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DESARROLLO HISTÓRICO Y PERSPECTIVAS DE LA SÍNTESIS DE
PÉPTIDOS EN FASE SOLIDA
ANDERSON SIERRA CALDERÓN
UNIVERSIDAD DISTRITAL FRANCISCO JOSÉ DE CALDAS
FACULTAD DE CIENCIAS Y EDUCACIÓN
PROYECTO CURRICULAR LIC. QUÍMICA
BOGOTÁ D.C., COLOMBIA
2017
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DESARROLLO HISTÓRICO Y PERSPECTIVAS DE LA SÍNTESIS DE
PÉPTIDOS EN FASE SOLIDA.
Autor:
ANDERSON SIERRA CALDERÓN
Co-Directores:
JULIO CESAR CALVO, Dr.Sc.
Grupo de investigación Proteoma UD
Proyecto Curricular Lic. Biología.
MIGUEL ANGEL DELGADO
Semillero de Investigación PhysicoChemie
Proyecto Curricular Lic. Química.
Universidad Distrital Francisco José de Caldas
UNIVERSIDAD DISTRITAL FRANCISCO JOSÉ DE CALDAS
FACULTAD DE CIENCIAS Y EDUCACIÓN
PROYECTO CURRICULAR LIC. QUÍMICA
BOGOTÁ D.C., COLOMBIA
2017
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RESUMEN
En esta monografía se hará una revisión bibliográfica sobre el desarrollo histórico y
las perspectivas de la síntesis de péptidos en fase sólida, haciendo énfasis en los
diferentes procesos químicos que han llevado a la construcción de fragmentos
peptídicos y macromoléculas, que tienen sus aplicaciones en la industria
farmacéutica, la agroindustria y en los métodos de diagnóstico.
El objetivo principal de la monografía consiste en describir las investigaciones
hechas por diferentes autores que contribuyeron en el desarrollo de la síntesis de
péptidos en fase sólida, del mismo modo, revisar y explicar de manera detallada las
estrategias propuestas para llevar a cabo los procesos químicos inmersos en la
obtención de los productos esperados. Por ultimo investigar acerca de los diversos
tipos de aplicación que tienen los péptidos en las diferentes industrias.
Partiendo de la descripción hecha a la estrategia propuesta por Bruce Merrifield y
pasando por los diferentes trabajos de autores que aportaron de una u otra manera
en el desarrollo de la temática, se realizará un recuento donde se presenta de
manera detallada y concisa los aportes más relevantes como procesos químicos,
nuevas resinas, grupos protectores, síntesis de macromoléculas, métodos de
purificación, protección ortogonal, péptidos como medicamentos y ligación química.
Palabras clave: Síntesis de péptidos, química Boc, química Fmoc, fragmentos
peptídicos, péptidos dendriméricos, péptidos con restricción conformacional,
síntesis convergente, síntesis divergente.
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INDICE
1. JUSTIFICACIÓN. ............................................................................................. 7
2. PREGUNTA PROBLEMA. ............................................................................... 8
3. OBJETIVOS. .................................................................................................... 9
3.1 Objetivo general. ................................................................................................. 9
3.2 Objetivos específicos. .......................................................................................... 9
4. METODOLOGÍA. ............................................................................................ 10
5. MARCO TEÓRICO. ........................................................................................ 12
5.1 Desarrollo histórico de la SPPS. ........................................................................ 12
5.2 Estrategias químicas para la SPPS. ................................................................. 14
5.2.1 Mecanismos de protección en la SPPS. ..................................................... 16
5.2.1.1 Estrategia Boc/Bzl. .............................................................................. 18
5.2.1.1 Estrategia Fmoc/tBu. ........................................................................... 20
5.3 Enfoques conformacionales. .............................................................................. 23
5.3.1 Enlaces Hidrazona...................................................................................... 23
5.3.2 Enlaces Disulfuro. ....................................................................................... 24
5.3.3 Ciclación. .................................................................................................... 25
5.4 Enfoques presentes en la síntesis de macromoléculas ramificadas. .................. 25
5.4.1 Macromoléculas ramificadas. ..................................................................... 26
5.4.2 Síntesis Convergente. ................................................................................ 29
5.4.3 Síntesis Divergente. .................................................................................... 31
5.5 Péptidos en la industria...................................................................................... 33
5.5.1 Industria farmacéutica. ............................................................................... 34
5.5.2 Métodos de diagnóstico. ............................................................................. 40
6. CONCLUSIONES. .......................................................................................... 43
7. BIBLIOGRAFÍA. ............................................................................................. 44
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ÍNDICE DE ILUSTRACIONES
Ilustración 1. Mecanismo general de las síntesis de péptidos en fase solida SPPS.
.............................................................................................................................. 16
Ilustración 2. Estruturas químicas de los grupos protectores Boc y Fmoc. ........... 17
Ilustración 3. Esbozo general de protección en la estrategia química Boc/Bzl. ..... 18
Ilustración 4. Mecanismo de desprotección estrategia química Boc. .................... 20
Ilustración 5. Representación de la química Fmoc/tBu. . ...................................... 21
Ilustración 6. Mecanismo de desprotección estrategia química Fmoc. ................. 23
Ilustración 7. Diversas estructuras dendriméricas. ................................................ 27
Ilustración 8. Formación de fragmentos peptídicos dendriméricos. ....................... 28
Ilustración 9. Esquema general de la síntesis convergente de péptidos en fase
sólida. .................................................................................................................... 30
Ilustración 10. Esquema de síntesis divergente .................................................... 32
INDICE DE TABLAS
Tabla 1. Principales investigaciones en MAP’s, entre los años 1990-1995……….36
Tabla 2. Principales fármacos biogenéricos, ingresos por año y casa
comercial………………………………………………………………………………….40
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ÍNDICE DE ABREVIACIONES
Acm, Acetamidometilo
API, Active Pharmaceutical Ingredients
Boc, tert-butiloxicarbonilo
BOP, Hexafluorofosfato de benzotriazol-1-il-N-oxi-tris(dimetilamino)fosfonio
Bzl, Bencilo
DBU, 1,8-diazobiciclo(5.4.0) undec-7-eno
DCM, Diclorometano
DIEA, Diisopropiletilamina
DTE, Ditioetano
Dnp, 2,4-dinitrofenilo
Fmoc, 9-Fluorenilmetiloxicarbonilo
HF, ácido fluorhídrico
MAP, Multi Antigenic Peptide
Npys, 3-nitro-2-piridinosulfenilo
Pmc, 2,2,5,7,8-pentametilcroman-6-sulfonilo,
SFPS, Solid-Phase Peptide Synthesis (siglas en ingles)
tBu, tert-butilo
TFA, Ácido Trifluoroacético
Tmob, 2,4,6-trimetoxibencilo
Trt, Tritilo
HBTU, N-óxido de hexafluorfosfato de N-[1H-benzotriazol-1-il)-
(dimetilamino)metileno]-Nnmetilmetanamino.
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1. JUSTIFICACIÓN.
Está monografía se realiza con el fin de abordar la historia y las diferentes
perspectivas de la síntesis de péptidos en fase sólida, así mismo permitirá a los
estudiantes de cursos como introducción a la ingeniería de proteínas, bioquímica y
biología molecular, comprender el desarrollo de las péptidos sintéticos y sus
aplicaciones.
La recopilación de información sobre la síntesis de péptidos en fase solida permite
tener claridad sobre el tema, del mismo modo lleva a reconocer los detalles más
relevantes de cada investigación que se propuso en una época específica y
diferenciar de manera clara los procesos químicos implementados. Por otro lado
los aportes de Merrifield fueron primordiales para la investigación en torno a la
síntesis de péptidos en fase sólida, ya que fue el primero en sintetizar un péptido
anclado a una resina en el año de 1963 [1]. Por lo tanto recopilar toda esta
información permite que los estudiantes vinculados tanto a la línea de síntesis de
péptidos como a los diferentes espacios académicos anteriormente mencionados,
tengan mayor claridad a la hora de abordar textos y artículos científicos cuando se
realice una investigación específica. Conocer el contexto histórico da las bases para
indagar sobre la una temática específica, ya que permite reconocer los diferentes
puntos de vista y los procesos experimentales implícitos en cada investigación; esto
permitirá tener claridad a la hora de proponer una metodología de trabajo.
Del mismo modo los estudiantes comprenderán los beneficios que presentan la
síntesis macromoléculas en las industrias de los medicamentos y métodos de
diagnóstico, por lo tanto se hace necesario desarrollar un texto que enfatice en esta
temática porque refuerza las bases en síntesis química e implícitamente permite
ampliar la visión sobre las aplicaciones que tienen los péptidos a nivel industrial.
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2. PREGUNTA PROBLEMA.
La ingeniería de péptidos es una rama de la ciencia que ha despertado fascinación
en los científicos, ya que permite abordar ciertas características en las proteínas
desde fragmentos cortos que se conocen como péptidos, los cuales cumplen
funciones específicas al interior de los organismos vivos.
La Universidad Distrital Francisco José de Caldas cuenta con una línea de
investigación relacionada con este tema, conocida como el Grupo de Investigación
en Proteómica y hace parte del proyecto curricular de Licenciatura en Biología.
Se ha observado que la información necesaria para esta línea de investigación no
está condesada en un solo lugar, por lo tanto recopilar ciertos datos que son de vital
importancia no es tarea fácil. Además al realizar búsquedas en gestores
bibliográficos no se logra identificar los textos que se deben tomar como referencia
en las diferentes investigaciones y cuáles permiten conocer las nuevas tendencias
en la síntesis de péptidos en fase sólida.
Por lo tanto estructurar un texto guía es de vital importancia para que los estudiantes
que pertenezcan a la línea de investigación de proteómica o que hagan parte de
materias como biología molecular, bioquímica e introducción a la ingeniería de
proteínas; pueden consultar este texto encontrando las bases teorías, el recuento
histórico y las nuevas tendencias en la síntesis de péptidos en fase sólida.
Por lo tanto la pregunta problema que da origen a esté trabajo escrito es la siguiente:
¿Es posible estructurar en un texto el contexto histórico y las nuevas tendencias de
la síntesis de péptidos en fase solida?
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3. OBJETIVOS.
3.1 Objetivo general.
Describir el desarrollo de la síntesis de péptidos en fase sólida, las estrategias
propuestas y las perspectivas de la aplicación de sus productos.
3.2 Objetivos específicos.
Describir el desarrollo histórico de la síntesis de péptidos en fase sólida, desde los
aportes hechos por Merrifield hasta la actualidad.
Identificar las características de las diferentes estrategias en la síntesis de péptidos
en fase sólida.
Presentar la bases químicas que soportan los enfoques conformacionales en la
síntesis de péptidos en fase sólida.
Describir los enfoques para la síntesis de macromoléculas ramificadas.
Recopilar ejemplos recientes que pongan en evidencia la importancia de los
péptidos a través de las aplicaciones en medicamentos y métodos de diagnóstico.
Elaborar un texto guía que contenga el desarrollo histórico de la síntesis de
péptidos, los procesos químicos implícitos, la química presente en la construcción
de macromoléculas y la importancia de los péptidos en la industria.
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4. METODOLOGÍA.
La metodología empleada la hora de realizar esta monografía se basó primero, en
dar solución a un problema identificado en la línea de investigación de proteómica,
el cual consiste en sintetizar la mayor cantidad de información referente a este tema
en un escrito. Para guiar en sus primeros pasos a los estudiantes, de la Universidad
Francisco José de Caldas, que deseen realizar investigaciones enfocadas en esta
línea de investigación.
El segundo paso fue realizar una búsqueda informática para corroborar que no
había un escrito con estas características. Debido a esta búsqueda se hallaron y
revisaron artículos que presentaban y describían la información. El siguiente paso
fue extraer y sintetizar de la manera más clara posible todo este cumulo de ideas,
referenciando cada una de ellas con sus respectivos autores, año de publicación,
medio en el que se publica (revista, congreso, etc.) y lo más importante el título de
dicho trabajo. Esta búsqueda bibliográfica fue exhaustiva y aunque en este trabajo
solo se referencian 122 títulos, fue de gran importancia revisar otras investigaciones
que no se citan pero si contribuyeron y guiaron en la búsqueda de artículos de gran
valía.
La organización temática se dio de esta manera. Primero, recuento histórico de los
acontecimientos más importantes en el desarrollo de la síntesis péptidos en fase
sólida. Segundo, las estrategias de síntesis más empleadas que se conocen como
estrategias químicas Fmoc y Boc. Tercero, las estrategias químicas para imitar los
enfoques conformacionales presentes en los epítopes y proteínas nativas. Cuarto,
La importancia de las macromoléculas ramificadas y sus enfoques de síntesis. Y
por último la importancia de los péptidos en la industria farmacéutica y en los
métodos de diagnóstico. Esta organización se decido gracias a la orientación
brindada por el profesor Julio Cesar Calvo que es Doctor en Ciencias de la
Universidad Nacional de Colombia y además es Postdoctor fellow otorgado en el
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Scripps Research Institute, La Jolla, CA, USA. Tambien se contó con la guía del
profesor y director del semillero de Investigación PhysicoChemie Miguel Ángel
Delgado, que cuenta con una maestría en educación de la universidad Santo
Tomas.
Por último se procedió a escribir el texto con la organización ya mencionada,
referenciando los trabajos más importantes sobre esta temática y formulando las
conclusiones finales que demuestran respaldan a los objetivos establecidos. Por lo
tanto la el problema de investigación se abordó y dio solución de manera integral.
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5. MARCO TEÓRICO.
5.1 Desarrollo histórico de la SPPS.
La síntesis de péptidos en fase solida es un campo de la ciencia reciente que ha
contribuido con el desarrollo de procesos químicos innovadores. Fue en el año
de1963 que Robert Bruce Merrifield logró obtener el primer tretapéptido anclado a
una resina de poliestireno, además en el año de 1964 introdujo el tert-
butiloxicarbonilo (Boc) como grupo protector de la función amino [1]. En los años
siguientes científicos de todo el mundo aportaron investigaciones que
complementaron el trabajo hecho por Merrifield.
En el año de 1967 Shumpei Sakakibara introdujo el fluoruro de hidrogeno anhidro
(HF) como reactivo para la acidólisis de algunos grupos protectores demostrando
que tenía un alto porcentaje de efectividad con respecto al bromuro de hidrógeno y
el ácido trifluoroacético. Para la manipulación del fluoruro de hidrogeno (HF)
Sakakibara y su grupo de trabajo crearon un equipo que permitió manipular de una
manera segura este reactivo, y así liberar el producto peptídico obtenido [2].
Para 1970 dos investigaciones adicionales se presentaron, una con el fin de mejorar
los tipos de resina y la otra se enfocó en el desarrollo de un nuevo protocolo de
síntesis. Pietta y Marshall desarrollaron una nueva resina para anclar el primer
aminoácido de la cadena peptídica, la cual se denomina benzhidrilamina
hidrocloridrato (BHA) [12]. Carpino y Han desarrollaron el nuevo protocolo de
síntesis, el cual se basó principalmente en la implementación del grupo 9-
fluorenilmetoxicarbonil (Fmoc), la característica principal de este grupo protector era
que se podía separar del producto peptídico con reactivos de carácter básico [9].
En el año de 1973 Su-Sung Wang desarrolló dos resinas con características
diferentes, la primera se conoce como p-alcoxibencil alcohol y es conveniente para
la síntesis de péptidos que posean un grupo carboxilo libre, la segunda resina se
conoce como p-alcoxibenciloxicarbonilhidrazida y es favorable en la síntesis de
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péptidos que presenten el grupo sulfonilo protegido [10]. En 1976 Burgus y Rivier
empleando la técnica de cromatografía liquida de alto rendimiento (HPLC) en fase
reversa purificaron fragmentos peptídicos obtenidos a partir de SPPS (Solid-Phase
Peptide Synthesis) utilizando el grupo protector Boc [15]. En el año 1977 George
Barany con ayuda de Merrifield propone la definición de esquemas de protección
ortogonal [13]. Johannes Meienhofer et al, propone en el año de 1978 la estrategia
Fmoc/tButil, donde la resina de anclaje era p-alcoxibencil alcohol y se protege el α-
amino de la cadena lateral con el grupo Fmoc o Boc, utilizando ácido trifluoroacético
(TFA) para separar el péptido de la resina [16].
En los años ochenta Richard Houghten propone dos tipos de síntesis de péptidos
que son la paralela simultánea y las bibliotecas peptídicas [21], estas bibliotecas
tienen importancia en la industria farmacéutica [16]. En 1987 Hans Rink introdujo
una nueva resina conocida como trialcoxidifenilmetilester (resina de Rink),
simultáneamente Peter Seiber desarrolló su propia resina que se conoce como
“xanthenyl linker” o resina de Seiber, para acoplar el primer aminoácido ambos
aplicaron la estrategia química Fmoc [15]. Para este mismo año Mergler et al,
desarrollo una resina compuesta de 2-metoxi-4-alcoxibencil alcohol denominada
SASRIN (Resina Súper Sensible Acida) [18]. En 1988 Barlos et al, propone una
resina para sintetizar péptidos ácidos a partir de protocolo Fmoc [17]. Para el mismo
año, J. P. Tam en fue uno de los pioneros en el desarrollo de estructuras dendríticas
a partir de monómeros de aminoácidos naturales, formado de esta manera péptidos
ramificados a los cuales nombro MAP (por sus siglas en inglés Multi Antigenic
Peptide) [71,72].
En los años noventa Paul Alewood y Stephen Kent introdujeron los protocolos de
rápida neutralización in situ para los procesos químicos Boc y Fmoc [18]. Hobbs de
Witt, Ellman y colaboradores para el año de 1993 desarrollan la síntesis rápida para
bibliotecas de péptidos cortos. Kent en el año de 1994 introduce la ligadura química
nativa para sintetizar proteínas y péptidos de gran tamaño; para este mismo año J.
Calvo investigador colombiano pública su investigación sobre la síntesis química de
14
epítopes funcionales en las proteínas [96]. En el año de 1996 se utilizan las
pseudoprolinas para minimizar la agregación de los aminoácidos en los fragmentos
peptídicos usando protocolo Fmoc [19,20].
En el año 2000 Gregory Verdine y Christian Schafmeister desarrollan los péptidos
grapa, que permiten modular las metas biológicas intracelulares dominantes y se
proyectan como nuevos fármacos [22]. Adolf Gogoll, entre otros, potencian la
síntesis de péptidos en fase solida implementando las microondas, debido a que las
microondas interactúan a nivel molecular con los fragmentos peptídicos y así el
acople de los aminoácidos es más eficiente [23]. Para el 2003 se propone la síntesis
paso a paso de péptidos largos, aproximadamente 100 aminoácidos, por medio de
protocolos Fmoc [21]. En el año 2007 Se sintetiza primer el dímero covalente de la
enzima proteasa HIV-1 por medio del método de ligación química nativa [24].
Las contribuciones que se mencionaron anteriormente sobre la síntesis química de
péptidos en fase solida demuestran que el desarrollo más significativo de esta rama
de la química se dio en cincuenta años e involucro a investigadores de talla mundial.
Del mismo modo se contribuyó en el desarrollo de diversas áreas como síntesis
orgánica, metodologías específicas, tratamientos médicos, optimización industrial,
entre otros campos.
5.2 Estrategias químicas para la SPPS.
Los procesos químicos presentes en la SPPS tienen como base la síntesis química
orgánica, la cual lleva aproximadamente un siglo de investigaciones y trabajo
científico, lo que permite el desarrollo de diferentes rutas sintéticas para la obtención
de un mismo producto; por lo tanto el proceso de síntesis que se desarrolle va de
acuerdo con las necesidades de cada investigación. De acuerdo con lo anterior se
conocen varios métodos para la obtención de péptidos que son la tecnología del
ácido desoxirribonucleico recombinante, la síntesis enzimática, la transgénesis y la
síntesis química [26]. Por medio de la síntesis química se presentan mayores
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beneficios estructurales en los fragmentos peptídicos, por lo tanto el impacto en la
comunidad científica ha sido favorable, generando nuevas moléculas para
posteriormente crear propiedad intelectual de dicho producto [26].
El desarrollo de la SPPS ha derivado en la simplicidad para obtener fragmentos
peptídicos, debido a que el tiempo de síntesis y purificación de un producto requiere
menos tiempo en comparación con la síntesis de péptidos en disolución [27]. El
desarrollo farmacéutico se fortaleció con la aplicación de la técnica SPPS, ya que
se han podido construir diversas moléculas, aportando herramientas en la
investigación preclínica y fomentando la producción de componentes activos en
fármacos [29, 30]. Una de las investigaciones más relevantes se dio con la
producción del péptido Fuseón, compuesto por 36 aminoácidos, el cual se destinó
para el tratamiento del síndrome de inmunodeficiencia adquirida humano [28].
Presentando resultados de gran valía y al mismo tiempo abriendo una brecha en la
producción diversas biomoléculas tales como los oligosacáridos y los
oligonucleótidos [30, 31, 32].
La base química de la SPPS radica fundamentalmente en acoplar por medio de un
enlace covalente del grupo amino, del aminoácido dado, al extremo c presente en
una resina insoluble y posteriormente prolongar la cadena peptídica, partiendo del
primer aminoácido enlazado a la resina, por medio del acoplamiento sucesivo de
aminoácidos específicos en donde se protegen y desprotegen los grupos α-amino
correspondientes. En esta reacción de acoplamiento se debe tener en cuenta la
protección de los grupos reactivos presentes en los aminoácidos, debido a que se
necesita una alta especificidad en la obtención de los productos peptídicos. Por lo
tanto se hace uso de una serie de protectores temporales para el grupo α-amino,
los cuales se eliminan en cada paso de desprotección, al mismo tiempo se utiliza
una protección permanente para los grupos reactivos presentes en la cadenas
laterales de los aminoácidos, que posteriormente se eliminan al culminar la síntesis
[28].
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En la SPPS la longitud de los fragmentos peptídicos tiene profunda relevancia
porque determina la metodología que se va a implementar. Para los productos
menores o iguales de 40 aminoácidos se hace uso de la síntesis por pasos (Figura
1) y para fragmentos más prolongados de emplea la síntesis convergente [33]. Esta
última permite acoplar cadenas peptídicas, de 40 o menos aminoácidos acopladas
por medio de la síntesis por pasos, purificándolas y posteriormente uniéndolas
covalentemente entre sí mediante la activación del grupo carboxilo o con reacciones
químicas específicas para así obtener el producto deseado.
Ilustración 1. Mecanismo general de las síntesis de péptidos en fase solida SPPS.
5.2.1 Mecanismos de protección en la SPPS.
En la SPPS es necesario la protección de los grupos funcionales presentes en
los aminoácidos debido a que pueden reaccionar y dar paso a la formación de
productos no deseados, esto se debe a la reactividad de carácter nucleófílo del
alfa-amino [39-40]. De igual forma, las cadenas laterales se protegen para no
permitir que estas reaccionen con los grupos carboxilo o amino de otros
aminoácidos. Los grupos protectores también cumplen la función de proteger el
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carbono alfa, debido a que este es susceptible en gran medida a presentar
racemización [35].
Las principales características que deben presentar los grupos protectores es,
ser químicamente estables en el medio (ácido o básico) en que se desarrolla la
síntesis, y ser fácilmente removibles en condiciones que no alteren la formación
del enlace peptídico durante o al finalizar la síntesis [36,37]. En consecuencia,
se conocen diferentes tipos de grupos protectores, tanto para el grupo amino
como para las cadenas laterales, pero son las estrategias Boc-Bencilo (Boc/Bzl)
[1,36] y Fmoc-terc-butilo (Fmoc/tBu) [34,35] las que más se emplean para la
SPPS debido a que cumplen con las condiciones ya mencionadas. Los
procesos químicos presentes en cada una de las estrategias tienen diferencias
marcadas debido a que el grupo tert-butiloxicarbonilo (Boc) es labil en medio
ácido [36] y el grupo 9-fluorenilmetiloxicarbonilo (Fmoc) es lábil en medio básico
(figura 2) [9].
R
NH
O
O
CH3
CH3
CH3
Grupo Boc
R
NH
O
O
Fmoc
Ilustración 2. Estruturas químicas de los grupos protectores Boc y Fmoc.
Cabe mencionar que los grupos protectores antes citados poseen una
estabilidad óptica alta, por lo tanto inhiben la racemización de los centros
quirales que son adyacentes a ellos, esta cualidad se debe a que son derivados
del uretano [40,41,42], estas características fueron ampliamente estudias por
Leonidas Zervas y Max Bergmann [42,43].
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5.2.1.1 Estrategia Boc/Bzl.
La estrategia química Boc/Bzl fue desarrollada por Robert Bruce Merrifield, en
donde plantea que el primer aminoácido de la serie sea anclado a un polímero
solido por medio de un enlace covalente para posteriormente unir
secuencialmente los aminoácidos correspondientes; al finalizar la síntesis se
separa el producto peptídico del polímero, teniendo en cuenta que este no es
soluble con ningún reactivo que se emplea durante la síntesis [1,49]. Las
ventajas que presenta este procedimiento es que las impurezas, que resultan
de las reacciones, no se tienen que recristalizar ya que se disuelven en los
diferentes reactivos implicados en la síntesis. Esto provocó una reducción
considerable en los tiempos de trabajo y así mismo abrió la posibilidad de
desarrollar productos peptídicos más complejos [1,49]. El tratamiento químico
para la estrategia Boc/Bzl se caracteriza por desarrollarse en medio ácido
debido a la continua reactividad de los grupos protectores [46,47], como se
presenta en la figura 3.
PAM
HF
2-CIZ
cHex
Boc
HF
OO
NH
O
O
O
NH
O
NH
O
ONH
O
O
O
NHR
CH3
CH3
CH3
CH3
Cl
RTFA
Ilustración 3. Esbozo general de protección en la estrategia química Boc/Bzl, empelando la resina
PAM (ácido p-hidroximetilfenilacético). Se observan los puntos de corte de los ácidos TFA y HF por
medio de flechas, que representan la eliminación de los grupos temporales y permanentes [27].
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En la estrategia Boc/Bzl, el grupo Boc se emplea para la protección temporal de
los α-amino, este se elimina por tratamiento con ácido trifluoroacético TFA, a
concentraciones entre 25-50% en diclorometano DCM [44,45]. El tratamiento
con TFA genera que la amina quede protonada, dando paso a especies tales
como iones de carbonio tert-butilo que pueden reaccionar para formar aductos
de isopreno y terc-butilo, por lo tanto se debe neutralizar para llevar a cabo el
siguiente acople y evitar la formación de especies indeseadas [50,51].
Aminoácidos tales como el triptófano, cisteína o metionina pueden reaccionar
con los iones terc-butilo y dar paso a productos peptídicos secundarios. Para
evitar la formación de especies no deseadas se adiciona ditioetano (DTE) al 5%,
que neutraliza los cationes de terc-butilo [50].
En la figura 4 se observa que el grupo Boc se elimina por tratamiento con TFA
dando paso a la formación de una sal entre la amina desprotegida y el TFA.
Para que el acople con el siguiente aminoácido se pueda llevar a cabo es
necesario dejar la amina libre, por lo tanto se trata el péptido con una solución
del 50% diisopropiletilamina (DIEA) en diclorometano (DCM), realizando
lavados sucesivos [45]. Cabe mencionar que las neutralizaciones in situ
optimizan el tiempo requerido para esta misma, los protocolos químicos
reportados en la literatura son BOP/DIEA [50] y HBTU [51].
20
TFA
TFACO2+
CH3
CH3
CH3
C+ Nuc
+CH2
CH3
CH3
CH3
CH3
CH3
Nuc
OH R
OO NH
O
R
O
OH+
OCH3
CH3CH3
NH
O
R
O
O
OCH3
CH3CH3
NH
O
NH3
+O
O
Ilustración 4. Mecanismo de desprotección estrategia química Boc.
De igual modo las cadenas laterales, presentes en los diversos aminoácidos,
se protegen con el grupo bencilo (Bzl). Esto se debe a la reactividad
característica de las cadenas laterales. Para neutralizar el grupo protector
bencilo (Bzl) se emplean ácidos fuertes como el fluoruro de hidrogeno (HF), pero
se debe tener en cuenta la formación carbocationes, por lo tanto es necesario
la presencia de agentes nucleófilos aptos para el medio en el que se desarrolla
la reacción [36]. No obstante, se pueden emplear diversos protectores en la
estrategia Boc, como lo son el 3-nitro-2-piridinosulfenilo (Npys), el 2,4-
dinitrofenilo (Dnp), el acetamidometilo (Acm) y el formilo, siendo estables en
ácidos fuertes para posteriormente ser eliminados al desanclar el péptido [52].
5.2.1.1 Estrategia Fmoc/tBu.
La estrategia química Fmoc/tBu fue desarrollada por Carpino y Han debido a
que ciertos fragmentos peptídicos son poco estables en condiciones ácidas [9],
por lo tanto el ambiente en que se desarrolla la síntesis es químicamente menos
agresivo con los péptidos a obtener [28]. El mecanismo de protección implícito
consiste en resguardar el alfa-amino con el grupo Fmoc, que es estable en
medio ácido, y las cadenas laterales con grupos tert-butilo (tBu) o Tritilo
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(trifenilmetilo) [53]. Por lo tanto la química Fmoc/tBu abrió la brecha para
desarrollar a fondo la protección ortogonal, la cual consiste en eliminar los
grupos protectores en diferente orden y empleando diversos mecanismos [34].
En la figura 5 podemos observar los diferentes puntos de corte ya que el grupo
Fmoc es lábil en medio básico y los grupos tBu y trifenil en medio ácido. Por lo
general en cada paso de desprotección la ortogonalidad se despliega en tres o
cuatro dimensiones, mediante el empleo de grupos protectores específicos con
espaciadores que se eliminan por medio de Pd0, hidracina, tioles e iones
metálicos [62,63]. La característica principal de los esquemas ortogonales es el
desarrollo y obtención de moléculas complejas, debido a que estos son menos
agresivos por la desprotección selectiva que los caracteriza [100].
BAL
TFA
Alil
Pd (0)
O
NH
CH3
O
NH
CH3
CH3
CH3
O
NH
O
O
N
O
O
OR
O
NH
CH3
CH3
CH2
O
O
O
NH
CH3
CH3 CH3
O
O
TFA
Bocter-Butil
Fmoc
Piperidina
Ilustración 5. Representación de la química Fmoc/tBu. Se representan los puntos de corte debido al
ácido TFA y al Pd 0 con flechas [27].
Para la protección específica de las cadenas laterales de los aminoácidos se
emplea el grupo tert-butilo, tritilo (Trt), el 2,2,5,7,8-pentametilcroman-6-sulfonilo
(Pmc), 2,4,6-trimetoxibencilo (Tmob) y algunos grupos específicos más [64].
Para eliminar los grupos ya mencionados se hace uso de TFA, no es necesario
emplear ácidos fuertes debido a que el TFA elimina los grupos protectores y
22
desancla el péptido de la resina, en presencia de agentes nucleófilos pertinentes
los cuales se encargan de capturar los carbocationes que aparecen en los
diferentes pasos de la síntesis [65].
El mecanismo de desprotección en la quimica Fmoc se desarrolla al eliminar
este grupo por medio de una base que separa el protón relativamente ácido del
anillo perteneciente al grupo fluorenilo [9,57,66]. Esto permite que se lleve
acabo la beta-eliminación y simultaneamente se forma dibenzofulveno y dióxido
de carbono como se observa en la figura 6 [57,66]. La base que se emplea en
el proceso de desprotección es la piperidina,a concentraciones entre el 20 y 50
% en dimetilformamida (DMF), ya que esta captura el grupo Fmoc y el
divenzofulveno [9,57]. Este ultimo compuesto es indispensable que se elimine
debido a que tiende a formar subproductos por su reactividad electrofila,
formando subproductos con las aminas desprotegidas que hacen parte del
peptido que esta anclado a la resina, para llevar a cabo este lavado se emplea
una solucion de 2% DBU (1,8-diazobiciclo(5.4.0) undec-7-eno [9,57] en DMF y
piperidina al 2 %.
NH
R
O
ONH O
O
H
R
O
ON O
O
H
R
O
ON
H
H
CH2
++ CO2
N
H
N
Divenzofulveno
23
Ilustración 6. Mecanismo de desprotección estrategia química Fmoc.
5.3 Enfoques conformacionales.
Los avances y aciertos en la síntesis de péptidos en fase solida han mostrado el
camino a diferentes cuestiones que se deben resolver. Una de ellas es poder
imitar las estructuras tridimensionales en la conformación de las proteínas, ya
que al revisar estas estructuras más a fondo se encuentra que hay de diversos
tipos [90,91]. Por lo tanto al sintetizar fragmentos peptídicos que imitan los
epítopes de las proteínas se debe tener en cuenta su estructura tridimensional si
se espera obtener altos porcentajes en su función antígena y en la respuesta del
individuo.
Uno de los pioneros en proponer un problema acerca de este fenómeno fue
Anfisen en 1973, concluyendo que la energía de unión de un fragmento peptídico
a un anticuerpo se ve afectada por la estructura conformacional del mismo. Por
lo tanto la afinidad de unión entre las cavidades sintéticas y los receptores
aumenta si se restringen en su conformación los fragmentos peptídicos [92].
La restricción conformacional de los fragmentos peptídicos represento un avance
muy importante, ya que permite que estos fragmentos imiten los epítopes nativos
de las proteínas. Diversos métodos se han propuesto para llevar acabo la
restricción conformacional entre los cuales están los enlaces hidrazona,
formación de enlaces disulfuro, la ciclación por reacciones de condensación
amida y sistemas anulares para permitir la formación de las diversas estructuras
que son alfa hélices, “loop” o bucle, laminas beta y “turns” (hebras conectoras)
[7,93].
5.3.1 Enlaces Hidrazona
Las formas características en las proteínas en gran medida se deben a la
interacción de los puentes de hidrogeno, por lo tanto es necesario imitar estos
tipos de enlace con el fin de lograr recrear las estructuras deseadas. Uno de
24
estos enfoques de conformación se basa en reemplazar un enlace de
hidrogeno por medio de un enlace hidrazona, para obtener una estructura de
alfa hélice [95]. Para llevar a cabo este proceso se hace necesario introducir
durante la síntesis diversos ligandos como lo son el ácido 5,5-dimetoxi-1-
pentanioco (J) y el ácido-propilideno-2-Fmochidrazinoacetico (Fmoc-Z) [94,
95,96].
Esta metodología fue ampliamente descrita por Julio Calvo y colaboradores en
el año 2003. En este informe presentan la síntesis del péptido HPV16-E7 con
restricción conformacional de alfa hélice y además un “loop” o bucle, las cuales
están presenten en la estructura nativa de la proteína que proviene del virus
del papiloma humano (VPH). Los resultados serológicos de esta investigación
fueron de alto impacto, debido a que el 68 % de los pacientes sometidos a la
estructura alfa hélice reconocieron esta estructura y el 41 % de los pacientes
reconocieron la estructura “loop”. Por ende el porcentaje de reconocimiento
aumento al 77%.
5.3.2 Enlaces Disulfuro.
Los puentes disulfuro son de gran importancia en la estructura y plegamiento
de las proteínas, y aun aparecen en moléculas como enzimas, hormonas,
toxinas e inmunoglobulinas [118]. Para la síntesis de péptidos es importante
imitar, como se habló anteriormente, la conformación espacial nativa de
diversos fragmentos peptídicos porque optimiza la función antígena para la
cual se desarrolló el producto sintético.
Una de las características propias de los enlaces disulfuro es la formación de
bucles. Por lo tanto se presentan tres enfoques para la formación de estos
enlaces, donde el principal aminoácido es la cisteína. El primer enfoque
consiste en emparejar dos residuos de cisteína cuando tienen el mismo grupo
protector y por medio de oxidación con oxígeno molecular, en presencia de
25
otros reactivos apropiados; se obtiene el puente disulfuro [118]. El segundo
enfoque consiste en oxidar lo grupos protectores con yodo u otros reactivos
electrófilos alternativos y así generar el directamente el enlace disulfuro [119].
Por último se presenta el tercer enfoque que requiere de dos grupo
protectores, uno para cada cisteína, en donde se puede escindir
selectivamente uno de los grupos protectores (característica ortogonal) y por
medio de una reacción de desplazamiento se obtienen el enlace [94, 118].
5.3.3 Ciclación.
Los péptidos sintéticos cíclicos se presentaron como una opción
conformacional para los diversos productos que se estaban presentando a
nivel mundial, ya que se había descrito en diferentes trabajos la importancia
de imitar la estructura tridimensional de los epítopes nativos. Principalmente la
estrategia de ciclar péptidos sintéticos permite imitar la estructura β-turn que
permite cambiar de orientación los fragmentos peptídicos [121].
Una publicación muy completa sobre este enfoque fue presentada por
Romanovskis y Spatola en año de 1998 [121]. La principal conclusión a la que
se llego fue la formación del ciclo Pro-Xxx-Lys-Arg-Gly-Asp, en la posición Xxx
pueden estar alanina, serina, leucina o tirosina. Para la obtención de este
producto peptídico se emplearon los grupos protectores Fmoc, Boc y éster de
paranitro bencilo (ONB). Este último fue destinado para la protección del α-
carbonilo, describiendo un enfoque ortogonal ya que se puede escindir este
por medio de cloruro de estaño (SnCl2) [121, 122].
5.4 Enfoques presentes en la síntesis de macromoléculas ramificadas.
Uno de los campos de acción recientemente abordado en diversas ramas de la
ciencia es el estudio de las proteínas, enfocado en comprensión de las funciones
hormonal, interacciones enzima-sustrato, antígeno-anticuerpo y proteína-ADN
26
[58, 69, 60], por lo tanto se ha buscado aislar proteínas de fuentes naturales con
procesos laboriosos y sin porcentajes interesantes del producto proteico.
Las recientes investigaciones en el desarrollo de péptidos sintéticos se han ido
enfocando hacia la construcción de macromoléculas, debido a que ellas poseen
un alto impacto en las áreas de la bioquímica y la biomedicina, presentando
resultados experimentales a niveles considerables [67]. Esto se debe a la
producción de proteínas artificiales mediante diversos procesos químicos, pero
el factor determinante es la comprensión de las diversas estructuras y como estas
funcionan en los organismos vivos.
Así mismo el desarrollo de la síntesis de péptidos en fase sólida como un campo
de investigación emergente en el mundo de la química, ha permitido encontrar
diversas soluciones en lo que se refiere al comportamiento de las proteínas.
Aunque los péptidos son cadenas de aminoácidos más cortas que las proteínas,
se ha determinado que son indispensables en el funcionamiento de estas últimas.
Ya que las proteínas presentan diversidad de pliegues y formas predeterminadas
que les permiten un funcionamiento óptimo, también cuentan con regiones
especializadas que se conocen como epítopes y motivos [67]. Los epítopes son
regiones de aproximadamente 4 a 21 residuos de aminoácidos que cumplen una
función antígena [67].
Para la síntesis de moléculas ramificadas es relevante conocer la función
fisiológica y secuencia de los epítopes presentes en las proteínas, porque
permitirá que el producto obtenido (macromolécula) cumpla una función
determinada. Del mismo modo se debe tener en cuenta que tipo de aminoácidos
se van a emplear durante la síntesis, ya que deben cumplir con ciertas
características específicas que ayuden a la obtención del producto deseado.
5.4.1 Macromoléculas ramificadas.
27
Todas las macromoléculas ramificadas comparten un diseño similar en el cual
se conjuga un péptido sintético, con acción antígena, a un polímero de
naturaleza similar o a una proteína conocida que les permite tener diversas
estructuras. La diversidad de formas que adquieren los productos sintetizados
poseen un carácter dendrimérico, esto quiere decir que el diseño de ramificación
que parte de una matriz de núcleo similar para todos los casos.
La estructura dendrimérica se encuentra generalizada en la naturaleza y el
diseño de macromoléculas no es la excepción. El diseño y de compuestos con
formas dendriméricas es un campo de acción reciente ya que los primeros
trabajos que reportaron el diseño de una estructura dendrítica fue en el año
1978 [68,69]. En principio estas moléculas se denominaron “moléculas en
cascada” por el Vögtle y sus colaboradores. La aplicación de estas moléculas
se dio en primera instancia en la industria de los polímeros, un claro ejemplo de
esto fue la construcción de recipientes moleculares para moléculas de menor
tamaño. Para los años ochenta el grupo de investigación a cargo de Tomalia,
conocido como Dow Chemicals, profundizo y desarrollo este tipo de moléculas.
Con el pasar del tiempo enfocaron sus investigaciones en la construcción de
una nueva clase de amida que contenía polímeros en cascada, esta nueva
macromolécula le fue dado el nombre de “dendrímeros”, palabra que viene del
griego “dendros” que significa árbol o rama y “meros” que significa parte
[68.69,70]. Se conocen diversas estructuras dendriméricas que se presentan en
la figura 7.
Ilustración 7. Diversas estructuras dendriméricas.
28
Simultáneamente la química molecular se interesó por este nuevo enfoque, J.
P. Tam en el año de 1988 fue uno de los pioneros en desarrollar una estructura
dendrítica a partir de monómeros de aminoácidos naturales, formado de esta
manera péptidos ramificados a los cuales se les dio el nombre de MAP ( por sus
siglas en inglés Multi Antigenic Peptide) [71,72]. Una de las características más
importantes que presento este nuevo enfoque fue la construcción de
macromoléculas de más de 10 kD (80-100 aminoácidos) ya que los productos
obtenidos podían superar los 20kD [25]. Estas moléculas dendriméricas se
conocen comúnmente como “arboles”, polímeros “arborescentes” o polímeros
“hiperramifacados” [73].
James P. Tam por medio de sus investigaciones desarrollo fragmentos
peptídicos cognados de proteínas nativas [84]. El objetivo principal de Tam era
construir antígenos peptídicos y vacunas que produjeran una respuesta más
eficiente en humanos, por lo tanto plateo y describió el desarrollo de los
sistemas MAP’s. El cual consiste en que a partir de una matriz de peptidilo se
unen secuencialmente fragmentos peptídicos que se distribuyen radialmente
como brazos dendríticos [87], como se observa en la figura 8.
Ilustración 8. Formación de fragmentos peptídicos dendriméricos [97].
El estudio de Tam se basó en un núcleo de heptalisina el cual contiene ocho
brazos dendríticos de aproximadamente de 9-16 aminoácidos [89]. Empleando
29
la síntesis de péptidos en fase sólida y posteriormente realiza un proceso de
purificación sencillo, que no afecta el producto peptídico [90]. Finalmente se
empleó este fragmento como un antígeno inmunizante, dejando de lado la
conjugación del péptido a un portador [86]. Otro aporte interesante fue
presentado J. C. Calvo investigador colombiano, en donde proponen construir
un doble dímero para el péptido 1513 de secuencia GYSLFQKEKM-
VLNEGTSGTA [25]. Uno de los grandes aportes de esta investigación fue el
hecho de que los 12 primeros aminoácidos eran parte de la vacuna sintética
para la malaria [25].
Con respecto a la arquitectura de las moléculas ramificadas se presentan dos
enfoques de síntesis que difieren en la forma de construcción de la molécula,
estos enfoques se conocen como convergente y divergente, los cuales se
abordan a continuación.
5.4.2 Síntesis Convergente.
La síntesis convergente surgió como una alternativa para construir moléculas
complejas que presentaran un respuesta biológica, ya que la síntesis
convencional de fragmentos peptídicos lineales presentaba diversos problemas
a la hora de construir moléculas de más de 100 residuos de aminoácidos debido
a la formación de intermediarios indeseados que afectaban la purificación y
aislamiento del producto deseado [73,76].
La propuesta de la síntesis convergente se desarrolló bajo el enfoque de
construir secuencias mediante el acople de fragmentos peptídicos totalmente
purificados y caracterizados en un soporte sólido (figura 9). Las ventajas que
presenta este tipo de síntesis son las mismas que se presentan en la SPPS más
la purificación y caracterización de los productos intermediarios presentes,
permitiendo que el producto final sea el esperado, con porcentajes de purea del
80 al 90% [72,75].
30
Ilustración 9. Esquema general de la síntesis convergente de péptidos en fase sólida [84].
En la síntesis de fragmentos peptídicos protegidos se basa en separar el péptido
de la resina bajo condiciones que no permitan eliminar ningún grupo protector
[74]. Este es uno de los requisitos más importantes en la CSPPS ya que en la
SPPS lineal el producto peptídico se separa de la resina con tratamiento ácido
y así mismo se eliminan todos los grupos protectores, en consecuencia este
fragmento no es útil para la síntesis convergente [76, 77,78]. Por lo tanto se han
desarrollado mecanismos alternativos en donde se puede separar el producto
péptico sin afectar los grupos protectores laterales; tales mecanismos son la
saponificación o trastesterificación, esto permite que el enlace péptido-resina
pueda modificarse químicamente y así selectivamente se puede escindir del
fragmento peptídico [79,80]. El éxito de la CSPPS radica en la estabilidad de las
condiciones implícitas para llevar a cabo la síntesis del fragmento peptídico y
las condiciones necesarias para que al momento de separar el segmento
31
deseado el rendimiento sea alto, del mismo modo se debe evitar la
epimerización del C-terminal, por tal razón las condiciones de síntesis son
suaves [81,83,84].
Otra característica importante de esta técnica de síntesis es la compatibilidad
entre los diversos grupos protectores ya que es importante poder eliminar un
grupo protector en presencia de otro. Este esquema de protección conocido
como ortogonal fue presentado por Merifield y Barany, en el cual plantean que
diversos grupos protectores se pueden eliminar en cualquier orden y en
presencia de los demás grupos protectores [63].
Es de gran importancia conocer qué tipo de estrategia se empleara a la hora de
construir los fragmentos peptídicos ya que de esto depende que tipo de
reactivos se van a emplear a la hora de escindir el péptido de la resina [85]. Es
claro que a la hora de emplear la estrategia Boc/Bzl es indispensable la
acidólisis para separar el péptido de la resina, pero si se pretende emplear tal
producto en la síntesis convergente de una macromolécula, se debe tener en
cuenta que el mejor mecanismo para la escisión del péptido es por fotolisis o
con la intervención de una base [86]. Por otro lado si se emplea la estrategia
Fmoc/tBu, la escisión del enlace péptido-resina no se puede realizar por
métodos básicos; se debe emplear acidólisis suave, tiólisis o transferencia de
grupos aliados, dependiendo del fragmento a sintetizar y del mecanismo de
protección empleado [87].
5.4.3 Síntesis Divergente.
La síntesis divergente de péptidos es un enfoque empleado para obtener
fragmentos peptídicos y se basa principalmente en construir la molécula
deseada de manera escalonada, teniendo como origen un núcleo definido y así
expandirse hacia la periferia (figura 10). En el proceso de formación del producto
peptídico se llevan a cabo dos sencillos pasos, el primero consiste en acoplar
32
el monómero a la resina, y segundo desproteger el extremo funcional del
monómero, con el fin de generar cierta reactividad y generar un enlace
monómero-monómero. Este enfoque presenta cierta similitud con la síntesis
natural de proteínas y péptidos, por lo cual ramas de la ciencia como la
bioquímica y microbiología se interesaron en ella [97].
Ilustración 10. Esquema de síntesis divergente [99].
La metodología empleada en la síntesis divergente es similar a la propuesta por
Merrifield en 1963. Esto quiere decir que los grupos protectores, los soportes y
los mecanismos de escisión se pueden aplicar como patrones en la síntesis
divergente de dendrímeros peptídicos.
La síntesis divergente en fase solida de péptidos inicialmente presento
fragmentos peptídicos partiendo del amino ácido conocido como Lisina, debido
a que este posee dos grupos amino funcionales [72]. Debido a esta
característica se construían estructuras con formas de dendron, ya que
secuencialmente se acoplaban los fragmentos de lisina, protegidos con dos
grupos Boc o Fmoc. En el año de 1998 el equipo de Goodman presento un
modelo de síntesis novedoso y el cual encamino la síntesis divergente en el
33
desarrollo de nuevas macromoléculas funcionales. Este novedoso enfoque se
basa principalmente en reemplazar monómeros presentes en la estructura del
colágeno para conocer su funcionamiento, aumentar su elasticidad y poder
obtener colágeno sintético. Los monómeros de colágeno están constituidos por
unidades funcionales Gly-XY, que contienen glicina (Glys) en una proporción de
un tercio del total de fragmentos de aminoácidos, por lo tanto tales unidades se
produjeron sintéticamente y se acoplaron utilizando el ácido tircarboxilico Kemp
arrojando resultandos muy interesantes [98].
Uno de los grandes inconvenientes que presenta esta estrategia de síntesis es
la agregación entre cadenas, esto se debe a que la cantidad de monómeros
aumenta y así mismo aumenta la reactividad al interior de la molécula. Por lo
tanto la cantidad de aminoácido que se emplea en la síntesis divergente es
aproximadamente de 0,1 mmol por gramo de resina, esta cantidad es
significativamente más baja que en la síntesis de fase solida convencional ya
que las cantidades que se emplean son entre 0,3 mmol y 0.8 mmol por gramo
de resina [99]. Otros factores a tener en cuenta son la formación de enlaces de
hidrógenos intercanetarios y la agregación de eliminadores aromáticos [99].
El esquema de síntesis divergente permite realizar variaciones tales que se
pueden sintetizar dos cadenas peptídicas similares en diferentes brazos de la
unidad de ramificación. Esta particular variación resulta útil en la síntesis de
inmunógenos que poseen diversos tipos de epítopes funcionales. Esto requiere
de un mecanismo de protección ortogonal, por lo tanto en la síntesis de estos
fragmentos peptídicos se utiliza tanto la protección de grupos Boc como Fmoc,
ya que las condiciones acidas no afectan el grupo Fmoc y su función, y del
mismo modo ocurre con el grupo Boc en condiciones básicas.
5.5 Péptidos en la industria.
34
La evolución de la SPPS ha permitido que la industria en general se interese por
sus beneficios e incremento en el bienestar humano, sin dejar a un lado que genera
ingresos económicos bastante interesantes. Por ende las industrias agrícola,
farmacéutica y médica han enfocado esfuerzos en desarrollar estrategias y
productos con un alto porcentaje de eficiencia. Los beneficios de estas
investigaciones han sido de gran valía porque han llevado al desarrollo de vacunas,
métodos de diagnóstico y otros aportes significativos.
5.5.1 Industria farmacéutica.
La industria farmacéutica ha sido una de las más beneficiadas con las
investigaciones derivadas de la SPPS, esto se debe a que algunos péptidos
presentan funciones antígenas en los organismos vivos, por ende se empleó
esta característica en el desarrollo de vacunas contra diversas enfermedades.
Otras de sus características son la baja toxicidad y los pocos efectos
secundarios. Por otro lado sus residuos no se acumulan en el organismo debido
a que su vida media es baja. Por estas y otras características los péptidos
sintéticos abarcan seis categorías de estudio y/o aplicación, las cuales abarcan
los antibióticos o antifúngicos, las enfermedades cardiovasculares, el cáncer,
desordenes en el sistema inmune y desordenes neuronales [101].
Los productos sintéticos de más relevancia son conocidos como los MAP’s (por
sus siglas en inglés, Multi-Antigenic Peptide), desarrollados por James P. Tam
en la década de los ochenta. Estas macromoléculas poseen características
especializadas ya que cumplen con la función de crear una respuesta antígena,
esto quiere decir que induce al organismo a formar anticuerpos, lo que permitió
desarrollar diversos tipos de vacunas. La estructura química generalmente
controlada de los MAP’s permitió identificar la generación de anticuerpos
específicos, por lo tanto se convirtió en un método reconocido. Empresas
especializadas en distribución de productos peptídicos ofrecieron desde
reactivos hasta servicios para sintetizar fragmentos peptídicos [67].
35
Diversas investigaciones se conocen al respecto y en su momento generaron
patentes generando así un nuevo enfoque en el tratamiento de diversas
enfermedades. En el año de 1988 se desarrolló el antígeno para Proteína Cs
Plasmodium Bergei, que corresponde a uno de los diversos tipos de malaria
[108]. Para el año de 1989 se presentaron tres investigaciones muy interesantes;
Tam y Lu desarrollaron la superficie antigénica para la hepatitis B, Lankinen y su
equipo de trabajo desarrollaron la reductasa para el virus del herpes simple y,
Wong y colaboradores presentaron la proteína Trp presente en el género
Drosophila. En la década de los noventa las investigaciones tienen un
incremento considerable ya que se presentaron alrededor de 70 trabajos, sobre
antígenos, en los primeros cinco años. En la tabla 1 se presentan las diversas
investigaciones, la fecha de publicación y sus principales autores Cabe
mencionar que para el año de 1990 la cantidad de péptidos sintéticos que se
habían comercializado no superaba la decena.
Tabla 1. Principales investigaciones en MAP’s, entre los años 1990-1995 [84]
Antígeno Año de Publicación Autores
Proteína CS, plasmodium
bergei
1990 Migliori, Zavala y Chai
1992 Windmann et al y Chai et al.
1993 Migliori
1994 Valmori et al.
Proteína CS, plasmodium malarie
1990 Del Guidice et al.
Proteína CS, plasmodium falciparium
1991 Munesinghe et al., Pessi et al.
1992 Valmori et al., Calvo-Calle et al.
1993 Calvo-Calle et al., Nardin y
Nussenzweig
1994 De Oliveira et al.
1995 Ahlborg
Proteína CS, plasmodium yoelii 1995 Wang et al.
36
Antígeno de superficie, hepatitis B
1993 Manivel et al.
Herpes simple tipo 1, gen UL47, UL8, Vmw63 y UL42
1990 Mc Lean et al.
1993 Parry et al.
1994 Sinclair et al., Marsden et al,
Lutrophin, humano 1990 Troalen et al.
Proteína Ribosomal, plantas 1990 Szymkowski y Deering
Motivos tamdem repetitivos, Leishmania
1990 Liew et al.
Virus de la lengua azul, VP2 y VP7
1990 Li y Yang
Virus de la fiebre aftosa, Proteína VP1
1991 Francis et al.
1992 Lugovskoi et al.; Brown
HIV-1, gpI20 1991 Wang et al.
1992 Defoort et al.; Nardelli
1993 Nardelli y Tam; Levi et al.
1994 Kelker et al.; De Santis et al.; Huang et al.; Fraisier et al.;
Vogel et al.
Proteína de unión a ácidos grasos
1991 St. Jhon et al.
Factor de crecimiento α, humano
1991 Lu et al.
Alquiltransferasa humana 1991 Pegg et al.
Antígeno P28, Schistosoma mansoni
1991 Auriault et al.
1994 Khan et al.; Pancré et al.
Citocromo P-450IA, ratón 1991 Edwars et al.
Proteína SLT-1, Escherichia coli
1991 Boyd et al.
Antígeno P30, Toxoplasma gondii
1992 Darcy et al.
1994 Godard et al.
Proteasa de mastocitosa-5’, ratón
1992 McNeil et al.
ATPasa, plantas 1992 Suzuki et al.
Canal de calcio, conejo 1992 Malouf et al.
Mioglobina de esperma, ballena
1992 McLean et al.
Proteína espermática humana 1992 Vanage et al.
1994 Vanage et al.
37
Proteína quinasa p34cdc2, eucariota
1992 Kamo et al.
Receptor angiotensina II tipo 1, rata
1992 Zelezna et al.
1994 Zelezna et al.
Nef, HIV-1 1992 Estaquier et al.
1993 Estaquier et al.
Polimerasa, virus de la influenza
1992 Nieto et al.
Hemaglutinina, Virus de la influenza
1993 G. K. Toth et al.
1994 Naruse et al.
Proteína NSm, Virus de la bunyamwera
1993 Nakitare y Elliot
B 19, parvovirus 1993 Saikawa et al.
1995 Anderson et al.
Glucosiltransferasa, Streptococcus
1993 Dj Smith et al.
1994
Toxina T, Bordetella pertussis 1993 Felici et al.
Toxina B, cólera Vibrio 1993 Halimi y Rivaille
Proteína de membrana 1, C. trachomatis
1993 Zhong et al.
Actin-fragmina quinasa, plasmodios
1993 Gettemans et al.
Proteína de unión IGF, bovinos 1993 Arnold et al.
Receptor de glutamato, rata 1993 Molnar et al.
Transportador de glucosa, rata 1993 Nagamatsu et al.
Proteína de unión ARN, roedor 1993 Henderson et al.
Receptor de insulina, humano 1993 Itoh et al.
Factor regulador de hierro, humano
1993 Emery-Goodman et al.; Gray et al
Proteína G, humano 1993 Raymond et al.
Tirosina quinasa, esponja 1994 Schacke et al.
Proteínas nucleares, virus vaccinia
1994 Vanslyke y Hruby
Proteína de membrana, Neisseria meningitidis
1994 Christodoulides y Heckels
Ciclasa, Saccharonmyces cerevisae
1994 Shi et al.
Isomerasa triosa fosfato, Saccharomyces mansoni
1994 Reynolds et al.
Polipéptido chaperonina, eucariota
1994 Lingappa et al.
Proteína de esperma, xenopus 1994 Bauer et al.
pP344 célula de retina, pollo 1994 Lio et al.
Miosina fosfatasa, pollo 1994 Shimizu et al.
Proteína prionica, ratón 1994 O’Rourke et al.
38
Amelogenina, ratón 1994 Simmer et al.
Histonas, ratón 1994 Meziere et al.
GTPasa, rata 1994 Wilson et al.
Neurexinas, rata 1994 Perin
T-tubulo, conejo 1994 Stout et al.
Dominio de membrana de la banda 3, humano
1992 Kang et al.
Canal de liberación de Ca 2+, conejo
1994 Callaway et al.
Proteína Anión de trasporte banda 3, humano
1994 Crandall y Sherman
Guanilina humana 1994 Kuhn et al.; Cetin et al.
Profilina humana 1994 Finkel et al.
Colágeno tipo V, humano 1994 Moradi-Arneli et al.
Fosfatasa 2A, humano 1994 Zolnierowicz
Moléculas DR, humano 1994 Demotz et al.
Elafin, humano 1994 Nara et al.
Ganglosidos, humano 1994 Helling et al.
5α-Reductasa 2, humano 1994 Eicheler et al.
Heme oxigenasa-1, humano 1994 Kutty et al.; M. A. Smith et al.
gp 46, HTLV-1 1995 Baba et al.
Proteína Espliceosoma, humano
1995 Digweed et al.
Fosfolipasa A2, humano 1995 Sa et al.
Receptor kainato, pez dorado 1995 Wo y Oewald.
Entre los años 1990 y 2000 la cantidad de compuestos que se comercializaron
fue alrededor de 40, pero con más 20 productos en fase clínica III y alrededor de
60 en fase clínica II [111]. Por lo tanto no es de escatimar el impacto económico
que hay detrás de toda esta industria, ya que para el año 2000 se obtuvieron
ganancias de aproximadamente 265 mil millones de dólares reportando un
crecimiento por año del 11% [112]. Para finales del año 2010 se reportaron
ingresos cercanos a los 13.000 millones de dólares, que provienen de tan solo
60 fármacos peptídicos, y se espera un crecimiento del 7,5 al 10 % para el año
2016; ya que hay 140 productos peptídicos a la espera de ser aprobados y se
prevén entre 500 y 600 nuevos péptidos que deberán ser sometidos a pruebas
preclínicas [113].
39
Entre las diversas estrategias de síntesis que se pueden emplear a la hora de
obtener un fragmento peptídico se presenta como un método de alto rendimiento
la estrategia Fmoc, ya que permite fabricar entre 10 kg a 100 kg del producto
deseado, claro está que todo se debe a la estandarización y sistematización de
las metodologías de trabajo y los equipos empleados [113].
Lo que el futuro depara para los péptidos en la industria farmacéutica es
prometedor. Se espera que el número de péptidos que pasen a ensayos
preclínicos aumente en proporciones exponenciales, al igual se emplearan como
complementos activos de diversos agentes farmacéuticos, con el objeto de
dirigirlos a objetivos específicos (intracelular). La complejidad de las API (por sus
siglas en inglés, active pharmaceutical ingredients) se prevé será mayor que sus
antecesores. La obesidad, la diabetes tipo 2 y los síndromes asociados con el
metabolismo serán tratados con fármacos específicos derivados de los péptidos
y/o medicamentos conjugados con ellos.
Las vías de administración no se escapan de la renovación, por lo tanto se deben
buscar alternativas para que los fármacos lleguen a su destino. Esto se debe a
que las proteasas presentes en el torrente sanguíneo porque degradan los
productos específicos. La ingesta es una posible solución, aunque se deben
emplear y encontrar vehículos que permitan a los fármacos ser digeridos
completamente por el organismo. Otras vías de aplicación son pulmonares y
nasales arrojando resultados interesantes, pero se fija un rumbo con el enfoque
de encontrar medios no invasivos que permitan la asimilación total del péptido.
No es de menospreciar todo el potencial que presenta esta industria y el futuro
que le espera, un claro ejemplo es el fármaco peptídico conocido como
Copaxone que genera aproximadamente en ingresos 3 mil millones de dólares
y se conocen otros tipos de fármacos comerciales que proviene de péptidos
sintéticos. Hay diversos anticuerpos monoclonales que se conocen como
biogenéricos, ya que las patentes han sido adquiridas por diversas empresas
40
farmacéuticas. En la tabla dos se presentan dichos fármacos, sus respectivos
ingresos y la casa farmacéutica que los provee.
Tabla 2. Principales fármacos biogenéricos, ingresos por año y casa comercial [123].
Biogenérico Ingresos anuales
(Billones de dólares) Casa comercial
Lantus (insulina glargina) $ 6,40 Sanofi-Aventis
Avastin (bevazizumab) $6,26 Roche
Hercepin (Trastuzumab $4,10 Roche
Lucentis (Ranibizumab) $3,72 Baxter
Aranesp (dabepoetin
alfa) $3,00 Janssen
Enbrel (Entanercept) $3,73 Pfitzel-Wyeth
Novoseven (factor VII
coagulación) $1,50 Novo-Nordisk
Aunque en muchos casos las investigaciones se realicen por actos altruistas y
tengan la intención de mejorar la calidad humana, es inevitable reconocer que
de alguna forma alguien se va ver beneficiado económicamente. Ojala todos los
intereses externos a esta ciencia tan increíble y fantástica como lo es la síntesis
de péptidos no intervenga de manera negativa, sino que permita que se
potencialice y mejore la calidad de vida a nivel mundial.
5.5.2 Métodos de diagnóstico.
El estudio de los anticuerpos ha capturado la atención de investigadores a nivel
mundial, dado que estos presentan un potencial gigantesco para producir tanto
vacunas como métodos de diagnóstico para diversas enfermedades. Desde
entonces los avances han sido significativos y han llevado el desarrollo de
anticuerpos a otro nivel, ya que se tiene la seguridad de poder realizar
41
anticuerpos específicos para cualquier proteína [109]. Esto lo corroboraron
Kohler y Milstein desarrollando la tecnología del hibridoma, que permite purificar
anticuerpos específicos derivados de la respuesta animal a un conjunto de
epítopes funcionales [110]. Por lo tanto, se demostró que es viable obtener
cualquier tipo de anticuerpos para las diversas regiones proteicas por medio de
inmunización con péptidos sintéticos. Por otro lado es de resaltar que las
regiones proteicas con las cuales reaccionan los anticuerpos se conocen, por lo
tanto se obtienen resultados específicos.
Otro de los grandes interrogantes que surgió a la hora de tratar diversas
enfermedades con productos peptídicos se basó en la identificación y/o
diagnóstico temprano. Por lo tanto se tuvieron que hacer distinciones entre
términos como antígeno e inmunógenos, ya que los antígenos son fragmentos
peptídicos que permiten reconocer los diferentes tipos de parásitos, virus y
demás, en cambio el término inmunógeno se refiere a la capacidad de generar
anticuerpos específicos [109,114]. Así entonces los métodos de diagnóstico se
basan principalmente en producir antígenos específicos que puedan ser
reconocidos por individuos que presenten algún tipo de enfermedad y a la postre
se realiza una comparación con resultados obtenidos de individuos no
infectados.
Diversas investigaciones se presentan sobre el uso de péptidos sintéticos como
método de diagnóstico pero dos autores resaltan en la literatura, Richard Alan
Lerner y Ruth Arnon. Aunque cada uno realizo diversas investigaciones en este
trabajo se van a abordar las más importantes y que derivaron en referencias
para guiar otras investigaciones.
En el año de 1981 Lerner publico la síntesis de trece péptidos que correspondían
a las secuencias de aminoácidos que fueron predichas a partir de la secuencia
de nucleótidos del antígeno presente en la superficie de la hepatitis B [114]. Otra
de las principales publicaciones presento Lerner fue en el año de 1984 donde
42
hace una recopilación bibliográfica. En un fragmento él hace énfasis sobre los
anticuerpos de especificidad que permiten seguir el rastro de los exones y como
estos funcionan en la expresión génica [109].
Por otro lado Ruth Arnon en el año de 1971 publico la obtención de un péptido
sintético de los residuos 64-82 de la enzima bactericida lisozima, con la
característica de la formación de un bucle en este fragmento y uniéndolo a una
multi-poli(DL-alanil)-poli(L-lisina), lo que desencadeno en cabras y conejos la
formación de anticuerpos capaces de reaccionar con lisozima y el péptido
sintético [115]. Para el año de 1976 publico para mi punto de vista uno de los
trabajos más interesantes ya que sintetizo un péptido correspondiente a los 11
residuos de aminoácidos de la parte NH2 terminal que está presente en la
secuencia del antígeno carcinoembrionario (CEA), el cual se había identificado
anteriormente y se caracteriza por estar presente en diversos tipos de tejido
cancerígeno [116].
Por lo tanto los péptidos sintéticos abrieron una brecha para identificar diversos
tipos de patologías y así poder tratarlas con antelación. No es de minimizar el
impacto que futuras investigaciones van a generar a nivel mundial, porque el
intelecto necesita siempre un trozo de locura para lograr cosas inimaginables.
43
6. CONCLUSIONES.
Se logró hacer una recopilación histórica desde los albores de la síntesis en fase
sólida, propuesta por R. B. Merifield, hasta los aportes al tema aparecidos en el año
2007.
Con respecto a las metodologías empleadas para la síntesis de péptidos en fase
solida es de resaltar que los grupos protectores Boc y Fmoc se siguen empleando
en la actualidad, aunque diversos factores como solventes y reactivos de acople se
pueden modificar, estas dos metodologías se lograron complementar la una a la
otra y así se dio paso síntesis ortogonal.
Se encontró que los enfoques conformaciones tratan de imitar subestructuras en
proteínas, tomando como bases el número de átomos que contiene una vuelta de
α hélice y/o la imitación de vueltas β con enlaces disulfuro, enlaces amida, formación
de hidrazonas, etc., que ciclen las secuencias
Las macromoléculas como los MAPs permitieron desarrollar vacunas con altos
porcentajes de eficiencia [96], empleando como referente las investigaciones
hechas por Tomalia [68]. Aunque las principales investigaciones fueron
desarrolladas por James P. Tam y colaboradores [89], estas sirvieron para generar
alrededor de 500 nuevos productos peptídicos con función antígena.
Actualmente hay patentados varios péptidos que son utilizados como fármacos,
estos se presentan en la tabla 2. Demostrando que la síntesis de péptidos en fase
solida ayudo a crear soluciones para mejorar la calidad de vida y al mismo tiempo
contribuyo a establecer una industria en el rango de los billones de dólares.
Toda la información encontrada y referenciada en lo objetivos expuestos
anteriormente se logró recopilar en la presente monografía.
44
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