hizo necesario desarrollar métodos de direccionamiento selectivo

hacia células o tejidos diana. Sin embargo los péptidos pueden ser transportados como

fármacos o por otro lado pueden actuar como vectores. Por lo tanto el péptido es un fármaco,

puede incluir respuesta inmune y tiene estructura y secuencia reconocida por el receptor [23].

6.2.4.6. Epítopes B

Los epítopes B son las regiones de un antígeno que interactúan con anticuerpos, generándose

así una respuesta inmune, para poder entenderla es importante caracterizar la estructura y

función de los epítopes B, los cuales se pueden clasificar en epítopes estructurales,

funcionales y energéticos.

Los epítopes estructurales están formados por aminoácidos que se encuentran en la superficie

de una proteína y que realizan contacto con un anticuerpo determinado. Los epítopes

funcionales están constituidos por determinados residuos de una proteína que al ser

sustituidos modifican la afinidad por el anticuerpo correspondiente. Los epítopes energéticos

son aquellos residuos de proteína que están vinculados directamente en interacciones con

residuos del anticuerpo, esto conlleva a que solo determinados epítopes funcionales harán

parte de los epítopes energéticos [24].

6.2.4.7. Péptidos como vacunas

Uno de los objetivos en la aplicabilidad de péptidos ha sido la posible utilización en el diseño

de vacunas peptídicas efectivas. La mimetización aproximada puede ser suficiente para

obtener una razonable inmunogenicidad cruzada entre péptido y proteína. De momento, sólo

algunos sitios antigénicos que incluyen epítopes B han demostrado una relativa eficacia como

vacunas peptídicas experimentales [25].

6.2.5. Síntesis de péptidos.

En este momento se conocen dos métodos para realizar la síntesis de péptidos, la secuencial

y la convergente. La síntesis secuencial se basa en la elongación secuencial, aminoácido por

aminoácido de la cadena peptídica, empezando del extremo C- terminal y finalizando en el

extremo N- terminal (Figura 9), este método es mayormente utilizado para secuencias con

menos de 50 residuos.

En la metodología convergente se producen péptidos pequeños (hasta de 50 residuos) por

síntesis secuencial por separado y luego, se unen estos péptidos para de esta manera obtener

péptidos de alto peso molecular o proteínas (Figura 10). La ventaja de la síntesis convergente

es que se puede realizar una purificación y caracterización de cada fragmento de péptido

antes de ser vinculados, así, se reducen al mínimo reacciones secundarias [26, 27].

Figura 9. Esquema de la síntesis de péptidos secuencial

Tomado de: [27]

Figura 10. Esquema de la síntesis de péptidos convergente

Tomado de: [27].

Desde los primeros trabajos realizados por Fisher, las diferentes síntesis de péptidos se

realizaron en solución, hasta 1963 cuando Merrifield describió el método de síntesis de

péptidos en fase sólida (Figura 11), basada en que el protector de la función carboxilo C-

terminal se encuentra unido de forma covalente a un polímero y por tanto, el componente

que contiene este extremo es insoluble en los diferentes solventes usados, de esta manera, los

excesos de reactivos y los productos secundarios se pueden eliminar por filtración y lavado

del polímero con el péptido [23].

Figura 11. Esquema general de la síntesis de péptidos en fase sólida.

Tomado de: [28]

Se conocen dos estrategias dentro de la síntesis de péptidos en fase sólida, la estrategia

BOc/Bzl y la estrategia Fmoc/tBu. La estrategia Boc/Bzl utiliza el grupo tert-butoxicarbonil

(Boc) como protector de los grupos aminos y grupos del tipo benzil (Bzl) para proteger las

cadenas [28].

6.2.5.1. Síntesis de péptidos por estrategia Fmoc/tBu

La síntesis de péptidos por estrategia Fmoc es una de las más utilizadas en la actualidad

puesto que a pesar de que sus reactivos son un poco costosos, la síntesis es más rápida y no

necesita de un equipo especial.

6.2.5.1.1. Soportes sólidos o Resinas

En los últimos años se han desarrollado un gran número de matrices o resinas para la síntesis

de péptidos en fase sólida, estas deben de cumplir con ciertos requisitos para que la síntesis

sea exitosa. El soporte debe ser estable mecánica, física y químicamente, permitiendo la

filtración y la agitación, los granos deben ser uniformes del orden de micrómetros, debe ser

estable a las variaciones de temperatura, debe poseer una buena capacidad de hinchamiento

en un alto rango de solventes y debe ser estable a ácidos, bases, agentes oxidantes y

reductores.

Entre los más usados se encuentra el polímero de estireno (Figura 12), el cual al estar seco

presenta esferas de aproximadamente 50µm de diámetro, pero con solventes como DCM

(diclorometano), DMF (dimetilformamida) o DMA (dimetilacetamida), aumentan su

volumen, hinchándose entre 2,5 a 6,0 veces su volumen inicial [28, 29].

Figura 12. Resina Rink amide fmoc. Usado en la síntesis.

Tomado de: [30]

6.2.1.5.2. Conector o Espaciador

El anclaje y el desprendimiento del péptido de la resina se logra usando moléculas

bifuncionales denominadas espaciadores, estas moléculas se unen de manera permanente a

la resina por un extremo, normalmente mediante un enlace amida, y por el otro se une

temporalmente al primer aminoácido de la secuencia peptídica mediante un enlace de tipo

éster. Para la liberación de péptidos en forma amida mediante la estrategia Fmoc se utilizan

los espaciadores Rink, Xal y PAL [30].

6.2.1.5.3. Grupos Protectores

Para poder realizar un enlace peptídico entre dos aminoácidos es necesario que todas las

funciones estén protegidas exceptuando las dos entre las que se va a dar el enlace. Los grupos

protectores deben de ser químicamente estables en las condiciones en las que se da el acople

y además debe de ser fácilmente removible en condiciones suaves que no alteren el enlace

peptídico, por lo cual, se pueden encontrar grupos protectores permanentes, los cuales son

retenidos hasta que la secuencia peptídica ha sido completada, y temporales los cuales se

eliminan al finalizar cada etapa de síntesis.

Entre los grupos protectores temporales se encuentran los de α-amino, los cuales suprimen

su reactividad nucleofílica. Estos son derivados del uretano desde que Bergmann y Zervas

determinaran que son los más adecuados para la protección del α-amino, como el

benciloxicarbonil (Z), el cual está basado en la acilación de una amina con cloruro de

carbobenzoxilo para generar una amida (Figura 13) [17].

Figura 13. Protección de un aminoácido por cloruro de carbobenzoxilo.

Tomado de: [17]

Los más trabajados son el fluorenil 9 metoxicarbonil (Fmoc) (Figura 14) y el t-butoxicarbonil

(Boc) (Figura 15), el primero se obtiene a partir de su respectivo cloruro de acilo, este grupo

es muy estable en medios ácidos pero puede removerse fácilmente en condiciones básicas.

El grupo Boc es obtenido del anhídrido correspondiente al grupo protector, este grupo es lábil

en disolución de ácido trifluoroacético

Figura 14. Grupo protector temporal Fmoc

Tomado de: [17]

Figura 15. Grupo protector temporal Boc

Tomado de: [https://www.google.com.co/search?q=grupo+protector+boc&biw=1366&bih=623&source=lnms&tbm=isch

&sa=X&ved=0ahUKEwj8386KvJrKAhXIQyYKHXQlCEEQ_AUIBygC#tbm=isch&q=grupo+protector+fm

oc&imgrc=CkXK1svf6szggM%3A]

Entre los grupos protectores permanentes encontramos todos aquellos de las cadenas laterales

de los diferentes aminoácidos, los cuales solo se eliminan al finalizar la síntesis. Las cadenas

laterales le confieren propiedades especiales a cada aminoácido, aunque no todas son iguales

de reactivas, se debe tener en cuenta que pueden afectar en la síntesis por lo cual la mayoría

de estas deben estar protegidas.

La lisina al presentar en su cadena lateral un grupo amino bastante nucleofílico, si no se

protegiera, generaría rápida unión y por tanto se obtendrían péptidos ramificados, esta

cualidad se puede aprovechar para sintetizar péptidos especiales como dímeros, pero para

síntesis normal la mayoría de veces se encuentra protegido con un grupo boc (Figura 16)

Figura 16. Lisina protegida en el α-amino con el grupo Fmoc y en el ε-amino con un grupo

Tomado de: Catalogo Merck. Disponible en: http://www.merckmillipore.com/INTERSHOP/web/WFS/Merck-CO-Site/es_ES/-

/COP/ViewParametricSearch-

SimpleOfferSearch?SynchronizerToken=3d0f10b83106a656fdc909c60a20f8f050c1db0c0a6bc578727ba84bd

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La arginina también presenta una cadena lateral reactiva al presentar un grupo guanidino,

aunque en las condiciones de acople y desprotección este grupo se encuentra protonado y por

tanto no reacciona fácilmente, si puede generar problemas de solubilidad. El grupo protector

más común de este es el pbf (Figura 17)

Los ácidos aspártico (Figura 18) y glutámico al poseer grupos ácidos en sus cadenas laterales,

pueden generar. De la misma manera que la lisina, reacción al realizar el acople y por tanto

crecimiento del péptido por la cadena lateral. Para estos es normalmente utilizado el grupo

protector bencil o el t-butil ester (tBu).

La cisteína posee una de las cadenas laterales más importantes para la síntesis de péptidos,

puesto que al poseer un grupo tiol, permite la formación de puentes disulfuro. Sea que se

desee hacer el puente disulfuro o no este grupo debe de estar protegido para que no interfiera

en la formación del enlace peptídico. Este grupo tiene gran variedad de grupos protectores

para el grupo tiol como Trt (Figura 19), Acm, Mob, TMob y Meb.

Figura 17. Arginina protegida en el α-amino con el grupo Fmoc y en el grupo guanidino

con el grupo pbf.

Tomado de: Catalogo de Merck. Disponible en: http://www.merckmillipore.com/INTERSHOP/web/WFS/Merck-CO-Site/es_ES/-/COP/ViewParametricSearch-

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Figura 18. Acido aspártico protegido en el α-amino por el grupo Fmoc y en la cadena

lateral con el grupo tBu

Tomado de: Catalogo Merck. Disponible en: http://www.merckmillipore.com/CO/es/product/Fmoc-

Asp%28OtBu%29-OH,MDA_CHEM-

852005?CategoryName=0000002600024bd800010023&CategoryDomainName=Merck-MerckMillipore

Figura 19. Cisteína protegido en el α-amino con el grupo Fmoc y en el grupo tiol de la

cadena lateral con el grupo Trt.

Tomado de: Catalogo Merck. Disponible en: http://www.merckmillipore.com/INTERSHOP/web/WFS/Merck-CO-

Site/es_ES/-/COP/ViewParametricSearch-

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La serina (Figura 20), treonina y tirosina presenta en sus cadenas laterales grupos hidroxilos

los cuales no son altamente influyentes en la formación del enlace peptídico pero es mejor

protegerlos de la misma manera que el anillo indólico del triptófano el cual es capaz de

atrapar reactivos electrofílicos con gran facilidad. El grupo protector que normalmente se

utiliza en las cadenas laterales estos aminoácidos es el tBu.

Figura 20. Serina protegido en el grupo α-amino por el grupo Fmoc y en la cadena lateral

el grupo tBu.

Tomado de: Catalogo Merck. Disponible en: http://www.merckmillipore.com/CO/es/product/Fmoc-Ser%28tBu%29-

OH,MDA_CHEM-852019?CategoryName=0000002600024c9d00010023&CategoryDomainName=Merck-

MerckMillipore

La Histidina es uno de los grupos más problemáticos puesto que su anillo imidazol es

fácilmente acilado y una vez así es capaz de intercambiar grupos acilo de forma no deseada

y además de esto la basicidad del anillo favorece la racemización, debido a esto debe de estar

protegido, generalmente por el grupo tritil (Figura 21) [17].

Figura 21. Histidina protegida en el grupo α-amino por el grupo Fmoc y en anillo imidazol

el grupo Trt.

Tomado de: Catalogo Merck. Disponible en: http://www.merckmillipore.com/INTERSHOP/web/WFS/Merck-CO-Site/es_ES/-/COP/ViewParametricSearch-

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6.2.1.5.4. Desprotección

Para poder realizar la síntesis de péptidos se realizan varios ciclos de desprotección, el

primero de estos es la eliminación del grupo Fmoc de la resina luego de haber realizado el

respectivo hinchamiento de esta con algún solvente como DMF o DCM. Al eliminar el grupo

Fmoc de la resina esta queda lista para realizar en enlace peptídico con el primer aminoácido

de la secuencia a sintetizar, al estar este acople listo se debe realizar una nueva desprotección,

esta vez para eliminar el grupo Fmoc del grupo amino del aminoácido ya acoplado, para que

de esta manera se pueda generar un nuevo enlace peptídico entre el aminoácido ya acoplado

el nuevo aminoácido a acoplar. De esa misma manera se siguen realizando ciclos de

desprotección y acople hasta terminar la secuencia peptídica.

EL grupo Fmoc es estable en presencia de agentes ácidos, pero puede removerse fácilmente

en ciertas condiciones básicas, por lo cual generalmente se utiliza piperidina entre el 10 y

20% en DMF (Figura 22), este procedimiento es rápido y se puede generar a temperatura

ambiente, además no afecta a los demás grupos protectores [31, 32].

Figura 22. Desprotección del grupo Fmoc de un aminoácido con piperidina, generando

como co-producto el aducto de la piperidina y el fluorenil meteno.

Tomado de: [17].

La última desprotección se realiza al finalizar la síntesis, en esta se elimina el grupo Fmoc

del último aminoácido acoplado, igualmente con piperidina y posteriormente se realiza una

desprotección de todas las cadenas laterales, eliminando los grupos protectores permanentes

y a la vez separando el péptido de la resina.

6.2.1.5.5. Activación y acople

Al tener solamente un ácido carboxílico y una amina se obtendrá la sal correspondiente, por

lo cual para obtener el enlace peptídico es necesario usar un agente que active el grupo

carboxilo. Existen diferentes reactivos que actúan como activadores, entre los cuales se

pueden encontrar carbodiimidas, sales de fosfonio y sales de uronio (Figura 23) [32, 33].

Mediante la utilización de estos grupos activos se obtienen altos rendimientos en pocas

reacciones secundarias y todos los co-productos son fácilmente removibles. Al utilizar sales

de fosfonio y de uranio, se debe tener en cuenta que estas son bastante ácidas por lo cual se

deben neutralizar con diisopropiletilamina (DIEA). Además, se adiciona un aditivo para

evitar racemización y mejorar los resultados de la síntesis como oxyma (Figura 24) [33].

Figura 23. Estructura de activadores usados en la síntesis de péptidos, carbodiimidas

(DCC, DIPCDI), sales de fosfonio (BOP, PyBOP) y sales de uronio (HBTU, TBTU).

Tomado de: [32]

Figura 24. Estructura del aditivo oxyma

Tomado de: Catalogo Merck. Disponible en: http://www.merckmillipore.com/CO/es/product/Oxyma-

Pure,MDA_CHEM-851086#anchor_REACH

Figura 25. Mecanismo de activación del aminoácido a acoplar mediante HBTU y posterior

unión al péptido-resina.

Tomado de: [34]

6.2.1.5.6. Desanclaje

Al finalizar la síntesis y tener la secuencia peptídica deseada, se dejan las bolsas con el

péptido-resina en DCM por 10 minutos, se sacan y se ponen a secar. Al tener el péptido-

resina seco se procede a agregar la solución de clivaje, la cual contiene TFA, agua, TIS y si

tienen metionina, cisteína o triptófano se agrega DOTA, en proporciones 94%, 2.5%, 2.5%

y 1% respectivamente y se deja en agitación durante 1 hora. Posteriormente se precipita el

péptido con éter frio y se realizan una serie de lavados con éter para eliminar las impurezas

presentes, por último se deja secar, se solubiliza en agua y se deja liofilizar [34, 35].

6.3. Proteínas

La palabra proteína es proveniente del griego Proteios, que significa “el primer lugar” puesto

que estas son las que regulan y controlan múltiples bioprocesos del cuerpo humano, entre

estos el metabolismo, el crecimiento celular, y la neurotransmisión. Las proteínas son

moléculas de gran tamaño formadas por largas cadenas de aminoácidos, las cuales proveen

de estructura y pueden actuar como una fuente energética, teniendo su principal función en

su rol como enzimas en el organismo.

Las proteínas intervienen en prácticamente todos los procesos que tienen lugar en la célula y

ejercen una diversidad casi inagotable de funciones, además presentan una gran variedad, en

una sola célula puede haber miles de proteínas diferentes, siendo así los árbitros de las

funciones moleculares. Las proteínas pueden encargarse de las diferentes funciones

necesarias en los organismos debido a su habilidad para mover los electrones y protones

dentro y fuera del biosistema.

La serie de proteínas generadas por un organismo es conocida como Proteoma del organismo.

Cada una de estas proteínas es codificada por nuestros genes los cuales están presentes en

nuestro ADN [21].

6.3.1. Generalidades de las Proteínas.

Las proteínas son aminoácidos poliméricos en donde los aminoácidos individuales (residuos)

están unidos por enlaces peptídicos. Estas son más grandes que los péptidos, de hecho una

proteína puede estar formada por la unión de varios péptidos. Independientemente de la

longitud de la cadena, todas las cadenas no cíclicas tienen un aminoácido N-terminal,

La mayoría de las proteínas son construidas en los ribosomas y las secuencias que las

conforman son dictadas por los códigos genéticos, leídas y transcritas por los ribosomas. Las

proteínas idénticas pueden compartir las mismas funciones dependiendo de cómo han sido

enlazadas. La estructura de la proteína original en la forma como es creada en el ribosoma es

conocida como estructura primaria. Por su parte, la estructura secundaria es formada cuando

la proteína empieza a tomar una estructura acorde a las fuerzas generadas dentro de las

cadenas primarias.

Entre las principales propiedades de las proteínas se encuentra la solubilidad la cual es

mantenida por la presencia de los de los enlaces fuertes y débiles, esta puede cambiar con

cambios de temperatura y pH. También está la capacidad electrolítica la cual determina si

una proteína posee carga positiva o negativa, esta es medida mediante electroforesis [21, 37].

Por otro lado, la estructura primaria de una proteína puede determinar la función que esta va

a cumplir, esto es conocido como la especificidad de la proteína. Y por último presenta una

alta capacidad para actuar como amortiguador de pH debido a su carácter anfótero, o sea, su

comportamiento como ácido al donar electrones y como base al aceptar electrones [37]

6.3.2. Estructura de las proteínas

Las proteínas al ser macromoléculas presentan varios niveles de complejidad a la hora de

determinar su estructura, por esto se clasificaron en cuatro grupos, teniendo así estructura

primaria, secundaria, terciaria y cuaternaria.

En la estructura primaria es la secuencia de los aminoácidos que conforman la proteína,

además de una descripción de todos los enlaces covalentes que presenta la proteína, o sea,

los enlaces peptídicos y los puentes disulfuro, los cuales unen los aminoácidos.

La estructura secundaria son las disposiciones particularmente estables que toma la cadena

proteica. Esta estructura comprende los patrones de plegamiento de hojas α, giros β, entre

otros. La estructura terciaria describe todos los aspectos del plegamiento tridimensional de

la proteína y cuando esta posee dos o más unidades polipeptídicas, su disposición en el

espacio se denomina estructura cuaternaria [19, 38].

Figura 26. Niveles estructurales de una proteína.

Tomado de: [19]

6.3.3. Clasificación de las Proteínas

Según la forma tridimensional de las proteínas, se pueden clasificar en:

Proteínas globulares, estas presentan una forma esférica con una estructura espacial definida

denominada conformación nativa, la cual es esencial para su función biológica, característica

por doblar sus cadenas de manera compacta dejando los grupos hidrófobos hacia adentro y

los grupos hidrófilos hacia afuera de la proteína, lo que lo hace soluble en solventes polares

como el agua.

Proteínas fibrosas, presentan cadenas polipeptídicas largas ordenadas de lado a lado en largos

filamentos, además son insolubles en agua por lo cual forman materiales estructurales como

piel, cabello, tendones, ligamentos y músculos.

Proteínas mixtas, las cuales poseen una parte fibrosa que normalmente se encuentra ubicada

en el centro de la proteína y otra parte globular que se encuentra en las partes externas de la

proteína.

Escleroproteínas, básicamente son insolubles, fibrosas y con un grado alto de cristalinidad,

además son resistentes a muchas enzimas y desempeñan funciones estructurales en el reino

animal.

Esferoproteínas, estas proteínas contienen moléculas esféricas, las cuales se clasifican según

su grado de solubilidad en albuminas, globulinas, glutelinas histonas y prolaminas [21, 39].

6.4. Inmunogenicidad

Los vertebrados poseen barreras físico-bioquímicas que dificultan la entrada de la mayoría

de los patógenos, como lo son la piel, mocos y otras secreciones anti-patógenas, Durante la

evolución el sistema inmune desarrollo una variedad de respuestas apropiadas para combatir

cada patógeno ya sea virus, bacteria, protozoo u hongos.

La respuesta inmune consiste en dos pasos, primero se da un reconocimiento del agente

infeccioso o material extraño, luego se elabora una respuesta adecuada para su eliminación.

6.4.1. Respuestas inmunes

Existen dos tipos de respuestas inmunes, las innatas y las adaptativas o específicas.

Las respuestas innatas son llevadas a cabo por células como los fagocitos o células agresoras

naturales (NK) y por factores solubles como proteínas de fase aguda. Los fagocitos reconocen

inespecíficamente los microorganismos, los ingieren y los destruyen. Las proteínas de fase

aguda como la proteína C reactiva recubren e inactivan microorganismos inespecíficamente.

La respuesta adaptativa es mediada por los linfocitos, teniendo como características

principales la especificidad y la memoria, en la inmunidad adaptativa hay una respuesta

primaria y una secundaria más rápida y efectiva, de modo que hay memoria específica frente

a una segunda infección por el mismo antígeno y además la respuesta inmunológica es más

eficiente. Existen dos tipos principales de linfocitos: B y T.

Para combatir una infección se hace una cooperación entre todos los componentes del sistema

inmunitario innato y adaptativo. Por ejemplo se realiza la presentación del antígeno por parte

de algunos fagocitos (respuesta innata), a los linfocitos T (respuesta adaptativa), luego se

reconoce por los fagocitos (respuesta innata) de los microorganismos opsonizados por

anticuerpos específicos (adaptativo) o por factores del complemento (innata: por vía

alternativa o adaptativa: por vía clásica) [40, 41].

Figura 27. Componentes del sistema inmune.

Tomado de: [43]

6.4.2. Linfocitos

Células B

Cada célula B está programada genéticamente para expresar un receptor de superficie

específico para un antígeno particular, esta molécula receptora del antígeno se llama

anticuerpo. Si una célula B se une a su antígeno especifico, se multiplicará y diferenciará en

células plasmáticas, las cuales producen gran cantidad de anticuerpos o inmunoglobulinas

(Figura 28).

Figura 28. Linfocito B.

Tomado de: https://www.google.com.co/search?q=respuesta+inmune&biw=1366&bih=623&source=lnms&tbm=isch&sa=X&ved=0a

hUKEwjwhavanZ7KAhWMPB4KHXOoCYAQ_AUIBigB#tbm=isch&q=linfocitos+b&imgrc=gsD2mP-Brj4k5M%3A

Figura 29. Estructura de un anticuerpo

Tomado de: [41]

Células T

La célula T reconoce el antígeno por medio de su receptor para antígeno de la celula T (TCR)

la cual presenta estructura y función similar a las inmunoglobulinas. La célula T reconoce

pequeños péptidos que contengas entre 9 y 24 residuos aminoacídicos, unidos a las moléculas

del sistema principal de histocompatibilidad, HLA.

Los linfocitos T tienen 2 funciones principales: Cooperadora y citolítica. Entre las

cooperadoras esta: ayudar a los linfocitos B en la producción de anticuerpos y liberar

citosinas que activan a los fagocitos y a los linfocitos T citotóxicos para destruir patógenos

fagocitados. Y la función citolítica es reconocer específicamente células propias infectadas

por virus y destriurlas.

Figura 30. Funciones de un linfocito T

hUKEwjwhavanZ7KAhWMPB4KHXOoCYAQ_AUIBigB#tbm=isch&q=linfocitos+t&imgrc=f_qg0hSoI3Xp9M%3A

6.4.3. Antígeno

Un antígeno es cualquier sustancia foránea que genera una respuesta inmune cuando es

introducida dentro de los tejidos de animales susceptibles y que son capaces de combinar con

los anticuerpos específicos formados. Los antígenos generalmente son moléculas de alto peso

molecular y comúnmente son proteínas o polisacáridos

Las partes variables del anticuerpo que contactan con el antígeno se denominan parátopos y

la región de un antígeno que puede específicamente unirse a un anticuerpo es llamado

epítope, los cuales normalmente contiene de 5 a 15 residuos de aminoácidos sobre la

superficie del antígeno.

Debido a que la molécula de antígeno existe en el espacio, el epitope reconocido por un

anticuerpo puede depender de la presencia de una específica conformación tridimensional

del antígeno (conformación loop o hélice) [40, 42].

6.4.4. Reacción antígeno anticuerpo

Los antígenos y anticuerpos interactúan por complementariedad espacial y no por uniones

covalentes. La asociación específica del antígeno y el anticuerpo es dependiente de los

puentes de hidrógeno, las interacciones hidrofóbicas, fuerzas electrostáticas y las fuerzas de

van der Waals, todas estas son uniones débiles no covalentes, aunque algunas de las

asociaciones entre el antígeno y anticuerpo pueden ser bastantes fuertes.

Figura 31. Tipos de unión entre antígeno anticuerpo

hUKEwjwhavanZ7KAhWMPB4KHXOoCYAQ_AUIBigB#tbm=isch&q=+antigeno+anticuerpo&imgrc=sDhTjn5eTdvR

Todos los anticuerpos tienen la misma estructura básica con forma de Y, con dos regiones en

las puntas que se unen al antígeno. Normalmente los agentes patógenos tienen muchos

antígenos diferentes en su superficie, por lo cual, cada anticuerpo se une a un epítope

específico, ya que los anticuerpos son específicos para los epítopes y no para toda la molécula

[42,43].

6.5. Virus del Papiloma Humano

El virus del papiloma humano se caracteriza por infestar las células del epitelio de la piel y

de las mucosas por lo que se transmite fundamentalmente por vía sexual, clasificándose así

dentro de las enfermedades de transmisión sexual.

Mundialmente se está trabajando en el virus del papiloma humano puesto que es el mayor

precursor del cáncer de cuello uterino, el cual está provocando la mayoría de muertes en el

mundo entero. En Latinoamérica y el Caribe el cáncer de cuello uterino presenta una tasa de

mortalidad más alta que la tuberculosis, la mortalidad materna o el síndrome de

inmunodeficiencia adquirida. Anualmente se diagnostican alrededor de medio millón de

casos invasivos y fallecen 231.000 mujeres, siendo los países en vía de desarrollo donde se

presentan el 80% de estos casos. En Colombia este cáncer es la mayor causa de muerte de

mujeres en edad productiva (de los 35 a los 64 años) [44, 45, 46].

6.5.1. Generalidades del HPV

EL microorganismo VPH pertenece a la familia Papovaviridae. Tiene un tamaño aproximado

de 55 nm de diámetro, con una cápside viral de simetría icosaédrica que está compuesto de

72 capsomeros, no tiene envoltura. Presenta un genoma de ADN de doble hebra circular de

7800 a 7900 pares de bases. [47, 48].

Figura 32. A. Representación de HPV. B. Micrografía electrónica del HPV

Tomado de: [47]

6.5.2. Clasificación del HPV

En la actualidad se han identificado más de 130 tipos de HPV, aunque solamente se han

podido caracterizar completamente alrededor de 80 (Tabla 3). Todos los tipos de HPV se

distinguen por ser epiteliotropos y según el epitelio que infectan, clásicamente, se han divido

en cutaneotropos y mucosotropos. Los tipos mucosos infectan preferentemente a la mucosa

genital, aunque también han sido detectados en la mucosa respiratoria y digestiva. De los 80

tipos de HPV caracterizados, al menos 25 afectan el tracto genital femenino y de acuerdo a

su asociación con lesiones preinvasivas y cáncer, se agrupan en, de alto riesgo (como los

tipos 16, 18, 45, 56), de riesgo moderado (como tipos 31, 33, 35,51, 52) y de bajo riesgo

(como tipos 6, 11, 40, 42, 43, 44) [48, 49].

Tabla 3. Tipos de HPV y su correlación clínica

6.5.3. Genoma del HPV

El HPV codifica para ocho regiones de lectura abierta, que regulan la síntesis de las 6

proteínas tempranas (E1, E2, E5, E6, E7) y las dos proteínas tardías (L1, L2) (Figura 33), de

acuerdo a su expresión durante el ciclo de vida viral.

Figura 33. Conformación del HPV

Tomado de: [50]

Las proteínas E1 y E2 transcritas a partir de la región temprana son responsables de la

replicación viral y expresión genética. La región tardía codifica para las proteínas L1 y L2,

componentes de 95% y 5%, respectivamente, de la cápside viral. Las proteínas E6 y E7,

productos de región temprana, son las encargadas de inmortalizar la célula hospedera y del

proceso carcinogénico [50, 51].

6.5.4. Patogenia del HPV

El virus tiene como blanco a las células de la capa basal del epitelio, a las que puede llegar

por heridas de la piel o mucosa (Figura 34), aun no se sabe si el virus puede penetrar la piel

intacta. El ciclo vital del HPV presenta varias fases, una vez colonizado el epitelio diana

puede extenderse desde los 2 a 3 meses hasta los 15 o 20 años, sin embargo el virus puede

estar en estado de latencia durante 20 años, en forma extracromosómica, sin producir lesiones

celulares; o bien puede reproducirse durante el proceso de diferenciación de los

queratinocitos. El virus expresa las proteínas E1 y E2, asociadas a la replicación y

transcripción de las células basales y parabasales provocando la hiperplasia epitelial, la

segunda etapa del virus ocurre en las capas más superficiales de la epidermis, donde expresa

las proteínas L1 y L2 que codifican la cápside, y en la que se produce el ensamble de las

partículas virales.

La inmunidad específica contra el VPH incluye la formación de anticuerpos y de células T

citotóxicas específicas. Ese proceso requiere la exposición de antígenos virales por las células

presentadoras de antígenos, en conjunto con moléculas del complejo mayor de

histocompatibilidad (MHC) [47, 51].

Figura 34. Patogenia del VPH en la piel.

Tomado de: https://www.google.cl/search?q=Patogenia+del+HPV&biw=1366&bih=667&source=lnms&tbm=isch&sa=X

&ved=0ahUKEwi2xdPot6DKAhXLHh4KHTgDDXEQ_AUIBigB#tbm=isch&q=ciclo+de+vida+VPH&imgd

ii=ZibfVMLccnEI3M%3A%3BZibfVMLccnEI3M%3A%3BTU4A_HusSct-

1M%3A&imgrc=ZibfVMLccnEI3M%3A

6.5.5. Métodos de identificación del HPV

La mayoría de los métodos de detección de VPH se basan en la detección de ADN. Es posible

realizar el análisis patológico y molecular de VPH a partir de una misma muestra. El

procedimiento se puede realizar mediante test de captura de híbridos (sondas ARN-ADN

viral) o por métodos de amplificación de secuencias diana mediante reacción en cadena de la

polimerasa (PCR).

Citología cervical o Prueba de Papanicolaou

En la actualidad la citología cervical es la herramienta más usada para el cribado del cáncer

cervical. No obstante, presenta un porcentaje de falsos negativos que, dependiendo del

laboratorio, puede alcanzar 20-30% de los frotis examinados. El aspecto más característico

de la infección por HPV es la presencia de coilocitos (células precancerosas) las cuales se

identifican por un gran halo perinuclear claro, que rechaza el citoplasma hacia la periferia.

Dentro de las limitaciones de esta prueba es importante resaltar que se puede generar error

humano y para disminuir este se necesita automatizar el procedimiento lo cual es muy

costoso, esto conlleva a generar falsos negativos a los cuales se les daría un mal seguimiento.

Biopsia de Cuello Uterino

Esta prueba se realiza cuando se ha obtenido un resultado positivo en otro examen más

sencillo como la prueba de Papanicolaou, por lo cual para certificar que se posea la

enfermedad se realiza una biopsia de cuello uterino para ver las células a través del

microscopio y asegurarse de que se trata de lesiones cancerosas o precancerosas.

Histología

Mediante una prueba histológica se puede observar por microscopia convencional cambios

morfológicos como el crecimiento nuclear e hipercromasia, aumento en la relación núcleo-

citoplasma y halos perinucleares.

Técnica de Cribado

Una prueba de cribado o de screening es una prueba que se realiza sobre toda la gente para

intentar detectar una enfermedad antes de que aparezca o en una fase precoz. Cuanto más

sensible y específica sea una prueba, mejor para el diagnóstico de una enfermedad. En los

últimos años se está valorando la posibilidad de introducir la técnica de cribado como técnica

primaria, con procedimientos de auto muestreo. Este test sería un buen sustituto o

complemento de la citología cervico-vaginal. La sensibilidad de la prueba es superior a la de

la citología para la detección de lesiones de alto grado (mejora la detección en un 28%). La

homogeneidad de los resultados es también significativamente superior a la de la citología

[52, 53, 54].

Técnica Inmunoenzimática (ELISA)

Estas pruebas hacen parte de aquellas reacciones serológicas que utilizan conjugados. Este

se basa en el uso de antígenos o anticuerpos marcados con una enzima, de forma que el

conjugado resultante tenga actividad, tanto inmunológica como enzimática. Al estar uno de

los componentes, sea el antígeno o el anticuerpo marcado con una enzima e insolubilizado

sobre un soporte, la reacción antígeno-anticuerpo quedara inmovilizada y por tanto podrá

fácilmente ser revelada mediante la adición de un substrato específico que al actuar la enzima,

producirá un color observable a simple vista o podrá ser cuantificable mediante

espectrofotometría [55].

La prueba ELISA se basa en varias teorías: primero el antígeno y anticuerpo pueden enlazarse

a una superficie portadora insoluble y retener su reactivad inmunológica; en segunda medida

las enzimas tienen actividad específica alta y convierten una cantidad relativamente grande

de sustrato en producto detectable, lo que permite detectar concentraciones muy bajas del

ligando; en tercer medida la actividad enzimática o reactividad inmunológica de los

conjugados se preserva y permanece estable durante el análisis y el almacenamiento y por

ultimo las enzimas no están presentes en el líquido biológico que se va a analizar.

Como el ELISA es una técnica simple, sensible, rápida, versátil y realizable, es muy utilizada

para la cuantificación de anticuerpos y antígenos. El ELISA ha sido desarrollado en muchas

configuraciones dependiendo de la particularidad del ensayo. En la práctica el ELISA como

una técnica para fase solida puede ser clasificada en dos grandes tipos: el primer tipo, es un

ensayo competitivo usando tanto un conjugado enzima-antígeno como un conjugado enzima-

anticuerpo. Y el segundo tipo es, ensayos no competitivos usando un doble anticuerpo

(llamada sándwich) donde el segundo anticuerpo tiene un indicador conjugado enzimático.

Para poder realizar una prueba de ELISA exitosa se deben de tener en cuenta los siguientes

aspectos para la elección de la enzima: La estabilidad bajo condiciones de almacenamiento,

enlace cruzado y ensayo; la alta actividad específica, sin embargo, no debe contener

componentes de la preparación del antígeno que se va a utilizar en la prueba, ya que pueden

presentarse falsos positivos y por último se debe evitar la presencia de inhibidores o

inactivadores de la enzima [56, 57, 58].

6.5.6. Vacunas contra HPV

Las vacunas profilácticas contra el VPH constituye la herramienta de salud pública más

promisoria para la prevención primaria de cáncer de cuello uterino. La vacunación de mujeres

antes de haber adquirido la infección viral tiene un gran impacto en la prevención de lesiones

pre-neoplásicas y cáncer de cuello uterino. Las vacunas actuales no eliminan completamente

el riesgo de cáncer de cérvix, por lo tanto las mujeres vacunadas como las que no alcancen a

recibir la vacuna, se les debe seguir ofreciendo los programas de detección temprana.

Estas vacunas tienen como principio fundamental la capacidad de las VLPs de inducir altos

niveles de anticuerpos neutralizantes en medio vaginal. Ya que las VLPs no contienen ADN

viral, no pueden infectar células, reproducirse o causar. Actualmente se encuentran en el

mercado dos vacunas la Gardasil y la Cervarix.

Gardasil.

Se encuentra en viales de 0,5mL inyectables como una suspensión compuesta por proteínas

L1 en forma de partículas no infecciosas similares al virus, generadas mediante tecnología

de ADN recombinante mediante el uso de un sistema de expresión que utiliza células

derivadas de Sacharomyces cerevisiae. Cada dosis de 0.5mL contiene 20µg de proteína L1

de VPH6, 40 µg de proteína L1 de VPH11, 40 µg de proteína L1 de VPH16 y 20µg de

proteína L1 de VPH18 adsorbidas en un adyuvante compuesto de sulfato hidroxifosfato de

aluminio amorfo.

Cervarix

Es una suspensión inyectable producto de tecnología recombinante que utilizan un sistema

de expresión con células derivadas de Trichoplusia ni. Cada dosis de 0.5mL está compuesta

por 20μg de proteína L1 de VPH-16 y 20μg de proteína L1 de VPH-18 en forma de VLPs

adsorbidas en el adyuvante llamado ASO4, el cual está compuesto por hidróxido de aluminio

y monofosforil lípido A [59, 60].

Tabla 4. Características generales de las vacunas contra HPV

7. METODOLOGÍA

7.1. Determinación de las secuencias a sintetizar.

Se inició el proceso realizando un análisis estructural de las proteínas HPV 16 L1 y HPV 16

E7, para lo cual se corroboró la estructura primaria mediante la base de datos universal de

proteínas, Protein Data Bank (PDB), la cual se encuentra en la página web del Nacional

Center for Biotechnology Information (NCBI), de allí se tomaron las secuencias de las dos

proteínas y se enviaron a I-TASSER, un servidor con varias bases de datos, en donde realizan

un blast de las secuencias y generan una posible estructura secundaria tridimensional de las

proteínas. Se realizó un análisis de la simulación estructural obtenida determinando los

fragmentos expuestos que presentan restricción conformacional y por tanto los de interés a

sintetizar.

7.2. Síntesis de péptidos

La síntesis de los péptidos se realizó mediante la estrategia de bolsas de Houghten (Figura

35), cada bolsa contenía 40 mg de resina Rink amida con sustitución de 0,59, además se

realizaron soluciones stock a concentración de 10 excesos por mililitro, de los activadores y

de cada uno de los aminoácidos a excepción de cisteína, metionina, triptófano e histidina

puesto que estos presentan alta tendencia a oxidarse.

Figura 35. Esquema general de la síntesis por estrategia de bolsitas de Houghten.

Tomado de: [16]

Para realizar síntesis simultánea mediante la estrategia de bolsitas, primero se introducen las

secuencias en el programa peptide.exe el cual genera un documento en donde primero se

encuentran las secuencias con algunas características (Figura 36) y posteriormente

organizadas mediante acoples (Figura 37).

Figura 36. Listado de la secuencias a sintetizar generada por el programa peptide.exe

Figura 37. Documento del primer acople generado por el programa peptide.exe

Para realizar las soluciones stock se determinó la constante de acople (Ecuación 1) dada por

la cantidad de resina usada, la sustitución de esta y la cantidad de excesos.

𝐶𝑜𝑛𝑠𝑡𝑎𝑛𝑡𝑒 = 𝑔 𝑟𝑒𝑠𝑖𝑛𝑎 × 𝑠𝑢𝑠𝑡𝑖𝑡𝑢𝑐𝑖ó𝑛 × 𝑒𝑥𝑐𝑒𝑠𝑜𝑠

Puesto que todos los péptidos se realizaron con las mismas condiciones, presentan la misma constante

de acople:

𝐶𝑜𝑛𝑠𝑡𝑎𝑛𝑡𝑒 = 0.04𝑔 × 0.59𝑚𝑒𝑞

𝑔× 10𝑒𝑥𝑐𝑒𝑠𝑜𝑠 = 0.236𝑚𝑒𝑞

Ecuación 1. Constante de acople

Con la constante de acople se procede a calcular la cantidad de cada aminoácido y cada

activador que se debe pesar para realizar el acople de una bolsa:

𝑚𝑔 𝑎𝑎 = 𝑐𝑜𝑛𝑠𝑡𝑎𝑛𝑡𝑒 × 𝑝𝑒𝑠𝑜 𝑚𝑜𝑙𝑒𝑐𝑢𝑙𝑎𝑟

Ecuación 2. Cantidad de aminoácido a pesar para el acople correspondiente

Para los péptidos con restricción conformacional el primer aminoácido acoplado fue cisteína,

por lo cual la cantidad de aa a pesar para una bolsa sería:

𝑚𝑔 𝐶𝑦𝑠 = 0.236𝑚𝑒𝑞 × 585.7𝑚𝑔

𝑚𝑒𝑞= 138.22 𝑚𝑔

Por último se observa en el documento para este acople cuantas bolsas van en este

aminoácido y se multiplica la cantidad de mg de aminoácido a pesar por la cantidad de bolsas

𝑚𝑔 𝑎𝑎 𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙𝑒𝑠: 138.22𝑚𝑔 × 6 = 829.32 𝑚𝑔

Ecuación 3. Cantidad total de aminoácido a pesar para el primer acople

De la misma manera se realizan los cálculos para los activadores, al tener la cantidad de

activador a pesar para una bolsa, este se multiplica por la cantidad total de péptidos que se

estén sintetizando. Para el activador HBTU:

𝑚𝑔 𝐻𝐵𝑇𝑈 = 𝑐𝑜𝑛𝑠𝑡𝑎𝑛𝑡𝑒 × 𝑝𝑒𝑠𝑜 𝑚𝑜𝑙𝑒𝑐𝑢𝑙𝑎𝑟

𝑚𝑔 𝐻𝐵𝑇𝑈 = 0.236𝑚𝑒𝑞 × 379.3𝑚𝑔

𝑚𝑒𝑞= 89,51𝑚𝑔

𝑚𝑔𝐻𝐵𝑇𝑈𝑇𝑜𝑡𝑎𝑙 = 89,51 × 8 = 716,06𝑚𝑔

Ecuación 4. Cantidad de mg de HBTU que se deben pesar para el primer acople

Para el acople, además de la resina- péptido, aa y activador es necesario agregar DIEA, pero

se debe de tener en cuenta que este se encuentra líquido, por lo cual se debe multiplicar por

su densidad y también por los dos equivalentes a los que corresponde:

𝑚𝑔 𝐷𝐼𝐸𝐴 = 𝑐𝑜𝑛𝑠𝑡𝑎𝑛𝑡𝑒 × 𝑝𝑒𝑠𝑜 𝑚𝑜𝑙𝑒𝑐𝑢𝑙𝑎𝑟 × 𝑑𝑒𝑛𝑠𝑖𝑑𝑎𝑑 × 𝑒𝑞𝑢𝑖𝑣𝑎𝑙𝑒𝑛𝑡𝑒𝑠

𝑚𝑔 𝐷𝐼𝐸𝐴 =0.236𝑚𝑒𝑞 × 129.2

𝑚𝑔𝑚𝑒𝑞

742𝑚𝑔𝑚𝑙

= 0,082𝑚𝐿

Ecuación 5. Cantidad de ml de DIEA que se deben agregar por bolsa

Al tener las soluciones de aminoácidos y activadores listos se empezó a preparar las bolsas

con resina para empezar la síntesis, para esto las bolsas se sumergieron en DCM para permitir

la hinchazón de la resina, luego se procedió a realizar la desprotección puesto que esta resina

posee un grupo f-moc la eliminación de este grupo se realiza con piperidina al 20% 2x*1min,

posteriormente se realizan una serie de lavados con DMF 3x*1min, IPA 1x*1min, azul de

bromofenol 1x*2min, DMF 2x*1min y DCM 2x*1min, siendo x la cantidad de veces.

Teniendo desprotegida la resina se procede a realizar el ciclo de acople del primer

aminoácido poniendo las bolsas con la resina desprotegida en una solución que contiene el

aminoácido correspondiente, el cual tiene un grupo protector en el amino terminal, un

activador que puede ser HBTU, TBTU, TCTU o DIC, oxima para disminuir la racemización

y DIEA para neutralizar, esto se deja en agitación por 3 horas aproximadamente. Para el

acople del siguiente aminoácido se realiza un nuevo ciclo de desprotección para eliminar el

grupo protector del amino terminal del aminoácido ya acoplado y se continúa con el ciclo de

acople del aminoácido correspondiente. Este ciclo de desprotección - acople se repite hasta

que las secuencias han sido sintetizadas en su totalidad.

En el caso de los péptidos con restricción conformacional, al finalizar la secuencia se realizan

3 ciclos más de desprotección – acople para adicionar en sitio de nucleación JAZ, al tener

exitosamente el sitio de nucleación en la cadena peptídica, se procede a realizar una última

desprotección y para generar la ciclación, de igual manera las bolsas con el péptido- resina

se sumergen en una solución de activador, oxima y DIEA.

Cada acople se realizó con 5 excesos, al tener soluciones stock a 10 excesos por mililitro,

solamente se adicionaba 0.5 mililitros de solución stock de aminoácido y 0.5 mililitros de

solución stock de activador con oxima y la cantidad correspondiente de DIEA. Al trabajar

con la metodología de bolsas no se puede realizar prueba de ninhidrina por lo cual, la reacción

se monitorea mediante el indicador azul de bromofenol, teniendo en cuenta que cuando el

color de la resina – péptido este amarillo (Figura 38), indica que el acople se realizó

exitosamente. Para asegurar el éxito del acople de cada aminoácido es necesario realizar dos

o más ciclos de acople, por lo cual se realizó acople sencillo con HBTU, doble acople con

TBTU y si era necesario, triple acople con TCTU.

Figura 38. A. Azul de bromofenol positivo para aminas libres. B. Azul de bromofenol

negativo para aminas libres.

7.3. Desanclaje

Finalmente se realiza el desanclaje del péptido del soporte (clivaje) y la eliminación de los

grupos protectores de las cadenas laterales mediante la adición de una solución de TFA (ácido

trifluoroacético), TIS (triisopropilsilano), agua y DOTA en proporciones 94%, 2,5%, 2,5% y

1% correspondientemente y se deja en agitación por una hora, posteriormente se precipita el

péptido con éter frio, se realizan una serie de lavados con éter y se deja secar (Figura 39).

Figura 39. Péptido precipitado y lavado con éter frio.

7.4. Liofilización

Al tener seco el péptido se solubilizó en agua ultrapura y se llevó a congelación a -80°C

durante una hora, realizando así una congelación rápida, generando la formación de pequeños

cristales de agua los cuales no afectan el péptido y lo protege de posible daño microbiológico.

Al tener completamente congeladas las muestras se llevaron al equipo liofilizador

LABCONCO.

7.5. Purificación

En la síntesis de péptidos se pueden generar diferentes impurezas y es necesario eliminarlas

para poder utilizar el péptido en diferentes pruebas. Al realizar análisis mediante HPLC se

puede determinar qué tan puro está el péptido y cual método de purificación es el más

adecuado.

7.5.1. Desalinización mediante G-10

Este método es empleado cuando la cantidad de impurezas son muy pocas. Para realizar una

G-10 primero se tomaron jeringas de 2 mL y se les adicionó sephadex (gel de dextrano), al

tener las jeringas cargadas se hidrató el gel con agua MQ, al tenerlas hidratas y a un pH

neutro, se procede a pasar la muestra (10mg de péptido en 1mL de agua), esta se agregó

completa en la jeringa y se esperó que entrara toda en el gel, luego se agregó 500µL de agua

y de igual manera se esperó que entrara en el gel, así mismo se siguió agregando agua hasta

llegar a un volumen de 1.7mL, se cambia de recolector y se procede a agregar 1.7 mL de

agua más. Por último los extractos obtenidos se llevaron a liofilizar.

Figura 40. Purificación mediante G-10

7.6. Caracterización del péptido

Mediante la síntesis de los péptidos se monitoreo el éxito de cada acople mediante el cambio

de coloración del azul de bromofenol, pero hay que tener en cuenta que este es un método

cualitativo, por lo cual después del desanclaje del péptido se procede a realizar diferentes

análisis para caracterizar el péptido y determinar la efectividad de la síntesis.

7.6.1. HPLC

Se pesó determinada cantidad de cada uno de los péptidos y se solubilizaron en agua a una

concentración de 1mg/ml, de esta solución se tomaron 15 µl y se llevaron a un volumen total

de 100µl con agua, esto se pasó por el equipo de cromatografía de alta eficiencia (Figura 41)

y se analizó en un programa de 0% a 70% de solvente A (agua + 0,05% TFA) a solvente B

(acetonitrilo+0.05% de TFA) en 10 minutos con un flujo de 1 ml por minuto, se utilizó una

columna water C18 um Corp.XBridge BEH130 y se trabajó a una longitud de onda de 215

Figura 41. Equipo HPLC

7.6.2. Espectroscopía de masas

De la misma solución utilizada en HPLC se tomaron 20µl y se llevaron a un volumen final

de 100µl con agua. Esto se analizó en un equipo LC MS 2020 (Figura 42), con un programa

de 0% a 100% de acetonitrilo en 20 minutos, utilizándose una longitud de onda de 215 nm.

Figura 42. Espectroscopio de masas de electro spray LC MS 2020

7.6.3. Espectroscopía de masas (MALDI-TOF)

Para la obtención de espectros se mezcló 1 μL de cada muestra de 1mg/ml, con 1 μL de la

matriz ácido α-ciano-4-hidroxicinámico (CHCA preparada a una concentración de 10 mg/mL

en acetonitrilo 50% v/v y ácido fórmico 0.1% v/v, esta matriz se utiliza de preferencia para

péptidos y/o proteínas de masa molecular menor a 10000 Da) en una placa porta muestra

micro scout (Bruker Daltonics Inc., MA-USA) (Figura 43. A).

El procedimiento se realizó en un equipo MALDI-TOF Microflex (Bruker Daltonics Inc.,

MA-USA) (Figura 43. B) en modo ion positivo mediante detección por reflexión. Previo a la

obtención de los espectros se realizó una calibración del equipo con un estándar externo

correspondiente a una mezcla de péptidos de masas 1000-3000 Da. Para el control del

espectrómetro se utilizó el programa flexControl 3.0 (Bruker Daltonik GmbH, Alemania).

Los espectros finales corresponden a la suma de 10 barridos de 30 impactos de láser (300

impactos de láser en total) aplicados en diferentes puntos tomados al azar de cada mezcla

depositada en la placa porta muestra.

Figura 43. A. Placa de acero porta muestra micro scout Bruker Daltonics Inc., MA-USA.

B. Equipo MALDI-TOF Microflex Bruker Daltonics Inc., MA-USA.

7.6.4. Dicroísmo Circular

De la solución de péptido de 1mg/ml se tomó 35µl y se le adicionaron 215µl de TFE al 30%,

favoreciendo de esta manera la formación de puentes de hidrógeno y por tanto estabilizando

la estructura. Esta solución se agregó en la celda de cuarzo con paso óptico de 0,1 cm, se

realizó la lectura en el equipo Jasco (J-815 Jasco Corporation, Japan) (Figura 44), con un

barrido de longitud de onda de 190 a 250 nm, con una señal promedio de 2 segundos por

cada intervalo de 0,5nm. Todos los datos de dicroísmo circular fueron expresados como

valores de elipticidad molar

Figura 44. Equipo de dicroísmo circular Jasco (J-815 Jasco Corporation, Japan)

8. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

A continuación se encuentran los resultados obtenidos en esta investigación los cuales

incluyen la determinación, análisis, síntesis y caracterización de diferentes secuencias

restringidas de las proteínas HPV16 L1 y HPV16 E7

8.1. Determinación de las secuencias a sintetizar

En primer medida se realizó una búsqueda de las proteínas L1 y E7 de HPV genotipo 16 en

la base de datos Protein Data Bank, de allí se tomaron las secuencias de la proteína L1, con

código de acceso ACN91181 (Figura 45), y la proteína E7 con código de acceso AHK23257

(Figura 46), de HPV del genotipo 16.

Figura 45. Secuencia de la proteína L1 de HPV genotipo 16 obtenida en PDB

Figura 46. Secuencia de la proteína E7 de HPV genotipo 16 obtenida en PDB

Estas secuencias obtenidas en PDB se enviaron a la base de datos I-TASSER, la cual realiza

un blast de la secuencia con varias bases de datos y genera una aproximación de la estructura

terciaria de las proteínas (Figura 47), mediante las cuales se eligieron los fragmentos para ser

sintetizados.

Figura 47. A. Fórmula estructural de la proteína HPV16 E7 B. Fórmula estructural de la

proteína HPV16 L1. Generadas en I-TASSER

Con estas estructuras se procedió a determinar cuáles eran los fragmentos que presentaban

restricción conformacional y estaban expuestos en la proteína, lo que los haría identificables.

Además de esto se apoya la elección de los fragmentos a sintetizar mediante el análisis de

antigenicidad realizado en la página Predicted Antigenic Peptides de la Universidad

Complutense de Madrid.

En estudios realizados anteriormente se determinó que la hélice 1 de HPV16 E7 presentaba

una alta reactividad frente a los sueros de mujeres con cáncer de cuello uterino, sobretodo

imitándose la estructura nativa, pero por el contrario la hélice dos no presentó ninguna

reactividad frente a los mismos sueros, de acuerdo a lo analizado en la formula estructural y

en el esquema de reactividad, la hélice 3 se encuentra expuesta en la proteína y presenta alto

índice de reactividad. Por lo anterior se decide sintetizar la hélice 3, para poder determinar

experimentalmente que nivel de reactividad presenta frente a sueros de mujeres con cáncer

de cuello uterino y la hélice 1 para comparar su rendimiento y determinar cuál sería el mejor

epítope [9, 10].

Finalmente de la proteína HPV16 E7 se eligieron la hélice 1, la cual se encuentra entre los

residuos 7 a 16 y la hélice 3 que se encuentra entre los residuos 74 a 84.

Figura 48. Esquema de antigenicidad de la proteína HPV16 E7

Figura 49. Estructura terciaria de la proteína HPV 16 E7 generada en I-TASSER con los

fragmentos seleccionados a sintetizar

De la proteína HPV16L1, se eligieron 4 fragmentos que presentaban alta antigenicidad y

exposición, dos helicoidales y dos loops. La hélice 2 que se encuentra entre los residuos 385

a 394, hélice 4 encontrada entre los residuos 414 a 425, loop FG encontrada entre los residuos

273 a 284 y la loop HI encontrada entre los residuos 348 a 360. Los dos fragmentos loop

presentaron alta reactividad frente a sueros de mujeres con cáncer de cuello uterino, mediante

los cuales se van a comparar las reactividades de los fragmentos hélices planteados.

Figura 50. Esquema de antigenicidad de la proteína HPV16 L1

Figura 51. Estructura terciaria de la proteína HPV 16 L1 generada en I-TASSER con los

fragmentos seleccionados a sintetizar

8.2. Diseño de los péptidos

Al tener definidas las secuencias que se van a sintetizar se procede a determinar la

metodología que se utilizara para su síntesis, para lo cual se diseña el péptido restringido con

su respectivo péptido lineal.

Teniendo en cuenta que la síntesis de péptidos se realiza tomando la secuencia de derecha a

izquierda, para todos los péptidos con restricción conformacional se realizan como primeros

acoples GC, de esta manera se generan una mayor estabilidad en la molécula.

Para los péptidos con restricción conformacional hélice se determinó que al final de la

secuencia, en el amino terminal, se realizarían tres acoples más, adicionando un sitio de

nucleación JAZ, el cual genera la primer vuelta hélice y por tanto el resto de la molécula

sigue tomando esta conformación mediante la formación de puentes de hidrógeno

Para los péptidos loop se generó un planteamiento similar, para estos, antes de empezar la

secuencia se acoplaría el Z, esto quiere decir que este iría después de GC y al finalizar la

secuencia se acoplaría J, de esta manera se generaría un sitio de nucleación en los extremos

y así el péptido tomaría forma de loop.

De acuerdo con esto, se tendrían 12secuencias para sintetizar, contando con el péptido

restringido y su correspondiente péptido lineal.

Tabla 5. Secuencias de las proteínas HPV16 E7 y HPV16 L1 escogidas para sintetizar

Proteína Estructura Residuos Secuencia

HPV16 E7

Hélice 1 7-16 TLHEYMLDLQ

JAZ--TLHEYMLDLQ—GC

Hélice 3 74-84 VDIRTLEDLLM

JAZ—VDIRTLEDLLM—GC

HPV16 L1

Hélice 2 385-394 ADVMTYIHSM

JAZ—ADVMTYIHSM—GC

Hélice 4 414-425 LEDTYRFVTSQA

JAZ—LEDTYRFVTSQA—GC

Loop FG 273-284 DDLYIKGSGSTA

J—DDLYIKGSGSTA—Z—GC

Loop HI 348-360 ISTSETTYKNTNF

J—ISTSETTYKNTNF—Z—GC

8.3. Resultados estructurales

Al finalizar la síntesis de los péptidos, desanclarlos y liofilizarlos se procedió a realizar el

análisis estructural y de pureza de cada uno de ellos mediante HPLC, espectrometría de

masas, MALDI-TOF y dicroísmo circular.

8.3.1. Hélice 1 de HPV16 E7

OH CH3

Figura 52. Fórmula estructural de la secuencia lineal de hélice 1 HPV16 E7

Figura 53. Espectro cromatográfico de la secuencia lineal de hélice 1 HPV16 E7

En el espectro cromatográfico de la secuencia lineal de la hélice 1 de la proteína E7,

TLHEYMLDLQ, (Figura 53), Se evidencia que el péptido obtenido mediante la síntesis

presenta un alto grado de pureza, además de esto en el espectro de masas (Figura 54) se puede

observar el pico correspondiente al péptido en 1261; este nos confirma que el péptido

obtenido mediante la síntesis es el planteado (Figura 52), puesto que este tiene una masa

molecular teórica de 1261,6 g/mol el cual concuerda con la masa experimental. Además se

encuentra el pico mayoritario en 632 correspondiente a la fragmentación principal de este

péptido.

En el espectro cromatográfico de la hélice 1 de la proteína E7, JAZ--TLHEYMLDLQ—

GC, (Figura 56), se puede observar la presencia de dos picos seguidos, lo cual es

característico y evidencia la presencia de metionina, el cromatograma toma esta forma debido

a la presencia de la metionina en su estado normal y la metionina oxidada, siendo el primer

pico y el que se evidencia en menor cantidad el péptido con la presencia de la metionina

oxidada y por ende el pico con mayor retención y que evidencia mayor cantidad es el péptido

con la presencia de la metionina normal.

En el espectro de masas (Figura 57) se puede observar la presencia de un pico en 1688 el cual

sería correspondiente al péptido puesto que este presenta una masa teórica de 1690 g/mol, lo

que evidencia que el péptido obtenido mediante la síntesis es efectivamente el fragmento

escogido (Figura 55), además presenta el pico mayoritario en 881, el cual es correspondiente

a la fragmentación principal del péptido.

Figura 54 Espectro de masas de la secuencia lineal de hélice 1 de HPV16 E7

OH CH3O

NH CH3OO

Figura 55. Fórmula estructural de la hélice 1 de HPV 16 E7

Figura 56. Espectro cromatográfico de la hélice 1 de la proteína HPV16 E7

109876543210

RT [min]

2450 (8)-191015.DATAmV

Figura 57. Espectro de masas de la hélice 1 de la proteína HPV16 E7

Puesto que la finalidad de la investigación es la síntesis de péptidos con restricción

conformacional para conseguir imitar de la mejor manera la proteína nativa, se hace necesario

determinar la efectividad de la restricción del péptido y por tanto observar si el péptido tomo

forma hélice.

Debido a lo anterior se realizaron medidas en dicroísmo circular, en el dicroísmo de la

secuencia lineal de la hélice 1 de la proteína E7 (Figura 58. A) se observa que se intentan

formar dos mínimos, el primero en 226 nm y el segundo en 207 nm aproximadamente,

llegando a niveles de elipticidad molar de -4066 y -7300 correspondientemente, y

posteriormente sube llegando a un valor de elipticidad molar de 13000, lo que evidencia que

a pesar de ser el péptido lineal, por si solo tiene la tendencia a tomar conformación hélice,

esto es debido a que la secuencia peptídica sintetizada, de los 10 residuos que posee, cuatro

de estos, alanina, metionina, histidina y glutámico, presentan alta tendencia a generar

conformación hélice .En el dicroísmo de la hélice 1 de la proteína E7 (Figura 58. B) se puede

observar que se generaron dos mínimos en 220 nm y 210 nm llegando ambos a elipticidad

molar de -11800 y posteriormente sube hasta 21760, esta forma con los dos mínimos a igual

valor y una subida muy pronunciada es lo que se considera como una hélice perfecta. Al

comparar los dos dicroísmos (Figura 58. C) se evidencia claramente el cambio generado en

el péptido al realizar la ciclación mediante JAZ llegando a mejorar la conformación hélice.

C. Figura 58. A. Dicroísmo circular de la secuencia lineal de la hélice 1 de HPV16 E7. B.

dicroísmo circular de la hélice 1 de HPV16 E7. C. Comparación del dicrísmo circular lineal

y restringido de la hélice 1 de HPV16 E7.

OH CH3

CH3CH3

Figura 59. Fórmula estructural de la secuencia lineal de la hélice 3 de HPV16 E7

En el espectro cromatográfico del péptido lineal de la hélice 3 de la proteína E7

VDIRTLEDLLM (Figura 60) se evidencia que el péptido obtenido presenta una pureza

mayor al 95%, mediante el espectro de masas (Figura 61) se puede confirmar que el péptido

sintetizado fue el planteado (Figura 59), puesto que este presenta una masa teórica de 1316.6

g/mol y en el espectro de masas se observa el pico del péptido en 1316, y el pico mayoritario

se presenta en 659, siendo la principal fragmentación encontrada en este péptido.

190 250200 220 240

Mol. Ellip.

Wavelength [nm]

-20000

-10000

190 250200 220 240

Mol. Ellip.

Wavelength [nm]

-20000

-10000

190 250200 220 240

Mol. Ellip.

Wavelength [nm]

Figura 60. Espectro cromatográfico de la secuencia lineal de la hélice 3 de HPV16 E7

Figura 61. Espectro de masas de la secuencia lineal de la hélice 3 HPV16 E7

En el espectro cromatográfico (Figura 63) de la hélice 3 de la proteína E7, JAZ—

VDIRTLEDLLM—GC, (Figura 62) se evidencian 4 señales que presentan prácticamente

la misma intensidad, lo que nos da a entender que el péptido no se encuentra puro; en el

espectro de masas de la hélice 3 de la proteína E7 (Figura 64) se observa una señal en 1743

la cual sería la correspondiente al péptido deseado, y el pico mayoritario es correspondiente

a la principal fragmentación del péptido, por lo cual se podría asegurar que el resultado

obtenido es efectivamente el péptido deseado, aun así se encuentran otras señales aunque en

menor intensidad, por lo cual se procedió a analizar la muestra en MALDI-TOF (Figura 65)

en donde se evidencia que el pico mayoritario es el del péptido deseado, encontrándose en

1743.66, de acuerdo con lo anterior se evidencia que efectivamente el péptido se encuentra

en gran proporción y posiblemente las diferentes contaminaciones que se observan en el

HPLC y en el masas son debidas a aductos y que se dieron en el momento del clivaje y

diferentes delesiones, como la primera delesión que se evidencia en 1630 generando una

diferencia de masa de 113, la cual podría ser la pérdida de una leucina. Este péptido podría

ser purificado mediante C-18.

NH NH2

OH CH3

CH3 CH3O

Figura 62. Formula estructural de hélice 3 de HPV16 E7

Figura 63. Espectro cromatográfico de la hélice 3 de la proteína HPV16 E7

Figura 64. Espectro de masas de la hélice 3 de la proteína HPV16 E7

Figura 65. Espectro de MALDI-TOF de la hélice 3 de la proteína E7

En el dicroísmo circular de la secuencia lineal de la hélice 3 de la proteína E7 (Figura 66. A)

se puede evidenciar que el péptido sintetizado presenta por si solo una tendencia a tomar

conformación hélice, puesto que presenta un primer mínimo a 220 nm llegando a un nivel de

elipticidad molar de -17383 y un segundo mínimo a 208 nm que llega a un nivel de -21375

de elipticidad molar y posteriormente sube hasta llegar a un nivel de 41561 de elipticidad

molar, lo que genera una formación característica de conformación hélice. Además se debe

de tener en cuenta que la secuencia tiene presencia de 3 leucinas, metionina o glutámico,

aminoácidos que son altamente influyentes para conformaciones hélice. En el espectro de

dicroísmo circular de la hélice 3 de la proteína E7 (Figura 66. B) se pueden observar los dos

mínimos y la posterior subida característica de la conformación hélice. El primer mínimo se

encuentra en 220 nm llegando a una elipticidad molar de -29735 y el segundo mínimo en 208

nm llegando a una elipticidad molar de -35750, posteriormente subiendo hasta llegar a una

elipticidad molar de 61535. En la comparación de los dicroísmos circulares de la secuencia

lineal y la secuencia restringida (Figura 66. C) se puede evidenciar claramente que el sitio de

nucleación JAZ efectivamente logró optimizar la formación de la hélice.

C. Figura 66. A. Dicroísmo circular de la secuencia lineal de la hélice 3 de HPV16 E7. B.

dicroísmo circular de la hélice 3 de HPV16 E7. C. Comparación del dicroísmo circular

lineal y restringido de la hélice 3 de HPV16 E7.

8.3.3. Hélice 2 de HPV16 L1

OH CH3O

CH3CH3O

Figura 67. Fórmula estructural de la secuencia lineal de la hélice 2 de HPV16 L1

-30000

-20000

190 250200 220 240

Mol. Ellip.

Wavelength [nm]

-40000

190 250200 220 240

Mol. Ellip.

Wavelength [nm]

-40000

-20000

190 210 230 250

Wavelength (nm)Lineal Restringido

Figura 68. Espectro cromatográfico de la secuencia lineal de hélice 2 de HPV16 L1

Figura 69. Espectro de masas de la secuencia lineal de hélice 2 de HPV16 L1

En el espectro cromatográfico (Figura 68) de la secuencia lineal de la hélice 2 de la proteína

L1 ADVMTYIHSM (Figura 67),, se puede observar una sola señal, la cual nos evidencia

que el péptido sintetizado presenta una pureza mayor al 50%, en el espectro de masas de la

secuencia lineal de la hélice 2 de L1 (Figura 69) se puede evidenciar un pico muy marcado

en 1166, el cual sería correspondiente al péptido deseado, puesto que este presenta un peso

molecular de 1166,4 g/mol, por lo cual se puede evidenciar que efectivamente se obtuvo el

péptido planteado.

En el espectro cromatográfico (Figura 71) de la hélice 2 de la proteína L1, JAZ—

ADVMTYIHSM—GC (Figura 70) se evidencia la presencia de dos picos seguidos,

prácticamente uno solo, esto se puede generar debido a las cisteína o a las metioninas, de las

cuales una pequeña porción se pudo oxidar y generar los dobles picos, pero se aun así se

puede evidenciar que presenta cierto grado de pureza. En el espectro de masas (Figura 72) se

puede observar el pico en 1593 el cual sería correspondiente al péptido deseado puesto que

este presenta un peso molecular de 1594,9 g/mol y presenta un pico mayoritario en 834

correspondiente a una de las principales fragmentaciones del péptido. Por lo cual se puede

evidenciar que efectivamente se obtuvo el péptido deseado.

NH CH3OO

NH NH2

OH CH3O

CH3CH3O

Figura 70. Fórmula estructural de la hélice 2 de HPV16 L1

Figura 71. Espectro cromatográfico de la hélice 2 de HPV 16 L1

Figura 72. Espectro de masas de hélice 2 de HPV 16 L1

dicroísmo circular de la hélice 2 de HPV16 L1. C. Comparación del dicroísmo circular

lineal y restringido de la hélice 2 de HPV16 L1.

En el dicroísmo circular de la secuencia lineal de la hélice 2 de la proteína L1 (Figura 73. A),

se puede observar que se presentan dos mínimos y posteriormente una subida muy

pronunciada; el primer mínimo se encuentra en 220 nm llegando a una elipticidad molar de

-20000

-10000

190 250200 220 240

Mol. Ellip.

Wavelength [nm]

-30000

-20000

190 250200 220 240

Mol. Ellip.

Wavelength [nm]

-30000

-20000

190 250200 220 240

Mol. Ellip.

Wavelength [nm]

-10933, luego presenta un segundo mínimo a 208 nm a un nivel de -13211 de elipticidad

molar y por ultimo sube hasta llegar a un nivel de 26702 de elipticidad molar. Esto evidencia

que la secuencia por si sola tiende a tomar una conformación hélice, y teniendo en cuenta

que la secuencia presenta alanina, metionina e histidina se puede asegurar esta conformación

puesto estos aminoácidos presenta alta tendencia a conformación hélice.

En el dicroísmo circular de la hélice 2 de la proteína L1 (Figura 73. B) se puede observar que

se presenta un primer mínimo a 220 nm llegando a una elipticidad molar de -24921,

posteriormente presenta un segundo mínimo más pronunciado en 208 nm, el cual llega hasta

una elipticidad molar de -27173 y por ultimo sube hasta llegar a un máximo de 56323,

determinando así que efectivamente se logró obtener una conformación hélice.

En la comparación del dicroísmo circular de la secuencia lineal y la secuencia restringida de

la hélice 2 de la proteína L1 (Figura 73. C) se puede evidenciar que efectivamente se logró

mejorar la restricción conformacional del péptido, lo cual se evidencia en el cambio de

amplitud de la onda.

8.3.4. Hélice 4 de HPV 16 L1

OH CH3O

CH3CH3

OH CH3

Figura 74. Fórmula estructural de la secuencia lineal de la hélice 4 de HPV16 L1

En el espectro cromatográfico (Figura 75) de la secuencia lineal de la hélice 4 de la proteína

L1 (Figura 74), LEDTYRFVTSQA, se puede observar la presencia de un solo pico, lo cual

nos indica que el péptido sintetizado se encuentra en una pureza mayor al 95%, en el espectro

de masas (Figura 76) se evidencia la presencia de un pico en 1428, el cual sería

correspondiente al péptido puesto que este presenta un peso molecular de 1428,6 g/mol y

además se encuentra el pico mayoritario en 715 el cual corresponde a la principal

fragmentación del péptido. Por lo cual se puede evidenciar que el péptido sintetizado es el

péptido deseado.

Figura 75. Espectro cromatográfico de la secuencia lineal de la hélice 4 de HPV16 L1

Figura 76. Espectro de masas de la secuencia lineal de la hélice 4 de HPV16 L1

NH CH3OO

NH NH2

OH CH3O

CH3CH3

OH CH3

Figura 77. Fórmula estructural de la hélice 4 de HPV16 L1

Figura 78. Espectro cromatográfico de la hélice 4 de HPV16 L1

En el espectro cromatográfico de la hélice 4 de la proteína L1 (Figura 78), JAZ—

LEDTYRFVTSQA—GC (Figura 77), se puede observar la presencia de dos picos, estos se

pueden deber a la cisteína, puesto que si esta se oxida se encontrara el péptido con la cisteína

normal y el péptido con la cisteína oxidada, en el espectro de masas de la hélice 4 de la

proteína L1 (Figura 79) se puede evidenciar la presencia de un pico en 1855, el cual sería el

correspondiente al péptido puesto que este presenta un peso molecular de 1857 g/mol, y

además presenta un pico en 965 correspondiente a una de las principales fragmentaciones.

Figura 79. Espectro de masas de la hélice 4 de HPV16 L1.

C. Figura 80. A. Dicroísmo circular de la secuencia lineal de la hélice 4 de HPV16 L1. B.

dicroísmo circular de la hélice 4 de HPV16 L1. C. Comparación del dicroísmo circular

lineal y restringido de la hélice 4 de HPV16 L1.

Mediante el dicroísmo circular de la secuencia lineal de la hélice 4 de la proteína L1 (Figura

80. A) se evidencia que la secuencia tiende a tomar conformación de hélice, muy

posiblemente debido a que la secuencia presenta alanina, glutámico y leucina, los cuales,

como se ha dicho anteriormente, tiene tendencia a formar hélices, en el dicroísmo se observa

un primer mínimo a 220 nm llegando a una elipticidad molar de -7525, luego presenta un

segundo mínimo más pronunciado a 207 nm, llegando a un nivel de -11735 de elipticidad

molar y por ultimo tiene una subida muy marcada a 190 nm, llegando a un nivel de elipticidad

molar de 10263.

Por otro lado se tiene el dicroísmo circular de la secuencia de la hélice 4 de la proteína L1

(Figura 80. B) en donde se puede observar un primer mínimo a 220 nm llegando a un nivel

de -23040 de elipticidad molar, posteriormente presenta otro mínimo en 208 nm con una

elipticidad molar de -26875 y por ultimo presenta una subida muy marcada llegando a un

nivel de 39871 de elipticidad molar. Por último se puede observar la comparación del

dicroísmo circular de la secuencia lineal y la restringida (Figura 80. C), en donde se evidencia

que efectivamente al poner el sitio de nucleación JAZ se mejoró la estructura hélice puesto

que la amplitud de la onda se hizo más grande llegando a mínimos y máximo más altos y

además los mínimos se estabilizaron más llegando a estar casi al mismo nivel.

-12000

190 250200 220 240

Mol. Ellip.

Wavelength [nm]

-30000

-10000

190 210 230 250

Wavelength (nm)

-30000

-20000

-10000

190 210 230 250

Wavelength (nm)

lineal restringido

8.3.5. Loop FG de HPV16 L1

OH CH3O

Figura 81. Fórmula estructural de la secuencia lineal de la loop FG de HPV16 L1

Figura 82. Espectro cromatográfico de la secuencia lineal de la loop FG de HPV16 L1

En el espectro cromatográfico de la secuencia lineal de la loop FG de la proteína L1 (Figura

82), DDLYIKGSGSTA (Figura 81) se puede evidenciar que el péptido sintetizado presenta

un porcentaje de pureza mayor al 95% pues que se observa un solo pico muy definido. En el

espectro de masas de la loop FG (Figura 83) se puede observar un pico en 1225, el cual

demuestra que el péptido sintetizado es el péptido planteado, puesto que este presenta un

peso molecular teórico de 1225,3 g/mol, y presenta el pico mayoritario en 614

correspondiente a la fragmentación principal del péptido.

Figura 83. Espectro cromatográfico de la secuencia lineal de la loop FG de HPV16 L1

Figura 84. Fórmula estructural de la loop FG de HPV16 L1

Mediante el espectro cromatográfico de la loop FG de la proteína L1 (Figura 85), J—

DDLYIKGSGSTA—Z—GC (Figura 84), se puede evidenciar que el péptido obtenido

presenta un buen grado de pureza, puesto que aunque presenta un poco de interferencia se

puede observar que hay un solo pico mayoritario. El peso molecular teórico de la molécula

planteada es de 1582,7, pero en el espectro de masas de la loop FG de la proteína L1 (Figura

86) no se encuentra una señal correspondiente a este valor, por otro lado, se encuentra una

señal en 1653 y la señal mayoritaria en 827 la cual correspondería a la fragmentación

principal de una molécula con un peso molecular de 1653. Por lo anterior se evidencia que

la molécula planteada no fue exactamente la sintetizada y que presenta una diferencia de +71

en el valor de su peso molecular. Esta diferencias de +71 se podría deber a la adición de una

alanina, o al cambio de glicina por glutamina o lisina.

Puesto que las probabilidades eran varias y para corroborar se decidió realizar nuevamente

la síntesis de las secuencias loop, al finalizar y realizar los debidos análisis de HPLC y masas

se observó que el péptido presentaba el mismo M+71, puesto que el valor no es tan alto se

puede plantear que lo más probable es que en el momento del clivaje se haya generado la

unión de un aducto, por lo cual se tendría el péptido deseado con la secuencia planteada más

la unión de un aducto con masa de 71.

Figura 85. Espectro cromatográfico de la loop FG de HPV16 L1

Figura 86. Espectro de masas de la loop FG de HPV16 L1

Figura 87. Dicroísmo circular de la secuencia lineal de la loop FG de HPV16 L1. B.

dicroísmo circular de la loop FG de HPV16 L1. C. Comparación del dicroísmo circular

lineal y restringido de la loop FG de HPV16 L1.

En el dicroísmo circular de la secuencia lineal de la loop FG de la proteína L1 (Figura 87. A)

se evidencia que solamente tiene un mínimo muy pronunciado que se presenta a 198 nm

llegando a un nivel de -10992 de elipticidad molar y posteriormente sube hasta llegar a un

nivel de elipticidad molar de -6755 en 190 nm, esta es una conformación característica de un

random coil, lo que normalmente se conoce como péptidos que no presentan una estructura

definida, pero literalmente random coil son vueltas aleatorias, la conformación loop es una

vuelta, por lo cual su espectro en dicroísmo circular es muy similar a random coil, lo que la

diferencia de esta es que la conformación loop, presenta una leve inflexión indicando otro

posible mínimo que va bajando en el valor de elipticidad molar entre los 235 nm y 215 nm

aproximadamente. Además se debe de tener en cuenta que la secuencia tiene gran cantidad

de glicinas, aspárticos y serinas, los cuales presentan altos índices de influencia para

conformaciones loop

En el dicroísmo circular de la loop FG de la proteína L1 (Figura 87. B) se puede observar

que a medida que se disminuye en la longitud de onda se puede observar una leve inflexión

tratando de formarse un mínimo entre los 230 nm y 220 nm a una elipticidad de molar de -

-11000

190 250200 220 240

Mol. Ellip.

Wavelength [nm]

-15000

-10000

190 250200 220 240

Mol. Ellip.

Wavelength [nm]

-15000

-10000

190 250200 220 240

Mol. Ellip.

Wavelength [nm]

5478, posteriormente baja hasta llegar a un mínimo muy pronunciado a 200 nm con un nivel

de elipticidad molar de -14749 y por ultimo sube hasta llegar a -3877 a 190 nm.

En la comparación del espectro lineal y el restringido de la loop FG de la proteína L1 (Figura

87. C), se puede evidenciar que la proteína efectivamente tomo una conformación loop al

generarse la inflexión más notoria y un mínimo más pronunciado y posteriormente una subida

8.3.6. Loop HI de HPV16 L1

OH CH3

OH CH3O

OH CH3

Figura 88. Fórmula estructural de la secuencia lineal de la loop HI de HPV16 L1

Figura 89. Espectro cromatográfico de la secuencia lineal de la loop HI de HPV16 L1

Mediante el espectro cromatográfico de la secuencia lineal de la loop HI de la proteína L1

(Figura 89), ISTSETTYKNTNF (Figura 88), se puede evidenciar que el péptido sintetizado

presenta una pureza mayor al 95%, puesto que se observa un solo pico muy definido, en el

espectro de masas de la loop HI de la proteína L1, (Figura 90), se observa un pico marcado

en 1505, el cual corresponde al péptido sintetizado puesto que este presenta un peso

molecular teórico de 1504,6 g/mol, por lo cual se puede determinar que el péptido obtenido

es efectivamente el que se diseñó.

En el espectro cromatográfico de la loop HI de la proteína L1 (Figura 92), J—

ISTSETTYKNTNF—Z—GC (Figura 91) se observa un pico muy definido, lo cual nos

indica que el péptido sintetizado presenta un alto nivel de pureza, en el espectro de masa de

la loop HI (Figura 93) se puede observar un pico característico que corresponde al péptido

sintetizado en 1932 m/z, además se observa que la señal mayoritaria es de 967 m/z la cual es

correspondiente a la fragmentación primaria del péptido con peso molecular de 1932 m/z, al

igual que el péptido anterior, este presenta una masa experimental de +71, puesto que el peso

molecular teórico del péptido es de 1862,1 g/mol. Por lo cual se plantea que al momento del

clivaje se adhirió un aducto al péptido sintetizado. De esta manera se tiene el péptido deseado

con un aducto que presenta una masa de +71

Figura 90. Espectro de masas de la secuencia lineal de loop HI de HPV16 L1

Figura 91. Fórmula estructural de la loop HI de HPV16 L1

Figura 92. Espectro cromatográfico de la loop HI de HPV16 L1

Figura 93. Espectro de masas de la loop HI de HPV16 L1

En el dicroísmo de la secuencia lineal de la loop HI de la proteína L1 (Figura 94. A) se puede

observar que se intenta generar un mínimo al redor de los 230 nm estando en una elipticidad

molar de -2379 y posteriormente se genera un mínimo muy marcado en 202 nm el cual llega

a un nivel de elipticidad molar de -9138, por ultimo sube hasta llegar a un nivel de elipticidad

molar de -4227 en 190 nm, esta conformación nos demuestra que la secuencia tiene una gran

tendencia a tomar conformación loop, posiblemente por la gran cantidad de presencia de

treoninas y serinas.

En el dicroísmo circular de la loop HI de la proteína L1 (Figura 94. B), se evidencia que hay

una curvatura pronunciada entre los 235nm y 225 nm estando aproximadamente a un nivel

de -6779 de elipticidad molar, posteriormente sigue bajando hasta llegar a un mínimo muy

marcado el cual se encuentra en un nivel de -14411 de elipticidad molar en 202 nm y por

ultimo sube hasta un nivel de 3901 de elipticidad molar en 190 nm. En la comparación del

dicroísmo circular de la secuencia lineal y la restringida de la loop HI (Figura 94. C) se

evidencia que al utilizar el sitio de nucleación JAZ es una buena metodología puesto que el

péptido tomó mayor restricción tomando una mejor forma de loop.

C. Figura 94. Dicroísmo circular de la secuencia lineal de la loop HI de HPV16 L1. B.

dicroísmo circular de la loop HI de HPV16 L1. C. Comparación del dicroísmo circular

lineal y restringido de la loop HI de HPV16 L1

7.1. Rendimiento de la síntesis

Al tener el péptido desalinizado y liofilizado se procedió a pesarlo para saber la cantidad

obtenido y por tanto determinar el rendimiento de la síntesis.

Para saber el rendimiento de la síntesis, primero se determinó el peso teórico, este se calcula

mediante la multiplicación del peso molecular del péptido, la sustitución de la resina y la

cantidad de resina usada.

𝑷𝒆𝒔𝒐 𝒕𝒆ó𝒓𝒊𝒄𝒐 = 𝑃. 𝑀. 𝑑𝑒𝑙 𝑝é𝑝𝑡𝑖𝑑𝑜 × 𝑠𝑢𝑠𝑡𝑖𝑡𝑢𝑐𝑖ó𝑛 𝑑𝑒 𝑙𝑎 𝑟𝑒𝑠𝑖𝑛𝑎 × 𝑔 𝑑𝑒 𝑟𝑒𝑠𝑖𝑛𝑎

El peso del péptido obtenido experimentalmente se divide por el peso teórico del péptido y

este se multiplica por cien, con lo cual se obtendrá el rendimiento de la síntesis del péptido

-10000

190 250200 220 240

Mol. Ellip.

Wavelength [nm]

-15000

-10000

190 250200 220 240

Mol. Ellip.

Wavelength [nm]

-15000

-10000

190 250200 220 240

Mol. Ellip.

Wavelength [nm]

Lineal

𝑹𝒆𝒏𝒅𝒊𝒎𝒊𝒆𝒏𝒕𝒐 𝒕𝒆ó𝒓𝒊𝒄𝒐 = 1262,46𝑚𝑔

𝑚𝑒𝑞× 0,59

𝑚𝑒𝑞

𝑔× 0,04𝑔 = 29,79𝑚𝑔

% 𝒓𝒆𝒏𝒅𝒊𝒎𝒆𝒏𝒕𝒐 =19,46𝑚𝑔

29,79𝑚𝑔× 100 = 65,32%

Restringido

𝑚𝑒𝑞× 0,59

𝑚𝑒𝑞

𝑔× 0,04𝑔 = 39,88𝑚𝑔

39,88𝑚𝑔× 100 = 39,69%

7.1.2. Hélice 3 de HPV 16 E7

Lineal

𝑚𝑒𝑞× 0,59

𝑚𝑒𝑞

𝑔× 0,04𝑔 = 31,09𝑚𝑔

31,09𝑚𝑔× 100 = 57,99%

Restringido

𝑚𝑒𝑞× 0,59

𝑚𝑒𝑞

𝑔× 0,04𝑔 = 41,18𝑚𝑔

41,18𝑚𝑔× 100 = 29,09%

En los péptidos sintetizados de la proteína E7 se puede observar que los péptidos lineales

presentan mayor porcentaje de rendimiento que los péptidos restringidos, los péptidos

lineales llegan a tener un rendimiento entre 57% y 66%, lo cual es considerado como un buen

rendimiento. Por el lado de los péptidos restringido, la hélice 1 presento un rendimiento

mayor que la hélice 3, aunque a pesar de esto, un 29% se sigue considerando como un buen

rendimiento, puesto que los péptidos restringidos presentar una mayor dificultad de ser

sintetizados, lo que genera mayor facilidad de bajar su rendimiento.

Lineal

𝑚𝑒𝑞× 0,59

𝑚𝑒𝑞

𝑔× 0,04𝑔 = 27,55𝑚𝑔

27,55𝑚𝑔× 100 = 46,24%

Restringido

𝑚𝑒𝑞× 0,59

𝑚𝑒𝑞

𝑔× 0,04𝑔 = 37,64𝑚𝑔

37,64𝑚𝑔× 100 = 30,79%

Lineal

𝑚𝑒𝑞× 0,59

𝑚𝑒𝑞

𝑔× 0,04𝑔 = 33,74𝑚𝑔

33,74𝑚𝑔× 100 = 51,66%

Restringido

𝑚𝑒𝑞× 0,59

𝑚𝑒𝑞

𝑔× 0,04𝑔 = 43,82𝑚𝑔

43,82𝑚𝑔× 100 = 30,73%

7.1.5. Loop FG de HPV 16 L1

Lineal

𝑚𝑒𝑞× 0,59

𝑚𝑒𝑞

𝑔× 0,04𝑔 = 28,94𝑚𝑔

28,94𝑚𝑔× 100 = 58,15%

Restringido

𝑚𝑒𝑞× 0,59

𝑚𝑒𝑞

𝑔× 0,04𝑔 = 37,35𝑚𝑔

37,35𝑚𝑔× 100 = 37,32%

7.1.6. Loop HI de HPV16 L1

Lineal

𝑚𝑒𝑞× 0,59

𝑚𝑒𝑞

𝑔× 0,04𝑔 = 28,94𝑚𝑔

28,94𝑚𝑔× 100 = 61,26%

Restringido

𝑚𝑒𝑞× 0,59

𝑚𝑒𝑞

𝑔× 0,04𝑔 = 43,94𝑚𝑔

% 𝒓𝒆𝒏𝒅𝒊𝒎𝒆𝒏𝒕𝒐 =12, 25𝑚𝑔

43,94𝑚𝑔× 100 = 27,88%

Los péptidos lineales sintetizados de la proteína L1 presentan altos porcentajes de

rendimiento, llegando incluso al 61% y ninguna bajo del 45%, esto indica que la síntesis se

realizó de una manera adecuada. Por otro lado, los péptidos restringidos a conformación

hélice presentaron rendimientos mayores que los péptidos restringidos a loop, pero todos se

consideran buenos rendimientos, puesto que la dificultad de generar una restricción loop es

mayor que la dificultad de generar una hélice, por lo tanto un rendimiento de 37% y 27% es

un rendimiento mayor al esperado para los péptidos con conformación loop, los dos péptidos

con conformación hélice presentan un buen rendimiento a estar en 30%

9. CONCLUSIONES

1. Fueron sintetizados 12 péptidos del virus del papiloma humano genotipo 16, mediante

la estrategia de síntesis de péptidos en fase sólida Fmoc. 4 de estos péptidos fueron

de la proteína E7, puesto que se sintetizaron las secuencias restringidas y lineales de

la hélice 1 (JAZ--TLHEYMLDLQ—GC) y la hélice 3 (JAZ—VDIRTLEDLLM—

GC) las cuales presentaron altos porcentajes de rendimiento, ambas secuencias

lineales tuvieron altos índices de pureza pero la secuencia restringida de la hélice 1

presentó mejor porcentaje de pureza que la secuencia restringida de la hélice 3. Sin

embargo, se demostró la presencia de las secuencias deseadas en los 4 péptidos.

2. De la proteína L1 se sintetizaron 8 péptidos, la hélice 2 (JAZ—ADVMTYIHSM—

GC), la hélice 4 (JAZ—LEDTYRFVTSQA—GC), la loop FG (J—

DDLYIKGSGSTA—Z—GC) y la loop HI (J—ISTSETTYKNTNF—Z—GC) con

sus respectivas secuencias lineales, todos los péptidos lineales presentaron altos

índices de pureza y porcentajes de rendimiento, las secuencias restringidas en

conformación hélice presentaron altos porcentaje de rendimiento y niveles de pureza

aceptables, por el lado de los péptidos con restricción conformacional a loop se

obtuvieron buenos porcentajes de rendimiento a pesar de la dificultad de su síntesis y

se determinó la presencia de los péptidos deseados aunque presentaran un aducto.

3. Se determinó que el sitio de nucleación JAZ (en proceso de patente por parte de la

Universidad Distrital y grupo Poteoma) es capaz de estabilizar en alfa hélice péptidos

cortos, lo cual no se había demostrado, pues se había aplicado exclusivamente a

macromoléculas dendriméricas tipo DDC.

10. RECOMENDACIONES.

Puesto que las diferentes secuencias lineales y con restricción conformacional de las dos

proteínas se obtuvieron exitosamente, la mayoría con altos niveles de pureza y rendimiento,

se sugiere que se proceda a realizar los respectivos análisis de ELISA para determinar la

reacción antígeno- anticuerpo de las secuencias lineales y restringidas y así poder determinar,

si efectivamente, las secuencias restringidas presentan mayor reactividad que las secuencias

lineales. Algunos de estos péptidos ya se habían analizado en el instituto de Inmunología de

Colombia, pero usando el sitio de nucleación JLAZ- propuesto por el grupo de Satterthwait

en California. Al tener estos resultados se podrá empezar a pensar en la postulación de un

nuevo método de identificación del virus del papiloma humano mediante pruebas más

sencillas y menos dolorosas para las pacientes.

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