inmunofenotipificion celular · -lma-m3 : hla-dr(-)-lma-m4 : hla-dr(+) enfermedad inflamatoria...

INMUNOFENOTIPIFICION CELULAR

T.M. MSC JUAN LUIS CASTILLO N.Centro de Diagnóstico Onco-inmunológicoLtda.

Laboratorio de Citometría de FlujoHospital del Trabajador, Concepción, Chile.

www.oncoinmun.co.cl

Fenotipo

Genotipo

Fenotipo: Caracterización

Microscopio óptico

Peripheral Blood FilmMagnification x100

Myeloid maturation

myeloblast promyelocyte myelocyte metamyelocyte band neutrophil

MATURATIONMATURATION

Hematopoiesis

PLURIPOTENT

STEM CELL

COMMITTED

PROGENITOR

CELL

RECOGNIZABLE

BONE MARROW

PRECURSOR CELL

MATURE

BLOOD

CELL

myeloblast

monoblast

pronormoblast red cell

neutrophil

monocyte

basophil

platelet

CFU-Baso

CFU-Eos

CFU-GM

BFU-E/CFU-E

eosinophil

pre-T

pre-B

myeloid

progenitor

cell

lymphoid

progenitor

cell

lymphoblast

lymphoblast

T-cell

B-cell

& plasma cell

MIXED

PROGENITOR

CELL

CFU-Meg megakaryocyte

pluripotent

stem cell

Silver stain (GMS) to detect presence of fungal hyphae in tissue x200

Gram’s stain to detect bacteria in tissue (oil immersion x1000)

USE OF HISTOCHEMISTRY TO DETECT INFECTIOUS ORGANISMS

Luxol Fast Blue for myelinFontana-Masson for melanocytes

MORE EXAMPLES OF HISTOCHEMISTRY

Mucin stained and H&E stained colon

Fenotipo: Caracterización

Microscopio electrónico

Antibodies

Polyclonal Monoclonal

Antibodies that are collected from sera of exposed animal

recognize multiple antigenic sites of injected biochemical.

Individual B lymphocyte hybridomais cloned and cultured.

Secreted antibodies are collected from culture media

recognize ONE antigenic site

of injected biochemical

Antibody

Anti−A Anti−BBloodType

A

B

O

Typing Blood:An Example ofAgglutination

AB

Type Bacteria by Agglutination

• E. coli and Salmonella• O antigens = LPS• H antigens = flagella• Example: E. coli O157:H7

Hybridoma

1975 Kohler and Milstein

http://www.immunecentral.com/images/immune_series/i mmune29.gif

Multiple myeloma (human disease)

Bence Jones proteins in urine

Fusions generated by Sendai virus

or PEG

Fluorescein (FITC)

400 nm 500 nm 600 nm 700 nm

Re

lat

ive

I

nt

en

sit

y

Wavelength

Protein

Excitation Emisson300 nm 400 nm 500 nm 600 nm 700 nm

Propidium Iodide

400 nm 500 nm 600 nm 700 nm

Re

lat

ive

I

nt

en

sit

y

DNA

Excitation Emisson300 nm 400 nm 500 nm 600 nm 700 nm

Fenotipo: Caracterización

Microscopio epifluorescencia

ImmunofluorescenceAntibody binds to slide at site of antigen…..

Adding of a suppressed fluorescent flag or ‘seconda ry antibody’… .

light

Immunofluorescense

www.cdc.gov www.phenopath.com/clinical/ skin.html

Bullous pemphgoid with linear deposits of IgG at dermal-epidermal junction

IFA of Ehrlichia chaffeensisin DH82 cells, 400X

Very good rapid diagnostics

About 25-30% of women who have metastatic breast cancer overexpress HER-2 (EGF) receptor

Determination of HER2-protein overexpression(semiquantitative DAKO Hercep Test™)

Fluorescence in situ hybridisation (FISH)of HER2 amplification

www.roche.com/pages/ facets/9/herc.htm

Fenotipo: Caracterización

Microscopio óptico

Microscopio electrónico

Microscopio epifluorescencia

Anticuerpos

ELISA (Enzyme−Linked ImmunoSorbent Assay)to Detect Antibody

Antigen

Sample

2° AntibodyEnzyme Linked

Detection

Substrate

ELISA to Detect Antigen

1° Antibody

Sample

2° AntibodyEnzyme Linked

Detection

Substrate

FLOW CYTOMETRY

CITOMETRIA DE FLUJO:APLICACIONES

• Hematología• Inmunología• Patología• Transplantes• Farmacología• Biología

• Toxicología• Microbiología• Parasitología• Citogenética• Virología• . . . . . . . . .

CITOMETRIA DE FLUJO:Aplicaciones Clínicas más Frecuentes

• Determinación de Subpoblaciones Linfocitarias• Inmunofenotipificación de Leucemias y Linfomas• Estudio de Ploidia de ADN y Ciclo Celular• Estudio de macrófagos intestinales (EII). • Estudio de Función Neutrofílica (estallido

respiratorio, fagocitosis, etc.) • Oncogenes (p53, PCNA, Ki67, k-ras, etc.)• Cuantificación de moléculas• Estudio de Células Progenitoras (CD34)• Estudios de Función Plaquetaria• Estudios de Resistencia a Drogas• Estudio de Citokinas Intracelulares

Fenotipo: Caracterización

Microscopio óptico

Microscopio electrónico

Microscopio epifluorescencia

Anticuerpos

ELISA

Citometría de Flujo

Southern Blot – DNA

• DNA es extraído desde las células y es

localizado en pocillos haciéndose migrar

como un gel de electrofóresis. El ADN es

transferido a una membrana (nitrocelulosa),

para luego ser teñido.

Southern Blot: Resultados

Western Blot – Protein

• Proteínas extraídas desde células, son dispuestas en pocillos, haciéndose migrar como un gel de electrofóresis. La proteína es transferida desde el gel a una membrana (nitrocelulosa). Finalmente se adicionan anticuerpos contra la proteína, los cuales luego son evidenciados (anticuerpo secundario conjugado, enzima, molécula radioactiva o fluorescente).

Western Blot

Western Blot Results

Northern blot – RNA

• RNA extraído desde células se dispone

en pocillos, haciéndose migrar como un

gel de electrofóresis. El RNA es

transferida desde el gel a una membrana

(nitrocelulosa) para luego ser teñido.

Northern Blot

PCR – Polymerase Chain Reaction

• Secuencias génicas específicas (DNA o

RNA) son replicadas y amplificadas para

una posterior secuenciación u otro

análisis.

Polymerase Chain Reaction

Fenotipo: Caracterización

Microscopio óptico

Microscopio electrónico

Microscopio epifluorescencia

Anticuerpos

ELISA

Citometría de Flujo

Southern blot

Northen blot

Western blot

PCR

Microscopio ópticoMicroscopio electrónicoMicroscopio epifluorescenciaAnticuerposELISACitometría de FlujoSouthern blotNorthen blotWestern blotPCR

Caracterización fenotípica

Caracterización genotípica

Utilidad clínica

Caracterización fenotípica y genotípica

Utilidad clínica

Caracterización fenotípica y genotípica

Utilidad clínica

Infección VIH-SIDA

CLASIFICACION INMUNOFENOTIPICA (LA)

•LLA-B :-BI-pro B: CD79a y/o CD22 Y/o CD19.-BII Común : CD10.-BIII Pre B: clg.-BIV Madura : slg

•LLA-T :-TI-proT: CD7-TII-pre T: CD2 y/o CD5 y/o CD8-TIII-Cortical: CD1a-IIV-Madura: CD1a y CD3mb

•LMA : -LMA-M6 : glicoforina A-LMA-M7 : CD61, CD41, CD42b-LMA-M3 : HLA-DR(-)-LMA-M4 : HLA-DR(+)

ENFERMEDAD INFLAMATORIA INTESTINAL

Espectro de presentación.

Colitis ulcerosa Enfermedad de Crohn

Alteración de la inmunoregulaciónde mucosa intestinal

Inflamación persistente y/o recurrente

Congestión ulcerativa Granulomatosa

Cáncer

Colon normal

CrohnCrohn

C.U.

ENFERMEDAD INFLAMATORIA INTESTINAL

Colitis ulcerosa Enfermedad de Crohn

Estudios celulares de mucosa intestinal (CF):

• Células epiteliales C.P.A.

• Macrófagos Moduladores

• Linfocitos: TCD4 Perpetuación

Induction and Modulation of Gastrointestinal Inflamatio nFALK Symposium 104, Amsterdam, 1999.

Marcadores de superficie en MI que se encuentran alterados en EII

CD16 Receptor de IgG (Fcγγγγ RIII)

HLA-DR Se expresan en: LBMonocito

Macrófago

Células dendítricas

CD80 y CD86 Interactúan con receptores de CD28 de LT

CD54 Receptor para ICAM-1

Mahida YR et al. Gut.1989;30:826-34

Roggler G. et al. In:Innovative Concept in IBD.Kluwer Acad. Publishers 1999 pps.:111-113

Mucosa

• HLA-DR• CD16

• CD54

• CD25

• CD68• CD80, CD86• CD11b

Normal

20-30%Ausente

7%

Ausente

AusenteAusente

5%

EII

PresentePresente

C.U. 70%Crohn 46%

C.U. PresenteCrohn ausente

PresentePresentePresente

Fenotipo de MI Mediante Inmunohistoquímica

Cambios en células neoplásicas

Transformación

1. Cambios morfológicos

2. Transplantabilidad

3. Disminución de la inhibición por contacto

4. Capacidad proliferativa infinita

5. Tumorgenicidad

Cambios en membrana

1. Comunicación celular

2. Alteraciones en el transporte3. Enzimas de superficie

4. Antígenos de superficie

Cambios bioquímicos

Cambios en el cariotipo

Cambios en células neoplásicas

Comparison of a typical normal (A) and malignant(B) cell. CEA, carcinoembryonic antigen, AFP, alpha-fetoprotein

Comparison of a typical normal (A) and malignant(B) cell. CEA, carcinoembryonic antigen, AFP, alpha -fetoprotein

Changes in tumor marker concentration during the course of disease

: www.dpcweb.com/medical/cancer/ cancer_tm_overview_l g.html

MAbs to serum Tumor marker Disease monitoring

Genética del cáncer:Clases de genes implicados en el cáncer

• Oncogenes• Genes supresores • Genes reparadores de DNA

Genes supresores Oncogenes

Genes reparadores de ADN

Genes supresores actúan como frenos

Oncogenes accionan el acelerador

LOH (Loss of Heterozygosity) Pérdida de heterozigocid ad.Pérdida de una copia normal de un gen

(puede dejar sólo una copia “mala”)

Tumor suppressor p53: “guardian of the genome”

(Inactivado en la mayoría de los tumores pormutación y LOH)

(apoptosis)

Tumor suppressor p53

La inestabilidad genómica puede ser identificada por citometrái de flujo.

Num

e ro

de c

é lu l

a s

DNA/Célula

Normal Tetraploide Aneuploide

Diploide

2N 4N 2N 4N 2N

> 6%< 6%

Tetraploidía predispone a la Aneuploidía en EB

Citometría de flujoNormal

Tetraploide

Progresando a aneuploidía8/74 (11%)

11/16 (69%)

N= 90 pacientes

P < 0.0001

Galipeau et al, Proc Nat Acad Sci USA 1996; 93:7081-7084

Intervalo promedio entre tetraplodía y aneuploidía: 17 meses

Caracterización Morfológica celular:

• Conceptos generales de células eucariontes y procar iontes.

• Alcances históricos.

• Microscopia luz, epifluorescencia, electrónica.

• Tinciones y marcadores celulares de estructuras.

Caracterización morfofuncional celular:

• Anticuerpos monoclonales.

• Técnicas ópticas (láser).

• Marcadores proteicos/enzimáticos.

• Expresión génica.

Alcances clínicos:

• Inmunodeficiencias.

• Enfermedades crónicas inflamatorias.

• Pre neoplasias y neoplasias.

INMUNOFENOTIPIFICION CELULAR

INMUNOFENOTIPIFICION CELULAR

T.M. MSC JUAN LUIS CASTILLO N.Centro de Diagnóstico Onco-inmunológicoLtda.

Laboratorio de Citometría de FlujoHospital del Trabajador, Concepción, Chile.

www.oncoinmun.co.cl