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SÍNTESIS DE PÉPTIDOS DERIVADOS DE LA

LACTOFERRICINA BOVINA Y EVALUACIÓN DE SU

ACTIVIDAD ANTIBACTERIANA

Nataly de Jesús Huertas Méndez

Universidad Nacional de Colombia

Facultad de Ciencias, Departamento de Química

Bogotá D.C, Colombia

2016



ACTIVIDAD ANTIBACTERIANA


Tesis presentada como requisito parcial para optar al título de:

Magíster en Ciencias- Bioquímica

Directora:

Dr. rer.nat. Zuly Jenny Rivera Monroy

Línea de Investigación:

Estructura y función de proteínas

Grupo de Investigación:

Síntesis y Aplicación de Moléculas Peptídicas (SAMP)

Universidad Nacional de Colombia

Facultad de Ciencias, Departamento de Química

Bogotá D.C, Colombia

2016

“Soy de las que piensan que la ciencia tiene

una gran belleza. Un científico en su

laboratorio no es sólo un técnico: es también

un niño colocado ante fenómenos naturales que

le impresionan como un cuento de hadas.”

― Marie Curie

I

Agradecimientos

Le agradezco inmensamente a mis padres y hermano por su amor incondicional y calidez,

por sus firmes enseñanzas y la ternura de la comprensión, ellos me han dado las herramientas

suficientes para que el hermoso equilibrio de la vida no se destruya y como dijo, Haniel

Long, "Gran parte de lo mejor que hay en nosotros está ligado a nuestro amor a la familia,

que sigue siendo la medida de nuestra estabilidad porque mide nuestro sentido de la lealtad.

Todos los otros pactos de amor o temor derivan de ella y se modelan sobre ella".

A mi directora de tesis, la profesora Zuly Rivera, por su incansable labor, paciencia, apoyo

incondicional y acertada dirección para la finalización de cada etapa de la tesis; mis más

sinceros afectos, agradecimientos y admiración por la tenacidad y el sentido humano con

que afronta cada situación, por sus enseñanzas tanto a nivel académico como personal, que

recuerdan que ´´educar la mente sin educar el corazón, no se llama educar´´(Aristóteles) y

la forma en la que mejor lo ha hecho, ha sido con su ejemplo.

Al profesor Javier García, quien ha sido eje fundamental para el desarrollo y culminación

de la tesis; sus consejos y apoyo enmarcan este proceso académico y, se quedan en mis

recuerdos con un enorme afecto.

Al grupo de investigación de Síntesis y Aplicación de Moléculas peptídicas, que durante su

historia me permitió no sólo desarrollar los trabajos de investigación, sino conocer y

compartir vivencias con personas especialmente únicas. A Diana Martínez, Alejandro Lara,

Andrés Sandoval, Jorge Rodríguez, entre otros compañeros, por su amistad, soporte y

consejos

Agradecimientos II

A los profesores Jaiver Rosas y Sandra Vega, por sus enseñanzas y aportes en mi formación

académica.

A mis compañeras Johana Rojas y Tatiana Valencia, por su apoyo y colaboraciones.

A los laboratoristas, Humberto, Diana, Rigoberto, quienes con excelente disposición

contribuyeron a cada uno de los resultados obtenidos.

A mis amigos y a Wilmer, quienes han constituido un cimiento emocional para afrontar cada

una de las adversidades presentadas en este proceso.

Al Programa Nacional de Ciencia y Tecnología de la salud de COLCIENCIAS, convocatoria

657-2014, por la financiación del proyecto: Diseño, síntesis química y caracterización de

péptidos derivados de lactoferricina y evaluación de su actividad anticancerígena. Fase II -

110165843141 contrato 678-2014.

A la vicerrectoría académica por la financiación otorgada mediante la beca exención de

derechos académicos.

A los profesores de la Facultad de Ciencias de la universidad Nacional de Colombia, al

Departamento de Química y al programa de Maestría en Ciencias-Bioquímica por la

preparación académica que recibí.

Y Finalmente, a la vida que, entre todas sus opciones y azares me permitió compartir con

estas personas momentos memorables, y además me permite hoy, que ustedes lean estos

agradecimientos.

Agradecimientos III

Resumen

La resistencia a los agentes antimicrobianos es un problema de salud pública a nivel

mundial. Los péptidos antimicrobianos catiónicos (AMPs) son moléculas potenciales para

el desarrollo de nuevos agentes terapéuticos contra infecciones causadas por patógenos

resistentes. En este trabajo se diseñaron, purificaron y caracterizaron péptidos derivados de

LfcinB 17-31 (17FKCRRWQWRMKKLGA31); se construyó una librería peptídica

removiendo sistemáticamente los residuos (N o C-terminal) que flaquean el motivo

RRWQWR que corresponde a la secuencia mínima reportada con actividad antimicrobiana.

Se incluyó también para el estudio (i) un péptido que contiene una Alanina en lugar de

Cisteína ([Ala19]-LfcinB 17-31) y (ii) péptidos polivalentes que contienen la secuencia

RRWQWR y un aminoácido no natural (ácido aminocaproico). Para cada péptido se ensayó

la actividad antibacteriana frente a E. coli ATCC 25922 y S. aureus ATCC 25923. Se

estableció que los péptidos LfcinB 17-26 (17FKCRRWQWRM26) y LfcinB 17-25

(17FKCRRWQWR25) presentaban la mayor actividad contra S. aureus ATCC 25923 y E.

coli ATCC 25922, respectivamente. Por otra parte, los péptidos polivalentes: el dímero

(FKARRWQWRMKKLGA)2K-Ahx-C y el tetrámero (RRWQWR)2K-Ahx-C)2, mostraron

la mayor actividad antibacteriana, indicando que múltiples copias de la secuencia aumentan

la actividad. Nuestros resultados sugieren que el diseño de péptidos lineales y polivalentes

es una estrategia versátil para identificar secuencias potenciales en el desarrollo de agentes

terapéuticos peptídicos.

Palabras clave: Lactoferricina Bovina, actividad antibacteriana, péptidos sintéticos

Contenido IV

Abstract

Resistance to antimicrobial agents is a public health problem worldwide. Cationic

antimicrobial peptides (AMPs) are potential molecules to develop new therapeutic agents

against infections caused by resistant pathogens. In this work, peptides derived from LfcinB

17-31 (17FKCRRWQWRMKKLGA31) were designed, purified and characterized. A peptide

library was constructed by systemically removing the flanking residues (N or C-terminal)

of the RRWQWR sequence that corresponds to minimal antimicrobial motif. For this

research, it was also included (i) a peptide containing an Ala instead of Cys ([Ala19]-LfcinB

17-31) and (ii) polyvalent peptides containing the RRWQWR sequence and a non- natural

amino acid (aminocaproic acid). For each peptide the antibacterial activity was tested against

E. coli ATCC 25922 and S. aureus ATCC 25923. We established that peptides LfcinB 17-

26 (17FKCRRWQWRM26) and LfcinB 17-25 (17FKCRRWQWR25) presented the bigger

activity against S. aureus ATCC 25923 and E. coli ATCC 25922, respectively. By the other

hand, polyvalent peptides, the dimer (FKARRWQWRMKKLGA)2K-Ahx-C, and tetramer

((RRWQWR)2K-Ahx-C)2, showed the highest antibacterial activity, indicating that the

multiple copies of the sequence increase the activity. Our results suggest that the design of

lineal and polyvalent peptides is a versatile strategy to identify potential sequences to

developing peptide therapeutics.

Keywords: Bovine Lactoferricin, antibacterial activity, Synthetic peptides

TABLA DE CONTENIDO V

Resumen……………………………………………………………………………………..

Abstract……………………………………………………………………………………..

Lista de figuras……………………………………………………………………………...

Lista de tablas………………………………………………………………………………

Lista de Símbolos y abreviaturas……………………………………………………….....

Introducción………………………………………………………………………………...

1. Marco teórico………………………………………………………………………...…..

1.1 Actividad antimicrobiana de la Lactoferricina (Lfcin)………………………………….

1.1.1 Moléculas derivadas de la Lfcin con potencial antibacteriano………………………..

1.1.2 Actividad antifúngica y antiparasitaria de la Lfcin……………………………………

1.1.3 Actividad Antiviral de la Lfcin………………………………………………………..

1.2 Características de las cepas bacterianas utilizadas………………………………………

1.2.1 Staphylococcus aureus (S. aureus)…………………………………………………….

1.2.2 Escherichia coli (E. coli) ………………………………………………………………

2. Hipótesis…………………………………………………………………………………

3.Objetivos…………………………………………………………………………………..

3.1 Objetivo General…………………………………………………………………………

3.2. Objetivos específicos……………………………………………………………………

4. Metodología……………………………………………………………………………....

4.1 Reactivos y materiales…………………………………………………………………...

4.2 Obtención de péptidos derivados de LfcinB mediante Síntesis en Fase Sólida (SPPS)

por la estrategia Fmoc/tBu…………………………………………………………………...

4.2.1 Reacción de remoción del grupo Fmoc (Figura 2. Paso 1)…………………………....

4.2.2 Reacción de activación de los Fmoc-aminoácidos y acople del aminoácido a la resina

(Figura 2. Paso 2)……………………………………………………………………………

4.2.3 Reacción de monitoreo (test de Kaiser)………………………………………..………

4.2.4 Reacción de desprotección de las cadenas laterales y desanclaje del péptido del

soporte sólido (Figura 2. Clivaje)……………………………………………………….…..

4.2.5 Oxidación para la obtención de tetrámeros……………………………………………

4.3 Caracterización de los péptidos por cromatografía analítica RP-HPLC y espectrometría

de masas MALDI-TOF………………………………………………………………………

4.3.1 Análisis por RP-HPLC………………………………………………………………

III

IV

VI

I

IX

1

4

7

7

8

8

10

10

11

13

14

14

14

15

16

16

17

19

19

20

20

20

20

Contenido VI

4.3.2 Purificación de los péptidos por extracción en fase sólida (SPE)…………………..…

4.3.3 Análisis por espectrometría de masas…………………………………………...…..…

4.4 Determinación de la actividad antibacteriana…………...………………………….…...

4.4.1 Acondicionamiento de las cepas bacterianas………………………………………….

4.4.2 Curva de calibración…………………………………………………………………...

4.4.3 Actividad antibacteriana…………………………………………………………….....

5. Resultados y Discusión……………………………………………………………….....

5.1. Desarrollo de un método de análisis por RP-HPLC para péptidos sintéticos empleando

una columna monolítica……………………………………………………………………..

5.2. Síntesis y purificación de los péptidos………………………………………………….

5.3. Determinación de la actividad antibacteriana…………………………………………..

5.3.1 Curva de calibración…………………………………………………………………...

5.3.2 Actividad antibacteriana…………………………………………………………….....

6. Conclusiones……………………………………………………………………………..

Bibliografía…….…………………………………………………………………………..

ANEXO 1: Resultados. Síntesis y caracterización de los péptidos diseñados…………..

21

21

22

22

22

23

25

26

29

32

32

33

41

42

49

Contenido VII

Lista de figuras

Figura 1. Secuencias de la Lactoferricina bovina y humana ............................................................ 5

Figura 2. Síntesis de Péptidos en Fase Sólida (SPPS) .................................................................... 18

Figura 3. Análisis cromatográfico de una mezcla de péptidos sintéticos, empleando una columna

empacada .......................................................................................................................................... 27


monolítica......................................................................................................................................... 28

Figura 5. Perfil cromatográfico del péptido LfcinB 17-25 (FKCRRWQWR) antes y después del

proceso de purificación. ................................................................................................................... 30

Figura 6. Curvas de calibración de las cepas bacterianas ............................................................... 33

Figura 7. Actividad antibacteriana del péptido LfcinB 17-31 ......................................................... 34

Figura 8. Péptidos con mayor actividad antibacteriana para cada una de las cepas evaluadas ....... 36

Figura 9. Actividad antibacteriana frente a E. coli ATCC 25922 del péptido Lfcin 20-25 y de sus

análogos con múltiples copias .......................................................................................................... 37

Figura 10. Actividad antibacteriana de péptidos análogos de Lfcin 17-31 con el intercambio de 19Cys

por 19Ala .......................................................................................................................................... 38

Contenido VIII

Lista de tablas

Tabla 1. Secuencias derivadas de LfcinB diseñados, sintetizadas, purificadas y caracterizadas .... 15

Tabla 2. Métodos diseñados para el análisis de péptidos, empleando una columna empacada y una

columna monolítica .......................................................................................................................... 21

Tabla 3. Diluciones escogidas para sembrado y conteo de colonias .............................................. 23

Tabla 4. Caracterización de los péptidos sintéticos por RP-HPLC ................................................. 31

Tabla 5. Evaluación de la actividad antibacteriana de los péptidos derivados de Lfcin 17-31 ....... 35

Contenido IX

Lista de Símbolos y abreviaturas

Abreviaturas

Término Abreviatura Siglas

Absorbancia Abs

Acetonitrilo ACN

Acetonitrilo + TFA 0,05% Solvente B

Ácido aminohexanoico Ahx

Ácido aspártico Asp D

Ácido glutámico Glu E

Ácido Trifluoroacético TFA

Agar Mueller Hinton AMH

Agar tripticasa de soya TSA

Agua + TFA 0,05% Solvente A

Alanina Ala A

American Type Culture

Collection

ATCC

Aminoácido AA

Arginina Arg R

Células dendríticas CD

Ciprofloxacina CIP

Cisteína Cys C

Clinical & Laboratory Standards

Institute

CLSI

Concentración mínima

bactericida

MBC

Concentración mínima inhibitoria MIC

Cromatografía líquida de alta

eficiencia en fase reversa

RP-HPLC

Diciclohexilcarbodiimida DCC

Diclorometano DCM

Diisopropiletilamina DIPEA

Enterococcus Faecalis E. Faecalis

Contenido X

Especies reactivas del oxígeno ERO

Espectrometría de masas EM

Etanoditiol EDT

Etcétera etc.

Extracción en fase sólida SPE

Fenilalanina Phe F

9-Fluorenilmetiloxicarbonilo Fmoc

Gentamicina GEN

Glicina Gly G

Glicosaminoglicanos GAGs

Glutamina Gln Q

1-Hidroxi-6-clorobenzotriazol 6-Cl-HOBt

Histidina His H

Inmunoabsorción ligado a

enzimas

ELISA

Isoleucina Ile I

Isopropanol IPA

KiloDaltons kDa

Lactoferricina Lfcin

Lactoferricina Bovina LfcinB

Lactoferricina Humana LfcinH

Lactoferrina LF

Leucina Leu L

Leucocitos Polimorfonucleares PMNs

Lipopolisacáridos LPS

Lisina Lys K

Matrix-Assisted Laser Desorp-

tion/Ionization / Time-Of-Flight

MALDI-TOF

Metanol MeOH

Metionina Met M

Mililitro mL

Nicotinamida adenina dinu-

cleótido fosfato (forma reducida)

NADPH

N,N-Dimetilformamida DMF

Organización Mundial de la salud OMS

Péptidos Antimicrobianos AMPs

Plate Count Agar PCA

Por ejemplo p.e

Prolina Pro P

Contenido XI

Resistencia a los agentes

antimicrobianos

RAM

Resonancia Magnética Nuclear RMN

Revoluciones por minuto rpm

Serina Ser S

Síntesis de Péptidos en Fase

Sólida

SPPS

Síntesis y aplicación de moléculas

peptídicas

SAMP

Staphylococcus aureus S. aureus

Staphylococcus aureus con resis-

tencia intermedia a vancomicina

VISA

Sulfato de heparina SH

Temperatura ambiente TA

Tetrafluoroborato de O-(Benzo-

triazol-1-yl)-N,N,N',N'-tetrame-

tiluronio

TBTU

Tiempo de retención tR

Tirosina Tyr Y

Treonina Thr T

Triisopropilsilano TIPS

Triptófano Trp W

Unidades formadoras de colonias UFC

Introducción El uso inadecuado e irracional de los antibióticos convencionales ha inducido un cambio en

los microorganismos, sus susceptibilidades y consecuentemente ha generado resistencia, lo

que limita las posibilidades de tratamiento y cura. Un informe de la Organización Mundial

de la Salud (OMS) lanzó una alerta de salud pública en todo el mundo: la resistencia a los

agentes antimicrobianos (RAM) amenaza la prevención y el tratamiento eficaz de una gama

cada vez mayor de infecciones causadas por bacterias, parásitos, virus y hongos; se habla

de una era post-antibiótica donde las infecciones comunes y lesiones menores pueden ser

mortales [1]. En este reporte, la OMS subraya siete tipos de bacterias que están presentando

resistencia a los fármacos antibacterianos: Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae,

Staphylococcus aureus, Streptococcus pneumoniae, Nontyphoidal Salmonella, Shigella

species, y Neisseria gonorrhoea [1]. Además del impacto negativo sobre la salud de los

pacientes, la resistencia a los agentes antimicrobianos genera un aumento en los gastos de

atención en salud ya que obliga al uso de antibióticos de segunda línea, los cuales presentan

en algunas ocasiones graves efectos secundarios que hacen necesarias actividades costosas

de fármaco-vigilancia [1].

Durante las últimas décadas varias investigaciones han abordado el desarrollo de fármacos

que no induzcan resistencia en los patógenos y por lo tanto se puedan considerar como una

alternativa para el tratamiento de infecciones bacterianas. Dentro de este campo de

investigación se ha contemplado el uso de péptidos obtenidos de fuentes naturales o

sintéticas y se ha demostrado su potencial en áreas como biología molecular, inmunología

y farmacología. Estas moléculas han sido empleadas para el tratamiento de diferentes

patologías, mostrando viabilidad a nivel terapéutico y comercial, actualmente existen en el

mercado cerca de 125 productos farmacéuticos basados en péptidos [2, 3]. Los péptidos

Introducción 2

antimicrobianos (AMPs) se consideran una parte importante de la respuesta inmune innata,

son péptidos de defensa del huésped con baja antigenicidad, han sido aislados de tejidos y

organismos de todos los reinos, incluyendo los seres humanos, estos péptidos son

anfipáticos, capaces de interactuar con las membranas microbianas. Los AMPs han

mostrado actividad antimicrobiana contra bacterias Gram (+) y Gram (−), hongos, virus y

parásitos [4-7], son una familia de moléculas con gran potencial para uso clínico debido a

sus múltiples mecanismos de acción, amplio espectro de actividad y bajo potencial de

resistencia [5, 8-10]. Actualmente, la comprensión de la importancia biológica y biomédica

de los AMPs es considerada un área de investigación que puede permitir el desarrollo de

nuevas terapias que no presenten resistencia a enfermedades infecciosas. Hay una inmensa

diversidad estructural de AMPs que se han estudiado hasta hoy [5, 8, 11, 12]. Se ha

identificado, en ensayos in vitro, que es más difícil el desarrollo de resistencia bacteriana

con péptidos antimicrobianos que con algunos antibióticos como gentamicina y

norfloxacina, adicionalmente, varios autores han reportado que los AMPs poseen un gran

potencial anticancerígeno, ya sean solos o en combinación con otros fármacos

convencionales, lo que constituye una estrategia terapéutica por explorar [11-13].

Dentro de la familia de los AMPs se encuentran los péptidos catiónicos como la

Lactoferricina (Lfcin) [14], este péptido es derivado de la Lactoferrina (LF) y se genera por

acción de la pepsina gástrica [9]. La Lfcin posee una amplia actividad antimicrobiana

antitumoral e inmunológica [15], varios estudios han suministrado evidencia clara de la

actividad antimicrobiana de la Lfcin, donde se resalta la actividad bactericida de la

Lactoferricina Bovina (LfcinB) y la actividad bacteriostática de la Lactoferricina Humana

(LfcinH) contra una amplia variedad de bacterias Gram (+) y Gram (−), haciendo que este

péptido sea de interés para el desarrollo de nuevos agentes antimicrobianos [16-18].

Diferentes estudios de actividad antibacteriana, han permitido concluir que la Lfcin ejerce

un efecto en la superficie de la membrana de la bacteria, y su actividad está directamente

relacionada con su naturaleza anfipática, específicamente por la presencia de aminoácidos

con cargas positivas (Arg y Lys) y residuos aromáticos hidrofóbicos (Trp, Phe) [15, 19]. La

secuencia RRWQWR ha sido reportada como el motivo mínimo con actividad

antibacteriana para la LfcinB [20], esta secuencia también ha mostrado actividad

Introducción 3

anticancerígena [21], sin embargo, su potencia antibacteriana es menor que la de la

secuencia de LfcinB completa [20-24]. La secuencia LfcinB 17-31 corresponde a un péptido

de 15 residuos derivado de LfcinB, que presenta igual o similar actividad antimicrobiana

que la obtenida para la secuencia de LfcinB de 25 residuos, ello sugiere que el potencial

antimicrobiano de la LfcinB no requiere el enlace disulfuro entre los residuos de 19Cys y

36Cys [25-27].

La síntesis de péptidos en fase sólida (SPPS, por sus siglas en inglés) presenta ventajas frente

a otros métodos de obtención de estas moléculas, como son: la rapidez, y la versatilidad en

el diseño de péptidos ya que permite realizar cambios puntuales en la secuencia utilizando,

por ejemplo, aminoácidos no naturales [22].

Dentro de este contexto, en el presente trabajo se diseñaron, sintetizaron, purificaron, y

caracterizaron, mediante cromatografía líquida de alta eficiencia en fase reversa (RP-HPLC)

y espectrometría de masas MALDI-TOF, péptidos derivados de la secuencia LfcinB 17-31.

Los péptidos fueron diseñados conservando el motivo mínimo con actividad antibacteriana

reportado para la LfcinB (20RRWQWR25) [20]. A los péptidos sintetizados se les hizo la

evaluación de su actividad antimicrobiana, las mejores moléculas que presentaron actividad

in vitro serán consideradas como potenciales candidatos para el diseño y desarrollo de

agentes terapéuticos basados en péptidos.

Marco Teórico 4

1. Marco teórico La Lfcin es un péptido generado por acción de la pepsina gástrica sobre la Lactoferrina (LF),

que es una glicoproteína multifuncional de 80 kDa presente en secreciones mucosas como

la leche materna, saliva, entre otras. Esta proteína ha demostrado tener actividad

antimicrobiana contra bacterias, virus, hongos y parásitos, además de actividad

inmunomoduladora y antitumoral. Se ha identificado que el fragmento N-terminal de la LF,

correspondiente a la Lfcin, es responsable de la actividad antimicrobiana y por tanto este

péptido se convierte en una molécula interesante y candidata para el uso clínico contra la

resistencia antimicrobiana [6, 15, 19].

La Lfcin ha sido identificada en varios mamíferos, de los cuales las más estudiadas han sido

la LfcinB (LfcinB: 17FKCRRWQWRMKKLGAPSITCVRRAF41) y la LfcinH (LfcinH:

20GRRRRSVQWCAVSQPEATKCFQWQRNMRKVRGPPVSCIKRDSPIQCI66), estos dos

péptidos poseen una amplia actividad antimicrobiana, antitumoral e inmunológica [15], sin

embargo, la LfcinB ha exhibido mayor actividad antimicrobiana que la LfcinH. La

diferencia se puede deber a la relativamente baja similitud de las secuencias que es del, 69%

[6, 15, 28]. La LfcinB y la LfcinH, presentan una estructura de bucle formado por 18

residuos de aminoácidos (Figura 1); este bucle se forma a través de un enlace disulfuro

intramolecular entre dos cisteínas, los residuos 19Cys y 36Cys en la LfcinB y en la LfcinH

residuos 39Cys y 56Cys. Los aminoácidos 20 al 30 de la LfcinH constituyen otro fragmento

separado que se conecta con el bucle principal a través de un puente disulfuro [19, 28, 29],

algunos autores indican que la LfcinH es una sola cadena continua de 49 residuos que forma

un bucle principal [30]. Existe controversia sobre la importancia del bucle en la actividad

antimicrobiana de la Lfcin, algunos autores sugieren que es independiente de la presencia

de este bucle, sin embargo, otros resaltan la importancia de esta estructura para la actividad

Marco Teórico 5

antimicrobiana, dado que le confiere rigidez y estabilidad a la estructura del péptido, como

ocurre en los péptidos cíclicos [19, 28].

La estructura secundaria de la LfcinB obtenida por Resonancia Magnética Nuclear (RMN)

muestra que el péptido adquiere una conformación de hoja antiparalela-β distorsionada,

mientras que la estructura dilucidada por difracción de Rayos X muestra que la LfcinB

presenta una estructura de α-hélice anfipática entre los residuos 1-13 [31, 32]. En la LfcinH

la estructura de RMN conserva una parte significativa de la conformación obtenida para la

LF intacta, que corresponde a una α-hélice [15, 19]. Estudios con péptidos antimicrobianos

de diferente estructura secundaria indican que los péptidos con estructura hoja-β se traslocan

más fácilmente a través de la membrana citoplasmática que los péptidos con estructura α-

helical o péptidos largos, lo que explicaría el aumento de la actividad antimicrobiana de

LfcinB comparada con LfcinH [15].

Figura 1. Secuencias de la Lactoferricina (A) bovina y (B) humana. Se muestra el bucle formado

por el puente disulfuro. Los aminoácidos cargados positivamente están en rojo, los números

corresponden a la posición en la proteína original. Tomado de Sebastien Farnaud et al [19].

A

B

Marco Teórico 6

La Lfcin y varias moléculas derivadas de su secuencia han sido evaluadas para determinar

la concentración mínima inhibitoria (MIC) y la concentración mínima bactericida (MBC).

La MIC es la concentración más baja de la molécula que produce la inhibición de

crecimiento visible y la MBC es la concentración más baja de la molécula que es capaz de

matar el 99.9 % del inóculo original en un periodo de tiempo establecido. Es de aclarar que

estas pruebas no permiten deducir el mecanismo a través del cual se ejerce la acción

antimicrobiana, es por ello que se emplean otras estrategias como el uso de marcadores

específicos de moléculas. Diferentes estudios de actividad antibacteriana, han permitido

concluir que la Lfcin ejerce un efecto en la superficie de la membrana de la bacteria, y su

actividad está directamente relacionada con su naturaleza anfipática, específicamente por la

presencia aminoácidos con cargas positivas y aminoácidos aromáticos hidrofóbicos [15, 19].

La secuencia RRWQWR ha sido reportada como el motivo mínimo con actividad

antibacteriana para la LfcinB [20], esta secuencia también ha mostrado actividad

anticancerígena [21]. Sin embargo, su potencia antibacteriana es menor que la de la

secuencia de LfcinB completa [20-24]. En la LfcinH la secuencia FQWQRN que es

equivalente al centro activo de la LfcinB, tiene menor potencia antibacteriana que el motivo

RRWQWR, debido tal vez a la pérdida en las cargas positivas [15].

El mecanismo de acción de la Lfcin propuesto para las bacterias Gram (–) consiste en una

interacción electrostática entre los residuos catiónicos y los LPS de la membrana externa,

permitiendo el acercamiento del péptido a la membrana interna, se requiere una carga neta

de por lo menos +4 para la actividad antibacteriana óptima [7]. Posteriormente, los residuos

hidrofóbicos interactúan con la bicapa lipídica, siendo el Trp el residuo más importante; la

Lfcin cruza esta barrera para interactuar con la membrana citoplasmática. Poco se sabe sobre

este proceso, pero se sugiere que ocurre a través del mecanismo ‘self-promoted uptake’, de

tal manera que el péptido logra entrar en la célula bacteriana y actuar sobre dianas

intracelulares [7, 15, 19]. La región de bucle (loop) de la LfcinH y su región homóloga en

LfcinB parecen estar involucradas con la unión a LPS [33]. Estudios sugieren que el

principal sitio de unión para la Lfcin con el LPS es el núcleo interior del lipopolisacárido

[19, 34].

Marco Teórico 7

Para las bacterias Gram (+) se ha propuesto una interacción entre los residuos catiónicos de

la Lfcin y la capa de ácido teicoico que rodea la membrana citoplasmática [7, 19]. Algunos

estudios con LfcinB y LfcinH parecen indicar que este péptido afecta la permeabilidad de la

membrana, lo que permite el paso de iones pequeños, y resulta en la pérdida del gradiente

de pH y electroquímico transmembranal, a diferencia de otros péptidos antimicrobianos que

forman poros o desintegran la membrana citoplasmática, la Lfcin parece no generar ningún

daño significativo a la integridad de esta membrana [15, 35-38].

1.1 Actividad antimicrobiana de la Lactoferricina (Lfcin)

1.1.1 Moléculas derivadas de la Lfcin con potencial antibacteriano

La secuencia Lfcin 17-31 (17FKCRRWQWRMKKLGA31) corresponde a un péptido de 15

residuos derivado de LfcinB, que presenta igual o similar actividad antimicrobiana que la

obtenida para la secuencia de LfcinB de 25 residuos, ello sugiere que el potencial

antimicrobiano de la LfcinB no requiere el enlace disulfuro entre los residuos de 19Cys y

36Cys. Estudios donde los aminoácidos de esta secuencia fueron reemplazados uno a uno

por Ala (scan Ala) muestran que la actividad antimicrobiana se disminuye al sustituir el

22Trp y el 24Trp, lo que sugiere que estos residuos son fundamentales en el mecanismo de

acción del péptido [39-41].

Varios autores han diseñado moléculas con cambios específicos en la secuencia de la Lfcin

para potenciar su actividad antimicrobiana, los parámetros estructurales que han tenido en

cuenta para el diseño de los péptidos involucran: la carga neta, la hidrofobicidad, lipofilia,

asimetría de la carga y la afinidad micelar [22, 40]. Algunos cambios específicos que se han

realizado consisten en: (i) la incorporación de aminoácidos no naturales, (ii) la reducción o

elongación del motivo, (iii) la sustitución de residuos básicos por residuos no cargados, (iv)

la presentación múltiple del motivo RWQWR en secuencias palindrómicas, diméricas y

tetraméricas, y (v) la variación de la longitud de secuencia [22]. Se ha identificado que la

acción antibacteriana de cada péptido depende del tipo de microorganismo, sus

características, la especie y la cepa [6, 22]. La actividad antibacteriana (en E. coli ATCC

25922 y E. faecalis ATCC 29212) se mejora para los péptidos que contienen múltiples

Marco Teórico 8

presentaciones del motivo RRWQWR, por otro lado, la actividad antimicrobiana se ha visto

afectada con cambios puntuales en la secuencia de este motivo [ 21, 22]. La importancia de

la ubicación relativa de los residuos de Trp y Arg en la actividad de los péptidos sintéticos

ha sido evidenciada con estudios en cepas de Escherichia coli. [19]. La sustitución de Trp

por aminoácidos no naturales tales como Tpc (β-[2-(2,2,5,7,8-pentametilcroman-6-

sulfonil)-indol-3-ilo]alanina) ha generado un aumento en la actividad antibacteriana [27,

39]. Sin embargo, la adición de muchos residuos aromáticos o muy voluminosos e

hidrofóbicos disminuye la selectividad de los péptidos, y aumenta la actividad hemolítica

[40]. Por otra parte, la sustitución de los residuos de Phe por una Pro en la LfcinH, conduce

a una disminución en la potencia antimicrobiana y una alteración estructural que sugiere la

importancia de la conformación espacial del péptido [41].

1.1.2 Actividad antifúngica y antiparasitaria de la Lfcin

La LfcinB y LfcinH tienen dos mecanismos antifúngicos, el primero está relacionado con la

interacción entre la Lfcin y la membrana plasmática, que resulta en la disipación del

gradiente de protones, también parece afectar el citoplasma de las células fúngicas

observándose agregación del material citoplasmático [15, 35, 42]. El segundo mecanismo,

parece implicar un aumento de la defensa del huésped a través del aumento de Leucocitos

Polimorfonucleares (PMNs). La exposición de PMNs a la Lfcin induce la generación de

especies reactivas del oxígeno (ERO) a través de un aumento de la actividad de las proteínas

Tirosina Quinasas y la activación del complejo NADPH [15, 35].

El mecanismo de acción parasiticida de la Lfcin es aún desconocido, aunque se sabe que

existe una atracción de cargas entre la superficie celular negativa de algunos protozoarios y

la Lfcin, que resulta en una interrupción de la membrana. Algunos autores plantean la

posibilidad de que esta interacción libere componentes estructurales parasitarios que activen

los sistemas de defensa del huésped [15, 36].

1.1.3 Actividad Antiviral de la Lfcin

Marco Teórico 9

La LF presenta actividad antiviral, mientras que para la Lfcin se ha encontrado una actividad

menor [43], existen evidencias que muestran que LF y Lfcin actúan a través de diferentes

mecanismos [44], la actividad de la LF se le atribuye a la afinidad de esta proteína con el

sulfato de heparina (SH) y glicosaminoglicanos (GAGs); la unión con estas moléculas

previene el ingreso del virus en la célula. No se conoce el mecanismo de acción de la Lfcin,

pero la carga positiva neta y la posición de los residuos catiónicos parecen ser importantes

para la actividad antiviral, sin embargo, esta actividad es independiente de la presencia de

este péptido en la superficie celular, es posible que Lfcin ejerza sus efectos dentro de la

célula huésped no en su membrana [15, 36].

La Lfcin ha demostrado ser un agente sinérgico eficaz cuando se utiliza en combinación con

antibióticos y agentes antifúngicos. La capacidad de Lfcin para aumentar la eficacia de los

agentes antimicrobianos y antivirales comunes no sólo proporciona un medio para el

tratamiento de cepas resistentes, sino que también sugiere una estrategia para disminuir la

creciente aparición de resistencia a los medicamentos mediante la reducción de su uso [15].

La síntesis de Moléculas derivadas de Lfcin representa una buena alternativa para esta

problemática y es un campo amplio de investigación y desarrollo. Actualmente, varias

moléculas derivadas de la Lfcin y la LF se encuentran en etapas avanzadas de ensayos

clínicos [45]. Además de su potencial antimicrobiano y especialmente antibacteriano, estos

péptidos parecen ser útiles en el desarrollo de biosensores [46], la capacidad para discriminar

entre las bacterias los hace candidatos para su uso como elementos de reconocimiento

molecular en plataformas de detección de patógenos. Estos péptidos antimicrobianos y sus

análogos son capaces también de penetrar en células dendríticas (CD) humanas derivadas

de monocitos, una cualidad que los hace buenos candidatos para ser portadores de vacunas

basadas en epítopes. La amplia gama de aplicaciones de la Lfcin y sus péptidos derivados,

hace necesaria la profundización y el estudio de estas moléculas. Para este propósito, la

obtención de péptidos sintéticos y la producción de Lfcin a gran escala a partir de proteínas

de la leche, están en desarrollo.

1.2 Características de las cepas bacterianas utilizadas

Marco Teórico 10

1.2.1 Staphylococcus aureus (S. aureus)

Es uno de los patógenos más importantes a nivel mundial, es una bacteria oportunista que

forma parte de la microflora humana; la colonización más frecuente por S. aureus es la

mucosa nasal, y el principal reservorio lo constituye el hombre enfermo o el portador. Bajo

condiciones normales S. aureus no produce infecciones, esto sólo ocurre en pacientes

inmunocomprometidos, las infecciones causadas por S. aureus se producen por lesiones

cutáneas, traumáticas o quirúrgicas que favorecen la penetración de la bacteria desde la piel

a los tejidos profundos, estas son supurativas y tienden a producir abscesos. Debido a su

amplia versatilidad, esta bacteria es capaz de causar enfermedades de amplio espectro como

infecciones menores de la piel e infecciones invasoras serias como: bactericemia,

infecciones del sistema nervioso central, osteomielitis, infecciones del tracto respiratorio,

infecciones del tracto urinario, el síndrome de choque tóxico, e infecciones gastrointestinales

[47].

S. aureus es una bacteria anaerobia facultativa, del género Staphylococcus, y la familia

Staphylococcaceae, formado por cocos Gram positivos, con un diámetro de 0.5 a 1.5 μm,

agrupados como células únicas, en pares, tétradas, cadenas cortas o formando racimos de

uvas [47]. Las colonias de S. aureus se observan lisas, elevadas, brillantes y de bordes

enteros, presentan consistencia cremosa y pigmentación que va del amarillo a dorado debido

a la producción de carotenoides, la mayoría de las cepas producen β-hemólisis o hemólisis

total alrededor de las colonias cuando se cultivan en agar sangre. S. aureus se diferencia de

las demás especies por producir coagulasa, es resistente al calor, a la desecación y puede

crecer en medios con grandes cantidades de NaCl (7.5%). S. aureus crece bien en medios

de cultivos no selectivos, como el agar sangre, o agar chocolate, y medios líquidos para

hemocultivo donde se recupera fácilmente.

La identificación de S. aureus se realiza con el empleo de la tinción de Gram, y pruebas

bioquímicas como: prueba de la catalasa, fermentación de glucosa (que permite diferenciar

al género Staphylococcus del género Micrococcus, que también se considera una catalasa

positiva pero no fermenta la glucosa).

https://es.wikipedia.org/wiki/Staphylococcus_aureus

Marco Teórico 11

Una característica sobresaliente del genoma de S. aureus es la presencia de gran número de

elementos móviles (plásmidos, secuencias de inserción y transposones), que contienen

factores de virulencia y resistencia a diversos antimicrobianos.

Respecto a la resistencia frente a los antibióticos, las dos más notables son la resistencia a

la meticilina y vancomicina. La resistencia a la meticilina se adquirió mediante la

transferencia inter-especies del gen mecA de una especie ancestral de Staphylococcus a S.

aureus a través de un único elemento genético móvil. La resistencia a la vancomicina se

adquirió mediante la transferencia horizontal del gen vanA de Enteriococcus resistente a

vancomicina a S. aureus. El otro tipo de resistencia a la vancomicina es expresado por las

cepas denominadas VISA, la cual es adquirida por mutaciones adaptativas incorporadas en

los genes que codifican la regulación de la fisiología de la célula bacteriana.

S. aureus es una bacteria capaz de formar biofilm sobre superficies poliméricas, las bacterias

dentro de las biopelículas se asemejan a las bacterias en fase estacionaria y son generalmente

menos sensibles a los antibióticos que bacterias en fase logarítmica, por lo tanto, se requiere

que la molécula tenga acción rápida sobre la bacteria para generar el efecto antibacteriano

[48].

En Staphylococcus aureus se han descrito varios mecanismos de resistencia a péptidos

antimicrobianos: (i) la modificación o el bloqueo de ácido teicoico (ii) alteraciones en la

membrana citoplasmática, (iii) la intervención de proteasas (iv) la cadena de transporte de

electrones defectuosa y (v) la participación de sistema de respuesta al estrés bacteriano.

La cepa utilizada en los ensayos, S. aureus ATCC 25923

(Staphylococcus aureus Rosenbach) corresponde a una cepa de referencia, β-lactamasa

negativa, y mecA negativa, no resistente a antibióticos.

1.2.2 Escherichia coli (E. coli)

Es un bacilo Gram negativo, anaerobio facultativo de la familia Enterobacteriaceae,

clasificación superior: Escherichia. Esta bacteria coloniza el intestino del hombre pocas

horas después del nacimiento y se le considera un microorganismo de flora normal, pero hay

cepas que pueden ser patógenas y causar daño produciendo diferentes cuadros clínicos, entre

Marco Teórico 12

ellos diarrea [49]. Escherichia coli es una causa frecuente de infecciones mortales del

torrente sanguíneo y otras infecciones comunes, como las infecciones del tracto urinario

[49]. Con base en su mecanismo de patogenicidad y cuadro clínico, las cepas de E.

coli causantes de diarrea se clasifican en seis grupos: (i) enterotoxigénica (ii) Shiga (iii)

enteroinvasiva (iv) enteropatógena (v) enteroagregativa y (vi) de adherencia difusa [49].

La teoría clonal de la patogenicidad de E. coli sugiere que las cepas patógenas son

descendientes de unas pocas líneas ancestrales que adquirieron la virulencia a través de

genes para enterotoxinas, factores de colonización y otras características. Los mecanismos

de virulencia son complejos, dependiendo no sólo de factores individuales tales como

hemolisinas, adhesinas fimbriales, citotoxinas y polisacáridos capsulares sino también de

sus interacciones [50,51]. Las tasas de resistencia a los antibióticos en E. coli están

aumentando rápidamente, especialmente con respecto a las fluoroquinolonas y

cefalosporinas de tercera y cuarta generación. Sorprendentemente, la mayoría de las cepas

resistentes a múltiples fármacos son adquiridas en la comunidad en lugar de

establecimientos de salud. El problema es crítico en los países en desarrollo, donde los

recursos, los controles y la vigilancia son escasos. Un gran número de personas que viven

en países en desarrollo se infectan con E. coli multiresistente que puede llegar a ser intratable

efectivamente [50]. Se ha descrito resistencia de bacterias Gram-negativas (entre las que se

encuentra E. coli) frente a los péptidos antimicrobianos catiónicos. Los mecanismos de

resistencia sugeridos son (i) modificación de las estructuras de superficie (ii) la formación

de biopelículas (iii) la utilización de bombas de salida (iv) agentes secuestrantes (v)

producción de proteasas (vi) alteración de la respuesta inmune para prevenir su inducción

[52].

Sin embargo, se ha identificado favorablemente una interacción sinérgica entre algunos

péptidos antimicrobianos y antibióticos, Ulvatnea et al. (2001) sugieren que cinco péptidos

antimicrobianos (6-18 residuos) y eritromicina tienen un efecto sinérgico frente a E. coli

25922 al igual que dos péptidos antimicrobianos y rifampicina [53]. La cepa utilizada en los

ensayos, E. coli (Migula) Castellani and Chalmers ATCC 25922 corresponde a una cepa de

referencia β-lactamasa negativa, no resistente a antibióticos.

Marco Teórico 13

2. Hipótesis

La misma actividad antibacteriana presentada por la LfcinB 17-31, frente a Gram positivas

y Gram negativas, puede ser obtenida usando péptidos más cortos derivados de esta

secuencia.

14

3. Objetivos

3.1 Objetivo General

Obtener péptidos cortos derivados de la Lactoferricina Bovina 17-31 (LfcinB 17-31:

17FKCRRWQWRMKKLGA31) y evaluar su actividad antibacteriana frente a

Escherichia coli ATCC 25922 y Staphylococcus aureus ATCC 25923.

3.2 Objetivos específicos

3.2.1 Sintetizar péptidos derivados de la LfcinB 17-31, que contengan el motivo

RRWQWR, usando la estrategia SPPS-Fmoc/tBu.

3.2.2 Purificar por Extracción en Fase Sólida (SPE) y caracterizar por cromatografía

líquida en fase revesa (RP-HPLC) y espectrometría de masas MALDI-TOF los

péptidos obtenidos.

3.2.3 Evaluar la actividad antibacteriana de los péptidos sintéticos mediante ensayos in

vitro utilizando bacterias Gram positivas y Gram negativas, específicamente


Metodología 15

4. Metodología

Se sintetizaron 14 péptidos derivados del fragmento 17-31 (17FKCRRWQWRMKKLGA31)

de la LfcinB, descritos en la Tabla 1, todos contienen el motivo RRWQWR. Los péptidos

fueron purificados, caracterizados y se les evaluó su actividad antibacteriana frente a


Tabla 1. Secuencias derivadas de LfcinB diseñados, sintetizadas, purificadas y caracterizadas

Código Secuencia

LfcinB 17-31

FKCRRWQWRMKKLGA

[Ala19

]-LfcinB 17-31 FKARRWQWRMKKLGA

([Ala19

]-LfcinB 17-31) 2 (FKARRWQWRMKKLGA)

2K-Ahx-C

LfcinB 18-31 KCRRWQWRMKKLGA

LfcinB 19-31 CRRWQWRMKKLGA

LfcinB 20-31 RRWQWRMKKLGA

LfcinB 17-30 FKCRRWQWRMKKLG

LfcinB 17-29 FKCRRWQWRMKKL

LfcinB 17-28 FKCRRWQWRMKK

LfcinB 17-27 FKCRRWQWRMK

LfcinB 17-26 FKCRRWQWRM

LfcinB 17-25 FKCRRWQWR

LfcinB 20-25 RRWQWR

(LfcinB 21-25) Palíndroma RWQWRWQWR

(LfcinB 20-25)4 ((RRWQWR)

2K-Ahx-C)

2

Lactoferrina Bovina

4.1 Reactivos y materiales

Metodología 16

Los reactivos, resina Rink amida, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Lys(Fmoc)-

OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Trp(Boc)-OH, Fmoc-Gln(Trt))-OH, Fmoc-

Met-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-6-aminohexanoico, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Cys(Trt)-OH,

TBTU, diciclohexilcarbodiimida, 1-Hidroxi-6-clorobenzotriazol fueron adquiridos de

AAPPTec (Louisville, KY, USA). Los reactivos acetonitrilo, ácido trifluoroacético,

diclorometano, diisopropiletilamina, N,N-dimetilformamida, etanoditiol, isopropanol,

metanol y triisopropilsilano fueron adquiridos de Merck (Darmstadt, Germany). La

Lactoferrina y Columnas SPE Supelclean™ LC-18 fueron adquiridos de Sigma-Aldrich (St.

Louis, MO, USA). Los medios Tryptic Soy Agar (TSA), Mueller Hinton Agar, y Plate

Count Agar (PCA) fueron adquiridos de Scharlau. El medio Mueller Hinton broth fue

adquirido de Merck. Las cepas bacterianas Escherichia coli ATCC 25922 y Staphylococcus

aureus ATCC 25923 fueron adquiridas de la ATCC. Todos los reactivos fueron empleados

directamente sin purificaciones posteriores.

4.2 Obtención de péptidos derivados de LfcinB mediante Síntesis

en Fase Sólida (SPPS) por la estrategia Fmoc/tBu

La obtención de los péptidos diseñados fue realizada empleando la SPPS, mediante la

estrategia Fmoc/tBu [54], se desarrolló según el protocolo establecido en el grupo de Síntesis

y Aplicación de Moléculas Peptídicas (SAMP) para la obtención manual de péptidos

sintéticos asistida por microondas [22, 55].

A continuación, se describen brevemente las etapas del procedimiento (Figura 2), (i) la

resina Rink amida (0.46 meq/g) se somete a un proceso de hinchamiento de acuerdo con las

recomendaciones del fabricante, luego (ii) el grupo Fmoc es removido tratando la resina con

solución de desprotección [55] quedando disponibles los grupos amino para permitir la

incorporación del primer aminoácido. La resina es lavada exhaustivamente y se realiza

entonces la reacción de (iii) acople del aminoácido a la cadena creciente, cabe aclarar que

previamente el aminoácido es activado a temperatura ambiente por 15 minutos y luego se

trata la resina, desprotegida y lavada, con el aminoácido activado, para permitir la formación

del enlace peptídico. También, durante cada ciclo sencillo de acople, a la resina mezclada

con el aminoácido activado se le realizan dos tratamientos con microondas (30 s cada uno)

Metodología 17

(iv) La reacción de monitoreo se realiza con el reactivo de Ninhidrina que permite

determinar la presencia de grupos amino libres [56]. Después de confirmar que la reacción

de acople es completa se (v) desprotege nuevamente el grupo α-amino y así se generan los

grupos alfa aminos libres disponibles para el acople del siguiente aminoácido. El (vi)

monitoreo de la reacción de desprotección permite evaluar si existen reacciones

incompletas. Esta serie de reacciones (ii-vi) se realizan hasta incorporar todos los

aminoácidos correspondientes a la secuencia de interés.

Finalmente se efectúan las reacciones de desprotección de las cadenas laterales, el desanclaje

del péptido del soporte sólido, la extracción y la precipitación del péptido en un medio no

polar. El producto crudo es analizado por cromatografía líquida de alta eficiencia en fase

reversa (RP-HPLC), y purificado por extracción en fase sólida (SPE) con elución por

gradiente; el producto purificado es caracterizado por RP-HPLC y por espectrometría de

masas MALDI-TOF. A continuación, se describe en detalle los protocolos usados en cada

etapa de la síntesis.

4.2.1 Reacción de remoción del grupo Fmoc (Figura 2. Paso 1)

Los aminoácidos empleados en la SPPS/Fmoc-tBu presentan una protección ortogonal, por

un lado, el grupo funcional alfa-amino (α-NH2) viene protegido por el grupo Fmoc y las

cadenas laterales de los AA presentan grupos protectores que son lábiles al tratamiento con

ácido trifluoroacético, por ejemplo, los grupos tritilo o terbutilo, entre otros. La remoción

del grupo protector Fmoc se realiza por tratamiento con una base débil por una reacción de

β-eliminación. Para este fin se utiliza una solución de 4-metilpiperidina al 25% v/v que

contiene tritón al 1% v/v, el solvente empleado es DMF [55]. La resina es tratada dos veces

con la solución de desprotección con asistencia del microondas (30 s). Finalmente, la resina

se lava exhaustivamente con DMF (4 × 1 min), IPA (4 × 1 min) y DCM (4 × 1 min) y se

realiza el test de Kaiser.

Metodología 18

Figura 2. Síntesis de Péptidos en Fase Sólida (SPPS). Diagrama del protocolo empleado. En el test

de Kaiser, B: blanco, 1. Test de desprotección y 2. Test de acople

1. Desprotección 2. Acople

Fmoc-Ala-OH

1.1. DCM/DMF

1.2. 4-metilpiperidina

1.3. Lavar -Test de Kaiser

2.1. AA:DCC:6-Cl-HOBT

2.2 Lavar (DMF,DCM)

2.4. Test de Kaiser1

2

Fmoc-Gly-OH

3. Clivaje

TFA

1 …

.2 1

LfcinB 17-31: FKCRRWQWRMKKLGA

Test de Kaiser

B1

2

Metodología 19

4.2.2 Reacción de activación de los Fmoc-aminoácidos y acople del

aminoácido a la resina (Figura 2. Paso 2)

Para la activación del grupo ácido carboxílico de los Fmoc-AA se emplean varias

estrategias, que conducen a la formación de ésteres; si la reacción de formación del enlace

peptídico no era completa se cambiaba la estrategia, hasta obtener test de Kaiser negativo.

A continuación son descritos los protocolos para activar los aminoácidos, en el orden que se

emplearon: (i) Estrategia de éster modificado; se disuelve el aminoácido (AA), DCC, 6-Cl-

HOBt (1:1:1; 5 excesos respecto a los mEq de resina) en DMF, y se agita por 15 min a

temperatura ambiente (TA). (ii) Sales de uronio; se disuelve una mezcla que contiene 5

excesos de AA, 6-Cl-HOBt, y TBTU (1:1:1), luego se adicionan 3 excesos de DIPEA

respecto al TBTU, en DMF, la mezcla se agita por 5 min a TA. Una vez activado el

aminoácido es adicionado a la resina desprotegida, se agita y se introduce al microondas

cuatro veces (30 s, c/u), entre cada tratamiento la mezcla de reacción se enfría en un baño

de hielo. La solución de acople se retira mediante filtración y se realizan los lavados con

DMF (2 × 1 min), IPA (2 × 1 min) y DCM (2 × 1 min), finalmente se realiza el test de Kaiser

[56].

4.2.3 Reacción de monitoreo (test de Kaiser)

Para realizar la prueba de Kaiser [49], se preparan tres soluciones: (i) 40 g de Fenol disueltos

en 10 mL de etanol absoluto; (ii) 0,65 mg de KCN, 1,0 mL de agua y 49,0 mL de Piridina;

(iii) 1.25 g de Ninhidrina en 25 mL de etanol absoluto. Las soluciones (i) y (ii) son mezcladas

y almacenadas (Solución A) la solución (iii) corresponde a la Solución B, que se debe

almacenar en la oscuridad. Para realizar la prueba se toma una fracción de la resina-péptido

seca (~1 mg), y se le adicionan las Soluciones A y B en proporción 2:1 (v/v). Una vez la

mezcla es homogenizada se somete a calentamiento a 105 ºC por 5 min, y se observa el color

generado por la reacción. Una coloración azul indica prueba positiva para la presencia de

grupos aminos libres y coloración amarilla, prueba negativa (ver, Test de Kaiser en la Figura

1). Para grupos amino secundario (Prolina), la prueba positiva se tiene cuando la resina se

torna roja y la solución es amarilla.

Metodología 20

4.2.4 Reacción de desprotección de las cadenas laterales y desanclaje del

péptido del soporte sólido (Figura 2. Clivaje)

Una vez se han incorporado todos los aminoácidos de la secuencia diseñada se realiza la

remoción del grupo Fmoc y la resina-péptido desprotegida se seca, pesa y se le adiciona una

solución de desprotección y desanclaje, que contiene TFA/H2O/EDT/TIPS (92.5/2.5/2.5/2.5

% v/v). La reacción se deja en agitación a TA por un periodo de tiempo entre 6 y 12 h. La

solución es filtrada y el péptido precipitado por tratamiento con éter etílico frío. La solución

se centrifuga a 2500 rpm por 10 min y el sobrenadante se desecha, luego se realizan 5

lavados con éter etílico frío bajo las mismas condiciones descritas.

4.2.5 Oxidación para la obtención de tetrámeros

La estrategia de obtención de las moléculas tetraméricas se realizó según la metodología

descrita por León MA et al. [22], que brevemente consiste en la oxidación de un péptido

dimérico sintético que contiene un espaciador, Ahx, y un solo residuo Cys en el extremo C-

terminal, como agente oxidante se emplea DMSO al 10% a pH 7,5 la reacción se monitorea

por RP-HPLC, cuando la reacción es completa, se caracteriza por espectrometría de masas.

4.3 Caracterización de los péptidos por cromatografía analítica

RP-HPLC y espectrometría de masas MALDI-TOF

4.3.1 Análisis por RP-HPLC

Se desarrolló un método por RP-HPLC para el análisis de péptidos sintéticos empleando una

columna monolítica Chromolith® C18 (50 × 4,6 mm). Se preparó de cada péptido un stock

de 1 mg/mL y se analizaron 10 µL con un gradiente de elución del 5 al 70 % de Solvente B

(ACN 0,05% TFA) en Solvente A (agua 0,05% TFA), el tiempo de gradiente (tG) fue de

11,5 minutos y el tiempo total de 15 minutos; el análisis se realizó a un flujo de 2,0 mL/min,

a 210 nm en el cromatógrafo Agilent series 1260.

Metodología 21

Para el desarrollo del método se realizó un análisis comparativo de una mezcla artificial de

cinco péptidos crudos usando las columnas Eclipse XDB-C18 (Agilent, 4,6 × 150 mm, 3,5

μm) y Chromolith® C18 (Merck, 50 × 4,6 mm). Se evaluaron diferentes flujos y tiempos de

gradiente, manteniendo el factor de retención constante para conservar la resolución. En la

tabla 2 se detallan los métodos diseñados, se comparó la resolución obtenida, los tiempos y

presión del análisis.

Tabla 2. Métodos diseñados para el análisis de péptidos, empleando una columna empacada y una

columna monolítica.

4.3.2 Purificación de los péptidos por extracción en fase sólida (SPE)

Para la purificación de los péptidos se emplearon columnas de RP-SPE de 5g (Tamaño de

partícula: 40-60 µm) [58]. El péptido se disolvió en el Solvente A, la muestra se sembró

sobre la columna, y luego se eluyó con fracciones que contenían diferentes porcentajes de

Solvente B. El péptido purificado fue liofilizado para determinar los porcentajes de

rendimiento en la síntesis.

4.3.3 Análisis por espectrometría de masas

El peso molecular de los péptidos se determina mediante espectrometría de masas MALDI-

TOF (Autoflex, Bruker), 1 µL de la solución stock de péptido purificado (0.5 mg/mL) con

Columna Eclipse XDB-C18

(4.6 × 150 mm, 3.5 𝜇m)

Columna Chromolith® C18

(50 × 4,6 mm)

Método F

(mL/min) ∆Ф tG tGF Método

F

(mL/min) ∆Ф tG tGF

1 1,0 0,65 45,0 45,0 4 2,0 0,65 11,5 23,0

2 1,5 0,65 30,0 45,0 5 3,0 0,65 7,7 23,0

3 1,0 0,65 11,5 11,5 6 4,0 0,65 6,8 23,0

7 5,0 0,65 4,6 23,0

k*: factor de retención en el gradiente tG: tiempo del gradiente; F: flujo;

Vm: volumen muerto; ∆Ф: rango del gradiente; S: constante

(dependiente del peso molecular de los analitos) [57].

Metodología 22

18 μL de matriz (ácido α-ciano-4-hidroxicinámico ,1 mg/mL) son mezclados y aplicados

sobre la placa porta muestra. La potencia del láser oscila entre 2700 y 3000V.

4.4 Determinación de la actividad antibacteriana

La Concentración mínima inhibitoria (MIC) y la Concentración mínima bactericida (MBC)

se hallan mediante ensayos in vitro empleando bacterias Gram positivas y/o Gram negativas.

Para el desarrollo del trabajo se seleccionaron las cepas Escherichia coli ATCC 25922 y

Staphylococcus aureus ATCC 25923. Los ensayos in vitro son importantes para el estudio

de la susceptibilidad de bacterias Gram positivas y/o Gram negativas frente a nuevos agentes

antibacterianos, siendo la determinación de la MIC uno de los primeros pasos para evaluar

el potencial antibacteriano. Los métodos de dilución son usados para determinar la MIC,

estos son considerados como referencia para ensayos de susceptibilidad in vitro y son

también empleados para evaluar la eficacia de otros métodos de ensayos de susceptibilidad

[59-60].

4.4.1 Acondicionamiento de las cepas bacterianas

Se hace una activación de la cepa de acuerdo al protocolo establecido por la ATCC. A este

inóculo se le debe efectuar un mantenimiento periódico antes de los 30 días en un agar no

selectivo [59-60]. Para la caracterización morfológica de la cepa de trabajo, se realiza un

aislamiento de la cepa en Agar Mueller Hinton (AMH) por agotamiento, se incuba por 24

horas a una temperatura de 37 ºC, y se observan las características de las colonias, luego se

realiza una coloración de Gram para comprobar la morfología y la afinidad por el colorante

de la cepa incubada, el protocolo de este ensayo consistió en el tratamiento con: solución

de (i) cristal violeta (1 min), (ii) lugol (1 min), (iii) alcohol-acetona (30 segundos) y (iv)

fucsina (15 segundos).

4.4.2 Curva de calibración

Con el objetivo de determinar una relación entre la cantidad de células (UFC) y la

absorbancia (Abs) medida a 620 nm, se efectuó una curva de calibración para la cepa de

Metodología 23

estudio; para ello, se realizaron diluciones seriadas en base 2 del inóculo inicial con medio

Mueller Hinton Caldo, posteriormente se distribuye cada dilución en una placa de 96 pozos

y a partir de esta se realizan diluciones seriadas en base 10, luego se efectúa la lectura de la

absorbancia en un lector de microplacas Asys Expert Plus a una longitud de onda de 620

nm. Se toman 200 µL de cada una de las diluciones establecidas para conteo (dependiendo

del crecimiento de la cepa evaluada) Tabla 3, así como de medio sin bacteria (control

negativo); esta dispersión se coloca en una caja de Petri, se adicionan aproximadamente 25

mL del medio Agar Plate Count (SPC) (Siembra en profundidad) y se agita cada caja con el

fin de distribuir el inóculo lo más homogéneamente posible, se deja solidificar el medio y

se incuba por 24 horas a 37°C en atmósfera aerobia. Después de las 24 horas de incubación,

se hace el conteo de las unidades formadoras de colonias (UFC). Para la gráfica de la curva

de calibración, en el eje de las ordenadas (eje Y) se ubica la absorbancia obtenida de las

diluciones en base 2, y en el eje de las abscisas (eje X) se ubica las UFC/mL (los datos de

las unidades formadoras de colonia por la dilución respectiva y la división por el factor de

dilución de 0.2). A continuación, se presentan las diluciones establecidas para el conteo de

las colonias.

Tabla 3. Diluciones escogidas para sembrado y conteo de colonias.

4.4.3 Actividad antibacteriana

La MIC se determina utilizando el ensayo de microdilución, según las guías de CLSI [59],

el inóculo se obtiene por el método de crecimiento en caldo: (i) La cepa bacteriana se incuba

E. coli S. Aureus

Inóculo Original (1:1) 105,10

6, 10

7, 10

810

5,10

6, 10

7, 10

8

1:2 105,10

6, 10

710

5,10

6, 10

7, 10

8

1:4 105,10

6, 10

710

5,10

6, 10

7

1:8 105,10

6, 10

710

4,10

5,10

6

1:16 105,10

6, 10

7 10

4,10

5, 10

6

1:32 104,10

5,10

610

4,10

5,10

6

Diluciones en base 10 (sembrado)

Dilución en base 2

Metodología 24

a 37°C en caldo de cultivo Mueller Hinton hasta alcanzar una concentración de bacterias

equivalente a Mcfarland Standard No. 0.5 [58, 59], que se obtiene por método

espectrofotométrico. (ii) Se diluye hasta 1.0 ×106 UFC/ml de tal forma que, al adicionar el

inóculo en la microplaca de 96 pozos, la concentración final de bacterias en el pozo sea de

5 ×105 UFC/ml. [59,60].

Para E. coli 25922, el inóculo se ajusta a aproximadamente 0,11 unidades de absorbancia a

620 nm y para S. aureus 25923, el inóculo se ajusta a aproximadamente 0,12 unidades de

absorbancia a 620 nm. Para el ensayo de MIC se efectúa una dilución en serie del péptido

(p.e: 200, 100, 50, 25, 12,5. 6,25 µM), se le adiciona el inóculo para una concentración final

de inóculo de 5×105 UFC/mL en el pozo, y se incuba durante 18 horas a 37°C. Después de

la incubación, se mide la absorbancia a 620 nm utilizando un Asys Lector de Expert Plus

ELISA. Para la determinación de la MBC, se toma una muestra con la punta del asa, se

extiende sobre las placas de agar Mueller Hinton, y se incuba por 24 horas a 37°C.

Todos los péptidos se evalúan por duplicado, los controles son control de esterilidad: CE

(medio Mueller Hinton Caldo), control positivo de crecimiento: Control + (medio Mueller

Hinton Caldo e inóculo), en los ensayos también se incluye un control negativo de

crecimiento: Control −, que corresponde al antibiótico frente al cual es sensible la bacteria;

para E. coli se utiliza Ciprofloxacina (CIP) 2µg/ml, y para S. aureus se utiliza Gentamicina

(GEN) 4,8 µg/ml.

Resultados y Discusión 25

5. Resultados y Discusión

Se diseñaron 13 péptidos derivados del fragmento 17-31 de la LfcinB (LfcinB 17-31:

17FKCRRWQWRMKKLGA31), en todos los casos los péptidos contenían la secuencia

mínima con actividad antibacteriana reportada (RRWQWR) [18]. Puntualmente, (i) Se

diseñó un análogo de LfcinB 17-31 en el que se cambió la 19Cys por un residuo de Ala

([Ala19]-LfcinB 17-31). También se diseñaron péptidos cortos, en los que la longitud de la

cadena respecto a LfcinB 17-31 se redujo eliminando de forma secuencial los residuos del

(ii) extremo N-terminal, que corresponden a los péptidos Lfcin 18-31 al 20-31; y eliminado

los residuos del (iii) extremo C-terminal, péptidos Lfcin 17-30 al 17-25. Además, se

incluyeron en el diseño (iv) dos dímeros, de los cuales uno de ellos se oxidó para formar un

tetrámero y (vi) una secuencia lineal palíndroma. Se sintetizaron como controles para los

ensayos biológicos los péptidos LfcinB 17-31 y LfcinB 20-25 (Tabla 1).

A continuación, se presentan los resultados obtenidos durante el desarrollo de este proyecto,

primero se discute la implementación de un método de análisis de péptidos sintéticos por

RP-HPLC que permitió la caracterización rápida y eficiente de las moléculas obtenidas y las

fracciones propias de la purificación de cada una de ellas. Luego, se presentan los resultados

de la síntesis y caracterización de los péptidos diseñados, y finalmente se muestra la

evaluación comparativa de la actividad antibacteriana de las moléculas frente a una cepa

Gram positiva y una Gram negativa.


5.1. Desarrollo de un método de análisis por RP-HPLC para

péptidos sintéticos empleando una columna monolítica

La síntesis de péptidos en fase sólida (SPPS) es un proceso versátil, que permite la obtención

de moléculas análogas a las naturales ya sean lineales, diméricas, o tetraméricas, así como

la incorporación de aminoácidos no naturales, marcadores fluorescentes, azúcares, motivos

organometálicos, etc. Dentro de este contexto, la evaluación del proceso sintético se realiza

al producto terminado mediante técnicas como la RP-HPLC y la espectrometría de masas

(EM), cabe resaltar que los productos deben ser purificados antes de su empleo en los

ensayos de actividad, y la evaluación del proceso de purificación también emplea las

técnicas mencionadas. La complejidad que se puede tener en los productos exige un análisis

cromatográfico eficiente, para lograr esto, en nuestro grupo se diseñó y utilizaba

rutinariamente un análisis empleando la columna empacada Eclipse XDB-C18 (4.6 × 150

mm, 3.5 𝜇m), y haciendo un gradiente lineal de 5 a 70 % del Solvente B en el Solvente A,

en un tiempo de gradiente de 45 min a un flujo de 1 mL/min [22]. Si bien este análisis nos

permitía evaluar los productos de la síntesis y los procesos de purificación de manera

adecuada, presentaba el inconveniente del tiempo empleado, en total 70 minutos, incluyendo

los lavados y el equilibrio de la columna (Figura 3, Método 1). Obtener resultados,

especialmente durante el proceso de purificación, en el que por cada péptido se analizan

entre 5 y 8 fracciones, demandaba un tiempo prolongado que hacía costoso el proceso.

Teniendo en cuenta que en el presente trabajo se sintetizaron 15 péptidos, y se necesitaba

caracterizar los productos crudos y las fracciones de la purificación, se realizó un estudio

con el objetivo de reducir los tiempos de análisis por RP-HPLC conservando la resolución

obtenida con el método tradicional en el que empleaba la columna empacada. Para esto, se

preparó una mezcla de cinco péptidos sintéticos crudos que presentaban diferentes

características fisicoquímicas y tiempos de retención, la cual fue empleada como analito

modelo para evaluar los métodos diseñados.

Como una alternativa para disminuir el tiempo de análisis usando la columna empacada, se

diseñó el Método 2 (datos tabulados en la figura 3), en el que se aumentó el flujo y

disminuyó el tiempo del gradiente, manteniendo el producto de tGF constante respecto al


Método 1 (figura 3), con lo cual se garantiza que el factor de retención en el gradiente (k*)

es igual en ambos análisis y la resolución se mantiene constante [57]. Como se observa en

la figura 3 la presión del sistema aumentó a 208 bar y el tiempo de análisis se redujo en el

mismo factor que se aumentó el flujo, conservándose la resolución del Método 1. Para seguir

reduciendo el tiempo de análisis sería necesario continuar aumentando el flujo, pero el

incremento en la presión es un factor limitante (p.e. si se lleva a un flujo de 2,0 mL/min el

sistema, la presión sería cercana a 288 y el límite del equipo son 350 bar).


empacada.

Como alternativa, se diseñó el Método 3, en el que se disminuyó k* en un factor de cuatro

respecto al Método 1, se conservó el flujo en 1,0 mL/min. En la Figura 3, se observa que

Columna empacada Eclipse XDB-C18

MétodoF

(mL/min)

Presión

(bar)

Resolución

(Rs)

1 1,0 144 1,4

2 1,5 208 1,4

3 1,0 144 0,8


este análisis es más rápido pero la resolución se reduce y no se obtiene una buena separación

de los picos.


monolítica

Para poder disminuir el tiempo de análisis se decidió usar una columna C18 monolítica,

estas columnas por presentar mayor porosidad, permiten el aumento del flujo sin un

incrementar drásticamente la presión (datos tabulados en la figura 4). Para el estudio con la

columna monolítica se diseñó el Método 4, el cual presenta respecto al Método 3 los mismos

valores de ∆Ф y tG a un flujo de 2mL/min; se observa que la separación fue tan eficiente

como la obtenida en el Método 1 con la columna empacada, con una reducción del tiempo

de análisis a 15 min (incluyendo el tiempo de equilibrio de la columna), cabe resaltar que la

presión del equipo fue de 74 bar. Este método es eficiente y rápido para el análisis de los

péptidos y además se consume solo el 60% de solventes comparado con el método

Columna Chromolith® C18

MétodoF

(mL/min)

Presión

(bar)

Resolución

(Rs)

4 2,0 74 1,8

5 3,0 110 1,8

6 4,0 142 1,8

7 5,0 185 1,8


tradicional en la columna empacada. Este método fue seleccionado para los análisis

posteriores de los péptidos objetos de este trabajo.

Finalmente, se quiso evaluar el alcance de la columna monolítica en el análisis de los

péptidos sintéticos, para lo que, empleando diferentes flujos y conservando el valor de tGF

constante (datos tabulados en la figura 4) se diseñaron los métodos 5 al 7, en todos los casos

se conservó la eficiencia de la separación y se redujo el tiempo de análisis en un factor igual

al cambio del flujo. A manera de ejemplo en figura 4 se muestra el resultado del análisis

con el Método 7 (5 mL/min), en el que el análisis total sólo emplea 8 minutos.

5.2. Síntesis y purificación de los péptidos

Las secuencias diseñadas fueron sintetizadas por la estrategia SPPS-Fmoc/tBu manual,

siguiendo el protocolo de síntesis descrito en la metodología. En las figuras del Anexo 1 se

muestra el comportamiento de la síntesis de cada uno de los péptidos (Panel B), en todos los

casos se observa que para la mayoría de los aminoácidos solo se necesitó un ciclo de acople

(usando el éster modificado), cabe resaltar que, durante cada ciclo sencillo de acople, a la

resina mezclada con el aminoácido activado se le realizaron cuatro tratamientos con

microondas (30 s cada uno). Ningún aminoácido necesitó más de dos ciclos de acople para

tener un test de ninhidrina (Kaiser) negativo. Los péptidos crudos fueron analizados por RP-

HPLC (usando el Método 4), en todos los casos los perfiles cromatográficos mostraron una

especie principal, con un porcentaje de área relativo entre el 44 % y 72 %.

Los péptidos son moléculas complejas y cada secuencia es única con respecto a sus

propiedades químicas y físicas, mientras que algunos péptidos son difíciles de sintetizar,

muchos péptidos son relativamente sencillos. Es de aclarar que una síntesis sencilla no

implica una purificación fácil, las secuencias diseñadas para este trabajo tienen una longitud

menor de 20 residuos de aminoácido, son secuencias que contienen varios aminoácidos

básicos (R, K), lo cual las hace hidrofílicas y solubles en medio acuoso, lo que facilita la

purificación por RP-SPE. Los péptidos con múltiple cisteína, metionina, arginina y

triptófano o las secuencias que tienen aminoácidos que se repiten en varias zonas pueden

tener dificultades sintéticas, con rendimientos de acoplamiento pobres. En este estudio, los


aminoácidos que requirieron un segundo ciclo de acople corresponden en su mayoría a la

secuencia 20R21R. Por otro lado, los rendimientos del producto crudo variaron entre el 60 y

95%, siendo el péptido de menor rendimiento el LfcinB 17-29, estos resultados son

congruentes con los obtenidos para otras secuencias similares, derivadas de Lfcin [22].

Figura 5. Perfil cromatográfico del péptido LfcinB 17-25 (FKCRRWQWR) antes y después del

proceso de purificación

En la Figura 5 (panel superior) se muestra, a manera de ejemplo, el perfil cromatográfico

del péptido LfcinB 17-25 crudo en el que se observa una especie principal cuyo porcentaje

de área relativo fue de 44%, se observan también especies propias de subproductos de

síntesis. El análisis de masas mostró especies de mayor peso molecular, principalmente

reacciones incompletas de remoción de los grupos de las cadenas laterales, entre otros.

Cabe resaltar que todas las secuencias contienen residuos de Arg, cuyo grupo protector (Pbf)

exige tiempos prolongados de clivaje (hasta 12 horas) e implica la presencia de scavengers

en concentraciones altas. Adicionalmente, las secuencias contienen residuos de triptófano,

Minutes

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

mA

U

0

200

400

600

800 4.7

Péptido puro

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 100

500

1000

1500

20004.7

Péptido crudo


cuya cadena lateral es muy sensible a reacciones de alquilación y en clivajes con tiempos

prolongados puede formar un aducto con el TFA. Por ese motivo, fue necesario estandarizar

para todas las secuencias el proceso de clivaje en cuanto a proporciones de resina-mezcla de

clivaje, tiempo y composición del cóctel de clivaje.

Tabla 4. Caracterización de los péptidos sintéticos por RP-HPLC

Código Secuencia tR

min

%

áreaa

Rendimiento

Puro (%)b

LfcinB 17-31 FKCRRWQWRMKKLGA 4,98 87 16

[Ala19

]-LfcinB 17-31 FKARRWQWRMKKLGA 4,94 97 20

([Ala19


2K-Ahx-C 5,52 87 18

LfcinB 18-31 KCRRWQWRMKKLGA 4,71 92 10

LfcinB 19-31 CRRWQWRMKKLGA 4,99 96 25

LfcinB 20-31 RRWQWRMKKLGA 4,95 90 9

LfcinB 17-30 FKCRRWQWRMKKLG 4,96 83 12

LfcinB 17-29 FKCRRWQWRMKKL 5,06 91 5

LfcinB 17-28 FKCRRWQWRMKK 4,68 86 5

LfcinB 17-27 FKCRRWQWRMK 4,87 90 13

LfcinB 17-26 FKCRRWQWRM 5,17 95 7

LfcinB 17-25 FKCRRWQWR 4,73 88 11

LfcinB 20-25 RRWQWR 4,19 91 37

(LfcinB 21-25) Palíndroma RWQWRWQWR 5,95 93 30

(LfcinB 20-25)2 (RRWQWR)

2K-Ahx-C 5,21 90 33

Lactoferrina Bovina NA 85 NA a Porcentaje de área del pico cromatográfico (RP-HPLC) de la fracción más pura. b Porcentaje de la fracción más pura respecto a la cantidad teórica.

tR= tiempo de retención en minutos, empleando el Método 4 y la columna monolítica

NA= no aplica

Como se observa en la figura 5, los péptidos sintéticos deben ser purificados antes de

cualquier determinación de actividad biológica, para este proceso, se empleó cromatografía

líquida usando columnas de extracción en fase sólida (RP-SPE) y elución con aumento de

la concentración del solvente B, para cada péptido fue necesario diseñar un gradiente

particular de elución que dependía del tR del analito (hidrofobicidad), de la cantidad de


subproductos y de la resolución de los mismos frente a la especie de interés. De este proceso

se obtuvieron moléculas cuyas purezas (determinadas por RP-HPLC) se encuentran entre

83% y 97% (Tabla 4). En la figura 5 (panel inferior) se muestra, a manera de ejemplo, el

perfil cromatográfico del péptido LfcinB 17-25 después del proceso de purificación, en el

que para la especie principal se obtuvo un 88% de área relativa.

En el Panel C de cada una de las figuras del anexo 1 se muestran los perfiles cromatográficos

de los péptidos purificados. Los rendimientos del producto puro están en el rango del 5% al

37 % (Tabla 4). Los péptidos puros fueron analizados por espectrometría de masas MALDI-

TOF, y en todos los casos se observó una señal principal correspondiente a la relación m/z

del ion [M+H]+, donde M es la masa monoisotópica de la especie deseada. En el panel D

del Anexo 1 se presentan los espectros de masas de todos los péptidos.

5.3. Determinación de la actividad antibacteriana

5.3.1 Curva de calibración

Para determinar la concentración mínima inhibitoria (MIC), se requiere evaluar el agente

antibacteriano frente a una concentración de inóculo conocida, esto se logra estableciendo

la relación entre la cantidad de UFC/mL y la absorbancia a 620 nm [59]. Se realizó la curva

de calibración según lo descrito en la metodología; los datos obtenidos para las cepas

bacteriana seleccionadas E. coli ATCC 25922 y S. aureus ATCC 25923 se presentan en la

figura 6. En cada caso se ajustó la curva a una línea recta usando mínimos cuadrados; la

ecuación de cada recta y el coeficiente de determinación son presentados en la figura.


Figura 6. Curvas de calibración de las cepas bacterianas.

5.3.2 Actividad antibacteriana

El interés en el desarrollo de agentes terapéuticos antibacterianos basados en péptidos

antimicrobianos (AMP´s) ha surgido debido al incremento en la frecuencia de resistencia de

las bacterias frente a los antibióticos convencionales, estos péptidos han presentado un

amplio espectro de actividad, y dentro de los muchos reportados, la LfcinB es de interés, ya

que presenta una actividad antibacteriana frente a bacterias Gram (+) y Gram (−) y además

ha demostrado ser un agente sinérgico eficaz cuando se utiliza en combinación con

antibióticos y agentes antifúngicos, lo cual no sólo proporciona una alternativa para el

tratamiento de cepas resistentes, sino que también sugiere una estrategia para disminuir la

creciente aparición de resistencia a los medicamentos mediante la reducción de su uso [15].

Dentro de este contexto, en este trabajo se evaluó la actividad antibacteriana de péptidos

derivados de la secuencia LfcinB 17-31 (17FKCRRWQWRMKKLGA31) que es un

fragmento de LfcinB del que se ha reportado que presenta igual o similar actividad

antimicrobiana que la obtenida para la secuencia de 25 residuos.

Para el presente estudio se seleccionaron dos cepas bacterianas y, como punto de partida, se

evaluó la actividad del péptido LfcinB 17-31 frente a cada una ellas. En la figura 7, panel

A, se presentan los datos obtenidos en la determinación del MIC; Se observa que para la

bacteria E. coli ATCC 25922 el péptido presenta un MIC de 200 µM, y para la bacteria S.

E. coli ATCC 25922 S. aureus ATCC 25923


aureus ATCC 25923 hay una reducción en la absorbancia, pero a las concentraciones

evaluadas no se logró identificar el MIC ni el MBC (>200 µM). En la Figura 7 (panel B),

se presenta la determinación del MBC del LfcinB 17-31 frente a E. coli ATCC 25922 (>200

µM).

Figura 7. Actividad antibacteriana del péptido LfcinB 17-31. Panel A: Determinación del MIC

frente a E. coli ATCC 25922 y S. aureus ATCC 25923. Panel B: determinación del MBC frente a E.

coli ATCC 25922, los números corresponden a la concentración µM.

Conociendo la actividad de la LfcinB 17-31, se quiso explorar la posibilidad de encontrar

secuencias cortas derivadas de este péptido que presenten igual o mayor actividad

antibacteriana frente a las cepas seleccionadas; cabe resaltar que un péptido antimicrobiano

de secuencia corta puede reducir la dificultad en el proceso de síntesis y purificación lo que

conlleva a una disminución en los costos. Adicionalmente, estas secuencias cortas podrían

ser sintetizadas en modelos estructurales que presenten múltiples copias de la secuencia

activa (p.e. dímeros, tetrámeros, etc.), con lo que se espera se potencie la actividad

antibacteriana [22].

En la tabla 5 se presentan los resultados de los ensayos de actividad antibacteriana de los

péptidos cortos derivados de LfcinB 17-31. Se observa que al retirar secuencialmente los

aminoácidos del extremo N-terminal (Lfcin 18-31 al 20-31) no hay efecto frente a S. aureus,

sin embargo, frente a E. coli, la remoción de la 18Lys (péptido LfcinB 19-31) genera un MIC

y MBC de 100 µM.

Cuando se retiran los residuos del extremo C-terminal (Lfcin 17-30 al 17-25), nuevamente

no hay efecto significativo frente a S. aureus, excepto para el péptido Lfcin 17-26 el cual

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

Control - 200 µM 100 µM 50 µM 25 µM 12,5 µM 6,25 µM Control +

Ab

sorb

an

cia

6

20

nm

LfcinB 17-31 (FKCRRWQWRMKKLGA)

E. coli ATCC 25922 S. aureus ATCC 25923

BA


corresponde a la secuencia después de la remoción de la 28Lys y 27Lys (MIC y MBC de 200

µM), mientras que para E. coli, se identifica un aumento en la actividad antibacteriana al

retirar el residuo de 28Lys del extremo C-terminal, y este efecto se mantiene al remover el

residuo 27Lys y posteriormente, el residuo de 26Met (Lfcin 17-27 al 17-25) (Tabla 5). Se

encontró que los péptidos LfcinB 17-25 y LfcinB 17-26 sin 27Lys y 28Lys, presentaron mayor

actividad antibacteriana que LfcinB 17-31, lo que indica que Lys en las posiciones C-

terminales no parecen ser cruciales para las propiedades antibacterianas. Interesantemente,

un estudio previo mostró que los péptidos con sustituciones de Arg en 18Lys, 27Lys y 28Lys

fueron ligeramente más activos que el péptido referencia frente a Mycobacterium avium. Y

a la inversa, la sustitución de Lys en 20Arg, 21Arg y 25Arg dio como resultado una actividad

antimicrobiana significativamente menor que el péptido original [61].

Tabla 5. Evaluación de la actividad antibacteriana de los péptidos derivados de Lfcin 17-31. MIC y

MBC frente a E. coli ATCC 25922 y S. aureus ATCC 25923

Código Secuencia E. coli ATCC 25922 S. aureus ATCC 25923

MIC (µM) MBC (µM) MIC (µM) MBC (µM)

LfcinB 17-31 FKCRRWQWRMKKLGA 200 >200 >200 >200

LfcinB 18-31 KCRRWQWRMKKLGA >200 >200 >200 >200

LfcinB 19-31 CRRWQWRMKKLGA 100 100 >200 >200

LfcinB 20-31 RRWQWRMKKLGA 200 >200 >200 >200

LfcinB 17-30 FKCRRWQWRMKKLG 200 200 >200 >200

LfcinB 17-29 FKCRRWQWRMKKL 200 >200 ND ND

LfcinB 17-28 FKCRRWQWRMKK 200 200 >200 >200

LfcinB 17-27 FKCRRWQWRMK 100 200 >200 >200

LfcinB 17-26 FKCRRWQWRM 100 200 200 200

LfcinB 17-25 FKCRRWQWR 100 100 >200 >200

LfcinB 20-25 RRWQWR >200 >200 >200 >200

(LfcinB 21-25) Palíndroma RWQWRWQWR 12,5 25 ND ND

(LfcinB 20-25)4 ((RRWQWR)

2K-Ahx-C)2 6,25 12,5 25 25

[Ala19

]-LfcinB 17-31 FKARRWQWRMKKLGA ND ND >200 >200

([Ala19


2K-Ahx-C ND ND 12,5 12,5

Lactoferrina Bovina - >50 >50 >50 >50

n =2


Los resultados descritos en la tabla 5 advierten que la actividad antibacteriana no está

directamente relacionada con el número de cargas positivas de los péptidos, si bien, el

principal mecanismo propuesto para péptidos antimicrobianos corresponde a la

permeabilización de las membranas bacterianas, la cual se desarrolla a través de un proceso

que consiste inicialmente en una interacción electrostática entre los residuos catiónicos y los

LPS de la membrana externa (bacterias Gram negativas), o los ácidos teicoicos o

lipoteicoicos (bacterias Gram positivas) permitiendo el acercamiento del péptido a la

membrana interna [7]. Por otro lado, se sugiere que la carga neta debe ser de por lo menos

+4 para una actividad antibacteriana óptima [7], en nuestro caso, todas las secuencias

diseñadas y sintetizadas tienen una carga neta superior a 4 (pH neutro), sin embargo, la

actividad antibacteriana encontrada frente a E. coli en este estudio, se incrementó al reducir

las cargas positivas del extremo C-terminal, lo que indica que la actividad puede estar

mediada también por otros factores determinantes como la conformación espacial específica

de la molécula y/o la asimetría de cargas.

De forma general, se observa que E. coli es más sensible que S. aureus frente a los péptidos

análogos derivados de Lfcin 17-31; estudios previos de la actividad antibacteriana con

análogos (scan Ala) del péptido LfcinB 17-31 muestran que el cambio de los aminoácidos

subrayados 17FKCRRWQWRMKKLGA31, causa pérdida de la actividad antibacteriana

contra S. aureus ATCC 25923 y adicionalmente, las posiciones 22Trp y 24Trp se encontraron

esenciales para la actividad antibacteriana del péptido LficnB 17-31 contra E. coli ATCC

25922 [62], esto sugiere, que la actividad antibacteriana del péptido LfcinB 17-31 contra E.

coli y S. aureus procede por diferentes mecanismos. Específicamente, se ha descrito que el

sitio de unión inicial de la lactoferricina B en S. aureus es ácido teicoico y no ácido

lipoteicoico, mientras que, para la lactoferricina B y magainina 1 en E. coli, es

lipopolisacárido. [63]

Resumiendo, del screening realizado con los péptidos lineales cortos se encontró un péptido

(Lfcin 17-26) con mejor actividad que la presentada por la Lfcin 17-31 frente a S. aureus

ATCC 25923. Y frente a E. coli ATCC 25922 el péptido que presentó mejor actividad fue

Lfcin 17-25, que tiene 9 residuos. (Tabla 5 y figura 8).


Figura 8. Péptidos con mayor actividad antibacteriana para cada una de las cepas evaluadas. Panel

A: Determinación del MIC y MBC de LfcinB 17-26 frente a S. aureus. Panel B: Determinación del

MIC y MBC de LfcinB 17-25 frente a E. coli. En ambos casos en la gráfica de barras se compara la

actividad respecto a LfcinB 17-31.

También se determinó la actividad antibacteriana del péptido Lfcin 20-25 frente a las dos

cepas y se encontró que el valor de MIC y MBC es >200 µM. Este péptido corresponde a la

secuencia reportada por otros autores como motivo mínimo de actividad (RRWQWR) [20].

La actividad frente a las dos cepas fue incrementada significativamente (MBC y MIC ≤ 25

µM) cuando se empleó una molécula que contenía cuatro copias de RRWQWR, el tetrámero

(LfcinB 20-25)4, que fue sintetizado según la metodología reportada por León A. et al. [22].

También se incrementó con un dímero lineal, la secuencia LfcinB 21-25 palíndroma, que

presentó actividad (MIC 6,25 µM y MBC 12,5 µM) frente a E. coli. (Tabla 5 y figura 9).

La forma de la secuencia palindrómica permite que los residuos de Arg y Trp se alternen

formando una estructura anfipática, lo cual posiblemente favorece la interacción del péptido

con la membrana bacteriana. Estudios previos muestran que estructuras palindrómicas que

contienen residuos de Trp y Arg presentan actividad antibacteriana contra E. coli. [64].

Figura 9. Actividad antibacteriana frente a E. coli ATCC 25922 del péptido Lfcin 20-25 y de sus

análogos con múltiples copias. Determinación del MIC para Lfcin 20-25, (LfcinB 21-25) Palíndroma, y

0,000

0,100

0,200

0,300

0,400

0,500

0,600

0,700


Abso

rbanci

a 620 n

m

S. aureus ATCC 25923

LfcinB 17-31 LfcinB 17-26

0,000

0,100

0,200

0,300

0,400

0,500

0,600

0,700

0,800

0,900


Abso

rba

nci

a 6

20 n

m

E. coli ATCC 25922

LfcinB 17-31 LfcinB 17-25

B

A


(LfcinB 20-25)4 (Panel A). Determinación del MBC del (LfcinB 21-25) Palíndroma. (Panel B) y del

(LfcinB 20-25)4. (Panel C).

Por otro lado, durante nuestros estudios, se observó que los péptidos que contenían cisteína

eran sensibles a la oxidación y tenían tiempos de vida cortos; como iniciativa para obtener

moléculas más estables, se sintetizaron y evaluaron también algunos péptidos análogos de

Lfcin 17-31 con el intercambio de 19Cys por 19Ala, ([Ala19]-LfcinB 17-31). El análogo

[Ala19]-LfcinB 17-31 se comportó igual que Lfcin 17-31 frente a S. aureus, sin embargo,

cuando se efectuó su presentación en forma dimérica, ([Ala19]-LfcinB 17-31)2, se obtuvo un

MIC y MBC de 12,5 µM, evidenciándose un claro aumento en su actividad antibacteriana.

(Tabla 5 y figura 10). Nuestros resultados sugieren que, la actividad antibacteriana

moderada de una secuencia puede ser potenciada con la presentación en múltiples copias de

la cadena peptídica en estudio, lo cual está de acuerdo con los resultados descritos por [65],

0,000

0,100

0,200

0,300

0,400

0,500

0,600

0,700

0,800

Control - 25 µM 12,5 µM 6,25 µM Control +

Ab

sorb

an

cia

6

20

nm

E. coli ATCC 25922

LfcinB 20-25 (LfcinB 21-25) Palíndroma (LfcinB 20-25)4

B

A

C


donde péptidos con múltiples antígenos (MAP) derivados de secuencias de LfcinH,

presentan mayor actividad antibacteriana que sus homólogos lineales.

Figura 10. Actividad antibacteriana de péptidos análogos de Lfcin 17-31 con el intercambio de 19Cys

por 19Ala. Determinación del MIC para Lfcin 17-31, [Ala19]-LfcinB 17-31, y ([Ala19]-LfcinB 17-

31)2 frente a S. aureus ATCC 25923 (Panel A). Determinación del MBC de [Ala19]-LfcinB 17-31

(Panel B) y ([Ala19]-LfcinB 17-31)2 (Panel C) frente a S. aureus ATCC 25923

0,000

0,100

0,200

0,300

0,400

0,500

0,600

0,700

Control - 100 µM 50 µM 25 µM 12,5 µM 6,25 µM Control +

Ab

sorb

an

cia

6

20

nm

S. aureus ATCC 25923

LfcinB (17-31) [Ala19]-LfcinB 17-31 ([Ala19]-LfcinB 17-31) 2

B

A

C

41

6. Conclusiones

Mediante la Síntesis de Péptidos en Fase Sólida (SPPS), empleando la estrategia Fmoc/tBu,

se lograron obtener 15 péptidos cuyas secuencias son derivadas de la Lactoferricina bovina.

Usando un protocolo de síntesis optimizado que incluye el uso de microondas, se encontró

para las secuencias diseñadas un comportamiento sintético sencillo. Este resultado nos

permite prever que la obtención de estas moléculas es viable, económica y el método es

versátil, lo cual nos da a futuro la posibilidad de introducir modificaciones en la secuencia

que aumenten la actividad de las moléculas. Los porcentajes (%) de rendimiento de las

síntesis se encuentran entre el 5 y el 37%; la purificación de estos péptidos por SPE fue

eficiente y nos permitió moléculas de purezas adecuadas para los ensayos de actividad

antibacteriana MIC (Concentración Mínima Inhibitoria) y MBC (Concentración Mínima

Bactericida). Se desarrolló también un método de análisis en RP-HPLC con una columna

monolítica que implica una reducción de costos para la caracterización de los productos

crudos y purificados. Por otro lado, se identificaron péptidos cortos análogos de la LfcinB 17-31 con mayor o

igual actividad antibacteriana respecto a la secuencia de 15 residuos, estas moléculas, por

ser más sencillas, facilitan el proceso sintético y pueden ser utilizadas para el diseño de

secuencias diméricas y tetraméricas como estrategia para potenciar la actividad

antibacteriana [22].

Se obtuvo un incremento en la actividad antibacteriana por la presentación múltiple de

motivos activos, este incremento se observa también para un péptido dimérico análogo de

LfcinB 17-31 al cual se le introdujo una alanina a cambio de la cisteína.

Como perspectiva del trabajo se sugiere evaluar los péptidos con mayor actividad

antibacteriana en poblaciones bacterianas y frente a cepas resistentes.

Bibliografía 42

Bibliografía 1. World Health organization. Antimicrobial resistance: global report on surveillance.

Geneva: WHO; 2014: p.1-205. Disponible en

http://www.who.int/drugresistance/documents/surveillancereport/en/.

2. Haug B, Strom M, Svendsen J. The medicinal chemistry of short Lactoferricin-based

antibacterial peptides. Curr Med Chem. 2007;14:1–18.

3. Poole S. Pyrogen testing of polypeptide and protein drugs. In: Hider RC; Barlow D

(eds.). Polypeptide and protein drugs: production, characterization and formulation.

P.146-153. CEH 1991; Editor.

4. Romero R. Microbiología y parasitología humana bases etiológicas de las

enfermedades infecciosas y parasitarias, Editorial Médica Panamericana, Buenos

Aires, Argentina. 2007.

5. Brogden N, Brogden K. Will new generations of modified antimicrobial peptides

improve their potential as pharmaceuticals? Int J Antimicrob Agents. 2011;38:217–

25.

6. Vorland L, Ulvatne H, Andersen J, Haukland H, Rekdal H, Svendsen J, et al.

lactoferricin of bovine origin is more active than lactoferricins of human, murine and

caprine origin. Scand J Infect Dis. 1998;30:513–7.

7. Andrä J, Lohner K, Blondelle S, Jerala R, Moriyon I, Koch M, et al. Enhancement

of endotoxin neutralization by coupling of a C12-alkyl chain to a lactoferricin-

derived peptide. Biochem J. 2005;385:135–43.

8. Marr A, Gooderham W, Hancock R. Antibacterial peptides for therapeutic use:

obstacles and realistic outlook. Curr Opin Pharmacol. 2006;6:468–72.

43

9. Shestakov A, Jenssen H, Nordström I, Eriksson K. Lactoferricin but not lactoferrin

inhibit herpes simplex virus type 2 infection in mice. Antivir Res. 2012;93:340–5.

10. Brown K, Hancock R. Cationic host defense (antimicrobial) peptides. Curr Opin

Immunol. 2006;18:24–30.

11. Mosca D, Hurst M, So W, Viajar B, Fujii C, Falla T. IB-367, A protegrin peptide

with in vitro and in vivo activities against the microflora associated with oral

mucositis. Antimicrob Agents Chemother. 2000;44:1803–8.

12. Steinberg D, Hurst M, Fujii C, Kung A, Ho J, Cheng F, et al. Protegrin-1: a broad-

spectrum, rapidly microbicidal peptide with in vivo activity. Antimicrob Agents

Chemother. 1997;41:1738–42.

13. Gaspar D, Veiga A, Castanho M. From antimicrobial to anticancer peptides. A

review. Front Microbiol. 2013;4:294.

14. Téllez G, Castaño J. Péptidos antimicrobianos. Infectio. 2010;14(1):55–67.

15. Gifford J, Hunter H, Vogel H. Lactoferricin: a lactoferrin-derived peptide with

antimicrobial, antiviral, antitumor and immunological properties. Cell Mol Life Sci.

2005;62:2588–98.

16. Yamauchi K, Tomita M, Giehl T, Ellison R. Antibacterial activity of lactoferrin and

a pepsin-derived lactoferrin peptide fragment. Infect Immun. 1993;61:719–28.

17. Bellamy W, Takase M, Wakabayashi H, Kawase K, Tomita M. Antibacterial

spectrum of lactoferricin B, a potent bactericidal peptide derived from the N-terminal

region of bovine lactoferrin. J Appl Bacteriol. 1992;73:472–9.

18. Shin K, Yamauchi K, Teraguchi S, Hayasawa H, Tomita M, Otsuka Y. Antibacterial

activity of bovine lactoferrin and its peptides against enterohaemorrhagic

Escherichia coli O157:H7. Lett Appl Microbiol. 1998;26:407–11.

19. Farnaud S, Evans R. Lactoferrin—a multifunctional protein with antimicrobial

properties. Molecular Immunology. 2003;40(7):395–405.

20. Schibli DJ, Hwang PM, Vogel HJ. The structure of the antimicrobial active center

of lactoferricin B bound to sodium dodecyl sulfate micelles. FEBS Lett. 1999;446:

213-217.

Bibliografía 44

21. Richardson A, Antueno R, Duncan R, Hoskin DW. Intracellular delivery of bovine

lactoferricin’s antimicrobial core (RRWQWR) kills T-leukemia cells. Biochem.

Biophys. Res. Commun. 2009;388:736-741.

22. León MA, Leal AL, Almanzar GA, Rosas JE, García JE, Rivera ZJ. Antibacterial

Activity of Synthetic Peptides Derived from Lactoferricin against Escherichia coli

ATCC 25922 and Enterococcus faecalis ATCC 29212. BioMed research

international. 2015. Article ID 453826, 8 pages.

23. Tomita M, Takase M, Bellamy W, Shimamura S. A review: the active peptide of

lactoferrin. Acta Paediatrica Japonica. 1994;36:585– 591.

24. Vogel HJ. Lactoferrin, a bird’s eye view. Biochem. Cell Biol. 2012;90: 233-244

25. Jing W, Svendsen J, Voge HJ. Comparison of NMR structures and model-membrane

interactions of 15-residue antimicrobial peptides derived from bovine lactoferricin.

Biochemistry and Cell Biology. 2006;84(3):312–326.

26. Strøm MB, Rekdal Ø, Stensen W and Svendsen JS. Increased antibacterial activity

of 15-residue murine lactoferricin derivatives. J. Pept. Res. 2001;57(2):127–139.

27. Eliassen LT, Haug BE, Berge G and Rekdal Ø. Enhanced antitumor activity of 15-

residue bovine lactoferricin derivatives containing bulky aromatic amino acids and

lipophilic C-terminal modifications. J. Pept. Sci. 2003;9:510–517.

28. Baker HM, Anderson BF, Kidd RD, Shewry SC, Baker EN. Lactoferrin three-

dimensional structure: a framework for interpreting function. In Lactoferrin:

Structure, Function and Applications. (K. Shimazaki et al., eds), Elsevier Science,

Amsterdam. 2000;3–15.

29. Bellamy W, Takase M, Yamauchi K, Wakabayashi H, Kawase K and Tomita M.

Identification of the bactericidal domain of lactoferrin. Biochim. Biophys.

1992;1121:130-136.

30. Hunter HN, Demcoe AR, Jenssen H, Gutteberg TJ and Vogel HJ. Human

lactoferricin is partially folded in aqueous solution and is better stabilized in

membrane mimetic solvent. Antimicrob. Agents Chemother. 2005;49(8):3387–

3895.

Bibliografía 45

31. Hwang P, Zhou N, Shan X, Arrowsmith C, Vogel H. Three-Dimensional Solution

Structure of Lactoferricin B, an Antimicrobial Peptide Derived from Bovine

Lactoferrin. Biochemistry. 1998;37(12):4288–4298.

32. Chan D, Prenner E, Vogel H. Tryptophan and arginine-rich antimicrobial

peptides:Structures and mechanisms of action. Biochimica et Biophysica. Acta.

2006;1758:1184–1202.

33. Elass E, Roseanu A, Legrand D, Trif M, Salmon V, Motas C, Montreuil J, Spik G.

Lactoferrin-lipopolysaccharide interaction: involvement of the 28–34 loop region of

humanmlactoferrin in the high-affinity binding to Escherichia coli 055B5

lipopolysaccharide. Biochem. J. 1995;312:839–845.

34. Odell EW, Sarra R, Foxworthy M, Chapple DS, Evans RW. Antibacterial activity of

peptides homologous to a loop region in human lactoferrin. FEBS Lett. 1996;

382:175–178.

35. Chapple DS, Mason DJ, Joannou CL, Odell EW, Gant V, Evans RW. Structure-

function relationship of antibacterial synthetic peptides homologous to a helical

surface region on human lactoferrin against Escherichia coli serotype O111. Infect.

Immun. 1998;66:2434–2440.

36. Legrand D, Pierce A, Elass E, Carpentier M., Mariller C, & Mazurier J. Lactoferrin

structure and functions. In Bioactive Components of Milk. Springer New York.

2008:163-194.

37. Hoek KS, Milne JM, Grieve PA, Dionysius DA and Smith R. Antibacterial activity

of bovine lactoferrin derived peptides. Antimicrob. Agents Chemother. 1997;41:54–

59.

38. Aguilera O, Ostolaza H, Quiros LM and Fierro JF. Permeabilizing action of an

antimicrobial lactoferricin-derived peptide on bacterial and artificial membranes.

FEBS Lett. 1999;462:273–277.

39. Haug BE, Skar ML and Svendsen JS. Bulky aromatic amino acids increase the

antibacterial activity of 15-residue bovine lactoferricin derivatives. J. Pept. Sci.

2001;7:425–432.

Bibliografía 46

40. Strøm MB, Rekdal Ø, Svendsen JS. The effects of charge and lipophilicity on the

antibacterial activity of undecapeptides derived from bovine lactoferricin. J. Pept.

Sci. 2002;7:36–43.

41. Lupetti A, Paulusma A, Welling M, Senesi S, van Dissel J and Nibbering P.

Candidacidal activities of human lactoferrin peptides derived from the N-terminus.

Antimicrob. Agents. Chemother. 2000;44:3257–3263.

42. Bellamy W, Yamauchi K, Wakabayashi H, Takase M, Takakura N, Simamura S et

al. Antifungal properties of lactoferricin B, a peptide derived from the N-terminal

region of bovine lactoferrin. Lett. Appl. Microbiol. 1994;18:230–233.

43. Andersen JH, Osbakk SA, Vorland LH, Traavik T and Gutteberg T J. Lactoferrin

and cyclic lactoferricin inhibit the entry of human cytomegalovirus into human fi

broblasts. Antiviral Res. 2001; 51: p.141–149.

44. Jenssen H, Andersen JH, Uhlin-Hansen L, Gutteberg TJ and Rekdal Ø. Anti-HSV

activity of lactoferricin analogues is only partly related to their affinity for heparan

sulfate. Antiviral Res. 2004; 61: p.101–109.

45. Brouwer CP, Rahman M, Welling M. Review: Discovery and development of a

synthetic peptide derived from lactoferrin for clinical use. Peptides. 2004; 32: p.

1953–1963.

46. Mannoor MS, Zhang S, Link AJ, McAlpine MC. Electrical detection of pathogenic

bacteria via immobilized antimicrobial peptides. Proc Natl Acad Sci USA.

2010;107(45):19207–12.

47. Cervantes G, García G, Salazar R, Paz M. Características generales del

Staphylococcus aureus. Rev Latinoam Patol Clin Med Lab. 2014;61(1):28–40.

48. Batoni G, Maisetta G, Esin S. Review: Antimicrobial peptides and their interaction

with biofilms of medically relevant bacteria. Department of Translational Research

and New Technologies in Medicine and Surgery, University of Pisa, Pisa, Italy.

Biochim Biophys Acta. 2016;1858:1044–60.

49. Rodríguez G. Principales características y diagnóstico de los grupos patógenos de

Escherichia coli. Salud Pública Mex. 2002;44: 464–75.

50. Collignon P. Resistant Escherichia coli— We Are What We Eat. Clin Infect Dis.

2009;49(2):202–4.

Bibliografía 47

51. Escherichia coli: Mechanisms of virulence. Ed Max Sussman. J R Soc Med. 1997

Aug;90(8):466.

52. Band V, Weiss D. Mechanisms of antimicrobial peptide resistance in gram-negative

bacteria. Antibiot (Basel). 2015;4(1):18–41.

53. Ulvatnea H, Karoliussenb S, Stibergb T, Rekdalb O, Svendsenc J. Short antibacterial

peptides and erythromycin act synergically against Escherichia coli. Antimicrob

Chemother. 2001;48(2):203–8.

54. Lloyd P, Albericio F, Giralt E. Chemical approaches to the synthesis of peptides and

proteins. University of Barcelona. CRC Press. Barcelona, Spain. 1997.

55. Vergel CF, Rivera Monroy ZJ, Rosas JE, García JE. Efficient Synthesis of Peptides

with 4-Methylpiperidine as Fmoc Removal Reagent by Solid Phase Synthesis.

Journal of the Mexican Chemical Society. 2014;58(4):386-392.

56. Kaiser E, Colescot RL, Bossinge CD, Cook PI. Color test for detection of free

terminal amino groups in solid-phase synthesis of peptides. Anal. Biochem.

1970;34:595.

57. L. Snyder, J. Kirkland y J. Dolan J. Introduction to modern liquid chromatography.

tercera edición. John Wiley & Sons. England (2010).

58. Kamysz W, Okrój M, Łempicka E, Ossowski T, Łukasiak J. Fast and efficient

purification of synthetic peptides by solid-phase extraction. Acta Chromatographica,

2004;14:180–186.

59. Wiegand I, Hilpert K, Hancock R. Agar and broth dilution methods to determine the

minimal inhibitory concentration (MIC) of antimicrobial substances. Nat Protoc.

2008;3(2):163–75.

60. CLSI. Methods for Dilution Antimicrobial Susceptibility Tests for Bacteria That

Grow Aerobically; Approved Standard—Ninth Edition. CLSI document M07-A9

Vol. 32 No. 2 Clinical and Laboratory Standards Institute; 2012. Pag. 61.

61. Silva T., Magalhães B., Maia S., et al. Killing of Mycobacterium avium by

lactoferricin peptides: improved activity of arginine- and D-amino-acid-containing

molecules. Antimicrob. Agents Chemother. 2014, 58, 3461–3467.

62. Strøm, M.B., Rekdal, O., Svendsen, J.S. Antibacterial activity of 15-residue

lactoferricin derivatives. J Pept Res. 2000, 56, 265-74.

Bibliografía 48

63. Vorland, L. H., Ulvatne, H., Rekdal, O. & Svendsen, J. S. Initial binding sites of

antimicrobial peptides in Staphylococcus aureus and Escherichia coli. Scand. J.

Infect. Dis.1999, 31, 467–473.

64. Strøm, M.B.; Haug, B.E.; Skar, M.L.; Stensen, W.; Stiberg T, Svendsen, J.S. The

Pharmacophore of Short Cationic Antibacterial Peptides. J. Med. Chem. 2003, 46,

1567–1570.

65. Azuma, M., Kojima, T., Yokoyama, I., Tajiri, H., Yoshikawa, K., Saga, S., Del

Carpio, C.A. Antibacterial activity of multiple antigen peptides homologous to a

loop region in human lactoferrin. J Pept Res. 1999, 54, 237-41.

Bibliografía 49



ACTIVIDAD ANTIBACTERIAL


ANEXO 1

Resultados. Síntesis y caracterización de los péptidos diseñados

Universidad Nacional de Colombia. Bogotá D.C. Colombia.

Facultad de Ciencias

Maestría en Ciencias -Bioquímica

Bogotá D.C. COLOMBIA - 2016

50

Síntesis y caracterización de los péptidos diseñados

A continuación, se presentan los resultados obtenidos de la síntesis química de los péptidos

diseñados (Tabla anexo 1), en cada una de las figuras se encuentra reportada la siguiente

información: Estructura y código (Panel A), comportamiento de síntesis (Panel B) y

caracterización del péptido puro por RP-HPLC (Método 4, Panel C) y por EM MALDI-TOF

(Panel D).

Tabla Anexo 1. Secuencias derivadas de LfcinB 17-31 diseñados, sintetizadas, purificadas y

caracterizadas

Código Secuencia Página

LfcinB 17-31 FKCRRWQWRMKKLGA 51

[Ala19

]-LfcinB 17-31 FKARRWQWRMKKLGA 52

([Ala19


2K-Ahx-C 53

LfcinB 18-31 KCRRWQWRMKKLGA 54

LfcinB 19-31 CRRWQWRMKKLGA 55

LfcinB 20-31 RRWQWRMKKLGA 56

LfcinB 17-30 FKCRRWQWRMKKLG 57

LfcinB 17-29 FKCRRWQWRMKKL 58

LfcinB 17-28 FKCRRWQWRMKK 59

LfcinB 17-27 FKCRRWQWRMK 60

LfcinB 17-26 FKCRRWQWRM 61

LfcinB 17-25 FKCRRWQWR 62

LfcinB 20-25 RRWQWR 63

(LfcinB 21-25) Palíndroma RWQWRWQWR 64

(LfcinB 20-25)2 (RRWQWR)

2K-Ahx-C 65

Anexo 1 51

A

B

C

D

LfcinB (17-31) FKCRRWQWRMKKLGA

Dirección de la síntesis

Minutes0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

mA

U

0

100

200

300

400

500

600

700

800

900

1000

1100

4.98

0

1

2

F K C R R W Q W R M K K L G A

Cic

los

de

aco

ple

re

qu

eri

do

s

Aminoácidos de la secuencia

Anexo 1 52

0

1

2

F K A R R W Q W R M K K L G ACic

los

de

aco

ple

re

qu

eri

do

s


A

B

C

D

FKARRWQWRMKKLGA


Minutes0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

mA

U

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600

4.93

Anexo 1 53

0

1

2

F A R Q R K L A Ahx

Cic

los

de

aco

ple

re

qu

eri

do

s


A

B

C

D

(FKARRWQWRMKKLGA) 2K-Ahx-C


Minutes0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

mA

U

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600

5.52

Anexo 1 54


0

1

2

K C R R W Q W R M K K L G A

Cic

los

de

aco

ple

re

qu

eri

do

s


A

B

C

D

LfcinB (18-31) KCRRWQWRMKKLGA

Minutes0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

mA

U

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600

1800

2000

2200

4.71

Anexo 1 55


A

B

LfcinB (19-31) CRRWQWRMKKLGA

C

D

0

1

2

C R R W Q W R M K K L G A

Cic

los

de

aco

ple

re

qu

eri

do

s


Minutes0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

mA

U

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600

1800

2000

2200

4.99

Anexo 1 56


A

B

C

D

LfcinB (20-31) RRWQWRMKKLGA

Inte

ns.[a

.u.]

x10

4

1.0

0.8

0.6

0.4

0.2

0.0

1000 1500 2000 2500 3000 3500

m /z

1617,38

0

1

2

R R W Q W R M K K L G ACic

los

de

aco

ple

re

qu

eri

do

s


Minutes0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

mA

U

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600

1800

2000

2200

4.95

Anexo 1 57

A

B

C

D

LfcinB (17-30): FKCRRWQWRMKKLG


0

1

2

F K C R R W Q W R M K K L G

Cic

los

de

aco

ple

re

qu

eri

do

s


Minutes0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

mA

U

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600

1800

2000

2200

2400

4.96

Anexo 1 58

A

B

C

D

LfcinB (17-29): FKCRRWQWRMKKL


1000 1500 2000 2500 3000

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

1865,73

Inte

ns.

[a

u]

10

4

m/z

0

1

2

F K C R R W Q W R M K K LCic

los

de

aco

ple

re

qu

eri

do

s


Minutes0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

mA

U

0

100

200

300

400

500

600

700

800

900

5.06

Anexo 1 59

A

B

C

D

LfcinB (17-28): FKCRRWQWRMKK


0

1

2

F K C R R W Q W R M K KCic

los

de

aco

ple

re

qu

eri

do

s


Minutes0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

mA

U

0

100

200

300

400

500

600

700

4.68

Anexo 1 60

Minutes0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

mA

U

0

50

100

150

200

250

300

350

400

450

500

4.87

A

B

C

D

LfcinB (17-27): FKCRRWQWRMK


0

1

2

F K C R R W Q W R M KCic

los

de

aco

ple

re

qu

eri

do

s


Anexo 1 61

A

B

C

D

LfcinB (17-26): FKCRRWQWRM


0

1

2

F K C R R W Q W R M

Cic

los

de

aco

ple

re

qu

eri

do

s


Minutes0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

mA

U

0

50

100

150

200

250

300

350

5.17

Anexo 1 62

A

B

C

D

LfcinB (17-25): FKCRRWQWR


1.25

1.00

0.75

0.50

0.25

0.00

1000 1250 1500 1750 2000 2250 2500 2750 3000 325 0

Inte

ns.

[au

]

10

4

m/z

1365,82

0

1

2

F K C R R W Q W RCic

los

de

aco

ple

re

qu

eri

do

s


Minutes0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

mA

U

0

100

200

300

400

500

600

700

800

900

1000

1100

1200

1300

4.73

Anexo 1 63

0.8

0.6

0.4

0.2

0.0

1000 1250 1500 1750 2000 225 0

250 0

275 0 300 0 325 0m/z

Tof-userUser: Printed:30/09/2015 17:14:31

Inten

s. [au

] 10

4

m/z

986,66

A

B

C

D

LfcinB (20-25): RRWQWR


0

1

2

R R W Q W RCic

los

de

aco

ple

re

qu

eri

do

s


Minutes1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

mA

U

0

100

200

300

400

500

600

700

800

900

1000

1100

4.19

Anexo 1 64

1.50

1.25

1.00

0.75

0.50

0.25

0.001000 1500 2000 2500 3000 3500

m /z

Inte

ns.[a

.u.]

1488,58

A

B

C

D

LfcinB (21-25) palíndroma RWQWRWQWR


Exact Mass: 1485,75

0

1

2

R W Q W R W Q W RCic

los

de

aco

ple

re

qu

eri

do

s


Minutes

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

mA

U

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600

1800

2000

5.95

Anexo 1 65

x10

4

1.25

1.00

0.75

0.50

0.25

0.001000 1500 2000 2500 3000 3500

m /z

Inte

ns.[a

.u.]

2302,96

A

B

C

D

(LfcinB 20-25)2 (RRWQWR)2K-Ahx-C


Exact Mass: 2298,32

0

1

2

R R W Q W R K Ahx C

Cic

los

de

aco

ple

re

qu

eri

do

s


Minutes

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

0

250

500

750

1000

1250

1500

1750

2000

2250

2500

2750

5,21

mA

U

sÍntesis de pÉptidos derivados de la ...©ndez...por otra parte, los péptidos polivalentes: el...

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