sÍntesis de pÉptidos con y sin restricciÓn...
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SÍNTESIS DE PÉPTIDOS CON Y SIN RESTRICCIÓN CONFORMACIONAL DE
LAS PROTEÍNAS HPV16 L1 Y HPV16 E7, PARA SU POSTERIOR ESTUDIO DE
REACTIVIDAD
ERIKA MARYORI NIÑO VEGA
UNIVERSIDAD DISTRITAL FRANCISCO JOSÉ DE CALDAS
FACULTAD DE CIENCIAS Y EDUCACIÓN
LICENCIATURA EN QUÍMICA
GRUPO DE INVESTIGACIÓN PROTEOMA
BOGOTÁ, D.C., 19 DE ENERO 2016
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SÍNTESIS DE PÉPTIDOS CON Y SIN RESTRICCIÓN CONFORMACIONAL DE
LAS PROTEÍNAS HPV16 L1 Y HPV16 E7, PARA SU POSTERIOR ESTUDIO DE
REACTIVIDAD
ERIKA MARYORI NIÑO VEGA
Trabajo de grado para optar al título de Licenciada en Química
Director, investigador:
Julio Cesar Calvo Mozo
Universidad Distrital
Grupo Investigación Proeoma
UNIVERSIDAD DISTRITAL FRANCISCO JOSÉ DE CALDAS
FACULTAD DE CIENCIAS Y EDUCACIÓN
LICENCIATURA EN QUÍMICA
GRUPO DE INVESTIGACIÓN PROTEOMA
BOGOTÁ, D.C., 19 DE ENERO 2016
3
NOTA DE ACEPTACIÓN
Números Letras
_______________________________________
Jurado (Nombre/firma) )
_________________________________________
Jurado (Nombre/firma) )
BOGOTÁ, D.C., 19 DE ENERO 2016
4
DEDICATORIA
Dedico este trabajo en primer medida a Dios quien siempre me ha guiado permitiéndome
llegar a este momento tan importante de mi formación profesional. A mi madre Amanda
Vega quien ha sido mi mayor apoyo, motivación y ejemplo. A mis hermanos Julián y
Felipe, puesto que por ellos lucho cada día. A mi abuelita Estrella quien me ha apoyado
incondicionalmente en todo momento. A mi tino Alex que en muchas ocasiones ha sido
como mi padre y me ha sabido aconsejar cuando lo he necesitado. A mi tía Gloria por
brindarme su ayuda y amor A Efraín por su gran apoyo, por creer en mí y darme lo mejor
de sí en cada momento que estuvo a mi lado. A mis amigos y compañeros Milena Gómez,
Adriana Molina, Juan Vanegas, Schneider Bárcenas, Mateo Álvarez y demás que me
acompañaron y apoyaron en este gran camino.
5
AGRADECIMIENTOS
Agradezco al profesor Julio Cesar Calvo por permitirme entrar en su grupo de investigación,
trabajar a su lado, compartirme sus conocimientos, por su orientación y apoyo en cada
momento y la enorme confianza que deposito en mí. A cada una de las personas del grupo
de investigación Proteoma quienes me apoyaron para culminar este trabajo.
A la doctora Fanny Guzmán de la Pontificia Universidad Católica de Valparaíso, por
recibirme en el laboratorio de síntesis de péptidos y permitirme continuar y finalizar allí mi
trabajo, por su hospitalidad brindada y por la calidez con la que me transmitió sus
conocimientos y me aportó lo necesario para culminar este proceso, así como a cada una de
las personas que se convirtieron en mi familia temporal en Chile.
Al personal del CERI y el CIDC por su gran ayuda para poder continuar este trabajo de
investigación en el exterior.
6
LA UNIVERSIDAD DISTRITAL FRANCISCO JOSÉ DE CALDAS
No se hace responsable de las ideas, ni del contenido del presente trabajo, aquí
expuesto por sus autores
7
CONTENIDO
1. INTRODUCCIÓN 16
2. PROBLEMA 17
2.1. DEFINICIÓN 17
2.2. DESCRIPCION Y DELIMITACIÓN 17
3. ANTECEDENTES Y JUSTIFICACIÓN 18
4. OBJETIVOS 20
4.1. GENERAL 20
4.2. ESPECIFICOS 20
5. HIPÓTESIS 21
6. MARCO TEÓRICO 22
6.1. Aminoácidos 22
6.1.1. Aminoácidos con cadena lateral apolar 22
6.1.2. Aminoácidos con cadenas laterales polares sin carga 23
6.1.3. Aminoácidos con cadenas laterales polares cargadas 24
6.2. Péptidos 26
6.2.1. Generalidades 26
6.2.2. Enlace peptídico 26
6.2.3. Estructura 27
6.2.3.1. Conformación α hélice 27
6.2.3.2. Conformación lamina beta o loop 28
6.2.4. Aplicaciones de los péptidos 30
6.2.4.1. Estudio del plegamiento de proteínas 30
6.2.4.2. Péptidos miméticos 30
6.2.4.3. Neuropéptidos funcionales 30
6.2.4.4. Antigenicidad e inmunidad 31
6.2.4.5. Fármacos peptídicos 31
6.2.4.6. Epítopes B 31
8
6.2.4.7. Péptidos como vacunas 31
6.2.5. Síntesis de péptidos. 32
6.2.5.1. Síntesis de péptidos por estrategia Fmoc/tBu 34
6.2.5.1.1. Soportes sólidos o Resinas 34
6.2.1.5.2. Conector o Espaciador 35
6.2.1.5.3. Grupos Protectores 35
6.2.1.5.4. Desprotección 40
6.2.1.5.5. Activación y acople 41
6.2.1.5.6. Desanclaje 43
6.3. Proteínas 44
6.3.1. Generalidades de las Proteínas. 44
6.3.2. Estructura de las proteínas 45
6.3.3. Clasificación de las Proteínas 46
6.4. Inmunogenicidad 46
6.4.1. Respuestas inmunes 46
6.4.2. Linfocitos 47
6.4.3. Antígeno 49
6.4.4. Reacción antígeno anticuerpo 49
6.5. Virus del Papiloma Humano 50
6.5.1. Generalidades del HPV 51
6.5.2. Clasificación del HPV 51
6.5.3. Genoma del HPV 52
6.5.4. Patogenia del HPV 53
6.5.5. Métodos de identificación del HPV 53
6.5.6. Vacunas contra HPV 55
7. METODOLOGÍA 57
7.1. Determinación de las secuencias a sintetizar. 57
7.2. Síntesis de péptidos 57
7.3. Desanclaje 61
7.4. Liofilización 61
7.5. Purificación 61
9
7.5.1. Desalinización mediante G-10 62
7.6. Caracterización del péptido 62
7.6.1. HPLC 62
7.6.2. Espectroscopía de masas 63
7.6.3. Espectroscopía de masas (MALDI-TOF) 63
7.6.4. Dicroísmo Circular 64
8. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 66
8.1. Determinación de las secuencias a sintetizar 66
8.2. Diseño de los péptidos 69
8.3. Resultados estructurales 70
8.3.1. Hélice 1 de HPV16 E7 70
8.3.2. Hélice 3 de HPV16 E7 74
8.3.3. Hélice 2 de HPV16 L1 78
8.3.4. Hélice 4 de HPV 16 L1 82
8.3.5. Loop FG de HPV16 L1 86
8.3.6. Loop HI de HPV16 L1 90
7.1. Rendimiento de la síntesis 93
7.1.1. Hélice 1 de HPV16 E7 94
7.1.2. Hélice 3 de HPV 16 E7 94
7.1.3. Hélice 2 de HPV 16 L1 95
7.1.4. Hélice 4 de HPV 16 L1 95
7.1.5. Loop FG de HPV 16 L1 96
7.1.6. Loop HI de HPV16 L1 96
9. CONCLUSIONES 98
10. RECOMENDACIONES. 99
11. REFERENCIAS 100
10
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Fórmula estructural de los aminoácidos con cadenas laterales no polares. 23
Figura 2. Fórmula estructural de los aminoácidos con cadenas laterales polares no cargadas
23
Figura 3. Oxidación de dos cisteínas para formar un enlace disulfuro 24
Figura 4. Formula estructural de los aminoácidos con las cadenas laterales cargadas 24
Figura 5. Pentapéptido serilgliciltirosilalanil-leucina, en donde los enlaces peptídicos se
encuentran sombreados. 27
Figura 6. Interacciones de resonancia en el grupo peptídico 27
Figura 7. a. Estructura secundaria α hélice. b. Puentes de hidrógeno de la estructura α hélice.
28
Figura 8. a. Estructura secundaria hoja plegada β. b. conformación de lámina β. 28
Figura 9. Esquema de la síntesis de péptidos secuencial 32
Figura 10. Esquema de la síntesis de péptidos convergente 33
Figura 11. Esquema general de la síntesis de péptidos en fase sólida. 34
Figura 12. Resina Rink amide fmoc. Usado en la síntesis. 35
Figura 13. Protección de un aminoácido por cloruro de carbobenzoxilo. 36
Figura 14. Grupo protector temporal Fmoc 36
Figura 15. Grupo protector temporal Boc 36
Figura 16. Lisina protegida en el α-amino con el grupo Fmoc y en el ε-amino con un grupo
Boc. 37
Figura 17. Arginina protegida en el α-amino con el grupo Fmoc y en el grupo guanidino con
el grupo pbf. 38
Figura 18. Acido aspártico protegido en el α-amino por el grupo Fmoc y en la cadena lateral
con el grupo tBu 38
Figura 19. Cisteína protegido en el α-amino con el grupo Fmoc y en el grupo tiol de la cadena
lateral con el grupo Trt. 39
Figura 20. Serina protegido en el grupo α-amino por el grupo Fmoc y en la cadena lateral el
grupo tBu. 39
Figura 21. Histidina protegida en el grupo α-amino por el grupo Fmoc y en anillo imidazol
el grupo Trt. 40
Figura 22. Desprotección del grupo Fmoc de un aminoácido con piperidina, generando como
co-producto el aducto de la piperidina y el fluorenil meteno. 41
Figura 23. Estructura de activadores usados en la síntesis de péptidos, carbodiimidas (DCC,
DIPCDI), sales de fosfonio (BOP, PyBOP) y sales de uronio (HBTU, TBTU). 42
Figura 24. Estructura del aditivo oxyma 42
Figura 25. Mecanismo de activación del aminoácido a acoplar mediante HBTU y posterior
unión al péptido-resina. 43
11
Figura 26. Niveles estructurales de una proteína. 45
Figura 27. Componentes del sistema inmune. 47
Figura 28. Linfocito B. 48
Figura 29. Estructura de un anticuerpo 48
Figura 30. Funciones de un linfocito T 49
Figura 31. Tipos de unión entre antígeno anticuerpo 50
Figura 32. A. Representación de HPV. B. Micrografía electrónica del HPV 51
Figura 33. Conformación del HPV 52
Figura 34. Patogenia del VPH en la piel. 53
Figura 35. Esquema general de la síntesis por estrategia de bolsitas de Houghten. 57
Figura 36. Listado de la secuencias a sintetizar generada por el programa peptide.exe 58
Figura 37. Documento del primer acople generado por el programa peptide.exe 58
Figura 38. A. Azul de bromofenol positivo para aminas libres. B. Azul de bromofenol
negativo para aminas libres. 61
Figura 39. Péptido precipitado y lavado con éter frio. 61
Figura 40. Purificación mediante G-10 62
Figura 41. Equipo HPLC 63
Figura 42. Equipo de masas 63
Figura 43. A. Placas de acero para MALDI-TOF. B. Equipo MALDI-TOF 64
Figura 44. Equipo de dicroísmo circular 65
Figura 45. Secuencia de la proteína L1 de HPV genotipo 16 obtenida en PDB 66
Figura 46. Secuencia de la proteína E7 de HPV genotipo 16 obtenida en PDB 66
Figura 47. A. Fórmula estructural de la proteína HPV16 E7 B. Fórmula estructural de la
proteína HPV16 L1. Generadas en I-TASSER 67
Figura 48. Esquema de antigenicidad de la proteína HPV16 E7 68
Figura 49. Estructura terciaria de la proteína HPV 16 E7 generada en I-TASSER con los
fragmentos seleccionados a sintetizar 68
Figura 50. Esquema de antigenicidad de la proteína HPV16 L1 68
Figura 51. Estructura terciaria de la proteína HPV 16 L1 generada en I-TASSER con los
fragmentos seleccionados a sintetizar 69
Figura 52. Fórmula estructural de la secuencia lineal de hélice 1 HPV16 E7 70
Figura 53. Espectro cromatográfico de la secuencia lineal de hélice 1 HPV16 E7 71
Figura 54. Espectro de masas de la secuencia lineal de hélice 1 de HPV16 E7 72
Figura 55. Fórmula estructural de la hélice 1 de HPV 16 E7 72
Figura 56. Espectro cromatográfico de la hélice 1 de la proteína HPV16 E7 72
Figura 57. Espectro de masas de la hélice 1 de la proteína HPV16 E7 73
Figura 58. A. Dicroísmo circular de la secuencia lineal de la hélice 1 de HPV16 E7. B.
dicroísmo circular de la hélice 1 de HPV16 E7. C. Comparación del dicrísmo circular lineal
y restringido de la hélice 1 de HPV16 E7. 74
Figura 59. Fórmula estructural de la secuencia lineal de la hélice 3 de HPV16 E7 74
Figura 60. Espectro cromatográfico de la secuencia lineal de la hélice 3 de HPV16 E7 75
12
Figura 61. Espectro de masas de la secuencia lineal de la hélice 3 HPV16 E7 75
Figura 62. Formula estructural de hélice 3 de HPV16 E7 76
Figura 63. Espectro cromatográfico de la hélice 3 de la proteína HPV16 E7 76
Figura 64. Espectro de masas de la hélice 3 de la proteína HPV16 E7 77
Figura 65. Espectro de MALDI-TOF de la hélice 3 de la proteína E7 77
Figura 66. A. Dicroísmo circular de la secuencia lineal de la hélice 3 de HPV16 E7. B.
dicroísmo circular de la hélice 3 de HPV16 E7. C. Comparación del dicroísmo circular lineal
y restringido de la hélice 3 de HPV16 E7. 78
Figura 67. Fórmula estructural de la secuencia lineal de la hélice 2 de HPV16 L1 78
Figura 68. Espectro cromatográfico de la secuencia lineal de hélice 2 de HPV16 L1 79
Figura 69. Espectro de masas de la secuencia lineal de hélice 2 de HPV16 L1 79
Figura 70. Fórmula estructural de la hélice 2 de HPV16 L1 80
Figura 71. Espectro cromatográfico de la hélice 2 de HPV 16 L1 80
Figura 72. Espectro de masas de hélice 2 de HPV 16 L1 81
Figura 73. A. Dicroísmo circular de la secuencia lineal de la hélice 2 de HPV16 L1. B.
dicroísmo circular de la hélice 2 de HPV16 L1. C. Comparación del dicroísmo circular lineal
y restringido de la hélice 2 de HPV16 L1. 81
Figura 74. Fórmula estructural de la secuencia lineal de la hélice 4 de HPV16 L1 82
Figura 75. Espectro cromatográfico de la secuencia lineal de la hélice 4 de HPV16 L1 83
Figura 76. Espectro de masas de la secuencia lineal de la hélice 4 de HPV16 L1 83
Figura 77. Fórmula estructural de la hélice 4 de HPV16 L1 83
Figura 78. Espectro cromatográfico de la hélice 4 de HPV16 L1 84
Figura 79. Espectro de masas de la hélice 4 de HPV16 L1. 84
Figura 80. A. Dicroísmo circular de la secuencia lineal de la hélice 4 de HPV16 L1. B.
dicroísmo circular de la hélice 4 de HPV16 L1. C. Comparación del dicroísmo circular lineal
y restringido de la hélice 4 de HPV16 L1. 85
Figura 81. Fórmula estructural de la secuencia lineal de la loop FG de HPV16 L1 86
Figura 82. Espectro cromatográfico de la secuencia lineal de la loop FG de HPV16 L1 86
Figura 83. Espectro cromatográfico de la secuencia lineal de la loop FG de HPV16 L1 87
Figura 84. Fórmula estructural de la loop FG de HPV16 L1 87
Figura 85. Espectro cromatográfico de la loop FG de HPV16 L1 88
Figura 86. Espectro de masas de la loop FG de HPV16 L1 89
Figura 87. Dicroísmo circular de la secuencia lineal de la loop FG de HPV16 L1. B.
dicroísmo circular de la loop FG de HPV16 L1. C. Comparación del dicroísmo circular lineal
y restringido de la loop FG de HPV16 L1. 89
Figura 88. Fórmula estructural de la secuencia lineal de la loop HI de HPV16 L1 90
Figura 89. Espectro cromatográfico de la secuencia lineal de la loop HI de HPV16 L1 90
Figura 90. Espectro de masas de la secuencia lineal de loop HI de HPV16 L1 91
Figura 91. Fórmula estructural de la loop HI de HPV16 L1 91
Figura 92. Espectro cromatográfico de la loop HI de HPV16 L1 92
Figura 93. Espectro de masas de la loop HI de HPV16 L1 92
13
Figura 94. Dicroísmo circular de la secuencia lineal de la loop HI de HPV16 L1. B.
dicroísmo circular de la loop HI de HPV16 L1. C. Comparación del dicroísmo circular lineal
y restringido de la loop HI de HPV16 L1 93
14
LISTA DE TABLAS
Tabla 1. Convenciones y propiedades de los aminoácidos indispensables. 25
Tabla 2. Frecuencias relativas con las que se encuentra a los distintos aminoácidos en las
estructuras secundarias de las proteínas. 29
Tabla 3. Tipos de HPV y su correlación clínica 52
Tabla 4. Características generales de las vacunas contra HPV 56
Tabla 5. Secuencias de las proteínas HPV16 E7 y HPV16 L1 escogidas para sintetizar 70
15
RESUMEN
En la actualidad, se han generado alrededor de 500.000 muertes anuales a nivel mundial
debido al cáncer de cuello uterino, problemática de salubridad que llegó además al ámbito
social, junto con su precursor, el virus del papiloma humano, por lo cual se hace necesario
empezar a generar nuevos métodos de tratamiento y diagnóstico de estos.
Los diversos estudios en péptidos han llevado a creer que el diseño de secuencias claves de
proteínas nativas, pueden ser la solución para generar mimos estructurales que generen una
gran respuesta inmune frente a virus que generan enfermedades graves.
La mayoría de investigaciones realizadas del virus del papiloma humano han sido con las
proteínas L1 por conformar el 95% de la cápside del virus y la E7 puesto que es una de las
responsables de inmortalizar la célula hospedero y del proceso cancerígeno.
De acuerdo a lo anterior se realizó esta investigación, empezando con la búsqueda de las
proteínas L1 y E7 del virus del papiloma humano genotipo 16 en la base de datos Protein
Data Bank (PDB), estos datos se trabajaron en I-TASSER, en donde se realizó un blast de
estas y se generó una aproximación de la estructura terciaria, esta se analizó y se determinaron
los fragmentos con restricción conformacional que se encuentran expuestos y presentan una
alta antigenicidad.
De la proteína HPV16 E7 se eligieron las hélices 1 y 3 presentes entre los residuos 7 a 16 y
74 a 84 respectivamente. De la proteína HPV16 L1 se eligieron las hélices 2 y 4 presentes
entre los residuos 385 a 394 y 414 a 425 respectivamente y las loops FG y HI siendo los
residuos 273 a 284 y 348 a 360 respectivamente. Obteniendo así un total de 6 péptidos, los
cuales se sintetizaron con su respectiva restricción conformacional y su homólogo lineal
mediante la estrategia de síntesis de péptidos en fase sólida Fmoc.
Para generar las debidas restricciones conformacionales de cada una de las secuencias se
utilizó el sitio de nucleación JAZ (en proceso de patente por parte de la Universidad Distrital
y grupo Poteoma), el cual logró estabilizar las conformaciones alfa-hélice y loop de las
diferentes secuencias cortas.
De cada uno de los péptidos sintetizados se realizó análisis por HPLC, masas y dicroísmo
circular, mediante los cuales se evidencia la obtención de los péptidos deseados al igual que
la formación y estabilización de las restricciones conformacionales correspondientes, la
mayoría con niveles de pureza y porcentajes de rendimientos altos.
16
1. INTRODUCCIÓN
Este Trabajo de Grado, se realizó en el Grupo de Investigación Proteoma de Licenciatura en
Biología de la Universidad Distrital Francisco José de Caldas con colaboración del Núcleo
Biotecnología Curauma de la Pontificia Universidad Católica de Valparaíso, Chile. En donde
se utilizó la síntesis de péptidos como estrategia para imitar la estructura de fragmentos de
proteínas nativas, teniendo en cuenta que este es un punto importante para la comprensión de
las interacciones de las proteínas [1].
Por lo anteriormente mencionado se realizó el diseño y la síntesis de fragmentos con y sin
restricción conformacional a alfa- hélice y loop de las proteínas L1 y E7 del virus del
papiloma humano (VPH) tipo 16, para lo cual se desarrolló una metodología que permitió
obtener los fragmentos más expuestos de las proteínas simulando de la mejor manera su
forma natural, siendo esta última el punto clave, teniendo en cuenta que los determinantes
antigénicos son reconocidos por el anticuerpo siempre y cuando se considere la conformación
y distribución espacial relativa de los segmentos constituyentes de la proteína nativa, debido
a que la especificidad del reconocimiento es el resultado de la complementariedad física y
química de las superficies interactuantes [2].
Con esta síntesis se esperó realizar un análisis inmunológico en donde se demuestre la posible
respuesta inmune inducida por los fragmentos sintetizados y así proponer en un futuro, una
metodología como posible candidato a método de diagnóstico del VPH, y con este aumentar
los índices de detección temprana del virus, contrastando con la prueba de detección actual,
Papanicolaou Frotis, la cual tiene una baja aceptación por parte de las pacientes debido a la
incomodidad que presenta su metodología y además manifiesta una baja sensibilidad para la
detección de precursores de cáncer de cuello uterino, siendo ésta alrededor del 50% [3].
17
2. PROBLEMA
2.1. DEFINICIÓN
¿Es posible diseñar y sintetizar péptidos con restricción conformacional, que imiten de la
mejor manera regiones helicoidales que se encuentran expuestas en las proteínas HPV 16 L1
y HPV 16 E7, para poder proponer métodos de diagnóstico en un futuro?
2.2. DESCRIPCION Y DELIMITACIÓN
En la década de 1990 el principal tipo de cáncer que provocó muertes a nivel mundial fue el
cáncer de cuello uterino; en este momento, la mayor tasa de mortandad corresponde al cáncer
de mama, pero el cáncer de cuello uterino sigue representando un nivel de riesgo muy alto,
estimándose que causa alrededor de 500.000 muertes al año en todo el mundo.
Algunos tipos de VPH son precursores del cáncer de cuello uterino, entre estos los tipos 16,
18 y 31, los cuales se encuentran muy presentes en las mujeres colombianas, por lo cual la
detección tardía de cualquiera de estos tipos del virus aumenta notablemente los índice de
mortalidad por cáncer de cuello uterino, por esto se ha visto la necesidad de buscar y revisar
métodos de diagnóstico que presenten nuevas estrategias para la predicción y prevención de
la enfermedad, generando nuevos métodos más eficientes en tiempo, calidad y aceptación
del paciente.
Este proyecto busca diseñar y la sintetizar péptidos que imiten de la mejor manera epítopes
de la proteína nativa, logrando un incremento en la especificidad y en la energía de unión en
la reacción antígeno-anticuerpo en sitios específicos de las proteínas VPH 16 L1 y VPH 16
E7
18
3. ANTECEDENTES Y JUSTIFICACIÓN
Emil Fisher desarrollo la síntesis de péptidos en 1901, al sintetizar químicamente un
dipéptido con el concepto de que esto era análogo a sintetizar una amida; luego fue necesario
empezar a generar grupos protectores para los grupos amino y las cadenas laterales de los
aminoácidos, destacándose Bergmann y Zervas al desarrollar protección mediante el grupo
carbobenzoxilo en 1932 [4]. Posteriormente, en 1986, Merrifield realiza la síntesis de
péptidos en fase sólida, consolidándose como uno de los padres de la síntesis de péptidos al
generar un procedimiento mucho más sencillo, rápido y con buenos rendimientos [5]
En 1995 se empiezan a desarrollar métodos para generar restricción conformacional en los
péptidos sintetizados, de manera que estos imiten estructuralmente a la proteína nativa,
puesto que de esta manera se aumentan las posibilidades de que el péptido sintetizado
reaccione con anticuerpos neutralizantes antiproteína [6]. Posteriormente, en 1999, se realiza
la síntesis de oxitocina, (primera molécula sintetizada por síntesis de péptidos en fase líquida
en 1952) determinándose que al usar la estrategia de síntesis de fase sólida Fmoc se obtienen
buenos resultados para la ciclación del péptido, inclusive superando el rendimiento obtenido
mediante la estrategia t-boc [7].
En el año 2003 se implementa la restricción conformacional al realizar la comparación de
reacción antígeno anticuerpo por pruebas de Elisa de un suero de conejo antigameto con
presencia del anticuerpo 4B7 contra un péptido sintético de 10 residuos de la proteína Pfs 25
de falciparum (proteína principal de la malaria) tanto lineal como con conformación loop,
determinándose que los anticuerpos mostraron baja reacción con el péptido lineal y por el
contrario, alta reacción con el péptido restringido conformacionalmente [8].
Para el año 2003 era muy alto el número de mujeres afectadas por el cáncer de cuello uterino,
por lo cual este se volvió un punto importante de investigación tanto para encontrar mejores
métodos de identificación como vacunas, sintetizando varios epítopes de una proteína de
cáncer de cuello uterino con restricción conformacional de hélice y realizar pruebas de Elisa,
con estos se determinó que tenían una reacción positiva muy fuerte con sueros de mujeres
con carcinoma invasor del cuello uterino y por el contrario no se generó reacción con los
sueros de pacientes con otro tipo de cáncer, niños o mujeres sanas, lo cual nos muestra que
al restringir los péptidos, estos pueden ser reconocidos por otros anticuerpos que de manera
lineal no se reconocerían [9].
Para este mismo año se sabía que el virus del papiloma humano tipo 16 era el que más
afectaba a las mujeres colombianas y uno de los más invasivos, mediante la búsqueda de
epítopes de la proteína E7 de este virus, se determinó que varios fragmentos presentaron alta
reactividad contra sueros de mujeres infectadas, sobre todo si estos fragmentos presentaban
19
restricción conformacional, entre estas se determinó la hélice 1 y una loop, por el contrario
la hélice 2 no presentó ninguna reactividad [10].
Para el 2004 se determinó que la complementariedad entre el anticuerpo y el antígeno, y la
afinidad depende de la sumatoria de las fuerzas atractivas y repulsivas entre ellos, esto se
logró mediante la utilización de secuencias cortas de aminoácidos que se corresponden con
secuencias de proteínas con importancia funcional en una forma que sea fácil y libremente
accesible. Esto se puede lograr en el caso de presentar la secuencia unida a un brazo ligando
que le permite estar libre en un medio fluido con acceso por todos los costados de la molécula,
este método se implementó con el uso de las proteínas albúmina sérica bovina (BSA) y ovo-
albumina (OVA), con brazos ligantes de maleimida, que permite unir el péptido a este quedar
expuesto para su reconocimiento por los anticuerpos; para esto se utilizaron péptidos control
fijados directamente a platos de ELISA. Los resultados obtenidos en este estudio
determinaron la mejora del reconocimiento de los antígenos hacia los anticuerpos al estar
ligados con un brazo y fijados directamente [11]
20
4. OBJETIVOS
4.1. GENERAL
Diseñar y sintetizar péptidos con y sin restricción conformacional que imiten de la mejor
manera la estructura de las proteínas nativas HPV16 L1 y HPV16 E7 para posteriormente
determinar la reactividad antígeno-anticuerpo.
4.2. ESPECIFICOS
Analizar los datos estructurales de las proteínas HPV16 L1 y HPV16 E7
Seleccionar secuencias correspondientes a los fragmentos con restricción conformacional
que se encuentren expuestos en las proteínas HPV16 L1 y HPV16 E7
Sintetizar péptidos con y sin restricción conformacional ya reportados y otros propuestos a
en este trabajo, mediante la metodología F-moc
Caracterizar los péptidos sintetizados con y sin restricción conformacional de las proteínas
HPV16 L1 y HPV 16 E7
21
5. HIPÓTESIS
Al sintetizar péptidos que imiten de la mejor manera fragmentos de la proteína nativa HPV16
L1 y HPV16 E7 es posible identificar anticuerpos contra epítopes conformacionales,
presentes solo en la estructura nativa de la proteína.
22
6. MARCO TEÓRICO
Cada uno de los conceptos teóricos que se encuentran a continuación, están enmarcados en
el interés de esta investigación, puesto que desde los péptidos, las proteínas, sus funciones y
formas son fundamentales para realizar su síntesis y determinar su reactividad antígeno
anticuerpo
6.1. Aminoácidos
Los aminoácidos son compuestos orgánicos característicos por poseer un grupo amino ya sea
primario o secundario y un grupo ácido que en su mayoría es un grupo carboxilo, lo que le
confiere un carácter anfotero. En la naturaleza existen más de 500 aa, pero en los diferentes
organismos solo se presentan de forma común 20 aa indispensables para la vida, por lo que
son conocidos como aa fundamentales, en los cuales el grupo amino se encuentra en la
posición α y los radicales que se pueden unir a este son muy variados, como alifáticos o
aromatocos, no polares de diversa longitud y ramificación, grupos polares sin carga
(hidroxilo, tiol, amida) o cargados positiva o negativamente (aminoácidos dibásicos o
dicarboxílicos) [12, 13]
El método más sencillo y común de clasificación de los aminoácidos es mediante la polaridad
de sus cadenas laterales o grupos radicales, puesto que las proteínas se pliegan de manera
que las cadenas laterales hidrófilas queden expuestas y las cadenas laterales hidrofóbicas
queden al interior de esta manera alejándolas del contacto con el agua. De acuerdo con esto
se encontrarían 3 grupos de aa: 1) con cadena lateral apolar, 2) con cadena lateral no cargada
y 3) con cadenas laterales polares cargadas [14].
6.1.1. Aminoácidos con cadena lateral apolar
Se presentan nueve aa con cadenas laterales apolares, comenzando con glicina el cual al
poseer de cadena lateral un átomo de hidrógeno es el de menor tamaño, la alanina, valina,
leucina e isoleucina presentan cadenas laterales hidrocarbonadas alifáticas las cuales varían
su tamaño entre el grupo metilo de la alanina y los grupos butilo isoméricos de la leucina e
isoleucina. La metionina posee una cadena lateral tiol éter que presenta gran semejanza de
propiedades físicas con un grupo n-butilo, esto debido a la similitud de electronegatividad de
C y S y de tamaño entre S y el grupo metileno. La prolina se caracteriza por ser un aa cíclico
gracias a la pirrilodina que posee por cadena lateral, esto le genera restricción
conformacional. La fenilalanina presenta un radical bencilo y el triptófano un grupo indol,
siendo aa con cadenas laterales aromáticas.
23
Debido a que son aa con cadenas laterales apolares, tienden a esconderse en el interior de las
estructuras de las proteínas, alejándose de esta manera del medio acuóso [14, 15, 16].
Figura 1. Fórmula estructural de los aminoácidos con cadenas laterales no polares.
Tomado de: [14]
6.1.2. Aminoácidos con cadenas laterales polares sin carga
Figura 2. Fórmula estructural de los aminoácidos con cadenas laterales polares no cargadas
Tomado de: [14]
En este grupo se encuentran seis aa, la serina y la treonina poseen cadenas laterales hidroxilo
de diferentes tamaños. La asparagina y glutamina poseen cadenas laterales amidas de
distintos tamaños, la tirosina posee un grupo fenólico, el cual es responsable de la absorción
en UV junto con fenilalanina y triptófano. La cisteína posee un grupo tiol muy característico,
puesto que mediante la oxidación de este grupo puede formar un puente disulfuro con otra
24
cisteína (Figura 3), este enlace es de gran importancia puesto que puede generar restricciones
en las proteínas o unión de varias de estas.
Figura 3. Oxidación de dos cisteínas para formar un enlace disulfuro
Tomado de: [14]
6.1.3. Aminoácidos con cadenas laterales polares cargadas
En este grupo se encuentran cinco aa, de los cuales tres presentan carga positiva a valores de
pH fisiológico, estos son la lisina que posee un butilamonio por cadena lateral, la arginina
que posee un grupo guanidinio y la histidina, una de cuyas mitades es el imidazol. Por otro
lado se presentan los dos aa ácidos, siendo el ácido aspártico y el ácido glutámico con cadenas
laterales carboxílicas de diferentes tamaños, estas presentan carga positiva por encima de un
pH 3
Figura 4. Formula estructural de los aminoácidos con las cadenas laterales cargadas
Tomado de: [14]
Debido a esto los aminoácidos presentan propiedades o características diferentes, las cuales
se encuentran en la tabla 1.
25
Tabla 1. Convenciones y propiedades de los aminoácidos indispensables.
26
6.2. Péptidos
Los péptidos están formados por la unión de varios aminoácidos. Son sustancias orgánicas,
que se diferencian de las proteínas al ser más pequeñas y livianas, pero muy similares en su
estructura y se encuentran presentes en la mayoría de tejidos incluyendo hormonas,
antibióticos y antimicrobianos. Los seres vivos poseen una enorme cantidad de proteínas que
participan en diversos procesos del cuerpo que son necesarios para el mantenimiento de la
vida [7, 17].
6.2.1. Generalidades
Además de que los péptidos son más pequeñas y presentan menor peso molecular que las
proteínas, estas últimas pueden estar formadas por la unión de varios polipéptidos. Puesto
que están formados de la unión de varios aminoácidos, también presentan un grupo amino
termina un grupo carboxilo terminal y varios grupos radicales ionizables, por lo cual los
péptidos también presentan un comportamiento anfótero el cual permite la regulación
homeostática de los diferentes organismos.
La mayoría de las propiedades de los péptidos dependen en gran medida de su composición,
puesto que a pesar de que todos están compuestos por los 20 aminoácidos esenciales, no se
encuentran en las mismas proporciones, por lo cual la presencia de un aminoácido en una
posición particular influye en gran medida, todo esto genera que los péptidos tomen
diferentes conformaciones tridimensionales, además de las diferentes fuerzas
intramoleculares entre residuos, normalmente, los residuos hidrófobos se juntan en el interior
del péptido fuera del contacto con el agua, mientras que las cadenas hidrófilas tienden a
ocupar la superficie de la proteína. [17, 18].
6.2.2. Enlace peptídico
Los péptidos están formados por la unión de varios aminoácidos, al unirse un aminoácido
con otro se genera un enlace covalente llamado enlace peptídico (Figura 5). Este enlace se
genera por la reacción que se presenta entre el grupo carboxilo de un aminoácido con el grupo
amino de otro formando una amida mediante la perdida de una molécula de agua. Debido al
enlace peptídico, se presenta una estructura plana rígida (Figura 6), la cual es consecuencia
de las interacciones de resonancia que le dan al enlace peptídico un carácter del 40% de doble
enlace [15, 18].
27
Figura 5. Pentapéptido serilgliciltirosilalanil-leucina, en donde los enlaces peptídicos se
encuentran sombreados.
Tomado de: [19]
Figura 6. Interacciones de resonancia en el grupo peptídico
Tomado de: [15]
6.2.3. Estructura
Los péptidos presentan una estructura primaria la cual es una descripción de los enlaces
covalentes, principalmente los enlaces peptídicos y disulfuros, que unen cada aminoácido,
esta determina su forma y función general. Esta estructura es muy importante puesto que el
cambio de un solo aminoácido puede generar un cambio total en la función del péptido.
Sin embargo, los péptidos y proteínas se doblan de manera que los segmentos de la cadena
se orientan y forman patrones regulares, llamadas estructuras secundarias. Las más comunes
y conocidas que se generan son la α hélice y la loop
6.2.3.1. Conformación α hélice
Es la estructura más frecuente en péptidos y proteínas, en donde la estructura del esqueleto
polipeptídico se encuentra enrollado en una espiral helicoidal la cual está estabilizada por la
formación de puentes de hidrógeno entre el grupo N-H de un aminoácido y el grupo C-O de
otro aminoácido a cuatro residuos de distancia (Figura 7). Cada vuelta de hélice tiene 3.6
residuos de aminoácidos.
28
a. b.
Figura 7. a. Estructura secundaria α hélice. b. Puentes de hidrógeno de la estructura α
hélice.
Tomado de: [19, 20]
6.2.3.2. Conformación lamina beta o loop
Esta conformación se genera cuando una cadena se dobla hacia atrás sobre sí misma después
de tener un doblez de horquilla y las dos secciones a cada lado de esta se alinean de manera
paralela unido por puentes de hidrogeno (Figura 8) [20, 21].
a.
b.
Figura 8. a. Estructura secundaria hoja plegada β. b. conformación de lámina β.
Tomado de: [20, 21]
29
Tabla 2. Frecuencias relativas con las que se encuentra a los distintos aminoácidos en las
estructuras secundarias de las proteínas.
Tomado de: [22]
Aminoácido Hélice Hoja Giro
Ala 1'29 0'90 0'78
Cys 1'11 0'74 0'80
Leu 1'30 1'02 0'59
Met 1'47 0'97 0'39
Glu 1'44 0'75 1'00
Gln 1'27 0'80 0'97
His 1'22 1'08 0'69
Lys 1'23 0'77 0'96
Val 0'91 1'49 0'47
Ile 0'97 1'45 0'51
Phe 1'07 1'32 0'58
Tyr 0'72 1'25 1'05
Trp 0'99 1'14 0'75
Thr 0'82 1'21 1'03
Gly 0'56 0'92 1'64
Ser 0'82 0'95 1'33
Asp 1'04 0'72 1'41
Asn 0'90 0'76 1'28
Pro 0'52 0'64 1'91
Arg 0'96 0'99 0'88
30
6.2.4. Aplicaciones de los péptidos
Debido a la naturaleza de las proteínas y su gran ayuda para la investigación, se han
desarrollado diferentes métodos de síntesis de estos, teniendo una gran variedad de campos
de estudio.
6.2.4.1. Estudio del plegamiento de proteínas
Debido a la relación directa entre la secuencia del péptido y la estructura secundaria que
toma, se han dedicado estudios en determinar que estructura va a tomar un péptido con una
secuencia determinada. Y por tanto, también se busca saber que secuencias son compatibles
con determinada restricción conformacional.
Los esfuerzos en este campo se han dirigido en tres direcciones distintas. La primera consiste
en generar péptidos que reproduzcan las estructuras presentes en los primeros plegamientos.
La segunda estrategia es encontrar péptidos de la menor complejidad para que se plieguen de
una forma deseada. Y finalmente se han generado proteínas artificiales que adopten
plegamientos complejos similares o análogos a los de proteínas naturales
6.2.4.2. Péptidos miméticos
La implicación de los péptidos en un gran rango de procesos fisiológicos, desempeñando
funciones hormonales y neurotransmisoras, hace que la modulación con antagonistas de los
receptores peptídicos asociados a la superficie celular o la inhibición de las enzimas
implicadas en su biosíntesis o degradación.
Sin embargo, la utilización de péptidos como posibles fuentes de fármacos ha tenido
diferentes problemas como la baja estabilidad metabólica, escasa disponibilidad oral por el
alto peso molecular y la baja selectividad de acción. Para solucionar esto surgen los péptidos
miméticos siendo estructuras no peptídicas capaces de mimetizar o bloquear el efecto
biológico del péptido en cuestión.
6.2.4.3. Neuropéptidos funcionales
Se han sintetizado gran variedad de péptidos funcionales principalmente neuropéptidos los
cuales han sido clasificados según la función que regulan, destacando el metabolismo
energético en donde se regulan los niveles glúcidos y lípidos en cuerpo graso, equilibrio
iónico y regulación de funciones musculares [23].
31
6.2.4.4. Antigenicidad e inmunidad
La identificación y caracterización estructural y funcional de las regiones de un antígeno que
interacciona con anticuerpos, denominadas epítopes B, son de gran relevancia para entender
y tratar de manipular la respuesta del sistema inmune frente a agentes patógenos como
bacterias y virus. En los estudios realizados se han utilizado péptidos sintéticos como
antígenos en el reconocimiento de una proteína por anticuerpos inducidos frente a ésta, o
como inmunógenos inductores de anticuerpos que reconocen una proteína nativa
6.2.4.5. Fármacos peptídicos
En la actualidad son pocos los fármacos que poseen un punto de acción y una frecuencia
adecuada, por lo cual, se hizo necesario desarrollar métodos de direccionamiento selectivo
hacia células o tejidos diana. Sin embargo los péptidos pueden ser transportados como
fármacos o por otro lado pueden actuar como vectores. Por lo tanto el péptido es un fármaco,
puede incluir respuesta inmune y tiene estructura y secuencia reconocida por el receptor [23].
6.2.4.6. Epítopes B
Los epítopes B son las regiones de un antígeno que interactúan con anticuerpos, generándose
así una respuesta inmune, para poder entenderla es importante caracterizar la estructura y
función de los epítopes B, los cuales se pueden clasificar en epítopes estructurales,
funcionales y energéticos.
Los epítopes estructurales están formados por aminoácidos que se encuentran en la superficie
de una proteína y que realizan contacto con un anticuerpo determinado. Los epítopes
funcionales están constituidos por determinados residuos de una proteína que al ser
sustituidos modifican la afinidad por el anticuerpo correspondiente. Los epítopes energéticos
son aquellos residuos de proteína que están vinculados directamente en interacciones con
residuos del anticuerpo, esto conlleva a que solo determinados epítopes funcionales harán
parte de los epítopes energéticos [24].
6.2.4.7. Péptidos como vacunas
Uno de los objetivos en la aplicabilidad de péptidos ha sido la posible utilización en el diseño
de vacunas peptídicas efectivas. La mimetización aproximada puede ser suficiente para
obtener una razonable inmunogenicidad cruzada entre péptido y proteína. De momento, sólo
algunos sitios antigénicos que incluyen epítopes B han demostrado una relativa eficacia como
vacunas peptídicas experimentales [25].
32
6.2.5. Síntesis de péptidos.
En este momento se conocen dos métodos para realizar la síntesis de péptidos, la secuencial
y la convergente. La síntesis secuencial se basa en la elongación secuencial, aminoácido por
aminoácido de la cadena peptídica, empezando del extremo C- terminal y finalizando en el
extremo N- terminal (Figura 9), este método es mayormente utilizado para secuencias con
menos de 50 residuos.
En la metodología convergente se producen péptidos pequeños (hasta de 50 residuos) por
síntesis secuencial por separado y luego, se unen estos péptidos para de esta manera obtener
péptidos de alto peso molecular o proteínas (Figura 10). La ventaja de la síntesis convergente
es que se puede realizar una purificación y caracterización de cada fragmento de péptido
antes de ser vinculados, así, se reducen al mínimo reacciones secundarias [26, 27].
Figura 9. Esquema de la síntesis de péptidos secuencial
Tomado de: [27]
33
Figura 10. Esquema de la síntesis de péptidos convergente
Tomado de: [27].
Desde los primeros trabajos realizados por Fisher, las diferentes síntesis de péptidos se
realizaron en solución, hasta 1963 cuando Merrifield describió el método de síntesis de
péptidos en fase sólida (Figura 11), basada en que el protector de la función carboxilo C-
terminal se encuentra unido de forma covalente a un polímero y por tanto, el componente
que contiene este extremo es insoluble en los diferentes solventes usados, de esta manera, los
excesos de reactivos y los productos secundarios se pueden eliminar por filtración y lavado
del polímero con el péptido [23].
34
Figura 11. Esquema general de la síntesis de péptidos en fase sólida.
Tomado de: [28]
Se conocen dos estrategias dentro de la síntesis de péptidos en fase sólida, la estrategia
BOc/Bzl y la estrategia Fmoc/tBu. La estrategia Boc/Bzl utiliza el grupo tert-butoxicarbonil
(Boc) como protector de los grupos aminos y grupos del tipo benzil (Bzl) para proteger las
cadenas [28].
6.2.5.1. Síntesis de péptidos por estrategia Fmoc/tBu
La síntesis de péptidos por estrategia Fmoc es una de las más utilizadas en la actualidad
puesto que a pesar de que sus reactivos son un poco costosos, la síntesis es más rápida y no
necesita de un equipo especial.
6.2.5.1.1. Soportes sólidos o Resinas
En los últimos años se han desarrollado un gran número de matrices o resinas para la síntesis
de péptidos en fase sólida, estas deben de cumplir con ciertos requisitos para que la síntesis
sea exitosa. El soporte debe ser estable mecánica, física y químicamente, permitiendo la
filtración y la agitación, los granos deben ser uniformes del orden de micrómetros, debe ser
estable a las variaciones de temperatura, debe poseer una buena capacidad de hinchamiento
en un alto rango de solventes y debe ser estable a ácidos, bases, agentes oxidantes y
reductores.
Entre los más usados se encuentra el polímero de estireno (Figura 12), el cual al estar seco
presenta esferas de aproximadamente 50µm de diámetro, pero con solventes como DCM
35
(diclorometano), DMF (dimetilformamida) o DMA (dimetilacetamida), aumentan su
volumen, hinchándose entre 2,5 a 6,0 veces su volumen inicial [28, 29].
Figura 12. Resina Rink amide fmoc. Usado en la síntesis.
Tomado de: [30]
6.2.1.5.2. Conector o Espaciador
El anclaje y el desprendimiento del péptido de la resina se logra usando moléculas
bifuncionales denominadas espaciadores, estas moléculas se unen de manera permanente a
la resina por un extremo, normalmente mediante un enlace amida, y por el otro se une
temporalmente al primer aminoácido de la secuencia peptídica mediante un enlace de tipo
éster. Para la liberación de péptidos en forma amida mediante la estrategia Fmoc se utilizan
los espaciadores Rink, Xal y PAL [30].
6.2.1.5.3. Grupos Protectores
Para poder realizar un enlace peptídico entre dos aminoácidos es necesario que todas las
funciones estén protegidas exceptuando las dos entre las que se va a dar el enlace. Los grupos
protectores deben de ser químicamente estables en las condiciones en las que se da el acople
y además debe de ser fácilmente removible en condiciones suaves que no alteren el enlace
peptídico, por lo cual, se pueden encontrar grupos protectores permanentes, los cuales son
retenidos hasta que la secuencia peptídica ha sido completada, y temporales los cuales se
eliminan al finalizar cada etapa de síntesis.
Entre los grupos protectores temporales se encuentran los de α-amino, los cuales suprimen
su reactividad nucleofílica. Estos son derivados del uretano desde que Bergmann y Zervas
determinaran que son los más adecuados para la protección del α-amino, como el
benciloxicarbonil (Z), el cual está basado en la acilación de una amina con cloruro de
carbobenzoxilo para generar una amida (Figura 13) [17].
36
Figura 13. Protección de un aminoácido por cloruro de carbobenzoxilo.
Tomado de: [17]
Los más trabajados son el fluorenil 9 metoxicarbonil (Fmoc) (Figura 14) y el t-butoxicarbonil
(Boc) (Figura 15), el primero se obtiene a partir de su respectivo cloruro de acilo, este grupo
es muy estable en medios ácidos pero puede removerse fácilmente en condiciones básicas.
El grupo Boc es obtenido del anhídrido correspondiente al grupo protector, este grupo es lábil
en disolución de ácido trifluoroacético
Figura 14. Grupo protector temporal Fmoc
Tomado de: [17]
Figura 15. Grupo protector temporal Boc
Tomado de: [https://www.google.com.co/search?q=grupo+protector+boc&biw=1366&bih=623&source=lnms&tbm=isch
&sa=X&ved=0ahUKEwj8386KvJrKAhXIQyYKHXQlCEEQ_AUIBygC#tbm=isch&q=grupo+protector+fm
oc&imgrc=CkXK1svf6szggM%3A]
Entre los grupos protectores permanentes encontramos todos aquellos de las cadenas laterales
de los diferentes aminoácidos, los cuales solo se eliminan al finalizar la síntesis. Las cadenas
laterales le confieren propiedades especiales a cada aminoácido, aunque no todas son iguales
de reactivas, se debe tener en cuenta que pueden afectar en la síntesis por lo cual la mayoría
de estas deben estar protegidas.
37
La lisina al presentar en su cadena lateral un grupo amino bastante nucleofílico, si no se
protegiera, generaría rápida unión y por tanto se obtendrían péptidos ramificados, esta
cualidad se puede aprovechar para sintetizar péptidos especiales como dímeros, pero para
síntesis normal la mayoría de veces se encuentra protegido con un grupo boc (Figura 16)
Figura 16. Lisina protegida en el α-amino con el grupo Fmoc y en el ε-amino con un grupo
Boc.
Tomado de: Catalogo Merck. Disponible en: http://www.merckmillipore.com/INTERSHOP/web/WFS/Merck-CO-Site/es_ES/-
/COP/ViewParametricSearch-
SimpleOfferSearch?SynchronizerToken=3d0f10b83106a656fdc909c60a20f8f050c1db0c0a6bc578727ba84bd
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La arginina también presenta una cadena lateral reactiva al presentar un grupo guanidino,
aunque en las condiciones de acople y desprotección este grupo se encuentra protonado y por
tanto no reacciona fácilmente, si puede generar problemas de solubilidad. El grupo protector
más común de este es el pbf (Figura 17)
Los ácidos aspártico (Figura 18) y glutámico al poseer grupos ácidos en sus cadenas laterales,
pueden generar. De la misma manera que la lisina, reacción al realizar el acople y por tanto
crecimiento del péptido por la cadena lateral. Para estos es normalmente utilizado el grupo
protector bencil o el t-butil ester (tBu).
La cisteína posee una de las cadenas laterales más importantes para la síntesis de péptidos,
puesto que al poseer un grupo tiol, permite la formación de puentes disulfuro. Sea que se
desee hacer el puente disulfuro o no este grupo debe de estar protegido para que no interfiera
en la formación del enlace peptídico. Este grupo tiene gran variedad de grupos protectores
para el grupo tiol como Trt (Figura 19), Acm, Mob, TMob y Meb.
38
Figura 17. Arginina protegida en el α-amino con el grupo Fmoc y en el grupo guanidino
con el grupo pbf.
Tomado de: Catalogo de Merck. Disponible en: http://www.merckmillipore.com/INTERSHOP/web/WFS/Merck-CO-Site/es_ES/-/COP/ViewParametricSearch-
SimpleOfferSearch?SynchronizerToken=3d0f10b83106a656fdc909c60a20f8f050c1db0c0a6bc578727ba84bd9ed4b43&se
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Figura 18. Acido aspártico protegido en el α-amino por el grupo Fmoc y en la cadena
lateral con el grupo tBu
Tomado de: Catalogo Merck. Disponible en: http://www.merckmillipore.com/CO/es/product/Fmoc-
Asp%28OtBu%29-OH,MDA_CHEM-
852005?CategoryName=0000002600024bd800010023&CategoryDomainName=Merck-MerckMillipore
39
Figura 19. Cisteína protegido en el α-amino con el grupo Fmoc y en el grupo tiol de la
cadena lateral con el grupo Trt.
Tomado de: Catalogo Merck. Disponible en: http://www.merckmillipore.com/INTERSHOP/web/WFS/Merck-CO-
Site/es_ES/-/COP/ViewParametricSearch-
SimpleOfferSearch?SynchronizerToken=3d0f10b83106a656fdc909c60a20f8f050c1db0c0a6bc578727ba84bd9ed4b43&se
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La serina (Figura 20), treonina y tirosina presenta en sus cadenas laterales grupos hidroxilos
los cuales no son altamente influyentes en la formación del enlace peptídico pero es mejor
protegerlos de la misma manera que el anillo indólico del triptófano el cual es capaz de
atrapar reactivos electrofílicos con gran facilidad. El grupo protector que normalmente se
utiliza en las cadenas laterales estos aminoácidos es el tBu.
Figura 20. Serina protegido en el grupo α-amino por el grupo Fmoc y en la cadena lateral
el grupo tBu.
Tomado de: Catalogo Merck. Disponible en: http://www.merckmillipore.com/CO/es/product/Fmoc-Ser%28tBu%29-
OH,MDA_CHEM-852019?CategoryName=0000002600024c9d00010023&CategoryDomainName=Merck-
MerckMillipore
La Histidina es uno de los grupos más problemáticos puesto que su anillo imidazol es
fácilmente acilado y una vez así es capaz de intercambiar grupos acilo de forma no deseada
y además de esto la basicidad del anillo favorece la racemización, debido a esto debe de estar
protegido, generalmente por el grupo tritil (Figura 21) [17].
40
Figura 21. Histidina protegida en el grupo α-amino por el grupo Fmoc y en anillo imidazol
el grupo Trt.
Tomado de: Catalogo Merck. Disponible en: http://www.merckmillipore.com/INTERSHOP/web/WFS/Merck-CO-Site/es_ES/-/COP/ViewParametricSearch-
SimpleOfferSearch?SynchronizerToken=3d0f10b83106a656fdc909c60a20f8f050c1db0c0a6bc578727ba84bd9ed4b43&se
arch=&TrackingSearchType=SB+-+Search+Box&SearchContextPageletUUID=&SearchTerm=Histidine+Trt
6.2.1.5.4. Desprotección
Para poder realizar la síntesis de péptidos se realizan varios ciclos de desprotección, el
primero de estos es la eliminación del grupo Fmoc de la resina luego de haber realizado el
respectivo hinchamiento de esta con algún solvente como DMF o DCM. Al eliminar el grupo
Fmoc de la resina esta queda lista para realizar en enlace peptídico con el primer aminoácido
de la secuencia a sintetizar, al estar este acople listo se debe realizar una nueva desprotección,
esta vez para eliminar el grupo Fmoc del grupo amino del aminoácido ya acoplado, para que
de esta manera se pueda generar un nuevo enlace peptídico entre el aminoácido ya acoplado
el nuevo aminoácido a acoplar. De esa misma manera se siguen realizando ciclos de
desprotección y acople hasta terminar la secuencia peptídica.
EL grupo Fmoc es estable en presencia de agentes ácidos, pero puede removerse fácilmente
en ciertas condiciones básicas, por lo cual generalmente se utiliza piperidina entre el 10 y
20% en DMF (Figura 22), este procedimiento es rápido y se puede generar a temperatura
ambiente, además no afecta a los demás grupos protectores [31, 32].
41
Figura 22. Desprotección del grupo Fmoc de un aminoácido con piperidina, generando
como co-producto el aducto de la piperidina y el fluorenil meteno.
Tomado de: [17].
La última desprotección se realiza al finalizar la síntesis, en esta se elimina el grupo Fmoc
del último aminoácido acoplado, igualmente con piperidina y posteriormente se realiza una
desprotección de todas las cadenas laterales, eliminando los grupos protectores permanentes
y a la vez separando el péptido de la resina.
6.2.1.5.5. Activación y acople
Al tener solamente un ácido carboxílico y una amina se obtendrá la sal correspondiente, por
lo cual para obtener el enlace peptídico es necesario usar un agente que active el grupo
carboxilo. Existen diferentes reactivos que actúan como activadores, entre los cuales se
pueden encontrar carbodiimidas, sales de fosfonio y sales de uronio (Figura 23) [32, 33].
Mediante la utilización de estos grupos activos se obtienen altos rendimientos en pocas
reacciones secundarias y todos los co-productos son fácilmente removibles. Al utilizar sales
de fosfonio y de uranio, se debe tener en cuenta que estas son bastante ácidas por lo cual se
deben neutralizar con diisopropiletilamina (DIEA). Además, se adiciona un aditivo para
evitar racemización y mejorar los resultados de la síntesis como oxyma (Figura 24) [33].
42
Figura 23. Estructura de activadores usados en la síntesis de péptidos, carbodiimidas
(DCC, DIPCDI), sales de fosfonio (BOP, PyBOP) y sales de uronio (HBTU, TBTU).
Tomado de: [32]
Figura 24. Estructura del aditivo oxyma
Tomado de: Catalogo Merck. Disponible en: http://www.merckmillipore.com/CO/es/product/Oxyma-
Pure,MDA_CHEM-851086#anchor_REACH
43
Figura 25. Mecanismo de activación del aminoácido a acoplar mediante HBTU y posterior
unión al péptido-resina.
Tomado de: [34]
6.2.1.5.6. Desanclaje
Al finalizar la síntesis y tener la secuencia peptídica deseada, se dejan las bolsas con el
péptido-resina en DCM por 10 minutos, se sacan y se ponen a secar. Al tener el péptido-
resina seco se procede a agregar la solución de clivaje, la cual contiene TFA, agua, TIS y si
tienen metionina, cisteína o triptófano se agrega DOTA, en proporciones 94%, 2.5%, 2.5%
44
y 1% respectivamente y se deja en agitación durante 1 hora. Posteriormente se precipita el
péptido con éter frio y se realizan una serie de lavados con éter para eliminar las impurezas
presentes, por último se deja secar, se solubiliza en agua y se deja liofilizar [34, 35].
6.3. Proteínas
La palabra proteína es proveniente del griego Proteios, que significa “el primer lugar” puesto
que estas son las que regulan y controlan múltiples bioprocesos del cuerpo humano, entre
estos el metabolismo, el crecimiento celular, y la neurotransmisión. Las proteínas son
moléculas de gran tamaño formadas por largas cadenas de aminoácidos, las cuales proveen
de estructura y pueden actuar como una fuente energética, teniendo su principal función en
su rol como enzimas en el organismo.
Las proteínas intervienen en prácticamente todos los procesos que tienen lugar en la célula y
ejercen una diversidad casi inagotable de funciones, además presentan una gran variedad, en
una sola célula puede haber miles de proteínas diferentes, siendo así los árbitros de las
funciones moleculares. Las proteínas pueden encargarse de las diferentes funciones
necesarias en los organismos debido a su habilidad para mover los electrones y protones
dentro y fuera del biosistema.
La serie de proteínas generadas por un organismo es conocida como Proteoma del organismo.
Cada una de estas proteínas es codificada por nuestros genes los cuales están presentes en
nuestro ADN [21].
6.3.1. Generalidades de las Proteínas.
Las proteínas son aminoácidos poliméricos en donde los aminoácidos individuales (residuos)
están unidos por enlaces peptídicos. Estas son más grandes que los péptidos, de hecho una
proteína puede estar formada por la unión de varios péptidos. Independientemente de la
longitud de la cadena, todas las cadenas no cíclicas tienen un aminoácido N-terminal,
La mayoría de las proteínas son construidas en los ribosomas y las secuencias que las
conforman son dictadas por los códigos genéticos, leídas y transcritas por los ribosomas. Las
proteínas idénticas pueden compartir las mismas funciones dependiendo de cómo han sido
enlazadas. La estructura de la proteína original en la forma como es creada en el ribosoma es
conocida como estructura primaria. Por su parte, la estructura secundaria es formada cuando
la proteína empieza a tomar una estructura acorde a las fuerzas generadas dentro de las
cadenas primarias.
Entre las principales propiedades de las proteínas se encuentra la solubilidad la cual es
mantenida por la presencia de los de los enlaces fuertes y débiles, esta puede cambiar con
45
cambios de temperatura y pH. También está la capacidad electrolítica la cual determina si
una proteína posee carga positiva o negativa, esta es medida mediante electroforesis [21, 37].
Por otro lado, la estructura primaria de una proteína puede determinar la función que esta va
a cumplir, esto es conocido como la especificidad de la proteína. Y por último presenta una
alta capacidad para actuar como amortiguador de pH debido a su carácter anfótero, o sea, su
comportamiento como ácido al donar electrones y como base al aceptar electrones [37]
6.3.2. Estructura de las proteínas
Las proteínas al ser macromoléculas presentan varios niveles de complejidad a la hora de
determinar su estructura, por esto se clasificaron en cuatro grupos, teniendo así estructura
primaria, secundaria, terciaria y cuaternaria.
En la estructura primaria es la secuencia de los aminoácidos que conforman la proteína,
además de una descripción de todos los enlaces covalentes que presenta la proteína, o sea,
los enlaces peptídicos y los puentes disulfuro, los cuales unen los aminoácidos.
La estructura secundaria son las disposiciones particularmente estables que toma la cadena
proteica. Esta estructura comprende los patrones de plegamiento de hojas α, giros β, entre
otros. La estructura terciaria describe todos los aspectos del plegamiento tridimensional de
la proteína y cuando esta posee dos o más unidades polipeptídicas, su disposición en el
espacio se denomina estructura cuaternaria [19, 38].
Figura 26. Niveles estructurales de una proteína.
Tomado de: [19]
46
6.3.3. Clasificación de las Proteínas
Según la forma tridimensional de las proteínas, se pueden clasificar en:
Proteínas globulares, estas presentan una forma esférica con una estructura espacial definida
denominada conformación nativa, la cual es esencial para su función biológica, característica
por doblar sus cadenas de manera compacta dejando los grupos hidrófobos hacia adentro y
los grupos hidrófilos hacia afuera de la proteína, lo que lo hace soluble en solventes polares
como el agua.
Proteínas fibrosas, presentan cadenas polipeptídicas largas ordenadas de lado a lado en largos
filamentos, además son insolubles en agua por lo cual forman materiales estructurales como
piel, cabello, tendones, ligamentos y músculos.
Proteínas mixtas, las cuales poseen una parte fibrosa que normalmente se encuentra ubicada
en el centro de la proteína y otra parte globular que se encuentra en las partes externas de la
proteína.
Escleroproteínas, básicamente son insolubles, fibrosas y con un grado alto de cristalinidad,
además son resistentes a muchas enzimas y desempeñan funciones estructurales en el reino
animal.
Esferoproteínas, estas proteínas contienen moléculas esféricas, las cuales se clasifican según
su grado de solubilidad en albuminas, globulinas, glutelinas histonas y prolaminas [21, 39].
6.4. Inmunogenicidad
Los vertebrados poseen barreras físico-bioquímicas que dificultan la entrada de la mayoría
de los patógenos, como lo son la piel, mocos y otras secreciones anti-patógenas, Durante la
evolución el sistema inmune desarrollo una variedad de respuestas apropiadas para combatir
cada patógeno ya sea virus, bacteria, protozoo u hongos.
La respuesta inmune consiste en dos pasos, primero se da un reconocimiento del agente
infeccioso o material extraño, luego se elabora una respuesta adecuada para su eliminación.
6.4.1. Respuestas inmunes
Existen dos tipos de respuestas inmunes, las innatas y las adaptativas o específicas.
Las respuestas innatas son llevadas a cabo por células como los fagocitos o células agresoras
naturales (NK) y por factores solubles como proteínas de fase aguda. Los fagocitos reconocen
inespecíficamente los microorganismos, los ingieren y los destruyen. Las proteínas de fase
aguda como la proteína C reactiva recubren e inactivan microorganismos inespecíficamente.
47
La respuesta adaptativa es mediada por los linfocitos, teniendo como características
principales la especificidad y la memoria, en la inmunidad adaptativa hay una respuesta
primaria y una secundaria más rápida y efectiva, de modo que hay memoria específica frente
a una segunda infección por el mismo antígeno y además la respuesta inmunológica es más
eficiente. Existen dos tipos principales de linfocitos: B y T.
Para combatir una infección se hace una cooperación entre todos los componentes del sistema
inmunitario innato y adaptativo. Por ejemplo se realiza la presentación del antígeno por parte
de algunos fagocitos (respuesta innata), a los linfocitos T (respuesta adaptativa), luego se
reconoce por los fagocitos (respuesta innata) de los microorganismos opsonizados por
anticuerpos específicos (adaptativo) o por factores del complemento (innata: por vía
alternativa o adaptativa: por vía clásica) [40, 41].
Figura 27. Componentes del sistema inmune.
Tomado de: [43]
6.4.2. Linfocitos
Células B
Cada célula B está programada genéticamente para expresar un receptor de superficie
específico para un antígeno particular, esta molécula receptora del antígeno se llama
anticuerpo. Si una célula B se une a su antígeno especifico, se multiplicará y diferenciará en
células plasmáticas, las cuales producen gran cantidad de anticuerpos o inmunoglobulinas
(Figura 28).
48
Figura 28. Linfocito B.
Tomado de: https://www.google.com.co/search?q=respuesta+inmune&biw=1366&bih=623&source=lnms&tbm=isch&sa=X&ved=0a
hUKEwjwhavanZ7KAhWMPB4KHXOoCYAQ_AUIBigB#tbm=isch&q=linfocitos+b&imgrc=gsD2mP-Brj4k5M%3A
Figura 29. Estructura de un anticuerpo
Tomado de: [41]
Células T
La célula T reconoce el antígeno por medio de su receptor para antígeno de la celula T (TCR)
la cual presenta estructura y función similar a las inmunoglobulinas. La célula T reconoce
pequeños péptidos que contengas entre 9 y 24 residuos aminoacídicos, unidos a las moléculas
del sistema principal de histocompatibilidad, HLA.
Los linfocitos T tienen 2 funciones principales: Cooperadora y citolítica. Entre las
cooperadoras esta: ayudar a los linfocitos B en la producción de anticuerpos y liberar
citosinas que activan a los fagocitos y a los linfocitos T citotóxicos para destruir patógenos
fagocitados. Y la función citolítica es reconocer específicamente células propias infectadas
por virus y destriurlas.
49
Figura 30. Funciones de un linfocito T
Tomado de: https://www.google.com.co/search?q=respuesta+inmune&biw=1366&bih=623&source=lnms&tbm=isch&sa=X&ved=0a
hUKEwjwhavanZ7KAhWMPB4KHXOoCYAQ_AUIBigB#tbm=isch&q=linfocitos+t&imgrc=f_qg0hSoI3Xp9M%3A
6.4.3. Antígeno
Un antígeno es cualquier sustancia foránea que genera una respuesta inmune cuando es
introducida dentro de los tejidos de animales susceptibles y que son capaces de combinar con
los anticuerpos específicos formados. Los antígenos generalmente son moléculas de alto peso
molecular y comúnmente son proteínas o polisacáridos
Las partes variables del anticuerpo que contactan con el antígeno se denominan parátopos y
la región de un antígeno que puede específicamente unirse a un anticuerpo es llamado
epítope, los cuales normalmente contiene de 5 a 15 residuos de aminoácidos sobre la
superficie del antígeno.
Debido a que la molécula de antígeno existe en el espacio, el epitope reconocido por un
anticuerpo puede depender de la presencia de una específica conformación tridimensional
del antígeno (conformación loop o hélice) [40, 42].
6.4.4. Reacción antígeno anticuerpo
Los antígenos y anticuerpos interactúan por complementariedad espacial y no por uniones
covalentes. La asociación específica del antígeno y el anticuerpo es dependiente de los
puentes de hidrógeno, las interacciones hidrofóbicas, fuerzas electrostáticas y las fuerzas de
van der Waals, todas estas son uniones débiles no covalentes, aunque algunas de las
asociaciones entre el antígeno y anticuerpo pueden ser bastantes fuertes.
50
Figura 31. Tipos de unión entre antígeno anticuerpo
Tomado de: https://www.google.com.co/search?q=respuesta+inmune&biw=1366&bih=623&source=lnms&tbm=isch&sa=X&ved=0a
hUKEwjwhavanZ7KAhWMPB4KHXOoCYAQ_AUIBigB#tbm=isch&q=+antigeno+anticuerpo&imgrc=sDhTjn5eTdvR
MM%3A
Todos los anticuerpos tienen la misma estructura básica con forma de Y, con dos regiones en
las puntas que se unen al antígeno. Normalmente los agentes patógenos tienen muchos
antígenos diferentes en su superficie, por lo cual, cada anticuerpo se une a un epítope
específico, ya que los anticuerpos son específicos para los epítopes y no para toda la molécula
[42,43].
6.5. Virus del Papiloma Humano
El virus del papiloma humano se caracteriza por infestar las células del epitelio de la piel y
de las mucosas por lo que se transmite fundamentalmente por vía sexual, clasificándose así
dentro de las enfermedades de transmisión sexual.
Mundialmente se está trabajando en el virus del papiloma humano puesto que es el mayor
precursor del cáncer de cuello uterino, el cual está provocando la mayoría de muertes en el
mundo entero. En Latinoamérica y el Caribe el cáncer de cuello uterino presenta una tasa de
mortalidad más alta que la tuberculosis, la mortalidad materna o el síndrome de
inmunodeficiencia adquirida. Anualmente se diagnostican alrededor de medio millón de
casos invasivos y fallecen 231.000 mujeres, siendo los países en vía de desarrollo donde se
51
presentan el 80% de estos casos. En Colombia este cáncer es la mayor causa de muerte de
mujeres en edad productiva (de los 35 a los 64 años) [44, 45, 46].
6.5.1. Generalidades del HPV
EL microorganismo VPH pertenece a la familia Papovaviridae. Tiene un tamaño aproximado
de 55 nm de diámetro, con una cápside viral de simetría icosaédrica que está compuesto de
72 capsomeros, no tiene envoltura. Presenta un genoma de ADN de doble hebra circular de
7800 a 7900 pares de bases. [47, 48].
Figura 32. A. Representación de HPV. B. Micrografía electrónica del HPV
Tomado de: [47]
6.5.2. Clasificación del HPV
En la actualidad se han identificado más de 130 tipos de HPV, aunque solamente se han
podido caracterizar completamente alrededor de 80 (Tabla 3). Todos los tipos de HPV se
distinguen por ser epiteliotropos y según el epitelio que infectan, clásicamente, se han divido
en cutaneotropos y mucosotropos. Los tipos mucosos infectan preferentemente a la mucosa
genital, aunque también han sido detectados en la mucosa respiratoria y digestiva. De los 80
tipos de HPV caracterizados, al menos 25 afectan el tracto genital femenino y de acuerdo a
su asociación con lesiones preinvasivas y cáncer, se agrupan en, de alto riesgo (como los
tipos 16, 18, 45, 56), de riesgo moderado (como tipos 31, 33, 35,51, 52) y de bajo riesgo
(como tipos 6, 11, 40, 42, 43, 44) [48, 49].
52
Tabla 3. Tipos de HPV y su correlación clínica
6.5.3. Genoma del HPV
El HPV codifica para ocho regiones de lectura abierta, que regulan la síntesis de las 6
proteínas tempranas (E1, E2, E5, E6, E7) y las dos proteínas tardías (L1, L2) (Figura 33), de
acuerdo a su expresión durante el ciclo de vida viral.
Figura 33. Conformación del HPV
Tomado de: [50]
Las proteínas E1 y E2 transcritas a partir de la región temprana son responsables de la
replicación viral y expresión genética. La región tardía codifica para las proteínas L1 y L2,
componentes de 95% y 5%, respectivamente, de la cápside viral. Las proteínas E6 y E7,
productos de región temprana, son las encargadas de inmortalizar la célula hospedera y del
proceso carcinogénico [50, 51].
53
6.5.4. Patogenia del HPV
El virus tiene como blanco a las células de la capa basal del epitelio, a las que puede llegar
por heridas de la piel o mucosa (Figura 34), aun no se sabe si el virus puede penetrar la piel
intacta. El ciclo vital del HPV presenta varias fases, una vez colonizado el epitelio diana
puede extenderse desde los 2 a 3 meses hasta los 15 o 20 años, sin embargo el virus puede
estar en estado de latencia durante 20 años, en forma extracromosómica, sin producir lesiones
celulares; o bien puede reproducirse durante el proceso de diferenciación de los
queratinocitos. El virus expresa las proteínas E1 y E2, asociadas a la replicación y
transcripción de las células basales y parabasales provocando la hiperplasia epitelial, la
segunda etapa del virus ocurre en las capas más superficiales de la epidermis, donde expresa
las proteínas L1 y L2 que codifican la cápside, y en la que se produce el ensamble de las
partículas virales.
La inmunidad específica contra el VPH incluye la formación de anticuerpos y de células T
citotóxicas específicas. Ese proceso requiere la exposición de antígenos virales por las células
presentadoras de antígenos, en conjunto con moléculas del complejo mayor de
histocompatibilidad (MHC) [47, 51].
Figura 34. Patogenia del VPH en la piel.
Tomado de: https://www.google.cl/search?q=Patogenia+del+HPV&biw=1366&bih=667&source=lnms&tbm=isch&sa=X
&ved=0ahUKEwi2xdPot6DKAhXLHh4KHTgDDXEQ_AUIBigB#tbm=isch&q=ciclo+de+vida+VPH&imgd
ii=ZibfVMLccnEI3M%3A%3BZibfVMLccnEI3M%3A%3BTU4A_HusSct-
1M%3A&imgrc=ZibfVMLccnEI3M%3A
6.5.5. Métodos de identificación del HPV
La mayoría de los métodos de detección de VPH se basan en la detección de ADN. Es posible
realizar el análisis patológico y molecular de VPH a partir de una misma muestra. El
procedimiento se puede realizar mediante test de captura de híbridos (sondas ARN-ADN
viral) o por métodos de amplificación de secuencias diana mediante reacción en cadena de la
polimerasa (PCR).
54
Citología cervical o Prueba de Papanicolaou
En la actualidad la citología cervical es la herramienta más usada para el cribado del cáncer
cervical. No obstante, presenta un porcentaje de falsos negativos que, dependiendo del
laboratorio, puede alcanzar 20-30% de los frotis examinados. El aspecto más característico
de la infección por HPV es la presencia de coilocitos (células precancerosas) las cuales se
identifican por un gran halo perinuclear claro, que rechaza el citoplasma hacia la periferia.
Dentro de las limitaciones de esta prueba es importante resaltar que se puede generar error
humano y para disminuir este se necesita automatizar el procedimiento lo cual es muy
costoso, esto conlleva a generar falsos negativos a los cuales se les daría un mal seguimiento.
Biopsia de Cuello Uterino
Esta prueba se realiza cuando se ha obtenido un resultado positivo en otro examen más
sencillo como la prueba de Papanicolaou, por lo cual para certificar que se posea la
enfermedad se realiza una biopsia de cuello uterino para ver las células a través del
microscopio y asegurarse de que se trata de lesiones cancerosas o precancerosas.
Histología
Mediante una prueba histológica se puede observar por microscopia convencional cambios
morfológicos como el crecimiento nuclear e hipercromasia, aumento en la relación núcleo-
citoplasma y halos perinucleares.
Técnica de Cribado
Una prueba de cribado o de screening es una prueba que se realiza sobre toda la gente para
intentar detectar una enfermedad antes de que aparezca o en una fase precoz. Cuanto más
sensible y específica sea una prueba, mejor para el diagnóstico de una enfermedad. En los
últimos años se está valorando la posibilidad de introducir la técnica de cribado como técnica
primaria, con procedimientos de auto muestreo. Este test sería un buen sustituto o
complemento de la citología cervico-vaginal. La sensibilidad de la prueba es superior a la de
la citología para la detección de lesiones de alto grado (mejora la detección en un 28%). La
homogeneidad de los resultados es también significativamente superior a la de la citología
[52, 53, 54].
55
Técnica Inmunoenzimática (ELISA)
Estas pruebas hacen parte de aquellas reacciones serológicas que utilizan conjugados. Este
se basa en el uso de antígenos o anticuerpos marcados con una enzima, de forma que el
conjugado resultante tenga actividad, tanto inmunológica como enzimática. Al estar uno de
los componentes, sea el antígeno o el anticuerpo marcado con una enzima e insolubilizado
sobre un soporte, la reacción antígeno-anticuerpo quedara inmovilizada y por tanto podrá
fácilmente ser revelada mediante la adición de un substrato específico que al actuar la enzima,
producirá un color observable a simple vista o podrá ser cuantificable mediante
espectrofotometría [55].
La prueba ELISA se basa en varias teorías: primero el antígeno y anticuerpo pueden enlazarse
a una superficie portadora insoluble y retener su reactivad inmunológica; en segunda medida
las enzimas tienen actividad específica alta y convierten una cantidad relativamente grande
de sustrato en producto detectable, lo que permite detectar concentraciones muy bajas del
ligando; en tercer medida la actividad enzimática o reactividad inmunológica de los
conjugados se preserva y permanece estable durante el análisis y el almacenamiento y por
ultimo las enzimas no están presentes en el líquido biológico que se va a analizar.
Como el ELISA es una técnica simple, sensible, rápida, versátil y realizable, es muy utilizada
para la cuantificación de anticuerpos y antígenos. El ELISA ha sido desarrollado en muchas
configuraciones dependiendo de la particularidad del ensayo. En la práctica el ELISA como
una técnica para fase solida puede ser clasificada en dos grandes tipos: el primer tipo, es un
ensayo competitivo usando tanto un conjugado enzima-antígeno como un conjugado enzima-
anticuerpo. Y el segundo tipo es, ensayos no competitivos usando un doble anticuerpo
(llamada sándwich) donde el segundo anticuerpo tiene un indicador conjugado enzimático.
Para poder realizar una prueba de ELISA exitosa se deben de tener en cuenta los siguientes
aspectos para la elección de la enzima: La estabilidad bajo condiciones de almacenamiento,
enlace cruzado y ensayo; la alta actividad específica, sin embargo, no debe contener
componentes de la preparación del antígeno que se va a utilizar en la prueba, ya que pueden
presentarse falsos positivos y por último se debe evitar la presencia de inhibidores o
inactivadores de la enzima [56, 57, 58].
6.5.6. Vacunas contra HPV
Las vacunas profilácticas contra el VPH constituye la herramienta de salud pública más
promisoria para la prevención primaria de cáncer de cuello uterino. La vacunación de mujeres
antes de haber adquirido la infección viral tiene un gran impacto en la prevención de lesiones
pre-neoplásicas y cáncer de cuello uterino. Las vacunas actuales no eliminan completamente
el riesgo de cáncer de cérvix, por lo tanto las mujeres vacunadas como las que no alcancen a
recibir la vacuna, se les debe seguir ofreciendo los programas de detección temprana.
56
Estas vacunas tienen como principio fundamental la capacidad de las VLPs de inducir altos
niveles de anticuerpos neutralizantes en medio vaginal. Ya que las VLPs no contienen ADN
viral, no pueden infectar células, reproducirse o causar. Actualmente se encuentran en el
mercado dos vacunas la Gardasil y la Cervarix.
Gardasil.
Se encuentra en viales de 0,5mL inyectables como una suspensión compuesta por proteínas
L1 en forma de partículas no infecciosas similares al virus, generadas mediante tecnología
de ADN recombinante mediante el uso de un sistema de expresión que utiliza células
derivadas de Sacharomyces cerevisiae. Cada dosis de 0.5mL contiene 20µg de proteína L1
de VPH6, 40 µg de proteína L1 de VPH11, 40 µg de proteína L1 de VPH16 y 20µg de
proteína L1 de VPH18 adsorbidas en un adyuvante compuesto de sulfato hidroxifosfato de
aluminio amorfo.
Cervarix
Es una suspensión inyectable producto de tecnología recombinante que utilizan un sistema
de expresión con células derivadas de Trichoplusia ni. Cada dosis de 0.5mL está compuesta
por 20μg de proteína L1 de VPH-16 y 20μg de proteína L1 de VPH-18 en forma de VLPs
adsorbidas en el adyuvante llamado ASO4, el cual está compuesto por hidróxido de aluminio
y monofosforil lípido A [59, 60].
Tabla 4. Características generales de las vacunas contra HPV
57
7. METODOLOGÍA
7.1. Determinación de las secuencias a sintetizar.
Se inició el proceso realizando un análisis estructural de las proteínas HPV 16 L1 y HPV 16
E7, para lo cual se corroboró la estructura primaria mediante la base de datos universal de
proteínas, Protein Data Bank (PDB), la cual se encuentra en la página web del Nacional
Center for Biotechnology Information (NCBI), de allí se tomaron las secuencias de las dos
proteínas y se enviaron a I-TASSER, un servidor con varias bases de datos, en donde realizan
un blast de las secuencias y generan una posible estructura secundaria tridimensional de las
proteínas. Se realizó un análisis de la simulación estructural obtenida determinando los
fragmentos expuestos que presentan restricción conformacional y por tanto los de interés a
sintetizar.
7.2. Síntesis de péptidos
La síntesis de los péptidos se realizó mediante la estrategia de bolsas de Houghten (Figura
35), cada bolsa contenía 40 mg de resina Rink amida con sustitución de 0,59, además se
realizaron soluciones stock a concentración de 10 excesos por mililitro, de los activadores y
de cada uno de los aminoácidos a excepción de cisteína, metionina, triptófano e histidina
puesto que estos presentan alta tendencia a oxidarse.
Figura 35. Esquema general de la síntesis por estrategia de bolsitas de Houghten.
Tomado de: [16]
58
Para realizar síntesis simultánea mediante la estrategia de bolsitas, primero se introducen las
secuencias en el programa peptide.exe el cual genera un documento en donde primero se
encuentran las secuencias con algunas características (Figura 36) y posteriormente
organizadas mediante acoples (Figura 37).
Figura 36. Listado de la secuencias a sintetizar generada por el programa peptide.exe
Figura 37. Documento del primer acople generado por el programa peptide.exe
59
Para realizar las soluciones stock se determinó la constante de acople (Ecuación 1) dada por
la cantidad de resina usada, la sustitución de esta y la cantidad de excesos.
𝐶𝑜𝑛𝑠𝑡𝑎𝑛𝑡𝑒 = 𝑔 𝑟𝑒𝑠𝑖𝑛𝑎 × 𝑠𝑢𝑠𝑡𝑖𝑡𝑢𝑐𝑖ó𝑛 × 𝑒𝑥𝑐𝑒𝑠𝑜𝑠
Puesto que todos los péptidos se realizaron con las mismas condiciones, presentan la misma constante
de acople:
𝐶𝑜𝑛𝑠𝑡𝑎𝑛𝑡𝑒 = 0.04𝑔 × 0.59𝑚𝑒𝑞
𝑔× 10𝑒𝑥𝑐𝑒𝑠𝑜𝑠 = 0.236𝑚𝑒𝑞
Ecuación 1. Constante de acople
Con la constante de acople se procede a calcular la cantidad de cada aminoácido y cada
activador que se debe pesar para realizar el acople de una bolsa:
𝑚𝑔 𝑎𝑎 = 𝑐𝑜𝑛𝑠𝑡𝑎𝑛𝑡𝑒 × 𝑝𝑒𝑠𝑜 𝑚𝑜𝑙𝑒𝑐𝑢𝑙𝑎𝑟
Ecuación 2. Cantidad de aminoácido a pesar para el acople correspondiente
Para los péptidos con restricción conformacional el primer aminoácido acoplado fue cisteína,
por lo cual la cantidad de aa a pesar para una bolsa sería:
𝑚𝑔 𝐶𝑦𝑠 = 0.236𝑚𝑒𝑞 × 585.7𝑚𝑔
𝑚𝑒𝑞= 138.22 𝑚𝑔
Por último se observa en el documento para este acople cuantas bolsas van en este
aminoácido y se multiplica la cantidad de mg de aminoácido a pesar por la cantidad de bolsas
𝑚𝑔 𝑎𝑎 𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙𝑒𝑠: 138.22𝑚𝑔 × 6 = 829.32 𝑚𝑔
Ecuación 3. Cantidad total de aminoácido a pesar para el primer acople
De la misma manera se realizan los cálculos para los activadores, al tener la cantidad de
activador a pesar para una bolsa, este se multiplica por la cantidad total de péptidos que se
estén sintetizando. Para el activador HBTU:
𝑚𝑔 𝐻𝐵𝑇𝑈 = 𝑐𝑜𝑛𝑠𝑡𝑎𝑛𝑡𝑒 × 𝑝𝑒𝑠𝑜 𝑚𝑜𝑙𝑒𝑐𝑢𝑙𝑎𝑟
𝑚𝑔 𝐻𝐵𝑇𝑈 = 0.236𝑚𝑒𝑞 × 379.3𝑚𝑔
𝑚𝑒𝑞= 89,51𝑚𝑔
𝑚𝑔𝐻𝐵𝑇𝑈𝑇𝑜𝑡𝑎𝑙 = 89,51 × 8 = 716,06𝑚𝑔
Ecuación 4. Cantidad de mg de HBTU que se deben pesar para el primer acople
Para el acople, además de la resina- péptido, aa y activador es necesario agregar DIEA, pero
se debe de tener en cuenta que este se encuentra líquido, por lo cual se debe multiplicar por
su densidad y también por los dos equivalentes a los que corresponde:
60
𝑚𝑔 𝐷𝐼𝐸𝐴 = 𝑐𝑜𝑛𝑠𝑡𝑎𝑛𝑡𝑒 × 𝑝𝑒𝑠𝑜 𝑚𝑜𝑙𝑒𝑐𝑢𝑙𝑎𝑟 × 𝑑𝑒𝑛𝑠𝑖𝑑𝑎𝑑 × 𝑒𝑞𝑢𝑖𝑣𝑎𝑙𝑒𝑛𝑡𝑒𝑠
𝑚𝑔 𝐷𝐼𝐸𝐴 =0.236𝑚𝑒𝑞 × 129.2
𝑚𝑔𝑚𝑒𝑞
× 2
742𝑚𝑔𝑚𝑙
= 0,082𝑚𝐿
Ecuación 5. Cantidad de ml de DIEA que se deben agregar por bolsa
Al tener las soluciones de aminoácidos y activadores listos se empezó a preparar las bolsas
con resina para empezar la síntesis, para esto las bolsas se sumergieron en DCM para permitir
la hinchazón de la resina, luego se procedió a realizar la desprotección puesto que esta resina
posee un grupo f-moc la eliminación de este grupo se realiza con piperidina al 20% 2x*1min,
posteriormente se realizan una serie de lavados con DMF 3x*1min, IPA 1x*1min, azul de
bromofenol 1x*2min, DMF 2x*1min y DCM 2x*1min, siendo x la cantidad de veces.
Teniendo desprotegida la resina se procede a realizar el ciclo de acople del primer
aminoácido poniendo las bolsas con la resina desprotegida en una solución que contiene el
aminoácido correspondiente, el cual tiene un grupo protector en el amino terminal, un
activador que puede ser HBTU, TBTU, TCTU o DIC, oxima para disminuir la racemización
y DIEA para neutralizar, esto se deja en agitación por 3 horas aproximadamente. Para el
acople del siguiente aminoácido se realiza un nuevo ciclo de desprotección para eliminar el
grupo protector del amino terminal del aminoácido ya acoplado y se continúa con el ciclo de
acople del aminoácido correspondiente. Este ciclo de desprotección - acople se repite hasta
que las secuencias han sido sintetizadas en su totalidad.
En el caso de los péptidos con restricción conformacional, al finalizar la secuencia se realizan
3 ciclos más de desprotección – acople para adicionar en sitio de nucleación JAZ, al tener
exitosamente el sitio de nucleación en la cadena peptídica, se procede a realizar una última
desprotección y para generar la ciclación, de igual manera las bolsas con el péptido- resina
se sumergen en una solución de activador, oxima y DIEA.
Cada acople se realizó con 5 excesos, al tener soluciones stock a 10 excesos por mililitro,
solamente se adicionaba 0.5 mililitros de solución stock de aminoácido y 0.5 mililitros de
solución stock de activador con oxima y la cantidad correspondiente de DIEA. Al trabajar
con la metodología de bolsas no se puede realizar prueba de ninhidrina por lo cual, la reacción
se monitorea mediante el indicador azul de bromofenol, teniendo en cuenta que cuando el
color de la resina – péptido este amarillo (Figura 38), indica que el acople se realizó
exitosamente. Para asegurar el éxito del acople de cada aminoácido es necesario realizar dos
o más ciclos de acople, por lo cual se realizó acople sencillo con HBTU, doble acople con
TBTU y si era necesario, triple acople con TCTU.
61
B.
Figura 38. A. Azul de bromofenol positivo para aminas libres. B. Azul de bromofenol
negativo para aminas libres.
7.3. Desanclaje
Finalmente se realiza el desanclaje del péptido del soporte (clivaje) y la eliminación de los
grupos protectores de las cadenas laterales mediante la adición de una solución de TFA (ácido
trifluoroacético), TIS (triisopropilsilano), agua y DOTA en proporciones 94%, 2,5%, 2,5% y
1% correspondientemente y se deja en agitación por una hora, posteriormente se precipita el
péptido con éter frio, se realizan una serie de lavados con éter y se deja secar (Figura 39).
Figura 39. Péptido precipitado y lavado con éter frio.
7.4. Liofilización
Al tener seco el péptido se solubilizó en agua ultrapura y se llevó a congelación a -80°C
durante una hora, realizando así una congelación rápida, generando la formación de pequeños
cristales de agua los cuales no afectan el péptido y lo protege de posible daño microbiológico.
Al tener completamente congeladas las muestras se llevaron al equipo liofilizador
LABCONCO.
7.5. Purificación
En la síntesis de péptidos se pueden generar diferentes impurezas y es necesario eliminarlas
para poder utilizar el péptido en diferentes pruebas. Al realizar análisis mediante HPLC se
puede determinar qué tan puro está el péptido y cual método de purificación es el más
adecuado.
62
7.5.1. Desalinización mediante G-10
Este método es empleado cuando la cantidad de impurezas son muy pocas. Para realizar una
G-10 primero se tomaron jeringas de 2 mL y se les adicionó sephadex (gel de dextrano), al
tener las jeringas cargadas se hidrató el gel con agua MQ, al tenerlas hidratas y a un pH
neutro, se procede a pasar la muestra (10mg de péptido en 1mL de agua), esta se agregó
completa en la jeringa y se esperó que entrara toda en el gel, luego se agregó 500µL de agua
y de igual manera se esperó que entrara en el gel, así mismo se siguió agregando agua hasta
llegar a un volumen de 1.7mL, se cambia de recolector y se procede a agregar 1.7 mL de
agua más. Por último los extractos obtenidos se llevaron a liofilizar.
Figura 40. Purificación mediante G-10
7.6. Caracterización del péptido
Mediante la síntesis de los péptidos se monitoreo el éxito de cada acople mediante el cambio
de coloración del azul de bromofenol, pero hay que tener en cuenta que este es un método
cualitativo, por lo cual después del desanclaje del péptido se procede a realizar diferentes
análisis para caracterizar el péptido y determinar la efectividad de la síntesis.
7.6.1. HPLC
Se pesó determinada cantidad de cada uno de los péptidos y se solubilizaron en agua a una
concentración de 1mg/ml, de esta solución se tomaron 15 µl y se llevaron a un volumen total
de 100µl con agua, esto se pasó por el equipo de cromatografía de alta eficiencia (Figura 41)
y se analizó en un programa de 0% a 70% de solvente A (agua + 0,05% TFA) a solvente B
(acetonitrilo+0.05% de TFA) en 10 minutos con un flujo de 1 ml por minuto, se utilizó una
columna water C18 um Corp.XBridge BEH130 y se trabajó a una longitud de onda de 215
nm.
63
Figura 41. Equipo HPLC
7.6.2. Espectroscopía de masas
De la misma solución utilizada en HPLC se tomaron 20µl y se llevaron a un volumen final
de 100µl con agua. Esto se analizó en un equipo LC MS 2020 (Figura 42), con un programa
de 0% a 100% de acetonitrilo en 20 minutos, utilizándose una longitud de onda de 215 nm.
Figura 42. Espectroscopio de masas de electro spray LC MS 2020
7.6.3. Espectroscopía de masas (MALDI-TOF)
Para la obtención de espectros se mezcló 1 μL de cada muestra de 1mg/ml, con 1 μL de la
matriz ácido α-ciano-4-hidroxicinámico (CHCA preparada a una concentración de 10 mg/mL
en acetonitrilo 50% v/v y ácido fórmico 0.1% v/v, esta matriz se utiliza de preferencia para
64
péptidos y/o proteínas de masa molecular menor a 10000 Da) en una placa porta muestra
micro scout (Bruker Daltonics Inc., MA-USA) (Figura 43. A).
El procedimiento se realizó en un equipo MALDI-TOF Microflex (Bruker Daltonics Inc.,
MA-USA) (Figura 43. B) en modo ion positivo mediante detección por reflexión. Previo a la
obtención de los espectros se realizó una calibración del equipo con un estándar externo
correspondiente a una mezcla de péptidos de masas 1000-3000 Da. Para el control del
espectrómetro se utilizó el programa flexControl 3.0 (Bruker Daltonik GmbH, Alemania).
Los espectros finales corresponden a la suma de 10 barridos de 30 impactos de láser (300
impactos de láser en total) aplicados en diferentes puntos tomados al azar de cada mezcla
depositada en la placa porta muestra.
A B
Figura 43. A. Placa de acero porta muestra micro scout Bruker Daltonics Inc., MA-USA.
B. Equipo MALDI-TOF Microflex Bruker Daltonics Inc., MA-USA.
7.6.4. Dicroísmo Circular
De la solución de péptido de 1mg/ml se tomó 35µl y se le adicionaron 215µl de TFE al 30%,
favoreciendo de esta manera la formación de puentes de hidrógeno y por tanto estabilizando
la estructura. Esta solución se agregó en la celda de cuarzo con paso óptico de 0,1 cm, se
realizó la lectura en el equipo Jasco (J-815 Jasco Corporation, Japan) (Figura 44), con un
65
barrido de longitud de onda de 190 a 250 nm, con una señal promedio de 2 segundos por
cada intervalo de 0,5nm. Todos los datos de dicroísmo circular fueron expresados como
valores de elipticidad molar
Figura 44. Equipo de dicroísmo circular Jasco (J-815 Jasco Corporation, Japan)
66
8. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
A continuación se encuentran los resultados obtenidos en esta investigación los cuales
incluyen la determinación, análisis, síntesis y caracterización de diferentes secuencias
restringidas de las proteínas HPV16 L1 y HPV16 E7
8.1. Determinación de las secuencias a sintetizar
En primer medida se realizó una búsqueda de las proteínas L1 y E7 de HPV genotipo 16 en
la base de datos Protein Data Bank, de allí se tomaron las secuencias de la proteína L1, con
código de acceso ACN91181 (Figura 45), y la proteína E7 con código de acceso AHK23257
(Figura 46), de HPV del genotipo 16.
Figura 45. Secuencia de la proteína L1 de HPV genotipo 16 obtenida en PDB
Figura 46. Secuencia de la proteína E7 de HPV genotipo 16 obtenida en PDB
67
Estas secuencias obtenidas en PDB se enviaron a la base de datos I-TASSER, la cual realiza
un blast de la secuencia con varias bases de datos y genera una aproximación de la estructura
terciaria de las proteínas (Figura 47), mediante las cuales se eligieron los fragmentos para ser
sintetizados.
A. B.
Figura 47. A. Fórmula estructural de la proteína HPV16 E7 B. Fórmula estructural de la
proteína HPV16 L1. Generadas en I-TASSER
Con estas estructuras se procedió a determinar cuáles eran los fragmentos que presentaban
restricción conformacional y estaban expuestos en la proteína, lo que los haría identificables.
Además de esto se apoya la elección de los fragmentos a sintetizar mediante el análisis de
antigenicidad realizado en la página Predicted Antigenic Peptides de la Universidad
Complutense de Madrid.
En estudios realizados anteriormente se determinó que la hélice 1 de HPV16 E7 presentaba
una alta reactividad frente a los sueros de mujeres con cáncer de cuello uterino, sobretodo
imitándose la estructura nativa, pero por el contrario la hélice dos no presentó ninguna
reactividad frente a los mismos sueros, de acuerdo a lo analizado en la formula estructural y
en el esquema de reactividad, la hélice 3 se encuentra expuesta en la proteína y presenta alto
índice de reactividad. Por lo anterior se decide sintetizar la hélice 3, para poder determinar
experimentalmente que nivel de reactividad presenta frente a sueros de mujeres con cáncer
de cuello uterino y la hélice 1 para comparar su rendimiento y determinar cuál sería el mejor
epítope [9, 10].
Finalmente de la proteína HPV16 E7 se eligieron la hélice 1, la cual se encuentra entre los
residuos 7 a 16 y la hélice 3 que se encuentra entre los residuos 74 a 84.
68
Figura 48. Esquema de antigenicidad de la proteína HPV16 E7
Figura 49. Estructura terciaria de la proteína HPV 16 E7 generada en I-TASSER con los
fragmentos seleccionados a sintetizar
De la proteína HPV16L1, se eligieron 4 fragmentos que presentaban alta antigenicidad y
exposición, dos helicoidales y dos loops. La hélice 2 que se encuentra entre los residuos 385
a 394, hélice 4 encontrada entre los residuos 414 a 425, loop FG encontrada entre los residuos
273 a 284 y la loop HI encontrada entre los residuos 348 a 360. Los dos fragmentos loop
presentaron alta reactividad frente a sueros de mujeres con cáncer de cuello uterino, mediante
los cuales se van a comparar las reactividades de los fragmentos hélices planteados.
Figura 50. Esquema de antigenicidad de la proteína HPV16 L1
69
Figura 51. Estructura terciaria de la proteína HPV 16 L1 generada en I-TASSER con los
fragmentos seleccionados a sintetizar
8.2. Diseño de los péptidos
Al tener definidas las secuencias que se van a sintetizar se procede a determinar la
metodología que se utilizara para su síntesis, para lo cual se diseña el péptido restringido con
su respectivo péptido lineal.
Teniendo en cuenta que la síntesis de péptidos se realiza tomando la secuencia de derecha a
izquierda, para todos los péptidos con restricción conformacional se realizan como primeros
acoples GC, de esta manera se generan una mayor estabilidad en la molécula.
Para los péptidos con restricción conformacional hélice se determinó que al final de la
secuencia, en el amino terminal, se realizarían tres acoples más, adicionando un sitio de
nucleación JAZ, el cual genera la primer vuelta hélice y por tanto el resto de la molécula
sigue tomando esta conformación mediante la formación de puentes de hidrógeno
Para los péptidos loop se generó un planteamiento similar, para estos, antes de empezar la
secuencia se acoplaría el Z, esto quiere decir que este iría después de GC y al finalizar la
secuencia se acoplaría J, de esta manera se generaría un sitio de nucleación en los extremos
y así el péptido tomaría forma de loop.
De acuerdo con esto, se tendrían 12secuencias para sintetizar, contando con el péptido
restringido y su correspondiente péptido lineal.
70
Tabla 5. Secuencias de las proteínas HPV16 E7 y HPV16 L1 escogidas para sintetizar
Proteína Estructura Residuos Secuencia
HPV16 E7
Hélice 1 7-16 TLHEYMLDLQ
JAZ--TLHEYMLDLQ—GC
Hélice 3 74-84 VDIRTLEDLLM
JAZ—VDIRTLEDLLM—GC
HPV16 L1
Hélice 2 385-394 ADVMTYIHSM
JAZ—ADVMTYIHSM—GC
Hélice 4 414-425 LEDTYRFVTSQA
JAZ—LEDTYRFVTSQA—GC
Loop FG 273-284 DDLYIKGSGSTA
J—DDLYIKGSGSTA—Z—GC
Loop HI 348-360 ISTSETTYKNTNF
J—ISTSETTYKNTNF—Z—GC
8.3. Resultados estructurales
Al finalizar la síntesis de los péptidos, desanclarlos y liofilizarlos se procedió a realizar el
análisis estructural y de pureza de cada uno de ellos mediante HPLC, espectrometría de
masas, MALDI-TOF y dicroísmo circular.
8.3.1. Hélice 1 de HPV16 E7
O
O NH2
NH
O
NH
CH3
CH3O
O
NH
OHO
NH
CH3
CH3
O
NH
SCH3
O
NH
OH
O
O
NH
OH
O
NH
N
H
N
O
NH
CH3
CH3
O
NH2
OH CH3
Figura 52. Fórmula estructural de la secuencia lineal de hélice 1 HPV16 E7
71
Figura 53. Espectro cromatográfico de la secuencia lineal de hélice 1 HPV16 E7
En el espectro cromatográfico de la secuencia lineal de la hélice 1 de la proteína E7,
TLHEYMLDLQ, (Figura 53), Se evidencia que el péptido obtenido mediante la síntesis
presenta un alto grado de pureza, además de esto en el espectro de masas (Figura 54) se puede
observar el pico correspondiente al péptido en 1261; este nos confirma que el péptido
obtenido mediante la síntesis es el planteado (Figura 52), puesto que este tiene una masa
molecular teórica de 1261,6 g/mol el cual concuerda con la masa experimental. Además se
encuentra el pico mayoritario en 632 correspondiente a la fragmentación principal de este
péptido.
En el espectro cromatográfico de la hélice 1 de la proteína E7, JAZ--TLHEYMLDLQ—
GC, (Figura 56), se puede observar la presencia de dos picos seguidos, lo cual es
característico y evidencia la presencia de metionina, el cromatograma toma esta forma debido
a la presencia de la metionina en su estado normal y la metionina oxidada, siendo el primer
pico y el que se evidencia en menor cantidad el péptido con la presencia de la metionina
oxidada y por ende el pico con mayor retención y que evidencia mayor cantidad es el péptido
con la presencia de la metionina normal.
En el espectro de masas (Figura 57) se puede observar la presencia de un pico en 1688 el cual
sería correspondiente al péptido puesto que este presenta una masa teórica de 1690 g/mol, lo
que evidencia que el péptido obtenido mediante la síntesis es efectivamente el fragmento
escogido (Figura 55), además presenta el pico mayoritario en 881, el cual es correspondiente
a la fragmentación principal del péptido.
72
Figura 54 Espectro de masas de la secuencia lineal de hélice 1 de HPV16 E7
O
NH
SHO
NH
O
O NH2
NH
O
NH
CH3
CH3O
O
NH
OHO
NH
CH3
CH3
O
NH
SCH3
O
NH
OH
O
O
NH
OH
O
NH
NH
N
O
NH
CH3
CH3
O
NH
OH CH3O
NHNH
O
NH CH3OO
NH2
Figura 55. Fórmula estructural de la hélice 1 de HPV 16 E7
Figura 56. Espectro cromatográfico de la hélice 1 de la proteína HPV16 E7
109876543210
260
240
220
200
180
160
140
120
100
80
60
40
20
0
-20
-40
-60
-80
-100
-120
-140
1,4
83
5,8
58
RT [min]
2450 (8)-191015.DATAmV
73
Figura 57. Espectro de masas de la hélice 1 de la proteína HPV16 E7
Puesto que la finalidad de la investigación es la síntesis de péptidos con restricción
conformacional para conseguir imitar de la mejor manera la proteína nativa, se hace necesario
determinar la efectividad de la restricción del péptido y por tanto observar si el péptido tomo
forma hélice.
Debido a lo anterior se realizaron medidas en dicroísmo circular, en el dicroísmo de la
secuencia lineal de la hélice 1 de la proteína E7 (Figura 58. A) se observa que se intentan
formar dos mínimos, el primero en 226 nm y el segundo en 207 nm aproximadamente,
llegando a niveles de elipticidad molar de -4066 y -7300 correspondientemente, y
posteriormente sube llegando a un valor de elipticidad molar de 13000, lo que evidencia que
a pesar de ser el péptido lineal, por si solo tiene la tendencia a tomar conformación hélice,
esto es debido a que la secuencia peptídica sintetizada, de los 10 residuos que posee, cuatro
de estos, alanina, metionina, histidina y glutámico, presentan alta tendencia a generar
conformación hélice .En el dicroísmo de la hélice 1 de la proteína E7 (Figura 58. B) se puede
observar que se generaron dos mínimos en 220 nm y 210 nm llegando ambos a elipticidad
molar de -11800 y posteriormente sube hasta 21760, esta forma con los dos mínimos a igual
valor y una subida muy pronunciada es lo que se considera como una hélice perfecta. Al
comparar los dos dicroísmos (Figura 58. C) se evidencia claramente el cambio generado en
el péptido al realizar la ciclación mediante JAZ llegando a mejorar la conformación hélice.
74
A. B.
C. Figura 58. A. Dicroísmo circular de la secuencia lineal de la hélice 1 de HPV16 E7. B.
dicroísmo circular de la hélice 1 de HPV16 E7. C. Comparación del dicrísmo circular lineal
y restringido de la hélice 1 de HPV16 E7.
8.3.2. Hélice 3 de HPV16 E7
O
NH
SCH3
O
NH
CH3
CH3
O
NH
CH3
CH3
O
O
NH
OHO
O
NH
OH
O
NH
CH3
CH3
O
NH
OH CH3
NH
O
NH
NH2
NH
O
NH
CH3
CH3
O
O
NH
OHO
NH2
CH3CH3
NH2
Figura 59. Fórmula estructural de la secuencia lineal de la hélice 3 de HPV16 E7
En el espectro cromatográfico del péptido lineal de la hélice 3 de la proteína E7
VDIRTLEDLLM (Figura 60) se evidencia que el péptido obtenido presenta una pureza
mayor al 95%, mediante el espectro de masas (Figura 61) se puede confirmar que el péptido
sintetizado fue el planteado (Figura 59), puesto que este presenta una masa teórica de 1316.6
g/mol y en el espectro de masas se observa el pico del péptido en 1316, y el pico mayoritario
se presenta en 659, siendo la principal fragmentación encontrada en este péptido.
-8000
13000
0
10000
190 250200 220 240
Mol. Ellip.
Wavelength [nm]
-20000
25000
-10000
0
10000
20000
190 250200 220 240
Mol. Ellip.
Wavelength [nm]
-20000
25000
-10000
0
10000
20000
190 250200 220 240
Mol. Ellip.
Wavelength [nm]
75
Figura 60. Espectro cromatográfico de la secuencia lineal de la hélice 3 de HPV16 E7
Figura 61. Espectro de masas de la secuencia lineal de la hélice 3 HPV16 E7
En el espectro cromatográfico (Figura 63) de la hélice 3 de la proteína E7, JAZ—
VDIRTLEDLLM—GC, (Figura 62) se evidencian 4 señales que presentan prácticamente
la misma intensidad, lo que nos da a entender que el péptido no se encuentra puro; en el
espectro de masas de la hélice 3 de la proteína E7 (Figura 64) se observa una señal en 1743
la cual sería la correspondiente al péptido deseado, y el pico mayoritario es correspondiente
a la principal fragmentación del péptido, por lo cual se podría asegurar que el resultado
obtenido es efectivamente el péptido deseado, aun así se encuentran otras señales aunque en
menor intensidad, por lo cual se procedió a analizar la muestra en MALDI-TOF (Figura 65)
en donde se evidencia que el pico mayoritario es el del péptido deseado, encontrándose en
1743.66, de acuerdo con lo anterior se evidencia que efectivamente el péptido se encuentra
en gran proporción y posiblemente las diferentes contaminaciones que se observan en el
HPLC y en el masas son debidas a aductos y que se dieron en el momento del clivaje y
76
diferentes delesiones, como la primera delesión que se evidencia en 1630 generando una
diferencia de masa de 113, la cual podría ser la pérdida de una leucina. Este péptido podría
ser purificado mediante C-18.
O
NH
SHO
NH NH2
O
NH
SCH3
O
NH
CH3
CH3
O
NH
CH3
CH3
O
O
NH
OH
O
O
NH
OH
O
NH
CH3
CH3
O
NH
OH CH3
NH
O
NH
NH2
NH
O
NH
CH3
CH3
O
O
NH
OH
O
NH
CH3 CH3O
NH
NH
O
NH
CH3
O
O
Figura 62. Formula estructural de hélice 3 de HPV16 E7
Figura 63. Espectro cromatográfico de la hélice 3 de la proteína HPV16 E7
77
Figura 64. Espectro de masas de la hélice 3 de la proteína HPV16 E7
Figura 65. Espectro de MALDI-TOF de la hélice 3 de la proteína E7
En el dicroísmo circular de la secuencia lineal de la hélice 3 de la proteína E7 (Figura 66. A)
se puede evidenciar que el péptido sintetizado presenta por si solo una tendencia a tomar
conformación hélice, puesto que presenta un primer mínimo a 220 nm llegando a un nivel de
elipticidad molar de -17383 y un segundo mínimo a 208 nm que llega a un nivel de -21375
de elipticidad molar y posteriormente sube hasta llegar a un nivel de 41561 de elipticidad
molar, lo que genera una formación característica de conformación hélice. Además se debe
de tener en cuenta que la secuencia tiene presencia de 3 leucinas, metionina o glutámico,
78
aminoácidos que son altamente influyentes para conformaciones hélice. En el espectro de
dicroísmo circular de la hélice 3 de la proteína E7 (Figura 66. B) se pueden observar los dos
mínimos y la posterior subida característica de la conformación hélice. El primer mínimo se
encuentra en 220 nm llegando a una elipticidad molar de -29735 y el segundo mínimo en 208
nm llegando a una elipticidad molar de -35750, posteriormente subiendo hasta llegar a una
elipticidad molar de 61535. En la comparación de los dicroísmos circulares de la secuencia
lineal y la secuencia restringida (Figura 66. C) se puede evidenciar claramente que el sitio de
nucleación JAZ efectivamente logró optimizar la formación de la hélice.
A. B.
C. Figura 66. A. Dicroísmo circular de la secuencia lineal de la hélice 3 de HPV16 E7. B.
dicroísmo circular de la hélice 3 de HPV16 E7. C. Comparación del dicroísmo circular
lineal y restringido de la hélice 3 de HPV16 E7.
8.3.3. Hélice 2 de HPV16 L1
O
NH
SCH3
O
NH
OHO
NH
NH
N
O
NH
CH3
CH3
O
NH
OH
O
NH
OH CH3O
NH
SCH3
O
NH
CH3CH3O
O
NH
OHO
NH2
CH3
NH2
Figura 67. Fórmula estructural de la secuencia lineal de la hélice 2 de HPV16 L1
-30000
50000
-20000
0
20000
40000
190 250200 220 240
Mol. Ellip.
Wavelength [nm]
-40000
70000
0
50000
190 250200 220 240
Mol. Ellip.
Wavelength [nm]
-40000
-20000
0
20000
40000
60000
190 210 230 250
Mo
l. El
lip.
Wavelength (nm)Lineal Restringido
79
Figura 68. Espectro cromatográfico de la secuencia lineal de hélice 2 de HPV16 L1
Figura 69. Espectro de masas de la secuencia lineal de hélice 2 de HPV16 L1
En el espectro cromatográfico (Figura 68) de la secuencia lineal de la hélice 2 de la proteína
L1 ADVMTYIHSM (Figura 67),, se puede observar una sola señal, la cual nos evidencia
que el péptido sintetizado presenta una pureza mayor al 50%, en el espectro de masas de la
secuencia lineal de la hélice 2 de L1 (Figura 69) se puede evidenciar un pico muy marcado
en 1166, el cual sería correspondiente al péptido deseado, puesto que este presenta un peso
molecular de 1166,4 g/mol, por lo cual se puede evidenciar que efectivamente se obtuvo el
péptido planteado.
En el espectro cromatográfico (Figura 71) de la hélice 2 de la proteína L1, JAZ—
ADVMTYIHSM—GC (Figura 70) se evidencia la presencia de dos picos seguidos,
prácticamente uno solo, esto se puede generar debido a las cisteína o a las metioninas, de las
cuales una pequeña porción se pudo oxidar y generar los dobles picos, pero se aun así se
80
puede evidenciar que presenta cierto grado de pureza. En el espectro de masas (Figura 72) se
puede observar el pico en 1593 el cual sería correspondiente al péptido deseado puesto que
este presenta un peso molecular de 1594,9 g/mol y presenta un pico mayoritario en 834
correspondiente a una de las principales fragmentaciones del péptido. Por lo cual se puede
evidenciar que efectivamente se obtuvo el péptido deseado.
O
NHNH
O
NH CH3OO
O
NH
SHO
NH NH2
O
NH
SCH3
O
NH
OHO
NH
NH
N
O
NH
CH3
CH3
O
NH
OH
O
NH
OH CH3O
NH
SCH3
O
NH
CH3CH3O
O
NH
OHO
NH
CH3
Figura 70. Fórmula estructural de la hélice 2 de HPV16 L1
Figura 71. Espectro cromatográfico de la hélice 2 de HPV 16 L1
81
Figura 72. Espectro de masas de hélice 2 de HPV 16 L1
Figura 73. A. Dicroísmo circular de la secuencia lineal de la hélice 2 de HPV16 L1. B.
dicroísmo circular de la hélice 2 de HPV16 L1. C. Comparación del dicroísmo circular
lineal y restringido de la hélice 2 de HPV16 L1.
En el dicroísmo circular de la secuencia lineal de la hélice 2 de la proteína L1 (Figura 73. A),
se puede observar que se presentan dos mínimos y posteriormente una subida muy
pronunciada; el primer mínimo se encuentra en 220 nm llegando a una elipticidad molar de
-20000
30000
-10000
0
10000
20000
190 250200 220 240
Mol. Ellip.
Wavelength [nm]
-30000
60000
-20000
0
20000
40000
190 250200 220 240
Mol. Ellip.
Wavelength [nm]
-30000
60000
-20000
0
20000
40000
190 250200 220 240
Mol. Ellip.
Wavelength [nm]
82
-10933, luego presenta un segundo mínimo a 208 nm a un nivel de -13211 de elipticidad
molar y por ultimo sube hasta llegar a un nivel de 26702 de elipticidad molar. Esto evidencia
que la secuencia por si sola tiende a tomar una conformación hélice, y teniendo en cuenta
que la secuencia presenta alanina, metionina e histidina se puede asegurar esta conformación
puesto estos aminoácidos presenta alta tendencia a conformación hélice.
En el dicroísmo circular de la hélice 2 de la proteína L1 (Figura 73. B) se puede observar que
se presenta un primer mínimo a 220 nm llegando a una elipticidad molar de -24921,
posteriormente presenta un segundo mínimo más pronunciado en 208 nm, el cual llega hasta
una elipticidad molar de -27173 y por ultimo sube hasta llegar a un máximo de 56323,
determinando así que efectivamente se logró obtener una conformación hélice.
En la comparación del dicroísmo circular de la secuencia lineal y la secuencia restringida de
la hélice 2 de la proteína L1 (Figura 73. C) se puede evidenciar que efectivamente se logró
mejorar la restricción conformacional del péptido, lo cual se evidencia en el cambio de
amplitud de la onda.
8.3.4. Hélice 4 de HPV 16 L1
O
NH
CH3O
O NH2
NH
O
NH
OHO
NH
OH CH3O
NH
CH3CH3
O
NH
NH
O
NH
NH2
NH
O
NH
OH
O
NH
OH CH3
O
O
NH
OHO
O
NH
OH
O
NH2
CH3
CH3
NH2
Figura 74. Fórmula estructural de la secuencia lineal de la hélice 4 de HPV16 L1
En el espectro cromatográfico (Figura 75) de la secuencia lineal de la hélice 4 de la proteína
L1 (Figura 74), LEDTYRFVTSQA, se puede observar la presencia de un solo pico, lo cual
nos indica que el péptido sintetizado se encuentra en una pureza mayor al 95%, en el espectro
de masas (Figura 76) se evidencia la presencia de un pico en 1428, el cual sería
correspondiente al péptido puesto que este presenta un peso molecular de 1428,6 g/mol y
además se encuentra el pico mayoritario en 715 el cual corresponde a la principal
fragmentación del péptido. Por lo cual se puede evidenciar que el péptido sintetizado es el
péptido deseado.
83
Figura 75. Espectro cromatográfico de la secuencia lineal de la hélice 4 de HPV16 L1
Figura 76. Espectro de masas de la secuencia lineal de la hélice 4 de HPV16 L1
O
NHNH
O
NH CH3OO
O
NH
SHO
NH NH2
O
NH
CH3O
O NH2
NH
O
NH
OHO
NH
OH CH3O
NH
CH3CH3
O
NH
NH
O
NH
NH2
NH
O
NH
OH
O
NH
OH CH3
O
O
NH
OHO
O
NH
OH
O
NH
CH3
CH3
Figura 77. Fórmula estructural de la hélice 4 de HPV16 L1
84
Figura 78. Espectro cromatográfico de la hélice 4 de HPV16 L1
En el espectro cromatográfico de la hélice 4 de la proteína L1 (Figura 78), JAZ—
LEDTYRFVTSQA—GC (Figura 77), se puede observar la presencia de dos picos, estos se
pueden deber a la cisteína, puesto que si esta se oxida se encontrara el péptido con la cisteína
normal y el péptido con la cisteína oxidada, en el espectro de masas de la hélice 4 de la
proteína L1 (Figura 79) se puede evidenciar la presencia de un pico en 1855, el cual sería el
correspondiente al péptido puesto que este presenta un peso molecular de 1857 g/mol, y
además presenta un pico en 965 correspondiente a una de las principales fragmentaciones.
Figura 79. Espectro de masas de la hélice 4 de HPV16 L1.
85
A. B.
C. Figura 80. A. Dicroísmo circular de la secuencia lineal de la hélice 4 de HPV16 L1. B.
dicroísmo circular de la hélice 4 de HPV16 L1. C. Comparación del dicroísmo circular
lineal y restringido de la hélice 4 de HPV16 L1.
Mediante el dicroísmo circular de la secuencia lineal de la hélice 4 de la proteína L1 (Figura
80. A) se evidencia que la secuencia tiende a tomar conformación de hélice, muy
posiblemente debido a que la secuencia presenta alanina, glutámico y leucina, los cuales,
como se ha dicho anteriormente, tiene tendencia a formar hélices, en el dicroísmo se observa
un primer mínimo a 220 nm llegando a una elipticidad molar de -7525, luego presenta un
segundo mínimo más pronunciado a 207 nm, llegando a un nivel de -11735 de elipticidad
molar y por ultimo tiene una subida muy marcada a 190 nm, llegando a un nivel de elipticidad
molar de 10263.
Por otro lado se tiene el dicroísmo circular de la secuencia de la hélice 4 de la proteína L1
(Figura 80. B) en donde se puede observar un primer mínimo a 220 nm llegando a un nivel
de -23040 de elipticidad molar, posteriormente presenta otro mínimo en 208 nm con una
elipticidad molar de -26875 y por ultimo presenta una subida muy marcada llegando a un
nivel de 39871 de elipticidad molar. Por último se puede observar la comparación del
dicroísmo circular de la secuencia lineal y la restringida (Figura 80. C), en donde se evidencia
que efectivamente al poner el sitio de nucleación JAZ se mejoró la estructura hélice puesto
que la amplitud de la onda se hizo más grande llegando a mínimos y máximo más altos y
además los mínimos se estabilizaron más llegando a estar casi al mismo nivel.
-12000
11000
0
190 250200 220 240
Mol. Ellip.
Wavelength [nm]
-30000
-10000
10000
30000
190 210 230 250
Mo
l. El
lip.
Wavelength (nm)
-30000
-20000
-10000
0
10000
20000
30000
40000
190 210 230 250
Mo
l. El
lip.
Wavelength (nm)
lineal restringido
86
8.3.5. Loop FG de HPV16 L1
O
NH
CH3O
NH
OH CH3O
NH
OHO
NH
O
NH
OHO
NH
O
NH
NH2
O
NH
CH3
CH3
O
NH
OH
O
NH
CH3
CH3
O
O
NH
OHO
O
NH2
OH
NH2
Figura 81. Fórmula estructural de la secuencia lineal de la loop FG de HPV16 L1
Figura 82. Espectro cromatográfico de la secuencia lineal de la loop FG de HPV16 L1
En el espectro cromatográfico de la secuencia lineal de la loop FG de la proteína L1 (Figura
82), DDLYIKGSGSTA (Figura 81) se puede evidenciar que el péptido sintetizado presenta
un porcentaje de pureza mayor al 95% pues que se observa un solo pico muy definido. En el
espectro de masas de la loop FG (Figura 83) se puede observar un pico en 1225, el cual
demuestra que el péptido sintetizado es el péptido planteado, puesto que este presenta un
peso molecular teórico de 1225,3 g/mol, y presenta el pico mayoritario en 614
correspondiente a la fragmentación principal del péptido.
87
Figura 83. Espectro cromatográfico de la secuencia lineal de la loop FG de HPV16 L1
O O
O
NH
CH3
O
NH
OH
CH3
O
NH
OHO
NH
O
NH
OH
O
NH
O
NH
NH2
O
NH
CH3
CH3
O
NH
OH
O
NHCH3
CH3
O
O
NH
OH
O
O
NH
OH
O
NH
SH
O
NH
NH2
O
NH
NH
Figura 84. Fórmula estructural de la loop FG de HPV16 L1
Mediante el espectro cromatográfico de la loop FG de la proteína L1 (Figura 85), J—
DDLYIKGSGSTA—Z—GC (Figura 84), se puede evidenciar que el péptido obtenido
presenta un buen grado de pureza, puesto que aunque presenta un poco de interferencia se
puede observar que hay un solo pico mayoritario. El peso molecular teórico de la molécula
planteada es de 1582,7, pero en el espectro de masas de la loop FG de la proteína L1 (Figura
86) no se encuentra una señal correspondiente a este valor, por otro lado, se encuentra una
señal en 1653 y la señal mayoritaria en 827 la cual correspondería a la fragmentación
principal de una molécula con un peso molecular de 1653. Por lo anterior se evidencia que
88
la molécula planteada no fue exactamente la sintetizada y que presenta una diferencia de +71
en el valor de su peso molecular. Esta diferencias de +71 se podría deber a la adición de una
alanina, o al cambio de glicina por glutamina o lisina.
Puesto que las probabilidades eran varias y para corroborar se decidió realizar nuevamente
la síntesis de las secuencias loop, al finalizar y realizar los debidos análisis de HPLC y masas
se observó que el péptido presentaba el mismo M+71, puesto que el valor no es tan alto se
puede plantear que lo más probable es que en el momento del clivaje se haya generado la
unión de un aducto, por lo cual se tendría el péptido deseado con la secuencia planteada más
la unión de un aducto con masa de 71.
Figura 85. Espectro cromatográfico de la loop FG de HPV16 L1
89
Figura 86. Espectro de masas de la loop FG de HPV16 L1
Figura 87. Dicroísmo circular de la secuencia lineal de la loop FG de HPV16 L1. B.
dicroísmo circular de la loop FG de HPV16 L1. C. Comparación del dicroísmo circular
lineal y restringido de la loop FG de HPV16 L1.
En el dicroísmo circular de la secuencia lineal de la loop FG de la proteína L1 (Figura 87. A)
se evidencia que solamente tiene un mínimo muy pronunciado que se presenta a 198 nm
llegando a un nivel de -10992 de elipticidad molar y posteriormente sube hasta llegar a un
nivel de elipticidad molar de -6755 en 190 nm, esta es una conformación característica de un
random coil, lo que normalmente se conoce como péptidos que no presentan una estructura
definida, pero literalmente random coil son vueltas aleatorias, la conformación loop es una
vuelta, por lo cual su espectro en dicroísmo circular es muy similar a random coil, lo que la
diferencia de esta es que la conformación loop, presenta una leve inflexión indicando otro
posible mínimo que va bajando en el valor de elipticidad molar entre los 235 nm y 215 nm
aproximadamente. Además se debe de tener en cuenta que la secuencia tiene gran cantidad
de glicinas, aspárticos y serinas, los cuales presentan altos índices de influencia para
conformaciones loop
En el dicroísmo circular de la loop FG de la proteína L1 (Figura 87. B) se puede observar
que a medida que se disminuye en la longitud de onda se puede observar una leve inflexión
tratando de formarse un mínimo entre los 230 nm y 220 nm a una elipticidad de molar de -
-11000
1000
-5000
190 250200 220 240
Mol. Ellip.
Wavelength [nm]
-15000
0
-10000
-5000
190 250200 220 240
Mol. Ellip.
Wavelength [nm]
-15000
1000
-10000
-5000
190 250200 220 240
Mol. Ellip.
Wavelength [nm]
90
5478, posteriormente baja hasta llegar a un mínimo muy pronunciado a 200 nm con un nivel
de elipticidad molar de -14749 y por ultimo sube hasta llegar a -3877 a 190 nm.
En la comparación del espectro lineal y el restringido de la loop FG de la proteína L1 (Figura
87. C), se puede evidenciar que la proteína efectivamente tomo una conformación loop al
generarse la inflexión más notoria y un mínimo más pronunciado y posteriormente una subida
8.3.6. Loop HI de HPV16 L1
O
NH
O
O
NH2
NH
O
NH
OH CH3
O
O
NH2
NH
O
NH
NH2
O
NH
OH
O
NH
OH CH3
O
NH
OH CH3O
O
NH
OH
O
NH
OHO
NH
OH CH3
O
NH
OHO
NH2
CH3
CH3
Figura 88. Fórmula estructural de la secuencia lineal de la loop HI de HPV16 L1
Figura 89. Espectro cromatográfico de la secuencia lineal de la loop HI de HPV16 L1
Mediante el espectro cromatográfico de la secuencia lineal de la loop HI de la proteína L1
(Figura 89), ISTSETTYKNTNF (Figura 88), se puede evidenciar que el péptido sintetizado
presenta una pureza mayor al 95%, puesto que se observa un solo pico muy definido, en el
espectro de masas de la loop HI de la proteína L1, (Figura 90), se observa un pico marcado
en 1505, el cual corresponde al péptido sintetizado puesto que este presenta un peso
molecular teórico de 1504,6 g/mol, por lo cual se puede determinar que el péptido obtenido
es efectivamente el que se diseñó.
91
En el espectro cromatográfico de la loop HI de la proteína L1 (Figura 92), J—
ISTSETTYKNTNF—Z—GC (Figura 91) se observa un pico muy definido, lo cual nos
indica que el péptido sintetizado presenta un alto nivel de pureza, en el espectro de masa de
la loop HI (Figura 93) se puede observar un pico característico que corresponde al péptido
sintetizado en 1932 m/z, además se observa que la señal mayoritaria es de 967 m/z la cual es
correspondiente a la fragmentación primaria del péptido con peso molecular de 1932 m/z, al
igual que el péptido anterior, este presenta una masa experimental de +71, puesto que el peso
molecular teórico del péptido es de 1862,1 g/mol. Por lo cual se plantea que al momento del
clivaje se adhirió un aducto al péptido sintetizado. De esta manera se tiene el péptido deseado
con un aducto que presenta una masa de +71
Figura 90. Espectro de masas de la secuencia lineal de loop HI de HPV16 L1
O
O
O
NH
SH
O
NH
NH2
O
NH
NH
O
NH
O
O
NH2
NH
O
NH
OH
CH3
OO
NH2NH
O
NH
NH2
O
NH
OH
O
NH
OH
CH3
O NH
OH
CH3 O
O
NH
OH
O
NH
OH
O
NH
OH
CH3
O
NH
OH
O
NH
CH3
CH3
Figura 91. Fórmula estructural de la loop HI de HPV16 L1
92
Figura 92. Espectro cromatográfico de la loop HI de HPV16 L1
Figura 93. Espectro de masas de la loop HI de HPV16 L1
En el dicroísmo de la secuencia lineal de la loop HI de la proteína L1 (Figura 94. A) se puede
observar que se intenta generar un mínimo al redor de los 230 nm estando en una elipticidad
molar de -2379 y posteriormente se genera un mínimo muy marcado en 202 nm el cual llega
a un nivel de elipticidad molar de -9138, por ultimo sube hasta llegar a un nivel de elipticidad
molar de -4227 en 190 nm, esta conformación nos demuestra que la secuencia tiene una gran
tendencia a tomar conformación loop, posiblemente por la gran cantidad de presencia de
treoninas y serinas.
En el dicroísmo circular de la loop HI de la proteína L1 (Figura 94. B), se evidencia que hay
una curvatura pronunciada entre los 235nm y 225 nm estando aproximadamente a un nivel
93
de -6779 de elipticidad molar, posteriormente sigue bajando hasta llegar a un mínimo muy
marcado el cual se encuentra en un nivel de -14411 de elipticidad molar en 202 nm y por
ultimo sube hasta un nivel de 3901 de elipticidad molar en 190 nm. En la comparación del
dicroísmo circular de la secuencia lineal y la restringida de la loop HI (Figura 94. C) se
evidencia que al utilizar el sitio de nucleación JAZ es una buena metodología puesto que el
péptido tomó mayor restricción tomando una mejor forma de loop.
A. B.
C. Figura 94. Dicroísmo circular de la secuencia lineal de la loop HI de HPV16 L1. B.
dicroísmo circular de la loop HI de HPV16 L1. C. Comparación del dicroísmo circular
lineal y restringido de la loop HI de HPV16 L1
7.1. Rendimiento de la síntesis
Al tener el péptido desalinizado y liofilizado se procedió a pesarlo para saber la cantidad
obtenido y por tanto determinar el rendimiento de la síntesis.
Para saber el rendimiento de la síntesis, primero se determinó el peso teórico, este se calcula
mediante la multiplicación del peso molecular del péptido, la sustitución de la resina y la
cantidad de resina usada.
𝑷𝒆𝒔𝒐 𝒕𝒆ó𝒓𝒊𝒄𝒐 = 𝑃. 𝑀. 𝑑𝑒𝑙 𝑝é𝑝𝑡𝑖𝑑𝑜 × 𝑠𝑢𝑠𝑡𝑖𝑡𝑢𝑐𝑖ó𝑛 𝑑𝑒 𝑙𝑎 𝑟𝑒𝑠𝑖𝑛𝑎 × 𝑔 𝑑𝑒 𝑟𝑒𝑠𝑖𝑛𝑎
El peso del péptido obtenido experimentalmente se divide por el peso teórico del péptido y
este se multiplica por cien, con lo cual se obtendrá el rendimiento de la síntesis del péptido
-10000
0
-8000
-6000
-4000
-2000
190 250200 220 240
Mol. Ellip.
Wavelength [nm]
-15000
4000
-10000
-5000
0
190 250200 220 240
Mol. Ellip.
Wavelength [nm]
-15000
4000
-10000
-5000
0
190 250200 220 240
Mol. Ellip.
Wavelength [nm]
94
7.1.1. Hélice 1 de HPV16 E7
Lineal
𝑹𝒆𝒏𝒅𝒊𝒎𝒊𝒆𝒏𝒕𝒐 𝒕𝒆ó𝒓𝒊𝒄𝒐 = 1262,46𝑚𝑔
𝑚𝑒𝑞× 0,59
𝑚𝑒𝑞
𝑔× 0,04𝑔 = 29,79𝑚𝑔
% 𝒓𝒆𝒏𝒅𝒊𝒎𝒆𝒏𝒕𝒐 =19,46𝑚𝑔
29,79𝑚𝑔× 100 = 65,32%
Restringido
𝑹𝒆𝒏𝒅𝒊𝒎𝒊𝒆𝒏𝒕𝒐 𝒕𝒆ó𝒓𝒊𝒄𝒐 = 1689,97𝑚𝑔
𝑚𝑒𝑞× 0,59
𝑚𝑒𝑞
𝑔× 0,04𝑔 = 39,88𝑚𝑔
% 𝒓𝒆𝒏𝒅𝒊𝒎𝒆𝒏𝒕𝒐 =15,83𝑚𝑔
39,88𝑚𝑔× 100 = 39,69%
7.1.2. Hélice 3 de HPV 16 E7
Lineal
𝑹𝒆𝒏𝒅𝒊𝒎𝒊𝒆𝒏𝒕𝒐 𝒕𝒆ó𝒓𝒊𝒄𝒐 = 1317,58𝑚𝑔
𝑚𝑒𝑞× 0,59
𝑚𝑒𝑞
𝑔× 0,04𝑔 = 31,09𝑚𝑔
% 𝒓𝒆𝒏𝒅𝒊𝒎𝒆𝒏𝒕𝒐 =18,03𝑚𝑔
31,09𝑚𝑔× 100 = 57,99%
Restringido
𝑹𝒆𝒏𝒅𝒊𝒎𝒊𝒆𝒏𝒕𝒐 𝒕𝒆ó𝒓𝒊𝒄𝒐 = 1745,09𝑚𝑔
𝑚𝑒𝑞× 0,59
𝑚𝑒𝑞
𝑔× 0,04𝑔 = 41,18𝑚𝑔
% 𝒓𝒆𝒏𝒅𝒊𝒎𝒆𝒏𝒕𝒐 =11,98𝑚𝑔
41,18𝑚𝑔× 100 = 29,09%
En los péptidos sintetizados de la proteína E7 se puede observar que los péptidos lineales
presentan mayor porcentaje de rendimiento que los péptidos restringidos, los péptidos
lineales llegan a tener un rendimiento entre 57% y 66%, lo cual es considerado como un buen
95
rendimiento. Por el lado de los péptidos restringido, la hélice 1 presento un rendimiento
mayor que la hélice 3, aunque a pesar de esto, un 29% se sigue considerando como un buen
rendimiento, puesto que los péptidos restringidos presentar una mayor dificultad de ser
sintetizados, lo que genera mayor facilidad de bajar su rendimiento.
7.1.3. Hélice 2 de HPV 16 L1
Lineal
𝑹𝒆𝒏𝒅𝒊𝒎𝒊𝒆𝒏𝒕𝒐 𝒕𝒆ó𝒓𝒊𝒄𝒐 = 1167,38𝑚𝑔
𝑚𝑒𝑞× 0,59
𝑚𝑒𝑞
𝑔× 0,04𝑔 = 27,55𝑚𝑔
% 𝒓𝒆𝒏𝒅𝒊𝒎𝒆𝒏𝒕𝒐 =12,74𝑚𝑔
27,55𝑚𝑔× 100 = 46,24%
Restringido
𝑹𝒆𝒏𝒅𝒊𝒎𝒊𝒆𝒏𝒕𝒐 𝒕𝒆ó𝒓𝒊𝒄𝒐 = 1594,89𝑚𝑔
𝑚𝑒𝑞× 0,59
𝑚𝑒𝑞
𝑔× 0,04𝑔 = 37,64𝑚𝑔
% 𝒓𝒆𝒏𝒅𝒊𝒎𝒆𝒏𝒕𝒐 =11,59𝑚𝑔
37,64𝑚𝑔× 100 = 30,79%
7.1.4. Hélice 4 de HPV 16 L1
Lineal
𝑹𝒆𝒏𝒅𝒊𝒎𝒊𝒆𝒏𝒕𝒐 𝒕𝒆ó𝒓𝒊𝒄𝒐 = 1429,57𝑚𝑔
𝑚𝑒𝑞× 0,59
𝑚𝑒𝑞
𝑔× 0,04𝑔 = 33,74𝑚𝑔
% 𝒓𝒆𝒏𝒅𝒊𝒎𝒆𝒏𝒕𝒐 =17,43𝑚𝑔
33,74𝑚𝑔× 100 = 51,66%
Restringido
𝑹𝒆𝒏𝒅𝒊𝒎𝒊𝒆𝒏𝒕𝒐 𝒕𝒆ó𝒓𝒊𝒄𝒐 = 1857,08𝑚𝑔
𝑚𝑒𝑞× 0,59
𝑚𝑒𝑞
𝑔× 0,04𝑔 = 43,82𝑚𝑔
96
% 𝒓𝒆𝒏𝒅𝒊𝒎𝒆𝒏𝒕𝒐 =13,47𝑚𝑔
43,82𝑚𝑔× 100 = 30,73%
7.1.5. Loop FG de HPV 16 L1
Lineal
𝑹𝒆𝒏𝒅𝒊𝒎𝒊𝒆𝒏𝒕𝒐 𝒕𝒆ó𝒓𝒊𝒄𝒐 = 1226,31𝑚𝑔
𝑚𝑒𝑞× 0,59
𝑚𝑒𝑞
𝑔× 0,04𝑔 = 28,94𝑚𝑔
% 𝒓𝒆𝒏𝒅𝒊𝒎𝒆𝒏𝒕𝒐 =16,83𝑚𝑔
28,94𝑚𝑔× 100 = 58,15%
Restringido
𝑹𝒆𝒏𝒅𝒊𝒎𝒊𝒆𝒏𝒕𝒐 𝒕𝒆ó𝒓𝒊𝒄𝒐 = 1582,74𝑚𝑔
𝑚𝑒𝑞× 0,59
𝑚𝑒𝑞
𝑔× 0,04𝑔 = 37,35𝑚𝑔
% 𝒓𝒆𝒏𝒅𝒊𝒎𝒆𝒏𝒕𝒐 =13,94𝑚𝑔
37,35𝑚𝑔× 100 = 37,32%
7.1.6. Loop HI de HPV16 L1
Lineal
𝑹𝒆𝒏𝒅𝒊𝒎𝒊𝒆𝒏𝒕𝒐 𝒕𝒆ó𝒓𝒊𝒄𝒐 = 1226,31𝑚𝑔
𝑚𝑒𝑞× 0,59
𝑚𝑒𝑞
𝑔× 0,04𝑔 = 28,94𝑚𝑔
% 𝒓𝒆𝒏𝒅𝒊𝒎𝒆𝒏𝒕𝒐 =17,73𝑚𝑔
28,94𝑚𝑔× 100 = 61,26%
Restringido
𝑹𝒆𝒏𝒅𝒊𝒎𝒊𝒆𝒏𝒕𝒐 𝒕𝒆ó𝒓𝒊𝒄𝒐 = 1862,05𝑚𝑔
𝑚𝑒𝑞× 0,59
𝑚𝑒𝑞
𝑔× 0,04𝑔 = 43,94𝑚𝑔
% 𝒓𝒆𝒏𝒅𝒊𝒎𝒆𝒏𝒕𝒐 =12, 25𝑚𝑔
43,94𝑚𝑔× 100 = 27,88%
97
Los péptidos lineales sintetizados de la proteína L1 presentan altos porcentajes de
rendimiento, llegando incluso al 61% y ninguna bajo del 45%, esto indica que la síntesis se
realizó de una manera adecuada. Por otro lado, los péptidos restringidos a conformación
hélice presentaron rendimientos mayores que los péptidos restringidos a loop, pero todos se
consideran buenos rendimientos, puesto que la dificultad de generar una restricción loop es
mayor que la dificultad de generar una hélice, por lo tanto un rendimiento de 37% y 27% es
un rendimiento mayor al esperado para los péptidos con conformación loop, los dos péptidos
con conformación hélice presentan un buen rendimiento a estar en 30%
98
9. CONCLUSIONES
1. Fueron sintetizados 12 péptidos del virus del papiloma humano genotipo 16, mediante
la estrategia de síntesis de péptidos en fase sólida Fmoc. 4 de estos péptidos fueron
de la proteína E7, puesto que se sintetizaron las secuencias restringidas y lineales de
la hélice 1 (JAZ--TLHEYMLDLQ—GC) y la hélice 3 (JAZ—VDIRTLEDLLM—
GC) las cuales presentaron altos porcentajes de rendimiento, ambas secuencias
lineales tuvieron altos índices de pureza pero la secuencia restringida de la hélice 1
presentó mejor porcentaje de pureza que la secuencia restringida de la hélice 3. Sin
embargo, se demostró la presencia de las secuencias deseadas en los 4 péptidos.
2. De la proteína L1 se sintetizaron 8 péptidos, la hélice 2 (JAZ—ADVMTYIHSM—
GC), la hélice 4 (JAZ—LEDTYRFVTSQA—GC), la loop FG (J—
DDLYIKGSGSTA—Z—GC) y la loop HI (J—ISTSETTYKNTNF—Z—GC) con
sus respectivas secuencias lineales, todos los péptidos lineales presentaron altos
índices de pureza y porcentajes de rendimiento, las secuencias restringidas en
conformación hélice presentaron altos porcentaje de rendimiento y niveles de pureza
aceptables, por el lado de los péptidos con restricción conformacional a loop se
obtuvieron buenos porcentajes de rendimiento a pesar de la dificultad de su síntesis y
se determinó la presencia de los péptidos deseados aunque presentaran un aducto.
3. Se determinó que el sitio de nucleación JAZ (en proceso de patente por parte de la
Universidad Distrital y grupo Poteoma) es capaz de estabilizar en alfa hélice péptidos
cortos, lo cual no se había demostrado, pues se había aplicado exclusivamente a
macromoléculas dendriméricas tipo DDC.
99
10. RECOMENDACIONES.
Puesto que las diferentes secuencias lineales y con restricción conformacional de las dos
proteínas se obtuvieron exitosamente, la mayoría con altos niveles de pureza y rendimiento,
se sugiere que se proceda a realizar los respectivos análisis de ELISA para determinar la
reacción antígeno- anticuerpo de las secuencias lineales y restringidas y así poder determinar,
si efectivamente, las secuencias restringidas presentan mayor reactividad que las secuencias
lineales. Algunos de estos péptidos ya se habían analizado en el instituto de Inmunología de
Colombia, pero usando el sitio de nucleación JLAZ- propuesto por el grupo de Satterthwait
en California. Al tener estos resultados se podrá empezar a pensar en la postulación de un
nuevo método de identificación del virus del papiloma humano mediante pruebas más
sencillas y menos dolorosas para las pacientes.
100
11. REFERENCIAS
1. J.C. Calvo; N.F. Barrera; J.A. García; F. Guzmán; F. Espejo; M.E. Patarroyo. Síntesis
de la oxitocina en fase sólida usando terbutoxicarbonilo y fluorenilmetoxicarbonilo
derivados. Rev. Colomb. Quim. 1999 28 (1), pp 19-25.
2. JC. Calvo Mozo, N.F. Barrera Cobos, Búsqueda de Epítopes Conformacionales en la
Proteína L1 de la Cápside del virus del papiloma humano tipo 16 (HPV-16), Tesis de
maestría en bioquímica, Universidad Nacional de Colombia, Bogotá, 2006, pp. 5-17.
3. P. Ricci; E. Perucca; J. Koljanin; E. Baeriswyl, Citología de base líquida: revisión de
la historia y los estudios al respecto, rev. Chil. obstet ginecol 2004; 69(3): pp 256-
262
4. Guzman F. Síntesis de Péptidos. En: Genómica Funcional Fundamentos y
Aplicaciones. Valparaíso, Chile: Universidad Técnica Federico Santa María.
2013.pp. 121-138.
5. Merrifield R. B, Solid Fase Péptide Synthesis, The Synthesis of a Tetrapeptide.
Rockefeler Institute New York. 1963(85) pp. 2149-2154.
6. Dyson H. J., Wright P. E. Antigenic Peptide. FASEB J. 1995 (9) pp. 37-42.
7. Calvo, J.C.; Barrera, N.F.; Garcia, J.A.; Guzman, F.; Espejo, F.; Patarroyo M.E.
Síntesis de la oxitocina en fase sólida usando terbutoxicarbonilo y
fluorenilmetoxicarbonilo derivados. Rev. Colomb. Quim. 1999 28 (1), pp 19-25.
8. J.C. Calvo Mozo; J.C. Martinez; A.C. Satterthwait; M.E. Patarroyo, "De la predicción
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