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Di r ecci ó n:Di r ecci ó n: Biblioteca Central Dr. Luis F. Leloir, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, Universidad de Buenos Aires. Intendente Güiraldes 2160 - C1428EGA - Tel. (++54 +11) 4789-9293
Co nta cto :Co nta cto : [email protected]
Tesis Doctoral
Acción de disruptores endocrinos enAcción de disruptores endocrinos encáncer de mama. Rol del factor decáncer de mama. Rol del factor de
crecimiento transformante-ß 1 y delcrecimiento transformante-ß 1 y delreceptor de hidrocarburosreceptor de hidrocarburos
aromáticosaromáticos
Miret, Noelia Victoria
2018-02-26
Este documento forma parte de la colección de tesis doctorales y de maestría de la BibliotecaCentral Dr. Luis Federico Leloir, disponible en digital.bl.fcen.uba.ar. Su utilización debe seracompañada por la cita bibliográfica con reconocimiento de la fuente.
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Cita tipo APA:
Miret, Noelia Victoria. (2018-02-26). Acción de disruptores endocrinos en cáncer de mama. Roldel factor de crecimiento transformante-ß 1 y del receptor de hidrocarburos aromáticos.Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires.
Cita tipo Chicago:
Miret, Noelia Victoria. "Acción de disruptores endocrinos en cáncer de mama. Rol del factor decrecimiento transformante-ß 1 y del receptor de hidrocarburos aromáticos". Facultad deCiencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires. 2018-02-26.
UNIVERSIDAD DE BUENOS AIRES
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
Departamento de Química Biológica
Acción de disruptores endocrinos en cáncer de mama. Rol
del factor de crecimiento transformante-β 1 y del receptor
de hidrocarburos aromáticos
Tesis presentada para optar al título de Doctor de la Universidad de Buenos Aires
en el área de Química Biológica
Lic. Noelia Victoria Miret
Directora de tesis: Dra. Andrea Silvana Randi
Consejera de Estudios: Dra. Elba Susana Vázquez
Lugar de trabajo: Laboratorio de Efectos Biológicos de Contaminantes Ambientales,
Departamento de Bioquímica Humana, Facultad de Medicina, Universidad de
Buenos Aires
Buenos Aires, 2018
Fecha de defensa: 26/02/18
Resumen
Acción de disruptores endócrinos en cáncer de mama - Rol del factor de
crecimiento transformante-beta 1 y del receptor de hidrocarburos aromáticos
Resumen
La incidencia de cáncer de mama está aumentando a nivel mundial y la exposición
a disruptores endocrinos ha cobrado importancia, como un potencial factor de riesgo. El
Hexaclorobenceno (HCB) fue utilizado como fungicida y, a pesar de estar prohibido, sigue
liberándose al ambiente como un subproducto de la manufactura de compuestos
organoclorados. Actúa como un disruptor endócrino y ha sido clasificado como probable
carcinógeno humano. Previamente observamos que genera lesiones mamarias
preneoplásicas y promoción de tumores mamarios en ratas. Asimismo, induce migración e
invasión en células de carcinoma mamario humano MDA-MB-231, así como metástasis en
diferentes modelos animales de cáncer de mama. El HCB se une débilmente al receptor de
hidrocarburos aromáticos (AhR) y ejerce parte de sus acciones a través del mismo. Existe
una interacción entre las vías de señalización del AhR y del factor de crecimiento
transformante-β1 (TGF-β1), teniendo blancos moleculares comunes y mecanismos de
regulación recíproca. El TGF-β1 participa en diferentes etapas de la morfogénesis mamaria
y del desarrollo del cáncer de mama. El objetivo de este trabajo fue evaluar si las vías de
señalización del TGF-β1 y del AhR están involucradas en el mecanismo de acción del HCB,
tanto en carcinogénesis mamaria como en la glándula mamaria normal.
En primer lugar, estudiamos si la migración e invasión inducidas por el HCB, en las
células MDA-MB-231, dependen de la interrelación TGF-β1/AhR. Observamos que el tóxico
modula la interacción entre ambas vías: la unión del HCB al AhR resulta en un incremento
de los niveles de ARNm del TGF-β1, mientras que la activación de la vía del TGF-β1 por el
tóxico reduce el contenido de ARNm del AhR. Además, estimula las vías de señalización
del TGF-β1 canónicas (Smad3) y no canónicas (p38 y JNK). Finalmente, la inducción de
estas vías de señalización del TGF-β1 son requeridas para que el HCB incremente la
migración y la invasión.
Por otro lado, se evaluó el efecto del HCB sobre el ciclo celular, la migración y las
vías de señalización del AhR y del TGF-β1, empleando células epiteliales (NMuMG) y
fibroblastos (FGM AhR+/+ y AhR-/-) de glándula mamaria de ratón. La exposición a una
Resumen
dosis baja de HCB (0,05 µM) induce la migración de las células NMuMG, y activa el camino
AhR/c-Src y las vías del TGF-β1. Sin embargo, a dosis alta (5 µM), el HCB reduce la
migración, promueve el arresto del ciclo celular y estimula el camino nuclear del AhR. Los
fibroblastos AhR+/+ expuestos al HCB (5 µM) adquirieron un fenotipo semejante al de los
fibroblastos asociados a cáncer, ya que expresan α-SMA y exhiben una reducción en los
niveles del receptor del TGF-β1 de tipo II. Adicionalmente, el medio condicionado de estos
fibroblastos incrementa la migración de las células NMuMG. Finalmente, analizamos si el
HCB produce alteraciones en la glándula mamaria de ratones (C57BL/6N) AhR+/+ y
AhR-/-. Los resultados sugieren que el tóxico enlentece el desarrollo mamario de los
ratones AhR+/+, generando la prevalencia de estructuras indiferenciadas como las yemas
terminales. Asimismo, induce hiperplasia ductal, y aumenta la proliferación y los niveles del
receptor de estrógenos-α en las células epiteliales. Los ratones AhR-/- exhibieron
hiperplasia ductal y un incremento en el crecimiento mamario en ausencia del tratamiento
con HCB, revelando la importancia del AhR en el desarrollo mamario.
En conclusión, nuestros hallazgos demuestran que concentraciones ambientales de HCB
modulan las vías de señalización del AhR y del TGF-β1. Esto podría contribuir a las
alteraciones observadas en la morfogénesis mamaria normal y a exacerbar un fenotipo
promigratorio, tanto en las células epiteliales normales como en las células neoplásicas,
generando un mayor grado de malignidad. Asimismo, nuestros resultados apoyan la
hipótesis de que la presencia y bioacumulación de disruptores endocrinos como el HCB en
tejidos con alto contenido graso y en períodos críticos, hacen de este compuesto un factor
de riesgo para el desarrollo tumoral mamario.
Palabras clave:
Hexaclorobenceno
Disruptores endócrinos
Cáncer de mama
Glándula mamaria
Receptor de hidrocarburos aromáticos
Factor de crecimiento transformante-beta 1
Abstract
Action of endocrine disruptors in breast cancer - Role of the transforming
growth factor-beta 1 and the aryl hydrocarbon receptor
Abstract
The incidence of breast cancer is increasing globally and the exposure to endocrine
disruptors has gained importance as a potential risk factor. Hexachlorobenzene (HCB) was
used as a fungicide and, despite being banned, considerable amounts are still being
released into the environment as waste by-product of several industrial processes. HCB
acts as an endocrine disruptor and was classified as a probable human carcinogen. We
have previously demonstrated that HCB induces premalignant mammary lesions and
promotes of mammary tumors in rats. Furthermore, HCB stimulates cell migration and
invasion in the human breast cancer cell line MDA-MB-231, and increases metastasis in
different breast cancer experimental models in mice. HCB weakly binds to the aryl
hydrocarbon receptor (AhR) and exerts some of its effects through the same. TGF-β1 and
AhR signaling interact both in reciprocal regulation and toward common target.
Transforming growth factor-β1 (TGF-β1) participates in different stages of mammary
morphogenesis and breast cancer development. The aim of our study was to evaluate
whether the TGF-β1 and AhR signaling pathways could be involved in the mechanism of
action of HCB, both in mammary carcinogenesis and in the normal mammary gland.
First, we analyzed whether the migration and invasion induced by HCB in MDA-MB-
231 cells, depend on the TGF-β1/AhR crosstalk. Our results have shown that HCB
modulates the interaction between AhR and TGF-β1 signaling: HCB binds to AhR and
induces TGF-β1 mRNA expression levels, whereas the activation of the TGF-β1 pathway by
HCB decreases the AhR mRNA content. Besides, HCB stimulates the canonical and non-
canonical TGF-β1 pathways. Finally, we found that both, the canonical and non-canonical
TGF-β1 signaling pathways, are necessary for the HCB-induced migration and invasion in
MDA-MB-231 cells.
On the other hand, HCB action was analyzed in terms of cell cycle, cell migration,
and AhR and TGF-β1 signaling pathways, in mouse mammary epithelial (NMuMG) and
fibroblast cells (FGM AhR+/+ and AhR-/-). Our results in NMuMG cells showed that, at a
low dose (0.05 µM), HCB induces cell migration and activates AhR/c-Src and TGF-β1
signaling. However, at a high dose (5 µM), HCB reduces cell migration, promotes cell cycle
Abstract
arrest and stimulates the AhR nuclear pathway. The fibroblasts AhR+/+ exposed to 5 µM
HCB acquired a phenotype similar to that of the cancer-associated fibroblast, since they
were expressing α-SMA and were displaying a reduction of the TGF-β1 receptor II levels.
Furthermore, the conditioned medium from these fibroblasts was able to enhance NMuMG
cell migration. Finally, we analyzed if HCB could induce alterations in mammary gland from
AhR+/+ and AhR-/- mice (C57BL/6N). Results suggest that HCB slow down mammary
gland development in AhR+/+ mice, generating the prevalence of undifferentiated
structures such as terminal end buds. Besides, HCB induces ductal hyperplasia and
enhances cell proliferation and estrogen receptor-α levels in ductal epithelial cells from
AhR+/+ mice. Interestingly, AhR-/- mice exhibited an increase in ductal hyperplasia and
mammary growth in the absence of HCB treatment, thus revealing the importance of AhR
in mammary development.
In conclusion, our results demonstrate that environmental HCB concentrations
modulate the AhR and TGF-β1 signaling pathways. This could contribute to alter mammary
branching morphogenesis and to exacerbate a pro-migratory phenotype in epithelial and
neoplastic cells, promoting a high degree of malignancy. In addition, our results support
the hypothesis that the presence and bioaccumulation of endocrine disruptors such as
HCB in tissues with high fat content and in critical periods make this compound a risk
factor for the development of breast cancer.
Keywords:
Hexachlorobenzene
Endocrine disruptors
Breast cancer
Mammary gland
Aryl hydrocarbon receptor
Transforming growth factor-beta 1
Agradecimientos
Una gran etapa de mi vida concluye y otra inicia. Convertirme en doctora me costó
mucho esfuerzo, dedicación, perseverancia y trabajo, y nunca lo habría logrado sola. Es por
eso, que hay algunas personas a las que me gustaría agradecerles. No estaría aquí sin
ustedes:
En primer lugar a mi directora Andrea Randi. Gracias por confiar en mi y por darme
la increíble oportunidad de trabajar juntas. Sos una gran directora y compañera, siempre
dispuesta a escuchar, discutir resultados y buscar soluciones a los problemas que se nos
presentaban en el camino, no solo en lo relacionado al trabajo sino a la vida misma.
Admiro tu amor y dedicación a la ciencia, algo que lograste transmitirme. Te aprecio
muchísimo.
A mis compañer@s/amig@s del labo, por hacer del espacio de trabajo un lugar
agradable y solidario, y por los mates interminables. Me alegra muchísimo poder seguir
compartiendo la mesada con todos ustedes!! A Caro y Flopi, por estar desde el inicio y
acompañarme en mis primeros pasos en el laboratorio, por enseñarme a tener paciencia
cuando los resultados no dan y por todas las charlas compartidas. Las admiro muchísimo y
“cuando sea grande” quiero ser como ustedes. A Lore y Lean, por llegar y traer un poco de
juventud al grupo, y por hacer que las charlas no sean solo sobre pañales!! Sigamos
organizando nuestras salidas cerveceras! A Lau, por ofrecer siempre su ayuda
desinteresada, aún más allá de la mesada. A Marce y Alicia por todos los momentos
compartidos. A Diana por su apoyo y colaboración. A Zahira, Gisel y Ezequiel por su buena
onda.
A la gente del quinto piso de Medicina por toda la buena predisposición a la hora
de ayudarnos, y por todas esas charlas en los pasillos. En particular a Mechita por pasar
siempre a chequear que todo funcione, acompañada de su taza de té y las chocolinas.
A toda la gente de Radiosótopos por recibirme siempre con los brazos abiertos y
por las horas de docencia compartida. En especial a Clau, Mariel y Clari por compartir este
camino juntas. Eternamente agradecida con ustedes por mostrarme el mundo de la ciencia
y guiarme en los primeros pasos de mi formación. A Gabi, Gra, Nora, Vani, Marianela,
Maria Rosa, Tami, Guada y Meli por su buena onda y predisposición.
Agradecimientos
Al Dr. Pedro Fernández-Salguero por recibirme en su laboratorio, y por su interés y
compromiso. Y a toda la gente del laboratorio de BIMOCAN, en especial a Eva, por todo su
apoyo y paciencia.
A la Dra. Natalia Fernández por toda su energía y por colaborar con nuestro
trabajo. A Ale, Dani y Emi por enseñarme tanto y toda su alegría.
A la Dra. Elsa Zotta por su colaboración con los ensayos de Inmunohistoquímica y
buena predisposición.
A la Universidad de Buenos Aires, a la Agencia de Promoción Científica y
Tecnológica, al Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas y a Boehringer
Ingelheim Fonds por el apoyo económico a través de las becas recibidas y los subsidios
que contribuyeron a la realización de este trabajo.
A mamá y papá por enseñarme a creer en mi misma y por mostrarme, con el
ejemplo, que con trabajo duro y esfuerzo toda meta es alcanzable. Gracias por estar
siempre a mi lado, los amo con todo el corazón.
A mis hermanos, Juan y Javi, por toda su ayuda y paciencia. Por todas las charlas y
esperarme siempre a que saliera del labo para viajar a Entre Ríos. Son mi tesoro!
A mis abuelos, tíos y primos por todo su apoyo incondicional y su cariño. En
especial, quiero agradecerle a mi tío Miguel por ser el primero en ofrecerse siempre a
darme una mano y por su paciencia infinita.
A mi hermana del alma Meli, por estar siempre a mi lado y bancarme en todas.
Gracias por escuchar siempre mostrando interés, aunque no entendieras que es una célula,
un paper o una pipeta. Te quiero muchísimo.
A Dario, Hernán y Nico por su hermosa amistad y por todos sus consejos. Gracias
por acompañarme en cada paso de este, que fue un largo camino.
A Hector, mi amor y compañero de la vida y de aventuras, gracias por apoyarme
siempre a lo largo de todo este camino y por toda tu paciencia y ayuda cuando tenía que
quedarme trabajando a hasta cualquier hora, incluso los fines de semana. Gracias por creer
siempre en mi. Te amo!!
En la adversidad despertamos cualidades que en
la comodidad, habrían permanecido dormidas
-Anónimo-
A mis viejos…
Publicaciones
TRABAJOS PUBLICADOS A PARTIR DE LOS RESULTADOS DE ESTA TESIS DOCTORAL
-Transforming Growth Factor-β1 signaling pathways are involved in
Hexachlorobenzene-induced cell migration and invasion in MDA-MB-231 human
breast cancer cell line.
Miret Noelia, Pontillo Carolina, Ventura Clara, Carozzo Alejandro, Chiappini Florencia,
Kleiman de Pisarev Diana, Fernández Natalia, Cocca Claudia, Randi Andrea.
Toxicology 366 (2016) 20–31. Doi: http://dx.doi.org/doi:10.1016/j.tox.2016.08.007
-A dioxin-like compound induces hyperplasia and branching morphogenesis in
mouse mammary gland, through alterations in TGF-β1 and Aryl hydrocarbon
receptor signaling.
Miret Noelia, Rico-Leo Eva, Pontillo Carolina, Zotta Elsa, Fernández-Salguero Pedro, Randi
Andrea.
Toxicology and Applied Pharmacology 334 (2017) 192–206. Doi:
http://dx.doi.org/10.1016/j.taap.2017.09.012
Índice
ABREVIATURAS ................................................................................................................................................. 1
INTRODUCCIÓN ................................................................................................................................................. 7
1. Disruptores endócrinos ............................................................................................................................ 8
2. Hexaclorobenceno ..................................................................................................................................... 9
2.1. Características generales ................................................................................................................. 9
2.2. Toxicidad en humanos ................................................................................................................... 11
2.3. Toxicidad en animales de experimentación ........................................................................... 12
2.3. Resultados previos de nuestro laboratorio ............................................................................ 13
2.4. Dosis ambientalmente relevantes .............................................................................................. 14
3- Glándula mamaria ................................................................................................................................... 15
3.1. Estructura y desarrollo de la glándula mamaria de ratón ................................................. 15
3.2. Interacción entre células epiteliales y fibroblastos en la morfogénesis
mamaria puberal ....................................................................................................................................... 19
4- Cáncer de mama ...................................................................................................................................... 21
4.1. Aspectos generales .......................................................................................................................... 21
4.2. Migración e invasión celular ........................................................................................................ 24
4.3. Ciclo celular ........................................................................................................................................ 26
5. Acción de disruptores endócrinos en glándula mamaria y carcinogénesis ....................... 29
6- Receptor de Hidrocarburos Aromáticos (AhR) ............................................................................. 31
6.1. Mecanismo de acción del AhR .................................................................................................... 31
6.2. Funciones del AhR en el desarrollo de la glándula mamaria .......................................... 34
6.3. Papel del AhR en carcinogénesis mamaria ............................................................................. 35
7- Factor de Crecimiento Transformante beta-1 (TGF-β1) ............................................................ 36
7.1. Funciones del TGF-β1 ..................................................................................................................... 36
7.2. Síntesis y regulación del TGF-β1 ................................................................................................ 37
7.3. Receptores del TGF-β1 y vías de señalización ....................................................................... 39
7.4. Acción del TGF-β1 en la glándula mamaria ........................................................................... 41
7.5. Vía de señalización del TGF-β1 y cáncer de mama ............................................................. 42
Índice
8. Interacción entre el AhR y el TGF-β1 ................................................................................................ 44
OBJETIVOS .......................................................................................................................................................... 46
Objetivo general ............................................................................................................................................ 47
objetivos específicos .................................................................................................................................... 48
MATERIALES Y MÉTODOS ........................................................................................................................... 51
1. ENSAYOS IN-VITRO ..................................................................................................................................... 52
1.1. Materiales y reactivos .......................................................................................................................... 52
1.2. Cultivos de líneas celulares ............................................................................................................... 53
1.2.1 MDA-MB-231 .................................................................................................................................. 53
1.2.2. MCF-10A .......................................................................................................................................... 53
1.2.3. NMuMG ............................................................................................................................................ 53
1.2.4. FGM AhR+/+ y FGM AhR-/- ..................................................................................................... 54
1.3. Cultivos primarios de células epiteliales de mama de ratón ................................................ 54
1.4. Exposición de las líneas celulares y los cultivos primarios al HCB. .................................... 55
1.5. Pretratamiento con inhibidores. ...................................................................................................... 55
1.6. Obtención de lisados celulares y sobrenadantes ..................................................................... 56
1.7. Análisis de niveles de proteínas ...................................................................................................... 57
1.7.1. Determinación de la concentración de proteínas. ........................................................... 57
1.7.2. Electroforesis en geles de poliacrilamida. .......................................................................... 57
1.7.3. Ensayo de Inmunoblot. ............................................................................................................... 57
1.8. Estudio de la expresión de ARNm .................................................................................................. 59
1.8.1. Extracción y cuantificación del ARN ...................................................................................... 59
1.8.2. Reacción de retrotranscripción (RT) seguida de la reacción en cadena
de la polimerasa en tiempo real (qPCR) .......................................................................................... 60
1.9. Ensayo de viabilidad celular .............................................................................................................. 62
1.10. Distribución del ciclo celular .......................................................................................................... 62
1.11. Ensayo de proliferación celular ..................................................................................................... 62
Índice
1.12. Ensayo de migración celular .......................................................................................................... 63
1.13. Ensayo de invasión celular .............................................................................................................. 64
1.14. Inmunofluorescencia ......................................................................................................................... 64
1.15. Determinación de los niveles citosólicos de calcio ............................................................... 66
2. ENSAYOS IN-VIVO ........................................................................................................................................ 67
2.1. Materiales y reactivos .......................................................................................................................... 67
2.2. Ratones ..................................................................................................................................................... 67
2.3. Evaluación morfológica de la glándula mamaria completa (whole mount) ................... 68
2.4. Análisis histológico de la glándula mamaria .............................................................................. 69
2.5. Inmunohistoquímica ............................................................................................................................ 69
3. ANÁLISIS ESTADÍSTICOS ............................................................................................................................ 71
CAPÍTULO I - CARCINOGÉNESIS MAMARIA ...................................................................................... 72
RESULTADOS ................................................................................................................................................ 73
1. Acción del HCB sobre los niveles de ARNm del AhR y del TGF-β1 ....................................... 73
2. El HCB altera la expresión proteica del AhR y su localización ................................................. 75
3. Efecto del HCB sobre los niveles de expresión y activación del TGF-β1 ............................. 78
4. Acción del HCB sobre la vía de señalización del TGF-β1 dependiente de Smad ............ 79
4.1. Niveles de fosforilación de Smad3 ............................................................................................ 79
4.2. Localización de Smad3 ................................................................................................................... 80
4.3. Mecanismo de acción del HCB sobre la vía de TGF-β1/Smad ........................................ 81
5. Efecto del HCB sobre las vías del TGFβ-1 independientes de Smad .................................... 82
6. HCB induce migración celular por medio de las vías del TGFβ-1 .......................................... 85
7. Contribución de las vías del TGF-β1 en la invasión celular inducida por HCB ................. 87
8. Validación de los inhibidores PP2, SP600125 y PD98059 ......................................................... 89
9. Niveles citosólicos de calcio ................................................................................................................. 91
DISCUSIÓN .................................................................................................................................................... 93
Índice
CAPÍTULO II - GLÁNDULA MAMARIA................................................................................................... 98
RESULTADOS ................................................................................................................................................ 99
1. Acción del HCB sobre las células epiteliales mamarias NMuMG ........................................... 99
1.1. Análisis de la viabilidad y del ciclo celular .............................................................................. 99
1.2. Efecto sobre la proliferación celular ....................................................................................... 100
1.3. Estudio de la migración de las células NMuMG ................................................................ 101
1.4. Efecto del HCB sobre la expresión y señalización del AhR en células NMuMG .... 103
1.5. Análisis de la expresión y señalización del TGF-β1 en células NMuMG
expuestas al HCB ................................................................................................................................... 105
1.6. Participación de las vías del AhR y del TGF-β1 sobre la migración inducida
por HCB ..................................................................................................................................................... 108
2. Cultivos primarios de células epiteliales de glándula mamaria de ratones
AhR+/+ y AhR-/- ........................................................................................................................................ 111
2.1. Caracterización del cultivo primario de células epiteliales (EMG) .............................. 111
2.2. Efecto del HCB sobre el AhR y su vía de señalización en cultivos EMG ................... 112
2.3. Expresión del TGF-β1 y sus receptores en cultivos EMG tratados con HCB ........... 112
2.4. Acción del HCB sobre la expresión de IGF-I y HER1 en cultivos EMG ...................... 112
3. Efecto del HCB sobre fibroblastos de glándula mamaria (FGM) de ratones
AhR+/+ y AhR-/- ........................................................................................................................................ 114
3.1. Análisis de la viabilidad, el ciclo celular y la migración ................................................... 114
3.2. Estudio de la expresión y señalización del AhR en fibroblastos expuestos
a HCB .......................................................................................................................................................... 117
3.3. Efecto del HCB sobre la expresión del TGF-β1 y sus receptores en
fibroblastos .............................................................................................................................................. 117
3.4. Acción del HCB sobre los niveles de expresión de IGF-I y HER1 ................................ 119
3.5. Expresión de α-SMA en los fibroblastos tratados con HCB .......................................... 119
4. Acción del medio condicionado de fibroblastos expuestos al HCB, sobre las
células epiteliales ....................................................................................................................................... 121
4.1. Efecto sobre la viabilidad y el ciclo celular .......................................................................... 121
4.2. Estudio de la migración celular ................................................................................................ 122
4.3. Niveles de expresión del AhR y del TGF-β1 ........................................................................ 122
Índice
5. Ensayos in vivo: acción del HCB sobre la glándula mamaria de ratones
AhR+/+ y AhR-/- ........................................................................................................................................ 124
5.1. Estudio morfológico de la glándula mamaria mediante Whole mount ................... 124
5.2. Análisis histológico de la glándula mamaria ...................................................................... 126
5.3. Expresión y localización del REα y del RP ............................................................................ 128
6. Niveles citosólicos de calcio en las células epiteliales MCF-10A ........................................ 130
DISCUSIÓN ................................................................................................................................................. 131
CONCLUSIONES Y PERSPECTIVAS ....................................................................................................... 138
BIBLIOGRAFÍA ................................................................................................................................................ 142
Abreviaturas 2
AhR: Receptor de hidrocarburos aromáticos, por sus siglas en inglés aryl hydrocarbon
receptor.
AHRR: Represor del AhR.
ANF: α-naftoflavona.
ARNT: Proteína translocadora nuclear del AhR, por sus siglas en inglés AhR nuclear
translocator.
ATCC: American Type Culture Collection.
BMPs: Proteínas morfogenéticas óseas, por sus siglas en inglés bone morphogenetic
proteins.
BrdU: 5-bromo-2-desoxiuridina.
BSA: Seroalbúmina bovina, siglas del inglés bovine serum albumin.
BSS: Solución salina tamponada, por sus siglas del inglés balanced salt solution.
CAF: Fibroblastos asociados a cáncer, por sus siglas en inglés cancer-associated fibroblast.
CDK: Quinasas dependientes de ciclina, por sus siglas en inglés cyclin-dependent kinases.
Celulas NK: Células asesinas naturales, por sus siglas en inglés natural killer.
CLG: Complejo latente grande.
CLP: Complejo latente pequeño.
COP(s): Compuesto(s) orgánico(s) persistente(s).
CYP: Citocromo P450.
DAB: 3,3' tetrahidrocloruro de diaminobencidina.
DAPI: 4’,6-Diamidino-2-fenilindol.
DDE: Dicloro difenil dicloroetileno.
DDT: Dicloro difenil tricloroetano.
DE(s): Disruptor(es) endócrino(s).
Abreviaturas 3
DEPC: Dietilpirocarbonato.
DES: Dietilbestrol.
DMEM: Medio de cultivo Dulbecco’s modified Eagle’s médium.
DMEM-F12: Medio de cultivo Dulbecco’s modified Eagle’s médium nutrient mixture Ham
F-12.
DMSO: Dimetilsulfóxido.
ECL: Kit para el ensayo de quimioluminiscencia, por sus del inglés enhanced
chemiluminescence.
EGF: Factor de crecimiento epidérmico, por sus siglas en inglés epidermal growth factor.
ERK1/2: Quinasa regulada por señales extracelulares 1 y 2, por sus siglas en inglés
extracellular signal related kinase 1 and 2.
ETOH: Etanol.
FGF: Factor de crecimiento de fibroblastos, por sus siglas en inglés fibroblast growth factor.
FICZ: 6-formil indol (3,2-b) carbazol.
Fura 2-AM: Fura 2-acetoximetil ester.
GAPDH: Gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa.
GDP: Guanosina difosfato.
GTP: Guanosina trifosfato.
HC: Hormona de crecimiento.
HCB: Hexaclorobenceno.
HER1: Receptor de EGF tipo 1, también llamado EGFR.
HER2: Receptor de EGF tipo 2.
Hsp: Chaperona de choque térmico.
i.p.: Inyección intraperitoneal.
Abreviaturas 4
IGF-I: Factor de crecimiento insulínico tipo 1, por sus siglas en inglés insulin growth factor I.
IP: Ioduro de propidio.
JNK: Quinasa c-jun N-terminal, por sus siglas en inglés c-Jun N-terminal kinase.
LAP: Péptido asociado a latencia, por sus siglas en inglés latency associated peptide.
LDL: Lipoproteína de baja densidad, por sus siglas en inglés low density lipoprotein.
LINE-1: Elemento nuclear largo intercalado-1, por sus siglas en inglés long interspersed
nuclear element-1.
LTBP: Proteína que une al TGF-β1 latente, por sus siglas en inglés latent TGF-β1 binding
protein.
MAPK: Proteínas quinasas activadas por mitógenos, por sus siglas en inglés mitogen-
activated protein kinases.
MC: Medio condicionado.
M-MLV RT: Transcriptasa reversa Moloney Murine Leukemia Virus.
MMP: Metaloproteasas.
MTT: Bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-ilo)-2,5-difeniltetrazol.
NF-κB: Factor nuclear kappa B.
p.c.: Peso corporal.
PAH: Hidrocarburos aromáticos policíclicos, por sus siglas en inglés polycyclic aromatic
hydrocarbons.
PBS: Buffer fosfato salino, por sus siglas del inglés phosphate buffered saline.
PCBs: Bifenilos policlorados, por sus siglas en inglés polychlorinated biphenyls.
PCNA: Antígeno nuclear de células en proliferación, por sus siglas en inglés proliferating
cell nuclear antigen.
PI3K: Fosfatidilinositol-3-kinasa.
PKB: Proteína quinasa B, también llamada Akt.
Abreviaturas 5
PMSF: Fluoruro de fenilmetilsulfonilo, por sus siglas en inglés phenylmethylsulfonil
fluoride.
PP2: 1-tert-Butyl-3-(4-chlorophenyl)-1H-pyrazolo [3,4-d]pyrimidin-4-amine.
PVDF: Polivinil difluoruro.
qPCR: Reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real, por sus siglas del inglés
quantitative polymerase chain reaction.
RE: Receptor de estrógenos.
RP: Receptor de progesterona.
RPMI: medio de cultivo Roswell Park Memorial Institute.
R-Smad: Smad regulados por receptores.
RT: Retrotranscripción.
SFB: Suero fetal bovino.
SMURF: E3 ligasa de ubiquitina, por sus siglas en inglés Smad ubiquitin regulatory factor.
STAT: Transductor de señales y activador transcripcional, por sus siglas en inglés signal
transducer and activator of transcription.
TCDD: 2,3,7,8-tetraclorodibenzo-p-dioxina.
TEBs: Brotes o yemas terminales, por sus siglas en inglés terminal end buds.
TEM: Transición epitelio-mesenquimática.
TGF-β1: Factor de crecimiento transformante beta 1, por sus siglas en inglés transforming
growth factor beta 1.
TIMP: Inhibidores tisulares de MMP, por sus siglas en inglés tissue inhibitor of MMP.
TRβI: Receptor de TGF-β de tipo 1, por sus siglas en inglés TGF-β1 receptor type I, también
conocido como ALK5.
TRβII: Receptor de TGF-β de tipo 2, por sus siglas en inglés TGF-β1 receptor type II.
Abreviaturas 6
VEGF: Factor de crecimiento endotelial vascular, por sus siglas en inglés vascular
endothelial growth factor.
VEGFR2: Receptor de VEGF de tipo 2.
XRE o DRE: Elementos de respuesta a xenobióticos o dioxinas, por sus siglas en inglés
xenobiotic / dioxin response elements.
α-SMA: Alfa-actina de músculo liso, por sus siglas en inglés alpha-smooth muscle actin.
Introducción 8
1. Disruptores endócrinos
Como su nombre lo sugiere, los disruptores endócrinos (DEs) son compuestos
químicos que alteran la función normal del sistema endócrino. La Agencia de Protección
Ambiental de los Estados Unidos (EPA) define a los DEs como cualquier agente exógeno
capaz de interferir con la síntesis, secreción, transporte, unión a su receptor, acción o
degradación de hormonas endógenas responsables de mantener la homeostasis,
reproducción, desarrollo y/o conducta. Podemos encontrarnos expuestos a DEs mediante
el consumo de agua o alimentos contaminados, incluso por respirar aire contaminado. Se
cree que una amplia gama de sustancias, tanto naturales como fabricadas por el hombre,
actúan como DEs, incluyendo fármacos como el dietilestilbestrol (DES), dioxinas y
compuestos tipo dioxina, bifenilos policlorados (PCBs), dicloro difenil tricloroetano (DDT) y
otros pesticidas, metales pesados como el cadmio, y plastificantes como el bisfenol A.
Dado que estos compuestos no parecen compartir ninguna similitud estructural, más allá
de presentar bajo peso molecular en comparación a las macromoléculas, es difícil predecir
que compuestos podrían actuar como DEs (Crews y col., 2003).
Los DEs presentan la característica de actuar a dosis muy bajas, pudiendo generar
anormalidades endocrinas y reproductivas, especialmente si la exposición ocurre en
ventanas temporales críticas para el desarrollo. Esto ha hecho imposible establecer dosis
seguras para este tipo de compuestos. Además, las dosis menores suelen provocar
mayores efectos, incluso que las dosis más elevadas, mostrando curvas de dosis-respuesta
que difieren de la tradicional respuesta lineal. Por el contrario, se observan curvas en forma
de U o en forma de U invertida, como ocurre con las respuestas hormonales o de los
neurotransmisores (Sheehan y col., 1999; WHO, 2013). Otro problema subyace en el hecho
de que nos encontramos expuestos a mezclas de DEs, y los efectos de dicha exposición
pueden ser aditivos o incluso sinérgicos (Crews y col., 2003; Schneider y col., 2017). Las
zonas industrializadas se caracterizan por presentar contaminaciones de una amplia
variedad de compuestos químicos, que se bioacumulan y biomagnifican a lo largo de la
cadena trófica. Algunas de estas sustancias fueron diseñadas para tener vida media larga, y
esto es sumamente perjudicial para la fauna y los seres humanos, debido a que no se
degradan fácilmente, no pueden ser metabolizadas o son metabolizadas en compuestos
más tóxicos. Incluso las sustancias que fueron prohibidas hace décadas permanecen en
niveles altos en el medio ambiente y pueden ser detectadas en muestras humanas (Calafat
y Needham, 2007).
La exposición a DEs, en particular durante el desarrollo fetal y los primeros años de
vida, puede desencadenar consecuencias en el adulto, dado que presentan cierta latencia
Introducción 9
entre el tiempo de exposición y la manifestación de los trastornos clínicos (Birnbaum, 2009;
Diamanti-Kandarakis y col., 2009). En general, los problemas de salud ocasionados en
humanos son el resultado de la exposición crónica a las cantidades bajas de mezclas de
DEs. Esto, sumado a su latencia, crea nuevos desafíos cuando uno intenta establecer una
relación entre la exposición a un compuesto y un desorden en particular. Además, los DEs
inducen alteraciones tanto genéticas como epigenéticas, por lo cual los efectos adversos
pueden observarse en las siguientes generaciones (Anway y Skinner, 2006).
Los xenoestrógenos son un grupo especial de DEs capaces de generar efectos
estrogénicos o antiestrogénicos, ya sea porque mimetizan o antagonizan a los estrógenos
naturales (Li y col., 2013), alteran la síntesis y el metabolismo de hormonas endógenas
(Wang y col., 2010), modifican los niveles de receptores hormonales (Hayashi y col., 2007),
o desencadenan múltiples caminos de señalización (Markey y col., 2002). Generalmente no
son ligandos específicos del Receptor de Estrógenos (RE) clásico y poseen una muy baja
afinidad de unión relativa al RE, aproximadamente 1000-2000 veces menor que el 17-β-
estradiol (Bouskine y col., 2009).
2. Hexaclorobenceno
2.1. Características generales
El Hexaclorobenceno (HCB) es un hidrocarburo aromático clorado, prácticamente
insoluble en agua, pero muy soluble en grasas, aceites y solventes orgánicos. Es un cristal
de color blanco, sólido a temperatura ambiente, sintetizado por el hombre mediante la
cloración del benceno. Su estructura y propiedades físicas se muestran en la Figura 1.
El HCB fue utilizado principalmente como fungicida, en el tratamiento de semillas
de cebollas, sorgo, trigo y otros granos destinados a la siembra. También se había utilizado
en la producción de materiales pirotécnicos con fines militares, en la producción de caucho
sintético, como regulador de la porosidad en la fabricación de electrodos, como un
intermediario químico en la fabricación de tinturas y como preservante de maderas. Su uso
como fungicida llegó a un punto máximo en la década de 1980 y luego comenzó a
reducirse, debido a diversas políticas de restricción que se fueron desarrollando en cada
país en particular (Reed y col., 2007). En Argentina, su uso fue restringido en el año 1993 y
prohibido en el año 2000 (Resolución 750/00 Sagpa, publicada en el B.O. N°29. 517 del
02/11/2000). Finalmente, en la Convención de Estocolmo del 2001 sobre compuestos
orgánicos persistentes, su fabricación, uso y comercialización fue prohibida en la mayoría
Introducción 10
de los países. Sin embargo, el HCB aún continúa liberándose al medio ambiente como un
producto involuntario en la fabricación de otros compuestos orgánicos clorados,
incluyendo otros pesticidas, así como por la combustión incompleta y emanaciones de
antiguos residuos de fungicidas (Starek-Świechowicz y col., 2017). La evidencia de que las
poblaciones humanas continuamos expuestas al HCB resulta de numerosas publicaciones
en diferentes partes del mundo, que reportan la presencia de HCB en suero, en leche
materna y en leche vacuna para consumo humano (Chen y col., 2014; Der Parsehian, 2008;
Guo y col., 2014; Harmouche-Karaki y col., 2017; Mrema y col., 2013; Yasmeen y col., 2017).
En un estudio reciente realizado en dos provincias de Argentina, Ushuaia y Salta, se
detectó HCB en el suero de mujeres post-parto, siendo el segundo contaminante más
abundante en Ushuaia (Bravo y col., 2017).
Figura 1: Ficha técnica del HCB.
Se trata de un compuesto orgánico persistente (COP) ya que es muy resistente a la
degradación, tanto química como biológica. Su localización es ubicua, pudiéndose
encontrar en suelo, aire y agua. Dada su vida media larga, puede ser transportado por aire
a través de distancias extensas y, en general, se absorbe en partículas suspendidas y en los
sedimentos del agua. Es acumulado por organismos acuáticos como los peces y se
magnifica a lo largo de la cadena trófica, razón por la cual las poblaciones humanas se
encuentran afectadas (ATSDR, 2015). La mayor vía de exposición es la ingesta de alimentos
contaminados, como productos lácteos, peces y carnes, y en menor medida, por vía
Introducción 11
dérmica y por inhalación. En un estudio realizado en Noruega se demostró que los niños
expuestos al HCB, a través de la leche materna, alcanzan concentraciones hasta 5 veces
superiores que la madre (Stigum y col., 2015). Los nonatos pueden encontrarse expuestos
por vía transplacental (Reed y col., 2007). Dada su naturaleza lipofílica, el HCB se
bioacumula en tejidos con alto contenido graso como la mama, el hígado, la tiroides, el
tejido adiposo y el ovario, donde puede permanecer durante años (van Raaij y col., 1993).
La absorción del HCB es mucho mayor cuando se administra disuelto en aceite,
comparado a su administración como suspensión acuosa (Koss y Koransky, 1975; ATSDR,
2015). En mamíferos, el HCB es lentamente metabolizado a pentaclorofenol en el hígado,
por las enzimas de la familia del citocromo P450 (CYP). A continuación es convertido a
tetraclorohidroquinona o reducido a pentaclorobenceno. Otros metabolitos incluyen
tetraclorobencenos, clorofenoles y tiofenoles. El HCB intacto y sus metabolitos pueden ser
excretados a través de la orina, la bilis y las heces (Starek-Świechowicz y col., 2017).
2.2. Toxicidad en humanos
El HCB produce diversas alteraciones a nivel sistémico (hígado, piel y tiroides),
neurológico, del desarrollo, endócrino e inmunológico, tanto en humanos como en
animales (Reed y col., 2007). Existe un número limitado de estudios de exposición
ocupacional que asocian la exposición al HCB con efectos en el hígado, la tiroides, el riñón
y el sistema inmune (ATSDR, 2015). La única evidencia epidemiológica de exposición oral
surge de los estudios que se hicieron en el sudeste de Anatolia, Turquía. Entre las décadas
de 1940 y 1950, la población se vio expuesta a niveles elevados de HCB por consumir pan
contaminado, ya que la harina había sido elaborada con semillas de trigo tratadas con el
pesticida. Una tasa de mortalidad extremadamente alta (95%) se produjo en lactantes
menores de 2 años de edad, que habían sido amamantados por madres que consumieron
el pan contaminado. En adultos, el mayor efecto fue el desarrollo de porfiria cutánea tarda.
Además se observaron efectos en el sistema nervioso como debilidad, temblores y
convulsiones; úlceras cutáneas y pigmentación en la piel; y efectos de la tiroides tales
como hormonas tiroideas disminuidas (Cripps y col., 1984; Gocmen y col., 1989).
Si bien no existen datos epidemiológicos de exposiciones a bajas dosis de HCB por
largos períodos de tiempo, se cree que sus efectos podrían ser similares, o incluso más
serios, que los producidos por una exposición aguda. La exposición crónica de poblaciones
humanas al HCB se considera un problema de salud pública, debido a que se asocia con
efectos adversos como síntomas neurológicos (Kyriklaki y col, 2016), desórdenes
Introducción 12
inmunológicos (Gascón y col., 2014) y disfunciones tiroideas (Llop y col., 2017). Debido a
que el HCB se acumula en la grasa, incluyendo el tejido mamario, donde puede
permanecer durante largos períodos, la exposición a largo plazo puede resultar en una
acumulación de HCB en el cuerpo. Varios estudios epidemiológicos han encontrado una
asociación entre los niveles séricos de HCB y el cáncer, en particular cáncer de mama
(Raaschou-Nielsen y col., 2005), de próstata (Hardell y col., 2006) y linfoma no-Hodgkin
(Spinelli y col., 2007). Sin embargo, presentan ciertas limitaciones como, por ejemplo, un
tamaño muestral reducido o el hecho de que la población estudiada se encuentra
expuesta a otros organoclorados al mismo tiempo.
2.3. Toxicidad en animales de experimentación
Diferentes estudios han reportado numerosos efectos perjudiciales del HCB, como
inmunotoxicidad, neurotoxicidad, aumento de la síntesis de enzimas microsomales en
hígado, y desencadenamiento de porfiria hepática, hipotiroxinemia y adenomas tiroideos
(Cabral y col., 1977; Kleiman de Pisarev y col., 1990; ATSDR, 2015). Un estudio en cerdos
mostró que solo la intoxicación con altas dosis de HCB provocaba porfiria. En ensayos que
implicaban la exposición subcrónica de ratas al HCB, se observó un incremento en la
porfirinuria y una reducción de las hormonas tiroideas, efecto que se mantenía luego de
cesar el tratamiento (den Besten y col., 1993). Cuando se empleaban dosis de HCB
relativamente bajas, a las cuales no se producían efectos hepáticos, se observaron cambios
a nivel óseo, que incluían alteraciones en la homeostasis del calcio y en la morfometría del
hueso (Reed y col., 2007).
Diversos reportes han demostrado que el pesticida produce toxicidad reproductiva
en animales de experimentación. Dosis bajas de HCB provocaron la estratificación del
epitelio germinal del ovario de monos (IPCS, 1997), mientras que ensayos en ratas
mostraron que el pesticida se acumula en ovarios y testículos, generando toxicidad. En
particular, en las ratas hembras, la exposición al pesticida alteró los niveles de hormonas
ováricas y pituitarias (Ribas-Fitó y col., 2002). Además, se ha observado que el HCB causa
toxicidad en las crías de los animales expuestos, impidiendo el correcto desarrollo
neurológico y reduciendo la viabilidad y el crecimiento neonatal (ATSDR, 2015).
Ensayos en diferentes modelos animales revelaron que el HCB exhibe poca o nula
actividad genotóxica. Sin embargo, se encontró que el pesticida es teratogénico en ratones
y ratas expuestos durante el desarrollo (Haworth y col., 1983; Starek- Świechowicz y col.,
2017). Por otro lado, se ha reportado que la exposición al HCB incrementa el riesgo a
Introducción 13
desarrollar cáncer de hígado, riñón y tiroides, en ratas, ratones y hamsters (ATSDR, 2015).
Además, el HCB actúa como promotor de tumores de hígado inducidos por
dietilnitrosamina en ratas (Stewart y col., 1989), y es co-carcinogénico en la formación de
tumores mamarios inducidos por N-Nitroso N-Metilurea en ratas (Randi y col., 2006).
Debido a la evidencia limitada de una asociación con el cáncer en seres humanos y a las
pruebas en animales de experimentación, la Agencia Internacional de Investigación sobre
el Cáncer (IARC) ha clasificado al HCB como un posible carcinógeno para humanos (grupo
2B).
2.3. Resultados previos de nuestro laboratorio
Nuestro laboratorio se ha centrado en investigar los efectos del HCB sobre la
función de la glándula tiroides y del hígado, así como en carcinogénesis hepática y
mamaria, con el fin de comprender los mecanismos de acción subyacentes. Previamente
observamos que el pesticida actúa como un DE, ya que produce un desbalance en las
hormonas tiroideas (Álvarez y col., 2005). A pesar de que se ha comprobado que el HCB
presenta una capacidad escasa o nula de unirse al REα (Noguerol y col., 2006), hemos
demostrado que produce efectos estrogénicos en glándula mamaria de rata (Peña y col.,
2012). Además, Ralph y colaboradores (2003) han reportado que el HCB induce efectos
androgénicos en ratones.
En estudios in vivo encontramos que la exposición de ratas al HCB altera la
morfología de la glándula tiroidea y los niveles séricos de la hormona tiroxina, así como
induce apoptosis por la vía intrínseca (Chiappini y col., 2009). En células de tiroides de rata,
el HCB reduce la viabilidad y altera la regulación del ciclo celular in vitro. En particular, el
pesticida incrementa los niveles del factor de crecimiento transformante β1 (TGF-β1), lo
que conduce a una reducción en los niveles de ciclina D1 y a un aumento de p27,
promoviendo un arresto del ciclo celular en las fases G2/M y G0/G1 (Chiappini y col., 2014).
Resultados similares se obtuvieron en hígados de ratas tratadas con HCB, donde se
observó un desbalance en la homeostasis hepática. Encontramos que el tratamiento de
ratas con HCB (100 mg/kg de peso corporal, p.c.) activa la quinasa regulada por señales
extracelulares (ERK1/2), conocida por su asociación a mecanismos de sobrevida, e
incrementa la proliferación celular en hígado de ratas. Sin embargo, al mismo tiempo el
tóxico induce la expresión de TGF-β1 y la apoptosis a un amplio rango de dosis, con un
efecto máximo a 10 mg/kg p.c., por mecanismos dependientes de los receptores de
muerte y de la vía mitocondrial (Giribaldi y col., 2011). En otro estudio en hígado de ratas,
Introducción 14
tanto en ensayos in vivo como in vitro, el HCB activa a la quinasa c-Src y promueve su
asociación con el receptor del factor de crecimiento epidérmico (HER1), lo que resulta en la
activación de HER1. Además, observamos que promueve la translocación del AhR del
citosol al núcleo de hepatocitos (Randi y col., 2008). Asimismo, se observó que el tóxico
estimula la actividad de la ornitina decarboxilasa, induce un aumento en la expresión
proteica de los protooncogenes c-Myc, c-Fos y c-Jun, e incrementa los niveles de
poliaminas libres, en hígado de ratas expuestas en forma aguda y crónica (Randi y col.,
2003).
Un estudio reciente sugiere que el HCB podría contribuir a la fisiopatología de la
endometriosis, ya que induce la actividad de metaloproteasas (MMPs), la expresión de
ciclooxigenasa 2 y el camino de señalización de prostaglandina E2, en células estromales
de endometrio humano (Chiappini y col., 2016). Por otra parte, hemos reportado que el
pesticida produce toxicidad reproductiva en ratas hembras. El tratamiento con HCB (1 g/kg
p.c.) resultó en una reducción significativa de los niveles del RE uterino, en los niveles
circulantes de estradiol y prolactina, y en el número de óvulos liberados (Alvarez y col.,
2000). Los resultados obtenidos por nuestro laboratorio, en relación a los efectos del HCB
en la glándula mamaria y en cáncer de mama, son discutidos en la Sección 5 de la
Introducción.
2.4. Dosis ambientalmente relevantes
Las dosis empleadas en este trabajo fueron seleccionadas luego de revisar la
literatura, con el interés de que las mismas sean representativas de las concentraciones
encontradas en el ambiente. Para los ensayos in vitro se empleó un rango de dosis de HCB:
0,005; 0,05; 0,5 y 5 µM. To-Figueras y colaboradores (1997) realizaron un estudio en una
población rural en España, que se encuentra muy expuesta por vía inhalatoria, dado que se
localiza en las cercanías de una fábrica de organoclorados. Estos autores reportaron niveles
de HCB en sueros humanos de 32 ng/ml, que equivale a 1,1 µM y se encuentra dentro del
rango de la dosis más alta empleada en este trabajo de tesis. Por otro lado, el límite
máximo residual permitido en frutas y verduras, según la directiva de la Comisión Europea,
es de 0,01 µM, que se encuentra en el mismo orden que la dosis utilizada de 0,05 µM de
HCB. Además, Guo y colaboradores (2014) mostraron que los niveles de HCB en suero de
madres al momento de dar a luz fueron de 70,62 ng/g de lípido, que equivale
aproximadamente a 0,07 µM. Asimismo, los niveles de HCB en suero de cordón umbilical
resultaron ser 65,16 ng/g de lípido, que equivale aproximadamente a 0,06 µM. En relación
a la menor dosis empleada aquí, un estudio realizado en China reportó niveles de HCB de
Introducción 15
420 pg/ml en suero de mujeres embarazadas, que equivale a 0,0015 µM (Cao y col., 2011).
De manera similar, Becker y colaboradores (2002) encontraron, en suero de una población
adulta en Alemania, niveles de HCB de 440 ng/L, que equivale a 0,002 µM, cercana a la
dosis mas baja usada en este trabajo de tesis. Finalmente, otros investigadores reportaron
que la dosis de 0,005 µM de HCB incrementaba la sensibilidad a andrógenos en células de
cáncer de próstata (Ralph y col., 2003).
Para los ensayos in vivo se seleccionó la dosis de 3 mg/kg p.c., ya que había sido
empleada en previos estudios de nuestro laboratorio. En esos trabajos observamos que el
HCB (3 mg/kg p.c.) promovía crecimiento tumoral mamario, así como incrementaba el
número de focos metastásicos en pulmón de ratón (Pontillo y col., 2013). En otro estudio,
reportamos que la administración de HCB (3 mg/kg p.c.) durante 30 días a ratones,
aumentaba la angiogénesis en la zona de inoculación de células de carcinoma mamario
(Pontillo y col., 2015). Además, Ralph y colaboradores (2003) emplearon una dosis similar
(5 mg/kg/día) y encontraron que producía efectos androgénicos en ratones. Por otra parte,
la dosis empleada en el presente estudio se asemeja a las encontradas en muestras de
suero de diferentes poblaciones (Guo y col., 2014; Mrema y col., 2013; Bravo y col., 2017). A
pesar de que en la presente investigación no se evaluaron las dosis internas del HCB en los
ratones expuestos, tras comparar la dosis empleada aquí con aquellas dosis usadas en un
trabajo previo, pensamos que estas deberían ser similares a las encontradas en
poblaciones humanas. En dicho ensayo, realizado en ratas Wistar a las cuales se les
administró por vía oral una dosis de HCB (500 mg/kg p.c.) en solución acuosa, la
concentración de HCB en suero fue 600 ng/ml (Chiappini y col., 2009). Asumiendo que la
distribución de HCB es similar en ratas y ratones, y considerando que en este trabajo el
pesticida se administró disuelto en aceite, podemos hipotetizar que la concentración en el
suero de los ratones sería de al menos 3 ng/ml. Al respecto, To Figueras y colaboradores
(1997) han encontrado 32 ng/ml de HCB en suero humano de poblaciones altamente
contaminadas.
3- Glándula mamaria
3.1. Estructura y desarrollo de la glándula mamaria de ratón
Para comprender los cambios que llevan a la transformación maligna del tejido
mamario es necesario conocer la estructura y el desarrollo de la glándula normal. La mama
es la característica fundamental de los mamíferos y se trata de una glándula exócrina,
especializada en la producción y secreción de leche, para alimentar y proteger a las crías.
Introducción 16
Está formada por el parénquima, que consta de una estructura celular epitelial dispuesta
como una red arbórea de conductos y alvéolos, rodeados por un estroma de tejido
conectivo y adiposo, que contiene también vasos sanguíneos, vasos linfáticos y nervios. Un
ducto mamario normal está compuesto, de afuera hacia dentro, por el estroma ductal, la
membrana basal, una monocapa de células mioepiteliales y otra de epiteliales luminales en
contacto con la luz del ducto mamario. El estroma ductal normal está formado por
leucocitos, fibroblastos, miofibroblastos y células endoteliales. Se puede identificar un
paralelismo entre la estructura y el desarrollo de la mama humana con la evolución de la
glándula mamaria murina (Chan y col., 2005; IBCERCC, 2013; Russo y Russo, 1996). Por este
motivo, el ratón representa uno de los principales modelos animales para el estudio de la
morfogénesis mamaria, así como del cáncer de mama.
El desarrollo de la glándula mamaria ocurre en tres etapas distintas y
diferencialmente reguladas: embrionaria, puberal y adulta (Figura 2). Estudios en ratones
negativos para el REα, el REβ, el receptor de progesterona (RP) o para los receptores de la
hormona de crecimiento (HC) y prolactina han evidenciado que la ramificación ductal
adolescente requiere de los niveles de estrógeno y del REα. Sin embargo, la ramificación en
el adulto depende de la progesterona y su receptor, mientras que la ramificación en el
período embrionario es independiente de estas hormonas (Sternlicht, 2006). En los ratones,
el desarrollo mamario embrionario comienza a mediados de la gestación, con la formación
de cinco pares de placodas en la capa epitelial, que se invaginan en el mesénquima
subyacente para formar las yemas o brotes mamarios. Cada yema mamaria prolifera y
extiende de 10 a 20 brotes, transformándose así en una rudimentaria estructura ductal.
Después del nacimiento, la glándula rudimentaria entra en una fase de reposo
morfogenético (Robinson, 2007).
Introducción 17
Figura 2: Desarrollo de la glándula mamaria del ratón. A partir del día embrionario 11,5 inicia el
desarrollo de la glándula mamaria hasta obtener un epitelio rudimentario. Al nacer, la mama consta
de unos pocos conductos pequeños que crecen hasta la pubertad (semana 4). Durante este periodo,
debido a la influencia del estrógeno, la HC y el factor de crecimiento insulínico tipo 1 (IGF-I), se
produce un crecimiento expansivo en un proceso llamado morfogénesis ductal. En el ratón virgen
adulto la progesterona solo estimula la ramificación terciaria. Sin embargo durante el embarazo, la
progesterona, junto a la prolactina, inducen el desarrollo de los alvéolos. El estímulo de la prolactina
continúa durante todo el proceso de lactogénesis hasta que, por carencia de demanda, se produce
la involución mamaria y la glándula se remodela volviendo a su estado adulto original. Adaptado de
los trabajos de Gjorevski y Nelson (2011), y de Macias y Hinck (2012).
La pubertad es quizás la etapa más llamativa de la morfogénesis mamaria. Debido a
la influencia de las hormonas ováricas y los factores de crecimiento, los extremos de los
conductos rudimentarios proliferan y se hinchan en estructuras epiteliales conocidas como
brotes o yemas terminales (TEBs). Estos están compuestos por una monocapa externa de
células mioepiteliales, varias capas internas de células epiteliales ductales y una población
de células madre, y el capuchón distal se caracteriza por la ausencia de estroma (Sternlicht,
2006). Además, expresan marcadores moleculares que los diferencian de los ductos
Introducción 18
mamarios. Daniel y colaboradores (1995) demostraron que tanto las células epiteliales de
los ductos, como de los TEBs, expresan E-cadherina, pero solo las células de los TEBs
expresan P-cadherina. Los TEBs penetran en la almohadilla de grasa y son sometidos a
sucesivas rondas de elongación, bifurcación y ramificación lateral, formando así el árbol
epitelial completo. La estructura ductal primaria es generada por la bifurcación de los TEBs
y es regulada por el estroma circundante. Las ramas secundarias brotan lateralmente de los
conductos primarios hasta que la red de conductos ocupa el 60% del estroma graso
disponible, dejando abundante espacio para el rellenado que ocurrirá bajo la influencia de
las hormonas del embarazo. Finalmente, bajo el estímulo ovárico cíclico, se producirán las
ramificaciones terciarias cortas, en cuyos extremos se desarrollan estructuras alveolares
que son incapaces de producir y secretar leche, sin el estímulo de las hormonas del
embarazo (Gjorevski y Nelson, 2011). En el humano, la mama puberal contiene un árbol
mamario semejantemente extenso, pero los TEBs se diferencian en estructuras
denominadas lóbulos, compuestos por un ducto terminal y varios pequeños acinos o
alvéolos. Su desarrollo durante el ciclo menstrual se caracteriza por cambios cíclicos que
reflejan las variaciones hormonales. El estrógeno estimula la proliferación del parénquima
con la formación y ramificación de los conductos, mientras que la progesterona favorece la
dilatación de los conductos y la diferenciación de las células alveolares (Macias y Hinck,
2012).
Durante el embarazo, el epitelio luminal prolifera y se diferencia en alvéolos
secretores y productores de leche, bajo la influencia de la progesterona y la prolactina. El
tejido adiposo desaparece mientras que las células epiteliales ocupan los espacios entre
los ductos. Finalmente, en el período post-lactancia se desencadena el proceso de
involución, donde se produce una apoptosis masiva que elimina hasta un 80 % del epitelio,
volviendo a generar la arquitectura ductal del adulto. Pueden distinguirse dos fases en la
involución mamaria. La primera es gobernada por factores locales que inducen la
apoptosis de las células alveolares, es reversible y no se producen grandes cambios
morfológicos. En cambio, en la segunda fase se produce un remodelado masivo e
irreversible de la arquitectura de la mama, bajo la influencia de factores sistémicos que
incluye el colapso de los alvéolos y la diferenciación de los adipocitos (Macias y Hinck,
2012; Walker y col., 1989). Notablemente, la glándula mamaria mantiene su capacidad para
llevar a cabo esta remodelación drástica durante el ciclo de embarazo - lactancia -
involución, a lo largo de varias décadas en los seres humanos.
Introducción 19
3.2. Interacción entre células epiteliales y fibroblastos en la morfogénesis mamaria
puberal
Desde hace varios años se sabe que la activación del eje hipotálamo-hipófisis-
ovario es esencial para el desarrollo mamario puberal (Figura 3). Estudios en ratones
hipofisectomizados y en ratones que carecen del receptor de la HC, han demostrado que
la HC liberada por la hipófisis es un regulador global de la morfogénesis mamaria
(Kleinberg y col., 2000, Sternlicht, 2006). La HC actúa a nivel del estroma, induciendo la
expresión y secreción del factor de crecimiento insulínico tipo 1 (IGF-I), que a su vez
estimula la proliferación, la activación de los TEBs y el desarrollo ductal en las células
epiteliales. Se ha sugerido que la sobreexpresión de IGF-I puede conducir a un incremento
descontrolado de la proliferación y se ha asociado con un mayor riesgo de malignidad
(Bonnette y Hadsell, 2001; Kleinberg y col., 2000, Macias y Hinck, 2012).
Otra hormona vital para el desarrollo ductal mamario es el estrógeno secretado por
el ovario, que actúa sobre el REα en las células epiteliales (Curtis Hewitt y col., 2000,
Sternlicht, 2006). El estrógeno y el IGF-I actúan juntos regulando y coordinando la
morfogénesis ductal, la evidencia demuestra, incluso, que producen un efecto sinérgico en
la elongación ductal (Ruan y Kleinberg, 1999). La activación del REα, en las células
epiteliales, estimula la actividad de una proteasa transmembrana (Adam 17), promoviendo
la liberación de anfiregulina, una proteína transmembrana de la familia del factor de
crecimiento epidérmico (EGF). A continuación, la anfiregulina se une a su receptor HER1 en
los fibroblastos, induciendo la expresión y liberación del factor de crecimiento de
fibroblastos (FGF) que, a su vez, actúa sobre las células epiteliales estimulando la
proliferación. Asimismo, la activación de HER1 promueve la liberación de MMPs, que se
encargan de la remodelación de la membrana basal requerida para los cambios en la
arquitectura de la mama (Hynes y Watson, 2010; Sternlicht, 2006).
Además, existen otras proteínas que colaboran en la regulación de la morfogénesis
ductal, como netrin-1, Slit2 y reelina. Estas proteínas son conocidas por operar a nivel del
sistema nervioso, guiando la orientación del axón durante el desarrollo neuronal. En la
glándula mamaria cumplen una función similar, actuando sobre las células epiteliales para
regular el desarrollo ductal (Macias y Hinck, 2012).
Introducción 20
Figura 3: Representación de las señales más importantes endocrinas y paracrinas, que regulan
la morfogénesis mamaria adolescente. Amp (anfiregulina), E (estrógeno), FGFR (receptor de FGF),
GL (ganglio linfático), IGF-IR (receptor de IGF-I), MEC (matriz extracelular), NTN1 (netrin-1), RELN
(reelina), RHC (receptor de HC). Adaptado de Macias y Hinck (2012).
Introducción 21
Por otro lado, el proceso de morfogénesis mamaria requiere un equilibrio de
factores positivos y negativos, que generan el patrón de crecimiento ductal ampliamente
espaciado observado en árboles mamarios. El mayor regulador negativo de la proliferación
de las células epiteliales y, por consiguiente, de la elongación y ramificación ductal es el
TGF-β1 (Ewan y col., 2002; Gorska y col. 1998). Sus efectos sobre la glándula mamaria son
desarrollados en la Sección 7.4 de la Introducción.
4- Cáncer de mama
4.1. Aspectos generales
El cáncer de mama es el cáncer invasivo más común en las mujeres e implica la
proliferación anárquica de las células de la glándula mamaria. En el 97% de los casos su
origen es epitelial, ya sea ductal o lobulillar, mientras que solo un 3% de los casos es de
origen mesenquimático. En los países menos desarrollados, es la causa principal de muerte
por cáncer en mujeres, mientras que en países más desarrollados es la segunda causa de
muerte, después del cáncer de pulmón (Torre y col., 2016). Argentina es el segundo país
con mayor tasa de mortalidad por cáncer de mama en América, siendo el primero
Uruguay. Según los datos del Instituto Nacional del Cáncer (Ministerio de Salud,
Argentina), en Argentina se producen 5600 muertes por año debido a cáncer de mama.
Esta enfermedad afecta principalmente a mujeres de entre 45 y 70 años de edad. Los
hombres también pueden desarrollar cáncer de mama, sin embargo es menos frecuente,
representando menos del 1% de los casos. La falla en la erradicación de la enfermedad se
debe a la falta de identificación de un agente etiológico específico, al tiempo preciso de
iniciación y los mecanismos moleculares responsables de la iniciación y progresión del
cáncer. Dentro de los factores de riesgo de la enfermedad se encuentran la edad, la
historia familiar, la exposición acumulada a hormonas reproductivas, ya sea por un
tratamiento hormonal o por presentar una menarca temprana o menopausia tardía, y el
estilo de vida (el sobrepeso, el sedentarismo, el tabaquismo, el consumo de alcohol
excesivo). Dado que los factores de riesgo conocidos no llegan a explicar todos los casos,
se ha postulado que la exposición ambiental a compuestos organoclorados podría ser un
factor etiológico en el cáncer de mama (IBCERCC, 2013; Salehi y col., 2008).
Según el grado histológico, el cáncer de mama se clasifica en carcinoma in situ
(ductal o lobular) e invasivo, de acuerdo a su capacidad de migrar e invadir otros tejidos. El
desarrollo de la mayoría de los carcinomas invasivos es lento y se origina a partir de
lesiones premalignas. La enfermedad inicia con una proliferación descontrolada de las
Introducción 22
células epiteliales y progresa a través de distintos estadios patológicos, comenzando por
una hiperplasia atípica, seguida por el desarrollo de un carcinoma in situ, un carcinoma
invasivo y generando, finalmente, una enfermedad metastásica (Figura 4). En el carcinoma
ductal in situ avanzado se rompe la membrana basal y se producen cambios en el estroma
circundante, que incluyen un incremento en la proliferación de fibroblastos, infiltración de
linfocitos y angiogénesis. Estos cambios podrían facilitar la transformación del tumor hacia
un estadio invasivo, en el cual se pierde la membrana basal así como la monocapa de
células mioepiteliales, y las células tumorales comienzan a invadir el estroma (Allred y col.,
2001; Burstein y col., 2004; Polyak y Kalluri, 2010).
El cáncer de mama es una enfermedad heterogénea y está compuesta por un
número creciente de subtipos biológicos, que difieren en su prognosis y en su abordaje
terapéutico. Teniendo en cuenta el análisis histológico y de expresión génica, los cinco
subtipos principales son: 1) normal, que tiene un perfil de expresión similar al del tejido de
mama no canceroso; 2) luminal A, RE y/o el RP positivo (+), receptor del factor de
crecimiento epidérmico de tipo 2 (HER2) negativo (-); 3) luminal B, RE y/o RP+, HER2+; 4)
los tumores que sobreexpresan HER2 (HER2+, RE-, RP-); y 5) el subtipo basal (RE-, RP-,
HER2-), usualmente denominado triple negativo. Los tumores triple negativos suelen ser
más agresivos, con una mayor tendencia a presentar metástasis a distancia. Asimismo,
suelen presentar recurrencias tempranas y tiene un mayor riesgo de muerte comparado
con los otros subtipos de cáncer de mama. Además, tienen un perfil epidemiológico
distinto, caracterizado por ser más frecuente en mujeres afroamericanas y latinas (Carey y
col., 2006).
El enfoque predominante en la progresión del cáncer de mama se centra en la
célula tumoral, la cual sufre una acumulación de alteraciones genéticas y epigenéticas que
le confieren un fenotipo maligno. Sin embargo, varios estudios han evidenciado que el
microambiente tumoral desempeña un papel importante en la progresión tumoral,
demostrando que la proliferación, la sobrevida, la polaridad, el estado de diferenciación y
la capacidad invasiva de la célula neoplásica pueden ser modulados por las células
estromales. Los fibroblastos son el mayor componente del estroma y, en cáncer de mama,
adquieren un fenotipo activado denominado fibroblastos asociados a cáncer (CAF). Estos
se caracterizan por expresar alfa-actina de músculo liso (α-SMA), vimentina, desmina y la
proteína activadora de fibroblastos, y por no expresar citoqueratina y CD31. Los CAFs
colaboran con la progresión tumoral, mediante la secreción de factores de crecimiento y
citoquinas que favorecen la pérdida de moléculas de adhesión celular y la transición
epitelio-mesenquimática (TEM). Asimismo, promueven la invasión y la metástasis ya que
Introducción 23
liberan proteínas que degradan la matriz extracelular, así como factores proangiogénicos
(Polyak y Kalluri, 2010; Shiga y col., 2015).
Figura 4: Modelo de progresión tumoral en cáncer de mama. En la parte superior se muestran
fotografías representativas de los diferentes estadios de evolución tumoral mamaria LOB:
estructuras alveolares presentes en la mama normal. HDA: hiperplasia ductal atípica. CIS: carcinoma
in situ. CI: carcinoma invasivo. MET: metástasis. Debajo se esquematizan la evolución tumoral, desde
el tejido normal hasta una metástasis pulmonar, detallando los diferentes tipos celulares
involucrados en el proceso. Adaptado de Vargo-Gogola y Rosen (2007).
Introducción 24
4.2. Migración e invasión celular
La motilidad direccional es un proceso celular esencial para el desarrollo
embrionario, la cicatrización de heridas, las respuestas inmunitarias y el desarrollo de los
tejidos. La migración de la célula tumoral y la invasión a los tejidos circundantes son
procesos necesarios para que se produzca la metástasis. En cáncer de mama, la motilidad
celular está regulada por el citoesqueleto, en particular, por los filamentos de actina
(Pollard y Borisy, 2003). Estos se organizan en diferentes estructuras tridimensionales
llamadas lamelipodios, filopodios e invadopodios. Los lamelipodios son protrusiones
anchas que se forman en la membrana, en la cara hacia donde se dirige al movimiento. Los
filopodios son proyecciones delgadas de la membrana sostenidas por los filamentos de
actina. Los invadopodios son extensiones de grosor moderado compuestos por filamentos
de actina que se forman durante la invasión celular. La célula tumoral se mantiene unida a
la matriz extracelular en sitios discretos, mediante la formación de complejos focales. En
estos complejos, proteínas transmembrana como las integrinas sirven de anclaje,
uniéndose en la cara extracelular a proteínas de la matriz extracelular, y en la cara
citoplasmática a los filamentos de actina, llamados fibras de estrés (Jiang y col., 2009).
En el cáncer de mama, la reorganización del citoesqueleto de actina, la polaridad y
la motilidad de la célula tumoral es dirigida por GTPasas de la familia Rho. Estas funcionan
como interruptores moleculares ciclando entre el estado inactivo (cargadas con guanosina
difosfato, GDP) y el activo (cargadas con guanosina trifosfato, GTP). Las señales que
emanan de una amplia variedad de receptores de membrana regulan positivamente la
actividad de las GTPasas Rho, como por ejemplo los receptores con actividad tirosina
quinasa intrínseca, HER1, el receptor del factor de crecimiento derivado de plaquetas y
receptores acoplados a proteínas G. Una vez activas, estas GTPasas activan un gran
número de efectores que incluyen a ERK1/2, p38, la quinasa c-jun N-terminal (JNK) y la
proteína quinasa B (PKB, también llamada Akt). Los miembros mejor caracterizados de la
familia Rho son: Rac, Rho y Cdc42. Rac participa en la formación del complejo focal, en la
polimerización de actina y en la formación del lamelipodio. Rho estimula la formación de
fibras de estrés, mientras que Cdc42 favorece la polimerización de actina y la formación de
filopodios (Etienne-Manneville y Hall, 2002).
La célula tumoral puede adoptar diferentes estrategias para migrar e invadir,
moviéndose individualmente o de manera colectiva. En la migración individual, la célula
puede escoger entre dos tipos de estrategias, alternando libremente entre un tipo y otro.
La primera es la invasión de tipo fibroblasto o mesenquimal, en el cual la célula se
caracteriza por su morfología ahusada y su movimiento lento. Este tipo de migración
Introducción 25
requiere que se produzca la TEM de la célula tumoral en el frente invasor del tumor
primario, y de la expresión de proteasas para el remodelado de la matriz extracelular. El
movimiento abarca un ciclo de 4 pasos que inicia con la formación de una protrusión
(lamelipodio) hacia la dirección del movimiento, seguido por el anclaje de la membrana al
sustrato en el borde frontal, por medio de la adhesión focal. A continuación, las fibras de
estrés se contraen, generando la tensión suficiente para tirar a la célula hacia adelante.
Finalmente, se desarman los contactos focales, liberando a la célula y permitiéndole ser
arrastrada en la dirección del movimiento (Broussard y col., 2008). La segunda estrategia es
la invasión de tipo ameboide o de leucocito, en la cual la célula pierde su polaridad y las
adhesiones focales. Se trata de un movimiento rápido en el cual la célula atraviesa la matriz
extracelular sin remodelarla, por lo tanto, no requiere de las proteasas (Melzer y col., 2017).
Por otro lado, la invasión colectiva se caracteriza por conservar la adhesión célula-
célula, por la remodelación de la matriz extracelular y por mantener la polaridad dentro de
la unidad migratoria. El movimiento se produce por medio de la coordinación multicelular
y la generación de una fuerza de tracción para la migración hacia adelante. Las células del
centro conservan su fenotipo epitelial y se encuentran protegidas, mientras que las células
de los bordes exhiben un fenotipo mesenquimático. Todas estas estrategias de
movimiento no son mutuamente excluyentes, ya que se ha demostrado que la célula
tumoral puede alternar entre un tipo de movimiento y otro ante determinadas condiciones
(Friedl y Gilmour, 2009; Melzer y col., 2017). De esta manera, la invasión individual de
células tumorales in vivo dirige a las células hacia los vasos sanguíneos resultando en la
diseminación por esta vía (Condeelis y Segall, 2003; Wyckoff y col., 2004); mientras que la
invasión colectiva dirige a las células tumorales hacia los vasos linfáticos (Giampieri y col.,
2009).
Varios estudios demostraron que la vía de señalización del TGF-β1, por medio de la
activación de sus efectores Smad, puede estimular la des-diferenciación de la célula
epitelial, promoviendo un fenotipo invasivo y metastásico (Sundqvist y col., 2012).
Asimismo, la activación de ERK1/2, p38, y JNK se han asociado a un incremento en la
migración e invasión celular en cáncer de mama (Joslin y col., 2007; Kim y col., 2003; Mitra
y col., 2011). De manera similar, la activación del receptor de hidrocarburos aromáticos
(AhR) conduce a la desregulación del contacto célula-célula, a la inducción de la TEM y a
un incremento en la motilidad de las células tumorales (Dietrich y Kaina, 2010).
Introducción 26
4.3. Ciclo celular
Los tejidos normales controlan cuidadosamente la producción y liberación de
factores de crecimiento que instruyen la entrada y la progresión a través del ciclo celular,
asegurando así una homeostasis en el número de células, tanto como en el mantenimiento
de la arquitectura y el funcionamiento del tejido normal. Posiblemente una de las
características fundamentales de la célula tumoral implica su capacidad para proliferar de
manera indefinida, gracias a la desregulación de estas señales (Hanahan y Weinberg,
2011).
El ciclo celular es una sucesión ordenada de eventos que conducen a la división de
la célula, para dar origen a dos células hijas. Se trata de un proceso irreversible y altamente
coordinado para garantizar la correcta duplicación y segregación del genoma.
Originalmente se reconocían dos fases: la interfase, donde se replica el ADN; y la mitosis,
en la que se segregan los cromosomas replicados en dos células separadas. Hoy se
conocen cuatro fases: G1, S, G2 y M (Figura 5). Ante el estímulo adecuado, las células en
estado quiescente (fase G0) ingresan a la fase G1, donde se sintetizan las proteínas
necesarias para la duplicación del ADN. Se trata de la fase de duración más variable y es
dependiente de mitógenos hasta atravesar el punto de restricción R, momento en el cual la
célula se compromete a progresar a la fase S y duplicar su ADN. En la fase G2 la célula se
prepara para la división celular, que ocurre en la fase M. Esta última fase es la de menor
duración y, en ella, las cromátidas hermanas resultantes de la duplicación del ADN se
distribuyen en cada una de las células hijas (Vermeulen y col., 2003).
La transición de una fase de ciclo celular a otra ocurre de manera ordenada y está
regulada por diferentes proteínas celulares (Figura 5). Las proteínas reguladoras clave son
las quinasas dependientes de ciclina (CDK), una familia de proteínas quinasas de
serina/treonina que se activan tras la unión de las ciclinas, en puntos específicos del ciclo
celular. Los niveles de CDK se mantienen relativamente constantes a lo largo del ciclo y
actúan en las fases G1 (CDK4, CDK6 y CDK2), S (CDK2) y en G2/M (CDK1). En cambio, las
ciclinas varían su concentración a lo largo del ciclo celular y pertenecen a cuatro clases (A,
B, D y E) (Diaz-Moralli y col., 2013). A su vez, la actividad de las CDK puede ser regulada
por inhibidores específicos, que pertenecen a dos familias: INK4 y Cip/Kip. Las primeras
actúan formando complejos estables con CDK4 y CDK6 en la fase G1, impidiendo la unión
de la ciclina D. Las segundas incluyen a p21, p27 y p57, y se unen e inactivan a los
complejos ciclinas-CDK en la fase G1 y M. Además, p21 inhibe la fase S al unirse al
antígeno nuclear de células en proliferación (PCNA) (Malumbres y Barbacid, 2001;
Vermeulen y col., 2003). Por otro lado, se ha observado que, en ausencia de ligando, el
Introducción 27
AhR interacciona con el complejo CDK4-Ciclina D favoreciendo su activación y la
progresión del ciclo celular. En cambio, en presencia del ligando esta interacción se
interrumpe y se induce el arresto del ciclo celular en la fase G1 (Barhoover y col., 2010).
La progresión apropiada a través del ciclo celular es monitoreada en diferentes
puntos de control, que detectan posibles defectos durante la síntesis de ADN y la
segregación cromosómica. Asimismo, regulan que una fase no inicie si la anterior no fue
exitosamente completada. La activación de estos puntos de control induce el arresto del
ciclo celular mediante la modulación de la actividad de las CDK. La detención del ciclo
celular permite que las células reparen adecuadamente estos defectos, evitando así su
transmisión a las células hijas (Malumbres y Barbacid, 2009). Dado que la replicación del
ADN es un proceso irreversible, el primer punto de control se encuentra en la fase G1. Allí
se censa que las condiciones externas sean favorables, así como la integridad de la
molécula de ADN que deberá ser replicada. De manera similar, si el ADN se replica de
manera parcial o si surgen problemas en la horquilla de replicación, pueden generarse
roturas de doble cadena en el ADN, por lo tanto existe otro punto de control dentro de la
fase S (Matson y Cook, 2017). Si uno de estos puntos de control es activado, la célula se
arrestará en la fase G1 o S, respectivamente. Si la reparación no tiene éxito, debido a daños
excesivos en el ADN, las células pueden entrar en senescencia o sufrir apoptosis.
Alternativamente, la acumulación de alteraciones del ADN puede dar lugar a la
transformación maligna de la célula y la oncogénesis (Kastan y Bartek, 2004). El tercer
punto de control, se encuentra en la transición desde la fase G2 a M, e impide el comienzo
de la mitosis hasta que el ADN se encuentre completamente duplicado. Finalmente,
durante la fase M, un cuarto punto de control impide el comienzo de la anafase hasta que
todos los cromosomas se encuentren correctamente asociados al huso mitótico. Esto
resulta en un arresto en las fases G2/M y evita que las células hijas reciban una herencia
desigual de la información genética (Kops y col., 2005).
Se han descripto varios mecanismos por los cuales una célula tumoral adquiere la
capacidad de mantener la señalización de proliferación. Uno de ellos implica que la célula
misma produzca factores de crecimiento que actúan sobre sus propios receptores,
resultando en una estimulación proliferativa autocrina. Asimismo, pueden enviar señales a
las células del estroma asociado al tumor, que responden secretando varios factores de
crecimiento. La vía de señalización, además, puede encontrarse desregulada aumentando
los niveles de expresión de los receptores, conduciendo a un incremento de la respuesta
aún ante niveles reducidos de factores de crecimiento. De manera similar, alteraciones
genéticas en dichos receptores, o en los componentes río abajo del receptor, pueden
Introducción 28
facilitar la respuesta en ausencia de ligando (Hanahan y Weinberg, 2011). La célula tumoral
acumula mutaciones que generan una señalización mitogénica constitutiva o falta de
respuesta ante señales anti-proliferativas. Además, la mayoría de los tumores presentan
inestabilidad genómica, lo que conduce a la adquisición de nuevas mutaciones que
contribuyen, no solo a escapar de los mecanismos de regulación del ciclo celular, sino
también a la progresión tumoral y la adquisición de fenotipos más agresivos (Malumbres y
Barbacid, 2009).
Figura 5. Ciclo celular. Se indican las fases del ciclo celular y los puntos donde actúan los distintos
complejos ciclinas-CDK. Adaptado de Vermeulen y colaboradores (2003).
Introducción 29
5. Acción de disruptores endócrinos en glándula mamaria y carcinogénesis
Debido a que la glándula mamaria es un órgano que sufre cambios funcionales y
morfológicos a lo largo de su desarrollo, regulados en gran parte por el sistema endocrino,
la convierten en un buen modelo para evaluar los efectos de los DEs. Sin embargo, la
mayoría de los estudios, enfocados en el análisis de los efectos de la exposición a
xenoestrógenos durante periodos críticos de la organogénesis mamaria, están orientados
hacia el desarrollo tumoral y no hacia la diferenciación del órgano.
La exposición de las ratas a 2,3,7,8-tetraclorodibenzo-p-dioxina (TCDD), durante la
gestación, afecta negativamente la diferenciación de la glándula mamaria y disminuye la
cantidad y calidad de la leche necesaria para mantener a sus crías (Fenton y col, 2002;
Vorderstrasse y col., 2004). De manera similar, el tratamiento con bisfenol A modifica la
histoarquitectura de la mama, alterando la tasa de maduración mamaria e incrementando
el crecimiento ductal, la respuesta secundaria a los estrógenos y la susceptibilidad a la
carcinogénesis mamaria (Betancourt y col., 2010; Durando y col., 2007; Muñoz de Toro y
col., 2005). La exposición prenatal a butil benzil ftalato causa un crecimiento levemente
acelerado de la glándula mamaria de ratas, pero retrasa el inicio de la pubertad (Moral y
col., 2011). En ensayos de nuestro laboratorio, hemos observado que el tratamiento con
HCB altera la glándula mamaria de ratas, induciendo hiperplasia e incrementando el
número de células estromales, al mismo tiempo que ejerce un efecto estrogénico,
activando al REα, c-Src y HER1 (Peña y col., 2012).
Los esfuerzos en el estudio del cáncer de mama se han centrado principalmente en
el diagnóstico y el tratamiento, siendo muy reducido el número de investigaciones en el
área de la prevención. Varios estudios han observado la importancia de los factores
ambientales en el desarrollo del cáncer de mama, incluyendo el contacto con diferentes
sustancias químicas. La exposición humana a COPs ubicuos, tales como PCBs, TCDD,
dicloro difenil dicloroetileno (DDE) y HCB, ha atraído la atención con respecto a su rol en la
etiología del cáncer de mama a nivel mundial (Gray y col., 2017; Lichtenstein y col., 2000).
Al ser liposolubles y poseer una larga vida media, cantidades medibles de estos
compuestos están presentes en diferentes tejidos humanos con alto contenido graso,
como la glándula mamaria, así como también en suero y leche materna (Li y col., 2006a).
La secreción cíclica de estrógenos durante la vida de las mujeres es un factor de
riesgo para el cáncer de mama (Travis y Key, 2003). Compuestos que actúan como DEs
podrían contribuir a la iniciación y al desarrollo tumoral, ya que interfieren con la
regulación hormonal en todas las etapas del desarrollo mamario y pueden inducir
Introducción 30
alteraciones epigenéticas (Brisken, 2008). De este modo, los DEs podrían actuar
directamente favoreciendo la carcinogénesis espontánea, o indirectamente aumentando la
susceptibilidad a carcinógenos (Macon y Fenton, 2013). Aunque el mecanismo exacto a
través del cual se inicia el cáncer de mama no está claro aún, se propuso que podría
depender de la activación del REα en poblaciones celulares incompletamente diferenciadas
y altamente proliferativas, como las que se encuentran en los TEBs (Russo y Russo, 1998;
Travis y Key, 2003). Otras posibilidades incluyen genotoxicidad directa (Liehr, 2001),
inducción de aneuploidía (Russo y Russo, 2006), y remodelado de tejido anormal a través
de interacciones entre el estroma y el tejido epitelial de la mama (Soto y Sonnenschein,
2010).
La glándula mamaria es particularmente vulnerable durante el desarrollo fetal y la
pubertad (Soto y col., 2008). La exposición a DEs en las etapas tempranas de la vida alteran
el desarrollo mamario, pudiendo tener consecuencias en el adulto (Macon y Fenton, 2013).
Por ejemplo, las mujeres cuyas madres usaron DES durante el embarazo, para evitar
abortos espontáneos, presentan un elevado riesgo de contraer cáncer de mama (Palmer y
col., 2006). Asimismo, la exposición a DDT, así como al cadmio, está asociada al desarrollo
tumoral mamario (Conh y col., 2015; Kortenkamp, 2011). Estudios en animales de
laboratorio también sugieren que la exposición a xenoestrógenos, durante el desarrollo del
embrión, pueden alterar la estructura del tejido mamario con posibles consecuencias en el
cáncer de mama (Muñoz de Toro y col., 2005; Maffini y col., 2006, Murray y col., 2007).
Ensayos in vitro demostraron que diferentes PCBs promueven la proliferación en la línea
celular de cáncer de mama humano MCF-7 (Andersson y col., 1999; Soto y col. 1994; Zou y
col., 2002). Empleando diversos abordajes in vivo e in vitro, se observó que diferentes DEs,
incluyendo TCDD, β-hexaclorociclohexano, dimetilbenzantraceno y benzopireno, producen
una serie de cambios asociados a la transformación maligna en las células del epitelio
mamario (Brown y Lamartiniere, 1995; Calaf y Russo, 1993; Davis y col., 2001; Roman y col.,
1998; Takagi y col., 2000; Wong y Matsumura, 2007). Un estudio similar en la línea celular
normal epitelial de mama HMEC mostró que la exposición a mezclas de pesticidas
organoclorados (DDT, DDE, dicloro dilfenil dicloroetano, aldrina y dieldrina) induce la
proliferación celular y la expresión de numerosos genes involucrados en la transformación
celular (Valerón y col., 2009). Asimismo, Diry y colaboradores (2006) observaron que la
exposición a TCDD o a 3-metilcolantreno promueve una reducción en la expresión de E-
cadherina, una pérdida de la adhesión célula-célula y a un incremento en la movilidad en
la línea celular de cáncer de mama MCF-7.
Introducción 31
En estudios previos de nuestro laboratorio demostramos que el HCB, a dosis bajas
(0,005 y 0,05 µM), induce proliferación celular y activa la vía de señalización de IGFs, de una
manera dependiente del REα en las células MCF-7. Además, a esas mismas dosis, el
pesticida estimula la actividad de la c-Src y la fosforilación del REα (García y col., 2010). En
un trabajo reciente, encontramos que la exposición al HCB (0,005 µM) promueve la
progresión del ciclo en las células MCF-7, ya que incrementa la expresión de la ciclina D1 y
la interacción entre c-Src y p27, lo que mantiene a p27 fuera del núcleo. Sin embargo, a
dosis altas (5 µM), el HCB favorece la formación de un complejo entre la ciclina E-CDK2-
p27, retrasando la progresión del ciclo celular (Ventura y col., 2017). En otro estudio, donde
inducimos químicamente tumores mamarios en ratas, el tratamiento con HCB aumentó el
crecimiento tumoral, el número de tumores por rata y la malignidad de los mismos. En
estos tumores, el HCB reduce la actividad del REα pero mantiene activos a c-Src y HER1,
apoyando el concepto de que el pesticida podría desempeñar un papel en la
transformación de los tumores hacia un fenotipo más maligno (Peña y col., 2012).
Asimismo, la exposición al HCB promueve la migración y la invasión de las células de
cáncer de mama humano MDA-MB-231 (REα-), mediante un mecanismo que involucra a la
quinasa c-Src, a HER1 y al AhR, e induce metástasis en pulmones e hígado en diferentes
modelos animales de cáncer de mama (Pontillo y col., 2011; 2013). Por otro lado,
observamos que el HCB (3 y 30 mg/kg p.c.) aumenta la expresión del factor de crecimiento
endotelial vascular (VEGF) y estimula la angiogénesis en un modelo xenográfico con la
línea celular MDA-MB-231. En células de endotelio microvascular de mama humana
HMEC-1, la unión del HCB al AhR incrementa la expresión de la ciclooxigenasa 2, del VEGF
y su receptor de tipo 2 (VEGFR2), generando un aumento en la migración y la
tubulogénesis. Además, las vías se señalización río abajo del VEGFR2 (p38 y ERK1/2) fueron
activadas por el tratamiento con el tóxico (Pontillo y col., 2015).
6- Receptor de Hidrocarburos Aromáticos (AhR)
6.1. Mecanismo de acción del AhR
El AhR es un factor de transcripción citosólico activado por ligando, que regula la
expresión de genes de detoxificación. Sin embargo, se ha demostrado su importante rol
fisiológico más allá de su función en el metabolismo de xenobióticos, incluyendo el
desarrollo de órganos, el metabolismo, la adaptación a hipoxia, el control del ciclo
circadiano y la neurogénesis. Ratones deficientes para el AhR presentan enfermedad
cardiovascular, fibrosis hepática, un reducido tamaño del hígado, deficiencia de células T
Introducción 32
en el bazo, fibrosis cutánea y una reducción de la esperanza de vida. Además, la evidencia
experimental vincula al AhR con la alteración de diversos procesos celulares como
proliferación, apoptosis, diferenciación, promoción de tumores, reproducción y respuesta
inmune (Barouki y col., 2007).
El AhR es activado principalmente por xenobióticos de naturaleza hidrofóbica y con
estructura plana. Dentro de estos se encuentran, por ejemplo, la TCDD, los PCBs, los
hidrocarburos aromáticos policíclicos (PAH) y el HCB. Además, existen ligandos de origen
natural, como los flavonoides presentes en frutas y verduras, y el resveratrol que se
encuentra de forma abundante en el vino (Cella y Colonna, 2015). En los últimos años, los
esfuerzos se han depositado en encontrar ligandos endógenos y, actualmente, se conoce
que el AhR se puede unir a la bilirrubina, a la lipoxina A4 y a derivados del triptófano,
como el 6-formil indol (3,2-b) carbazol (FICZ) y la L-quinurenina (Vázquez-Gómez y col.,
2016).
En ausencia de ligando, el AhR se encuentra predominantemente en el citosol,
formando un complejo inactivo con la chaperona de choque térmico (Hsp) 90, Hsp70 y
Hsp50, con co-chaperonas como ARA9 y p23, y la quinasa c-Src. La unión del ligando
desencadena diferentes mecanismos de acción: uno genómico o nuclear y otros no
genómicos. En el primero, la unión del ligando permite la translocación del complejo
ligando-AhR al núcleo, donde se produce disociación de las chaperonas y se une a la
proteína translocadora nuclear del AhR (ARNT). Tanto el AhR como el ARNT pertenecen a
la familia de los factores de transcripción con dominio bHLH-PAS (basic helix loop helix-
PER ARNT-SIM) y su dimerización genera la formación de un complejo activo. Este
complejo interacciona con proteínas acetil transferasas de histonas y factores
remodeladores de cromatina, lo que permite su unión a secuencias consenso en los
promotores de sus genes blanco, denominadas elementos de respuesta a xenobióticos o
dioxinas (XRE o DRE) (Figura 6, vía 1). Asimismo, puede reclutar otros factores de
transcripción o activadores, como el receptor de ácido retinoico, el REα, el E2F y el factor
nuclear- κB (NF-κB) (Quintana y Sherr, 2013; Pocar y col., 2005). Como consecuencia de la
activación del AhR se inducen genes de detoxificación de la fase I, que incluyen a las
enzimas CYP1A1, CYP1A2, CYP1B1 y CYP2S1; y de la fase II como las enzimas glutation-S-
transferasa, NAD(P)H quinona oxidoreductasa, UDP-glucuroniltransferasa, y aldehído-3-
deshidrogenasa 3 (Álvarez y col., 2005; Puga y col., 2009). Se considera que la inducción de
este tipo de enzimas es una respuesta celular adaptativa dirigida a la detoxificación de
estos compuestos exógenos lipofílicos. Sin embargo, en muchos casos se ha observado
Introducción 33
que los metabolitos presentan mayor toxicidad que los compuestos originales (Feng y col.,
2013; Stejskalova y col., 2011; Vázquez-Gómez y col., 2016).
En una de las vías no genómicas, denominada vía de membrana, la quinasa c-Src se
activa y trasloca a la membrana celular, donde puede interaccionar con receptores de
factores de crecimiento, estimulando su fosforilación y las vías de señalización
correspondientes, que incluyen a ERK1/2, al transductor de señales y activador
transcripcional 5b (STAT5b), p38 y JNK (Park y col., 2007). En la búsqueda de un evento
inicial que desencadene la activación del camino no genómico del AhR y la respuesta
tóxica de estos compuestos, se ha reportado que la estimulación del AhR induce la
activación de c-Src mediada por un aumento rápido de calcio en el citosol (Matsumura,
2009) (Figura 6, vía 2). Por otro lado, Ohtake y colaboradores (2007) han reportado que el
AhR posee actividad de ligasa de ubiquitina E3, dependiente de ligando, lo que le permite
marcar para su degradación por la vía del proteosoma a las proteínas con las que
interactúa, como el REα (Figura 6, vía 3).
Existen mecanismos de regulación negativa de la señalización del AhR. Uno de ellos
consiste en la retención del receptor en el citosol, gracias a la presencia de una secuencia
de exportación nuclear, y su degradación por la vía del proteosoma 26 S (Feng y col.,
2013). Además, dentro de los genes inducidos por el AhR se encuentra aquel que codifica
para el represor del AhR (AHRR), el cual compite con el receptor por la unión al ARNT y, de
este modo, inhibe el camino genómico del AhR (Mimura y col., 1999). Por otro lado, la
expresión génica del AhR es regulada mediante mecanismos epigenéticos. Mulero-Navarro
y colaboradores (2006) demostraron que el promotor del AhR contiene islas CpG
susceptibles a ser metiladas, lo que resulta en el silenciamiento génico.
Se ha clasificado al HCB como un compuesto tipo dioxina, ya que se une al AhR y
activa el camino genómico, aumentando la expresión de las enzimas CYP en el hígado
(Smith y col., 1993), presenta efectos similares a los producidos por la TCDD, y se
bioacumula en los tejidos grasos y en el suelo. La intensidad de las respuestas bioquímicas
y tóxicas a los diferentes ligandos correlaciona con su afinidad de unión al receptor (Safe y
col., 2000). La TCDD es considerada la dioxina más tóxica y la que presenta mayor afinidad
por el AhR, en cambio, el HCB tiene una afinidad 10000 veces menor (Hahn y col., 1989;
van Birgelen, 1998). Dado que el HCB es un agonista débil del AhR (Hahn y col., 1989),
algunos de los procesos celulares alterados por este tóxico podrían ser independientes de
su unión al receptor, dependiendo del tiempo y la dosis de exposición.
Introducción 34
Figura 6. Vías de señalización del AhR. 1) En el camino genómico, el complejo ligando-AhR se
transloca al núcleo y dimeriza con ARNT para actuar como un factor de transcripción, induciendo la
expresión de sus genes blanco. En los caminos no genómicos, 2) se activa la quinasa c-Src, por un
mecanismo que puede o no involucrar el incremento de calcio citosólico (línea interrumpida),
conduciendo a la activación de receptores de factores de crecimiento y desencadenando sus
respectivas vías de transducción de señales. 3) Además, el AhR actúa como ligasa de ubiquitina, con
lo cual controla la degradación por la vía del proteosoma de otros factores de transcripción.
6.2. Funciones del AhR en el desarrollo de la glándula mamaria
El desarrollo mamario durante la pubertad y el embarazo dependen de hormonas
ováricas, como el estrógeno y la progesterona (Sternlicht, 2006). Dado que la activación del
camino genómico del AhR es esencial para el mantenimiento de la función ovárica (Le
Provost y col., 2002), es esperable que el AhR juegue un papel importante en el desarrollo
mamario. La interacción entre los caminos del AhR y del REα es clave en la regulación de
vías de señalización fundamentales para las funciones de los órganos reproductivos
femeninos. Se han propuesto diferentes mecanismos para explicar como el AhR, activado
por la unión de su ligando, puede modular negativamente la señalización del REα. Entre
ellos se encuentra la interacción física entre el AhR y el REα, la competencia por factores
Introducción 35
comunes necesarios para estimular la transcripción de sus genes blanco, la degradación
del estradiol por las enzimas CYP, y la degradación del REα vía proteosoma desencadenada
por el AhR. En un estudio realizado en ratas se observó que el tratamiento con 3-
metilcolantreno, un ligando fuerte del AhR, inhibe el desarrollo de los TEBs inducido por
estradiol, y este efecto anti-estrogénico esta mediado, al menos en parte, por la reducción
de los niveles proteicos del REα (Helle y col., 2016). A pesar de que el AhR parece ser
dispensable para el desarrollo de la mama (Le Provost y col., 2002), se expresa en el
epitelio durante las fases proliferativas y se lo ha asociado al desarrollo lobular temprano,
la ramificación ductal y al desarrollo de TEBs. Hushka y colaboradores (1998) encontraron
que los ratones negativos para el AhR presentaban un menor desarrollo de la glándula
mamaria, con un reducido número de TEBs, en comparación con los ratones positivos para
el AhR. Asimismo, el tratamiento con TCDD, durante la etapa puberal, impedía el desarrollo
lobular y reducía la proliferación en los TEBs, sin alterar el desarrollo ductal. Sin embargo, si
la exposición con TCDD se realiza durante la fase embrionaria, se observa un incremento
en el número de TEBs, así como alteraciones en el desarrollo y la funcionalidad de la mama
del ratón (Lew y col., 2009), indicando que la ventana de exposición es un factor
importante.
6.3. Papel del AhR en carcinogénesis mamaria
La glándula mamaria expresa modestos niveles de AhR en las células mioepiteliales
y epiteliales ductales. Sin embargo, tanto en las células tumorales como en los fibroblastos
del microambiente tumoral, los niveles del receptor se incrementan y la expresión de sus
genes blanco se desregula, indicando que el AhR juega un papel importante en la
tumorigénesis mamaria (Powell y col., 2013; Schlezinger y col., 2006). Dentro de los genes
desregulados se encuentran varios factores de crecimiento, que incrementan su expresión
y conducen a un aumento en la proliferación de la célula tumoral (Murray y col., 2014). El
AhR regula varios procesos relacionados con el desarrollo y la progresión tumoral, que
incluyen la adhesión célula-célula y célula-sustrato, la proliferación, la diferenciación y la
motilidad (Dietrich y Kaina, 2010). En un estudio empleando una línea celular de epitelio
mamario que sobreexpresa el AhR, se observó la aparición de características malignas, que
incluyen un incremento en la tasa de crecimiento, pérdida del control del ciclo celular,
inducción de la TEM y mayor migración e invasión (Brooks y Eltom, 2011). Por otro lado, la
modificación genética de células de cáncer de mama MDA-MB-231, de modo que
subexpresen el AhR, resultó en la atenuación de las propiedades tumorigénicas in vitro
(proliferación, crecimiento independiente de anclaje y migración), mientras que aumentó la
Introducción 36
apoptosis. Asimismo, en un modelo de xenotransplante, empleando estas células, se
observó una reducción en el crecimiento tumoral y en el número de metástasis en pulmón,
sugiriendo así que el AhR por si solo es requerido y suficiente para inducir la
transformación maligna de las células epiteliales mamarias (Goode y col., 2013).
El tratamiento con ligandos del AhR, como el TCDD y el benzopireno, predispone a
la glándula mamaria para el desarrollo de tumores (Jenkins y col., 2007; Ronco y col., 2011).
En ensayos previos de nuestro laboratorio observamos que la exposición al HCB induce la
vía de membrana del AhR, donde c-Src fosforila y activa a HER1, conduciendo a un
incremento en la expresión de MMP-2 y MMP-9, así como en la migración e invasión de
las células MDA-MB-231 (Pontilo y col., 2011; 2013).
7- Factor de Crecimiento Transformante beta-1 (TGF-β1)
7.1. Funciones del TGF-β1
La superfamilia del TGF-β surge a lo largo de la evolución en los organismos
multicelulares, sugiriendo que podría contribuir al incremento en la diversidad y la
complejidad requerida para el desarrollo y la homeostasis de estos organismos. Incluye
alrededor de 40 citoquinas entre las que se pueden encontrar las subfamilias del TGF-β, las
activinas e inhibinas, y las proteínas morfogenéticas óseas (BMPs). Dentro de la subfamilia
del TGF-β, las tres isoformas expresadas en humanos han sido designadas como TGF-β1,
TGF-β2 y TGF-β3. El TGF-β1 y el TGF-β2 son sintetizados por muchos tipos celulares,
mientras que el TGF-β3 es expresado por células mesenquimáticas (Barnard y col., 1990;
Cheifetz y col., 1990). Juegan un rol muy importante en la morfogénesis de la mayoría de
los órganos y sus acciones se modulan en el tiempo y el espacio durante la embriogénesis,
lo que lleva a una amplia variedad de respuestas celulares. El TGF-β1 regula múltiples
procesos celulares que incluyen proliferación, la determinación de linaje, diferenciación,
movilidad, adhesión y muerte celular (Lawrence, 1996; Wu y Hill, 2009). Se trata del
miembro de la familia más estudiado, lo que ha permitido entender los mecanismos por
los cuales se regulan muchos procesos celulares normales, que se encuentran alterados en
la enfermedad.
El TGF-β1 es una citoquina multifuncional, debido a los efectos que tiene sobre los
diferentes blancos celulares. Es un potente inhibidor de la proliferación de varios tipos
celulares, como por ejemplo células epiteliales, mesenquimales, linfoides y endoteliales. Sin
embargo, puede estimular la proliferación de fibroblastos normales, de células no
Introducción 37
epiteliales y neoplásicas (Sporn y Roberts, 1992). En células no transformadas, el TGF-β1
colabora en el mantenimiento de la homeostasis y se comporta como un supresor tumoral,
promoviendo citostasis, diferenciación y apoptosis, y suprimiendo la inflamación. En
cambio, durante la transformación maligna se alteran los mecanismos de regulación
celular inducidos por esta citoquina. En consecuencia, en las células tumorales el TGF-β1
colabora con la producción de factores de crecimiento, estimula la TEM y la adquisición de
un fenotipo invasivo, y favorece la evasión del sistema inmune, la angiogénesis, la
inducción de la degradación de la matriz extracelular, la diseminación y el establecimiento
de metástasis (Dumont y Arteaga, 2000; Lebrun, 2012).
Además, el TGF-β1 estimula la síntesis y depósito de proteínas de matriz
extracelular, al mismo tiempo que induce la expresión de proteínas de membrana como
integrinas y receptores que median las interacciones celulares con proteínas de matriz
extracelular (Barnard y col., 1990). Cumple un papel fundamental en el sistema inmune, ya
que controla el inicio y la resolución de las respuestas inflamatorias, colaborando con el
proceso de tolerancia. Lleva a cabo esta función por medio de la regulación de la
proliferación, diferenciación, sobrevida y quimiotaxis de los linfocitos, células asesinas
naturales (NK), células dendríticas, macrófagos, mastocitos y granulocitos (Li y col., 2006b).
En resumen, el TGF-β1 tiene un espectro muy amplio de funciones, las cuales dependen de
su concentración, del balance de expresión que exista con otras citoquinas, del tipo celular
y de las condiciones fisiológicas.
7.2. Síntesis y regulación del TGF-β1
El TGF-β1 es sintetizado como un precursor de mayor tamaño y es procesado hasta
obtener el monómero de 12,5 kDa (Figura 7). La modificación post-transcripcional crítica
es su procesamiento proteolítico en el extremo carboxilo, cortado por la endoproteasa
furina (Robertson y col., 2015). Su forma activa es un homodímero de 112 aminoácidos (25
kDa), que se mantiene asociado de manera no covalente a su precursor, el péptido
asociado a latencia (LAP), formando un complejo latente pequeño (CLP). LAP contiene la
secuencia señal para ser secretado y le confiere latencia al TGF-β1, ya que evita su unión a
sus receptores. Además, asegura un reservorio extracelular de TGF-β1, que puede ser
activado si hay alguna demanda del mismo (Moses y Barcellos-Hoff, 2011). A su vez, LAP
se une covalentemente a la proteína que une al TGF-β1 latente (LTBP), generando el
complejo latente grande (CLG). LTBP es capaz de interactuar con componentes de la matriz
Introducción 38
extracelular como las microfibrillas de fibrilina y fibronectina, y es necesario tanto para la
síntesis de TGF-β1 como para su almacenamiento (Robertson y col., 2015).
Figura 7: Síntesis, procesamiento y activación del TGF-β1. Adaptado de Robertson y
colaboradores (2015).
La regulación de la actividad del TGF-β1 puede ocurrir a múltiples niveles. Cambios
transcripcionales y post-traduccionales en la expresión del TGF-β1 han sido reportados,
incluyendo alteraciones en el grado de activación del TGF-β1 latente. La liberación del
TGF-β1 maduro ha sido estudiada intensamente in vitro, donde valores extremos de pH, el
calor o algunas proteasas pueden causar la liberación del TGF-β1 activo del complejo
latente (Koli y col., 2001). En estudios in vivo se han identificado diversos mecanismos de
activación que incluyen, por ejemplo, la deformación mecánica de la matriz extracelular y
la degradación de LAP por proteasas (Curran y Keely, 2013). Se ha reportado un
Introducción 39
incremento en la actividad de TGF-β1 mediante diversos mecanismos que involucran a las
integrinas, calpaina, MMP-9, catepsina D, quimasa, elastasa, endoglicosidada F,
neuraminidasa, trombospondina-1, plasmina, lipoproteína de baja densidad (LDL), entre
otros (Moses y Barcellos-Hoff, 2011; Zarzynska, 2014).
7.3. Receptores del TGF-β1 y vías de señalización
La transducción de la señal del TGF-β1 se realiza mediante la unión a receptores
transmembrana con actividad de serina-treonina quinasa: el receptor de TGF-β1 de tipo I
(TβRI, también denominado ALK5) y de tipo II (TβRII) (Figura 8). Se ha demostrado que
existe una correlación entre la ausencia de los receptores TβRI y TβRII y la pérdida de las
respuestas celulares inducidas por el TGF-β1 (Levy y Hill, 2006). Ambos receptores tienen
una región extracelular rica en cisteínas, una región transmembrana y una región
citoplasmática que contiene el dominio de serina-treonina quinasa. El TβRI tiene una
secuencia GS (rica en glicina/serina) altamente conservada en la región que precede al
dominio de quinasa, la cual está ausente en TβRII (Zarzynska, 2014). En ausencia de
ligando, ambos receptores se encuentran formando homodímeros. El TGF-β1 se une
directamente al TβRII, que luego recluta al TβRI para formar un complejo tetramérico. En
este complejo, el TβRII se autofosforila constitutivamente y fosforila el dominio GS del
TβRI, lo cual induce su actividad quinasa e inicia la cascada de transducción de señales al
interior de la célula (Derynck y Zhang, 2003). La unión del TGF-β1 estabiliza este complejo,
generando respuestas fisiológicas adecuadas en una forma dependiente del ligando. Sin
embargo, la expresión anormal de estos receptores puede contribuir a la formación de
complejos activos, produciendo una señalización independiente del ligando y, en
consecuencia, respuestas celulares inapropiadas (Feng y Derynck, 1996).
En la vía de señalización canónica participan proteínas transductoras de señales de
la familia Smad, que median los efectos biológicos del TGF-β1. Los Smad2 y 3, también
denominados Smad regulados por receptores (R-Smads), son directamente fosforilados
por TβRI en el extremo C-terminal. Esto les permite separarse del TβRI y formar un
complejo trimérico estable con Smad4. Este complejo transloca al núcleo, recluta co-
activadores o co-represores y regula la transcripción de muchos genes que responden al
TGF-β1 (Zarzynska, 2014). Dentro de estos genes se encuentran los que codifican para los
Smad inhibitorios 6 y 7, lo que desencadena un mecanismo de autorregulación negativa
de la señalización del TGF-β1. Estos Smad inhibitorios interactúan con TβRI de una manera
más estable que los R-Smads, compitiendo así por la unión al receptor. Además, el Smad6
Introducción 40
impide la formación del complejo con Smad4, mientras que el Smad7 recluta a la proteína
E3 ligasa de ubiquitina (SMURF) lo que conduce a la degradación del TβRI (Derynck y
Zhang, 2003; Di Guglielmo y col., 2003; Nagarajan y col., 1999).
Figura 8: Vías de señalización del TGF-β1, dependiente e independientes de Smad, y
principales efectos biológicos. Las flechas anaranjadas muestran la interacción entre las diferentes
vías de señalización. Adaptado de Lebrun (2012).
Por otro lado, la formación del complejo TβRI-TβRII, en respuesta al TGF-β1, puede
inducir otras cascadas de señalización, en lo que se conoce como las vías no canónicas o
independientes de Smad. Se ha reportado que el TGF-β1 puede activar distintas proteínas
Introducción 41
quinasas activadas por mitógenos (MAPK) como la ERK1/2, JNK y p38 (Derynck y Zhang,
2003). En particular, Yu y colaboradores (2002) demostraron que la activación de p38 por
TGF-β1 no solo es independiente de Smad, sino que tampoco requiere del TβRI. Además,
el TGF-β1 puede activar la vía del fosfatidilinositol-3-kinasa (PI3K) / Akt, así como diversas
GTPasas de la subfamilia Rho, como RhoA, Rac y Cdc42 (Akhurst y Hata, 2012; Lebrun,
2012). Sin embargo, aún no se conoce en detalle el mecanismo de acción por el cual estas
vías de señalización son inducidas. Galliher y Schiemann (2006) plantearon un mecanismo
en el cual la integrina β3 interactúa con el TβRII, favoreciendo la fosforilación de este
receptor por la quinasa c-Src, lo que desencadena la activación de las MAPK. Los caminos
dependientes e independientes de Smad pueden cooperar en el desarrollo de
determinadas funciones, como la inducción de la TEM; o contraponerse ya que, por
ejemplo, ERK y JNK pueden fosforilar a los Smad2 y 3 e inhibir su translocación al núcleo
(Derynck y Zhang, 2003).
7.4. Acción del TGF-β1 en la glándula mamaria
El TGF-β1 se expresa en el epitelio mamario a lo largo de todos los estadios del
desarrollo y la diferenciación mamaria. A pesar de que estos procesos están regulados
principalmente por las hormonas ováricas, se ha postulado que su acción está mediada por
la inducción de otros factores. Diversos estudios demostraron que tanto el estrógeno
como la progesterona regulan los niveles de expresión y de activación del TGF-β1 (Moses y
Barcellos-Hoff, 2011). El TGF-β1 induce el remodelado de la matriz extracelular, así como la
apoptosis e inhibición de la proliferación de las células epiteliales. Durante los estadios
proliferativos, como la pubertad, la fase estro y el embarazo, se reduce la activación del
TGF-β1 (Ewan y col., 2002). En un estudio en ratones se demostró que la administración de
TGF-β1 produce la regresión de los TEBs e impide la elongación ductal y la morfogénesis
lóbulo-alveolar (Daniel y col., 1989). En cambio, ratones heterocigotas para el TGF-β1, o
que expresan un dominante negativo para el TβRII, mostraban un incremento en el
crecimiento ductal durante la pubertad y en el desarrollo alveolar durante el embarazo
(Ewan y col., 2002; Gorska y col., 1998). La inducción de apoptosis en respuesta al TGF-β1
es esencial durante la segunda fase de la involución mamaria (Bierie y col., 2009), así como
en la morfogénesis ductal, probablemente para la formación del lumen de los ductos
mamarios (Humphreys y col., 1996).
Por otro lado, las células estromales proliferan y establecen la matriz extracelular
por acción del TGF-β1, al mismo tiempo que controlan el crecimiento de las células
Introducción 42
epiteliales. Varios estudios resaltan la importancia de la matriz extracelular en modular la
respuesta hormonal de las células epiteliales (Moses y Barcellos-Hoff, 2011). Además, el
TGF-β1 disminuye los niveles de MMP-3, reduciendo la ramificación lateral secundaria,
mientras que incrementa la expresión de MMP-2, lo que fomentaría el alargamiento ductal
y así aumentaría la distancia entre los puntos de ramificación secundarios (Sternlicht,
2006).
7.5. Vía de señalización del TGF-β1 y cáncer de mama
En la actualidad, la búsqueda de mecanismos de señalización del TGF-β1 es un
campo de activa investigación. Así, se determinó que la señalización de TGF-β1 es regulada
por diversos mecanismos y que muchas proteínas, tanto oncogénicas como anti-
oncogénicas, participan del desarrollo tumoral a través de la modulación de la actividad
del TGF-β1 (Miyazono y col., 2003).
Durante los primeros estadios del cáncer de mama, el TGF-β1 actúa como un
supresor tumoral, inhibiendo la proliferación celular y estimulando la apoptosis (Figura 9).
Por medio de la activación de la vía dependiente de Smad, induce el arresto de las células
en la fase G1, principalmente mediante el incremento en la expresión de inhibidores de las
CDK y la reducción de los niveles de c-Myc. Al avanzar el desarrollo tumoral, las células
pierden sensibilidad a los efectos antimitóticos del TGF-β1 y la proliferación se vuelve
descontrolada (Bierie y Moses, 2009). Varios estudios han reportado que la falta de
sensibilidad al TGF-β1 puede ser causada por mutaciones en los receptores o en las
proteínas Smad. Se han descripto varias mutaciones somáticas que interrumpen la vía de
señalización del TGF-β1 en tumores de mama humanos, ya sea porque impiden la
fosforilación de los R-Smad por parte del TβRI o la oligomerización entre los R-Smad y
Smad4. Incluso la alteración en otras vías de señalización, como la vía del STAT o de NF-κB,
pueden conducir a un incremento de Smad7, permitiéndole a la célula neoplásica evadir el
efecto citostático del TGF-β1 (Zarzynska, 2014). Sin embargo, en los tumores mamarios
humanos estas mutaciones son relativamente raras, exceptuando las alteraciones en el
TβRII. Una disminución en la expresión de este receptor se ha correlacionado con mayor
progresión y agresividad, tanto en tumores in situ como en carcinomas invasivos (Busch y
col., 2015; Gorska y col., 2003). El silenciamiento del TβRII puede ser ocasionado por un
incremento en la metilación de su promotor. De hecho, estudios en células mamarias
epiteliales y tumorales mostraron que la expresión de TGF-β1, TβRI y TβRII puede ser
reducida por alteraciones epigenéticas (Hinshelwood y col., 2007).
Introducción 43
En estadios más avanzados, el TGF-β1 cambia su acción convirtiéndose en un
promotor tumoral. Si bien aún no se conoce como se produce este cambio en su función,
algunos autores postulan que se debería a un desbalance en la vías que se inducen, ya que
la vía dependiente de Smad estaría involucrada en los efectos antitumorales, mientras que
las vías independientes de Smad estarían implicadas en la inducción de la promoción
tumoral (Parvani y col., 2011). Sin embargo, varios estudios han demostrado que la acción
pro-tumoral del TGF-β1 requiere también de la vía de los Smad (Massague, 2008;
Zarzynska, 2014). Las células tumorales expresan elevados niveles de TGF-β1, y esto se
correlaciona con peor pronóstico y mayor probabilidad de que se produzcan metástasis
(Chen y col., 2015; Dumont y Arteaga, 2003). El TGF-β1 colabora con la mayoría de los
procesos necesarios para que una metástasis ocurra, incluyendo TEM, migración e invasión
celular, angiogénesis y extravasación (Zarzynska, 2014). Estudios in vivo e in vitro
demostraron que el TGF-β1 es el mayor inductor de la TEM y, para ello, requiere de las vías
dependiente e independientes de Smad. La capacidad de las células epiteliales o de un
carcinoma de sufrir TEM in vitro se correlaciona con cambios celulares que facilitan la
invasión y la metástasis in vivo (Taylor y col., 2010). Resulta interesante que las células
puedan continuar respondiendo a los efectos citostáticos del TGF-β1 y sufrir TEM al mismo
tiempo. En este caso, el TGF-β1 puede suprimir el crecimiento tumoral y promover la
metástasis (Bierie y Moses, 2009).
La disponibilidad de TGF-β1 en el microambiente tumoral tiene un fuerte impacto,
no solo sobre la célula tumoral sino también en el estroma, produciendo efectos en los
fibroblastos, las células del sistema inmune y las células endoteliales. Por un lado, el TGF-
β1 puede alterar el fenotipo de los fibroblastos transformándolos a CAF, mientras que el
TGF-β1 secretado por los CAF incrementa la proliferación y capacidad migratoria de las
células neoplásicas (Calon y col., 2014). Además, en un ensayo con células endoteliales,
cultivadas sobre una matriz de colágeno, se observó que el TGF-β1 puede inducir la
expresión del VEGF y la formación de capilares (Pertovaara y col., 1994). Asimismo, esta
citoquina aumenta la expresión de MMP-2 y MMP-9, al mismo tiempo que disminuye la
expresión de inhibidores tisulares de MMP (TIMPs), tanto en las células tumorales como en
las células endoteliales. Esto provee un microambiente rico en proteasas que conduce a
una mayor capacidad migratoria e invasiva de las células tumorales y de las células
endoteliales angiogénicamente activas (Dumont y Arteaga, 2000; Hagedorn y col., 2001).
En tumores de mama humanos, niveles altos de ARNm del TGF-β1 se asocian con una
densidad de microvasos aumentada y ambos parámetros se correlacionan con un peor
pronóstico del paciente (de Jong y col., 1998). Finalmente, el TGF-β1 actúa como un
potente inmunosupresor, impidiendo la respuesta de las células T citotóxicas y
Introducción 44
favoreciendo la diferenciación a células T regulatorias, lo que deriva en una reducción de la
inmunovigilancia y un incremento en la progresión tumoral (Yang y col., 2010).
Figura 9: Efecto del TGF-β1 en epitelio mamario y en células neoplásicas. En las células
epiteliales y en los primeros estadios tumorales, el TGF-β1 actúa como un supresor tumoral
induciendo el arresto del ciclo celular y apoptosis. A medida que el tumor progresa, las células
neoplásicas se vuelven resistentes al efecto inhibitorio de la proliferación y sufren TEM en respuesta
al TGF-β1. Este proceso facilita la migración, invasión y metástasis de la célula tumoral. Adaptado de
Bierie y Moses (2009).
8. Interacción entre el AhR y el TGF-β1
Hace ya varios años se conoce que existe una interrelación entre la señalización del
TGF-β1 y del AhR. Se han encontrado que ambas vías comparten blancos moleculares,
como la proteína retinoblastoma y el factor E2F, y regulan procesos en común, como el
ciclo celular, la apoptosis, la TEM y la diferenciación de las células Treg y TH17 (Gomez-
Duran y col., 2009; Haarmann-Stemmann y col., 2009). Asimismo, se ha demostrado que
existen mecanismos de regulación recíproca entre el AhR y el TGF-β1. Ensayos en células
de cáncer de pulmón mostraron que el TGF-β1 es capaz de bloquear la vía de señalización
genómica del AhR, inducida por TCDD, y de reducir los niveles de ARNm del receptor
(Döhr y col., 1997). Por medio de la vía dependiente de Smad, el TGF-β1 puede regular la
expresión del AhR, dado que su promotor cuenta con un elemento de respuesta a TGF-β1.
De esta manera, el complejo Smad2/3-Smad4 se une a dicha secuencia en el gen del AhR,
Introducción 45
y recluta co-represores, resultando en su inhibición transcripcional (Wolff y col., 2001). En
cambio, en una línea de hepatocarcinoma celular, el tratamiento con TGF-β1 incrementa
los niveles de AhR, demostrando que el TGF-β1 posee la capacidad de regular la expresión
del receptor diferencialmente, dependiendo del tipo celular y tejido (Haarmann-Stemmann
y col., 2009).
Uno de los primeros trabajos en reportar que el AhR puede regular los niveles de
TGF-β1 fue realizado usando como modelo los paladares de embriones de ratón. En el
mismo, se observó que el tratamiento con TCDD reducía los niveles de TGF-β1 e impedía la
fusión del paladar (Abbott y col., 1992). Actualmente, los estudios en líneas celulares y en
ratones positivos y negativos para AhR indican que el TGF-β1 podría ser uno de los
efectores del AhR. Se ha demostrado, en ensayos in vitro e in vivo, que en ausencia del
AhR se sintetizan y secretan mayores niveles de TGF-β1, y esto se relaciona con una
reducción en la proliferación, así como con un incremento en la TEM. Un posible
mecanismo que explique estos resultados es la inducción de LTBP-1, como se observa en
los fibroblastos negativos para el AhR, lo que contribuye a la secreción y activación del
TGF-β1 (Gomez-Duran y col., 2009). Por otro lado, en la línea celular de epitelio mamario
de ratón NMuMG se encontró que tanto el tratamiento con TGF-β1, como la reducción de
los niveles del AhR, inducen la migración celular y la expresión de marcadores de TEM. En
cambio, cuando las células son expuestas a FICZ (un ligando del AhR) o expresan una
forma del AhR constitutivamente activa, exhiben una reducida capacidad migratoria y un
incremento de marcadores epiteliales (Rico-Leo y col., 2013).
En resultados previos, observamos que la exposición al HCB puede modular los
niveles de expresión del ARNm y de la proteína del TGF-β1 en hígado de ratas, y esto se
asocia con un incremento en la apoptosis (Giribaldi y col., 2011). De manera similar, en
células de tiroides de rata, el HCB induce un arresto del ciclo en las fases G0/G1 y G2/M,
mediado por la vía de TGF-β1 dependiente de Smad (Chiappini y col., 2014).
Objetivos 47
OBJETIVO GENERAL
Durante los últimos años, un número creciente de investigaciones científicas se han
centrado en estudiar los efectos perjudiciales ocasionados por la exposición crónica a
diferentes contaminantes ambientales, sobre la salud humana. Debido a que muchos de
estos compuestos presentan propiedades mutagénicas, actúan promoviendo el
crecimiento, poseen efectos carcinogénicos o actúan como DEs, se ha postulado que
podrían contribuir en las diferentes etapas del desarrollo del cáncer. Particularmente, los
DEs constituyen uno de los principales factores de riesgo para el cáncer de mama, dada la
gran influencia hormonal y la remodelación drástica que sufre la glándula mamaria en su
desarrollo. El HCB es un ligando débil del AhR y un compuesto organoclorado persistente,
al cual las poblaciones se encuentran aún expuestas a pesar de que su uso fue prohibido
hace ya varios años. En estudios previos de nuestro laboratorio demostramos que el HCB
actúa como un DE, ya que produce efectos estrogénicos en glándula mamaria de rata,
activando al REα, c-Src y HER1. Este órgano es sumamente vulnerable durante el desarrollo
fetal y la pubertad, por lo tanto la exposición a DEs en estas etapas de la vida alteran el
desarrollo mamario, pudiendo tener consecuencias en el adulto. Previamente observamos
que la exposición al HCB produce lesiones preneoplásicas en la glándula mamaria de ratas,
que incluyen hiperplasia ductal e hipercelularidad del estroma.
A su vez, demostramos que este tóxico actúa como un co-carcinógeno en la
formación de tumores mamarios inducidos químicamente en rata, aumentando el número
de tumores, el volumen tumoral y la malignidad de los mismos. En un modelo in vitro,
reportamos que el tratamiento con HCB estimula la migración y la invasión de las células
de carcinoma mamario humano MDA-MB-231 (REα-), por medio de un mecanismo que
involucra la activación de la vía de membrana del AhR y de la señalización de c-Src/HER1.
Además, induce metástasis en pulmones e hígado, en diferentes modelos animales de
carcinoma mamario. Por otro lado, en la línea celular de cáncer de mama humano MCF-7
(REα+), dosis bajas de HCB inducen la proliferación y la vía de señalización del receptor de
IGF-I, de manera dependiente del REα; mientras que dosis altas del tóxico retrasan la
progresión del ciclo celular y estimulan la muerte por apoptosis. Estos hallazgos
demuestran que la exposición al HCB favorece la promoción tumoral mamaria tanto en
etapas iniciales hormono-dependientes, al estimular la proliferación celular por la vía del
REα, como en etapas hormono-independientes, al inducir migración, invasión y metástasis.
Dado que los caminos de señalización del AhR y del TGF-β1 se regulan entre sí, y
que la vía del TGF-β1 es de suma importancia, tanto para el desarrollo mamario como para
Objetivos 48
la progresión tumoral, planteamos que el HCB podría modular la interacción entre ambas
vías, activando el camino de señalización del TGF-β1. De esta manera, el tóxico podría
alterar el desarrollo mamario normal y favorecer los procesos de migración e invasión,
previamente observados en las células MDA-MB-231. Por esta razón, nuestro objetivo es
estudiar si las vías de señalización del TGF-β1 y del AhR están involucradas en el
mecanismo de acción del HCB, tanto en glándula mamaria normal como en carcinogénesis
mamaria. En particular, nos proponemos evaluar si la exposición de ratones y células al
tóxico modula la interacción del TGF-β1 con el AhR, y de esta manera altera procesos
como la proliferación, la migración y la invasión celular. Debido a que se ha reportado que
la activación del AhR induce la estimulación de c-Src, mediada por un aumento rápido de
calcio en el citosol, nos propusimos, además, estudiar si el calcio media la activación de c-
Src inducida por el HCB.
OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Capítulo 1: Carcinogénesis mamaria
Nos planteamos estudiar si la exposición al HCB modula la interacción entre las vías
de señalización del TGF-β1 y del AhR. Además, evaluamos si los procesos de migración e
invasión celular inducidos por el tóxico, previamente observados en nuestro laboratorio,
dependen de las vías del TGF-β1, dependiente e independientes de Smad. Finalmente,
analizamos la entrada de calcio a la célula como primer evento tóxico inducido por el HCB.
Para cumplir con nuestros objetivos, trabajamos in vitro con la línea celular de cáncer de
mama humano MDA-MB-231 (REα-) expuestas al HCB o vehículo, y examinamos:
a) La relación entre las vías de señalización del AhR y el TGF-β1.
b) Los niveles de expresión del AhR
c) La vía de señalización nuclear del AhR.
d) Los niveles de expresión y activación del TGF-β1.
e) Las vías de señalización del TGF-β1, dependiente de Smad e independientes
(p38 y JNK).
Objetivos 49
f) El rol de las vías de señalización del TGF-β1 en la migración e invasión celular
inducida por el tóxico.
g) Los niveles citosólicos de calcio.
Capítulo 2: Glándula mamaria
Dado que el HCB se une débilmente al AhR, parte de sus acciones podrían ser
independientes de dicho receptor. Para evaluar esta posibilidad, trabajamos con células y
ratones positivos y negativos para el AhR. Además, debido a que la evidencia sugiere que
la iniciación tumoral depende fuertemente del microambiente, decidimos estudiar el
efecto del HCB no solo en las células epiteliales, sino también en los fibroblastos.
1-Estudios In Vitro:
Con el objetivo de examinar la acción del HCB sobre el epitelio mamario
trabajamos con la línea celular murina NMuMG y la humana MCF-10A, así como con
cultivos primarios de células epiteliales de ratones C57BL/6N AhR+/+ y AhR-/-. Además,
empleamos la línea celular de fibroblastos de glándula mamaria murina FGM AhR+/+ y
FGM AhR-/-. Evaluamos los efectos de la exposición al tóxico sobre:
a) La viabilidad celular.
b) El ciclo celular.
c) La migración celular.
d) Los niveles de expresión del TGF-β1 y sus receptores TβRI y TβRII.
e) Las vías de señalización del TGF-β1 (Smad3, ERK1/2 y p38).
f) Los niveles de expresión del AhR.
g) La vía de señalización nuclear (CYP1A1) y de membrana (c-Src) del AhR.
h) Los niveles de expresión del IGF-I y del HER1.
i) El contenido de α-SMA en fibroblastos.
Objetivos 50
j) La entrada de calcio a la célula como primer evento tóxico inducido en las células
epiteliales.
Además, usando los medios condicionados de los fibroblastos tratados con HCB,
estudiamos si los diferentes factores secretados por los fibroblastos podrían alterar en
células epiteliales:
a) La viabilidad celular.
b) El ciclo celular.
c) La migración celular.
d) Los niveles de expresión del TGF-β1 y del AhR
2-Estudios In Vivo:
Analizamos el rol potencial del HCB de inducir alteraciones moleculares y/o
morfológicas en la glándula mamaria, empleando un modelo murino. Dado que el proceso
de ramificación ductal se produce mayormente durante la etapa adolescente, trabajamos
con ratones C57BL/6N AhR+/+ y AhR-/- de 8 semanas de edad expuestos al HCB (3 mg/kg
p.c.) durante 21 días y evaluamos:
a) La estructura de la glándula mamaria, por crecimiento ductal y por el número de
TEBs y de ramificaciones.
b) La presencia de lesiones preneoplásicas
c) La expresión y localización del REα.
d) La expresión y localización de RP.
e) La proliferación celular, determinando los niveles de PCNA.
Materiales y Métodos 52
1. ENSAYOS IN-VITRO
1.1. Materiales y reactivos
El HCB (>99% de pureza) fue obtenido en Aldrich-Chemie GmbH & Co. (Steinheim,
Germany). Los reactivos de electroforesis en geles de poliacrilamida, las membranas de
polivinil difluoruro (PVDF) de 0,2 µm de espesor, el marcador de peso molecular precision
plus protein dual color standard y los anticuerpos secundarios acoplados a peroxidasa
dirigidos contra anti-inmunoglobulina de conejo y anti-inmunoglobulina de ratón fueron
adquiridos en la empresa Bio-Rad Laboratories, Inc. (CA, USA). Los anticuerpos policlonales
contra c-Src fosforilado en Y416, ERK1/2 total, ERK1/2 fosforilado en T202/Y204, SAPK/JNK
total y SAPK/JNK fosforilado en T183/T185, y los anticuerpos monoclonales Smad3 total,
Smad3 fosforilado en S423/S425 y p38 total fueron comprados en Cell Signalling (MA,
USA). El anticuerpo policlonal contra c-Src total y el anticuerpo monoclonal contra p38
fosforilado en Y182 fueron adquiridos en Santa Cruz Biotechnology (TX, USA). Los
anticuerpos monoclonales contra el AhR y el TGF-β1 fueron comprados en Abcam
(Cambridge, UK). El anticuerpo monoclonal contra β-Actina, el bromuro de 3-(4,5-
dimetiltiazol-2-ilo)-2,5-difeniltetrazol (MTT), el dimetilsulfóxido (DMSO), el fluoruro de
fenilmetilsulfonilo (PMSF), el EGF, la insulina, la seroalbúmina bovina (BSA), la tripsina, la
mezcla penicilina/estreptomicina, la glutamina, la TCDD, los insertos para invasión celular,
el TGF-β1, la 5-bromo-2-desoxiuridina (BrdU), el Fura 2-AM (Fura 2-acetoximetil ester), el
anticuerpo monoclonal anti-BrdU y los inhibidores α-naftoflavona (ANF), SB431542,
SB203580, SP600125, PD98059 fueron obtenidos en Sigma-Aldrich Chemical Co. (MO,
USA). El anticuerpo policlonal anti- queratina 14 fue adquirido en Covance (NJ, USA) y el
anticuerpo monoclonal contra PCNA fue comprado en Dako Laboratories (CA, USA). El
matrigel fue comprado en Becton Dickinson (NJ, USA) y el suero fetal bovino (SFB) en
Natocor SA (Argentina). El kit para el ensayo de quimioluminiscencia (ECL) fue adquirido en
GE Healthcare (Buckinghamshire, UK), y el colágeno fue comprado en Roche (IN, USA). Los
cebadores específicos para la RT-qPCR, los medios de cultivo, el Trizol y la colagenasa III
Gibco fueron obtenidos en Invitrogen Life Technology (MA, USA). El inhibidor de c-Src
(PP2) fue obtenido en Calbiochem (CA, USA). Para los estudios en cultivos celulares, los
materiales plásticos estériles fueron obtenidos en Greiner Bio-One (GBO) S.A. (Argentina).
Los anticuerpos secundarios anti- conejo conjugado a Alexa 488, anti- ratón conjugado a
Alexa 488 y anti- conejo conjugado a Alexa 633 fueron comprados en Thermo Fisher
Scientific Inc (MA, USA). Los random primers fueron adquiridos en Biodynamics
(Argentina). La transcriptasa reversa Moloney Murine Leukemia Virus (M-MLV RT), así
como los cofactores para la transcripción reversa fueron obtenidos en Promega
Materiales y Métodos 53
Corporation (WI, USA). El kit Hot Firepol EvaGreen qPCR Mix Plus (ROX) para la PCR en
tiempo real fue comprado en Solis Biodyne (Estonia). El resto de los reactivos químicos
utilizados fueron de grado analítico.
1.2. Cultivos de líneas celulares
1.2.1 MDA-MB-231
La línea celular de cáncer de mama humano MDA-MB-231 fue obtenida en
American Type Culture Collection (ATCC, USA). Esta línea celular deriva de la efusión
pleural de un adenocarcinoma mamario humano. Son consideradas triples negativas ya
que no expresan REα, RP ni HER2. Además se caracterizan por expresar Ki67 y E-cadherina,
por sobreexpresar HER1 y la oncoproteína c-Src, y por presentar bajos niveles de Claudina
4 y 7 (Belches-Jablonski y col., 2001; Holliday y Speirs, 2011). Las células fueron cultivadas
en una estufa a 37 °C con CO2 5 % en medio de cultivo Roswell Park Memorial Institute
(RPMI)-1640, suplementado con SFB 10 % y penicilina/estreptomicina 50 µg/ml.
1.2.2. MCF-10A
La línea celular de epitelio mamario humano MCF-10A fue adquirida en ATCC
(USA). Deriva de tejido mamario fibroquístico, que es una lesión proliferativa, benigna y
muy común en la glándula mamaria. Esta línea celular fue espontáneamente inmortalizada,
no es tumorigénica y no expresa el RE (Soule y col., 1990). Presentan características de
células epiteliales luminales del ducto mamario, responden a insulina, a glucocorticoides y
a EGF. Las células fueron mantenidas en una estufa a 37 °C con CO2 5 % en medio de
cultivo Dulbecco’s modified Eagle’s medium nutrient mixture Ham F-12 (DMEM-F12) sin
rojo fenol, suplementado con SFB 10 %, EGF 20 ng/ml, insulina 10 µg/ml, hidrocortisona
0,5 µg/ml, glutamina 10 µl/ml y penicilina/estreptomicina 50 µg/ml.
1.2.3. NMuMG
La línea celular de epitelio mamario de ratón NMuMG fue obtenida en Sigma-
Aldrich Co. (USA). Se trata de células epiteliales derivadas de tejido de la glándula mamaria
normal de un ratón adulto NAMRU. Exhiben muchas de las características de un epitelio
secretor y forman uniones célula-célula como desmosomas y uniones intermedias. Las
células fueron cultivadas en una estufa a 37 °C con CO2 5 %, en medio Dulbecco’s modified
Materiales y Métodos 54
Eagle’s medium (DMEM) suplementado con SFB 10 %, insulina 10 µg/ml, glutamina 10
µl/ml y penicilina/estreptomicina 50 µg/ml.
1.2.4. FGM AhR+/+ y FGM AhR-/-
Las líneas celulares de fibroblastos mamarios FGM AhR+/+ y AhR-/- fueron
obtenidas a partir de cultivos primarios de fibroblastos de la glándula mamaria de ratones
C57BL/6N AhR+/+ y AhR-/-, que fueron inmortalizados como describen Mulero-Navarro y
colaboradores (2005). Ambas líneas celulares presentan similar tasa de proliferación,
distribución del ciclo celular y morfología en los cultivos in-vitro. Las células fueron
mantenidas en una estufa a 37 °C con CO2 5 % en medio de cultivo DMEM-F12,
suplementado con SFB 10 % y penicilina/estreptomicina 50 µg/ml.
1.3. Cultivos primarios de células epiteliales de mama de ratón
Se removieron las glándulas mamarias 3, 4 y 5 de ratones hembras vírgenes
C57BL/6N AhR+/+ y AhR-/- de 8-10 semanas de edad, bajo condiciones de esterilidad. Se
disgregó el tejido y se procedió a la digestión con colagenasa tipo III 2 mg/ml, en
agitación constante durante 3 horas a 37 °C. A continuación, las muestras fueron
centrifugadas a 1000 xg durante 5 minutos, los pellets se resuspendieron en medio de
cultivo DMEM-F12 y luego se incubaron con DNAsa 2 U/ml durante 2 minutos. La acción
de la DNAsa se detuvo mediante el agregado de DMEM-F12 suplementado con SFB 4%.
Finalmente, se purificaron los organoides mediante centrifugación diferencial en buffer
fosfato salino (PBS, del inglés phosphate buffered saline) con SFB 4%. Los organoides
obtenidos se cultivaron en placas cubiertas con colágeno 50 µg/ml, de modo que se
formara una monocapa. Además, fueron mantenidos en medio DMEM-F12 suplementado
con SFB 10%, EGF 5 ng/ml, insulina 10 µg/ml, BSA 5 mg/ml y penicilina/estreptomicina 50
µg/ml. Si se observaba el crecimiento de fibroblastos, estos eran removidos por
tripsinización diferencial.
Las células aisladas se denominaron EMG AhR+/+ y EMG AhR-/- (respectivamente),
y fueron fotografiadas bajo la luz de un microscopio óptico para evaluar si presentaban la
morfología epitelial típica. Para confirmar su identidad, se evaluó la expresión de
queratina-14 (marcador de células epiteliales de mama) y de vimentina (marcador de
fibroblastos) por inmunofluorescencia.
Materiales y Métodos 55
1.4. Exposición de las líneas celulares y los cultivos primarios al HCB
Las células fueron sembradas en placas de 6, 24 o 96 pocillos (según se indica en
cada ensayo) y, cuando se encontraban al 70-80 % de confluencia, se procedió a hambrear
las células con medio de cultivo sin SFB durante 24 horas. Luego, las células fueron
expuestas al HCB (0,005; 0,05; 0,5 y 5 µM) o vehículo en medio de cultivo suplementado
con SFB 5 % durante diferentes tiempos, como se indica en cada ensayo. Para las células
NMuMG y los cultivos primarios, los tratamientos se realizaron en medio RPMI sin rojo
fenol. Para el tratamiento de las células, el HCB fue disuelto en etanol (ETOH) absoluto. La
concentración final de ETOH en cada tratamiento fue de 0,5% (V/V) y trabajos previos de
nuestro laboratorio mostraron que esta concentración no tuvo influencia sobre los
parámetros analizados (García y col., 2010).
En los casos donde se indica, como control positivo de la activación de la vía del
AhR o del TGF-β1, las células se trataron con TCDD (1 nM) o TGF-β1 (5 ng/ml),
respectivamente. Para los ensayos con medios condicionados, se utilizaron los
sobrenadantes de las células FGM AhR+/+ y AhR-/- previamente expuestas al HCB durante
48 horas. Para ello, se agregó 1/3 de medio fresco al sobrenadante y esto se usó para
tratar a las células NMuMG durante los tiempos indicados en cada ensayo.
1.5. Pretratamiento con inhibidores
Para evaluar si la acción del tóxico dependía de alguna vía de señalización en
particular, se pretrataron las células con inhibidores farmacológicos específicos, disueltos
en DMSO, durante los tiempos que se indican en cada ensayo. Además, como control de
vehículo se realizaron tratamientos en presencia de DMSO.
SB431542 (hidrato de benzamida 4-(5-Benzol[1,3]dioxol-5-il-4- pirldin-2-il-1H-
imidazol-2-il) es un inhibidor de la actividad del TβRI (también conocido como ALK5), lo
que impide la activación de la vía canónica del TGF-β1. En menor medida, SB431542
también es capaz de inhibir la actividad de otros receptores, como ALK4 y 7, que se
encuentran altamente relacionados en sus dominios quinasa con TβRI. Sin embargo, no
afecta las vías no canónicas de ERK, p38 y JNK (Inman y col., 2002). Para determinar la
concentración del inhibidor a usar, se seleccionaron dosis que fueron utilizadas
previamente por otros grupos (Mandel y col., 2013), de las cuales se eligió la menor dosis
que inhibió la fosforilación de Smad 3: 2 µM (resultados no mostrados).
Materiales y Métodos 56
SP600125 (1,9-pyrazoloantrone o Anthrapyrazolone) es un inhibidor selectivo de
JNK 1, 2, y 3. Se trata de un competidor reversible del ATP, que inhibe selectivamente la
actividad intrínseca de esta quinasa, afectando la fosforilación de c-Jun, entre otros
sustratos. Se utilizó una concentración de 12,5 mM que se obtuvo mediante una puesta a
punto con distintas concentraciones (resultados no mostrados).
SB203580 tiene afinidad por el sitio de unión del ATP, inhibiendo la actividad
catalítica de la quinasa p38, sin afectar las actividades de las MAPKs JNK ni ERK1/2. La
concentración empleada fue 10 µM, que fue seleccionada teniendo en cuenta ensayos
previos de nuestro laboratorio (Chiappini y col., 2013).
PD98059 (2-(2-Amino-3-metoxifenil)-4H-1-benzopiran-4-one) se une
selectivamente e inhibe a MEK I y II, impidiendo la activación de ERK1/2. Se empleó una
concentración de 10 µM que fué seleccionada por estudios previos en nuestro laboratorio
(Chiappini y col., 2013).
PP2 (1-tert-butil-3-(4-clorofenil)-1H-pirazol[3,4-d]pirimidin-4-amina) es un
inhibidor de c-Src. La dosis utilizada de 0,2 nM se eligió tomando en cuenta trabajos
previos de nuestro laboratorio (Pontillo y col., 2011). Ungefroren y colaboradores (2011)
demostraron que este inhibidor interfiere con la vía de señalización del TGF-β1, pero a
dosis mucho mayores a las empleadas en este estudio (100 nM – 50 µM).
ANF (α-naftoflavona) actúa como un antagonista del AhR (Merchan y col., 1993). En
este estudio se utilizó una concentración de 1 µM, que fue testeada previamente por
Pontillo y colaboradores (2011).
1.6. Obtención de lisados celulares y sobrenadantes
Una vez finalizado el tratamiento, el sobrenadante se recolectó y se guardó a -80
°C, en los casos donde fue requerido para ensayos de inmunoblot. En cambio, si debía ser
usado como medio condicionado para tratar a las células epiteliales, primero se centrifugó
a 500 xg y se suplementó con BSA 100 µg/µl y PMSF 100 µg/µl para su conservación.
Por otro lado, las células fueron lavadas tres veces con buffer PBS y se agregó
buffer de lisis (Tris-HCl 20 mM M pH 7,4, Tritón X-100 0,5 %, EGTA 1 mM, EDTA 1 mM,
NaCl 0,15 M, NaF 50 mM, leupeptina 6 µM, aprotinina 1 mg/ml, pepstatina 0,6 µM, PMSF 1
mM, Na3VO4 2 mM). Luego de 10 minutos, los lisados se retiraron utilizando un raspador y,
Materiales y Métodos 57
a continuación, fueron agitados empleando un vortex. Los lisados celulares se guardaron a
-80 °C para ser utilizados en los ensayos de inmunoblot.
1.7. Análisis de niveles de proteínas
1.7.1. Determinación de la concentración de proteínas
La concentración de proteínas fue analizada por el método de Bradford (Bradford,
1976), utilizando BSA 1 mg/ml como proteína patrón para realizar la curva de calibración.
1.7.2. Electroforesis en geles de poliacrilamida
Volúmenes iguales de sobrenadante o cantidades equivalentes de proteína de cada
muestra fueron resuspendidos en buffer Laemmli (Tris 0,25 M pH 6,8, SDS 8%, azul de
bromofenol 0,03 %, glicerol 40 %, β-mercaptoetanol 20 %) y se calentaron durante 10
minutos a 95 °C. Seguidamente, se sembraron las muestras en geles de poliacrilamida
(SDS-PAGE) al 7,5 -10 - 12 %, según el peso molecular de la proteína a evaluar. Se realizó
la electroforesis en buffer de corrida Tris 25 mM, glicina 200 mM y SDS 0,1 % (pH 8,3) a
voltaje constante de 80-120 V durante 45-60 minutos a temperatura ambiente. Se
corrieron paralelamente proteínas marcadoras de peso molecular de rango amplio (10-250
kDa).
1.7.3. Ensayo de Inmunoblot
Las muestras de proteínas de los geles fueron transferidas a membranas de PVDF,
utilizando una cámara de transferencia semiseca (Mini Protean Transblot, Bio-Rad). Para
ello, los geles y las membranas fueron equilibrados previamente en buffer de transferencia
(Tris 25 mM; glicina 200 mM; SDS 0,1 %; metanol 20 %; pH 8,3) y la electrotransferencia se
realizó durante 0,5 - 1,5 horas, dependiendo del peso molecular de la proteína a analizar,
con voltaje constante de 18 V. Luego de finalizada la transferencia, se utilizó la tinción de
proteínas con rojo Ponceau S al 0,5 % como control de transferencia y sembrado. Para
tener registro de esta etapa, escaneamos las membranas con las bandas teñidas con
Ponceau S y guardamos las imágenes.
Seguidamente, las membranas se bloquearon mediante la incubación con una
solución de leche descremada 5 % en TBS-T (Tris 10 mM, NaCl 150 mM, Tween 20 0,05 %,
pH 8) durante toda la noche a 4 °C. Luego, las membranas se incubaron con diferentes
Materiales y Métodos 58
anticuerpos primarios (Tabla 1) durante toda la noche a 4 °C, con agitación constante.
Después de la incubación, se realizaron 5 lavados de 10 minutos cada uno con TBS-T a
temperatura ambiente y, seguidamente, las membranas se incubaron con anticuerpo
secundario conjugado con peroxidasa dirigido contra IgG de conejo o de ratón (1:1000 en
TBS-T con BSA 3%) durante 1 hora, a temperatura ambiente y con agitación constante.
Finalmente se realizaron 5 lavados con TBS-T y un lavado con TBS (Tris 10 mM, NaCl 150
mM, pH 8), de 10 minutos cada uno. Las membranas fueron empleadas, en primer lugar,
para analizar los anticuerpos contra las formas fosforiladas y, luego, se realizaron dos
lavados de 15 minutos en baño calefactor con agitación a 60 °C, en buffer de estripping
(Tris 0,063 M, β-mercaptoetanol 0,1 M, SDS 2 %, pH 6,7). Seguidamente se bloquearon y se
reincubaron con anticuerpos contra las formas totales de las diferentes proteínas
analizadas.
Los complejos inmunes fueron visualizados empleando un kit de
quimioluminiscencia (ECL), con densitometría láser utilizando un equipo Fotodyne
(Foto/Analyst). Las bandas obtenidas fueron cuantificadas mediante densitometría óptica,
utilizando el programa Gel-Pro Analyzer 3.1. Como control de carga de los ensayos de
inmunoblot, se incubaron las membranas con el anticuerpo monoclonal anti-β-Actina, toda
la noche a 4 °C. Los valores obtenidos para las proteínas fosforiladas fueron normalizados
en relación a la señal de la proteína total, mientras que los valores de las proteínas totales
fueron normalizados en relación a la señal de β-Actina. En ambos casos, los valores fueron
relativizados al control, al cual se le asignó un valor igual a 1.
Materiales y Métodos 59
Anticuerpo Fabricante Código Origen Dilución usada
p-Smad-3 (Ser 423/425) CS 9520 CM 1/250
p-ERK1/2 (Thr 202/Tyr204) CS 9101 CP 1/500
p-p38 (Tyr 182) SC 7973 CM 1/500
p-SAPK/JNK (Thr 183/185) CS 9251 CP 1/250
p-c-Src (Tyr 416) CS 2101 CP 1/500
AhR Ab 2770 RM 1/500
Smad-3 CS 9523 CM 1/500
ERK1/2 CS 9102 CP 1/500
p38 CS 9217 CM 1/500
SAPK/JNK CS 9252 CP 1/500
c-Src SC 19 CP 1/500
TGF-β1 Ab 27969 RM 1/500
β -Actina Sigma ab 5636 CP 1/2000
anti-conejo BR 170-6515 Ca 1/1000
anti-ratón BR 170-6516 Ca 1/1000
Tabla 1. Anticuerpos utilizados para inmunoblot. CP (policlonal, de conejo), CM (monoclonal, de
conejo), RM (monoclonal, de ratón), Ca (cabra). Santa Cruz (SC), Abcam (Ab), Cell Signaling (CS),
Bio-Rad (BR), Sigma-Aldrich (Sigma).
1.8. Estudio de la expresión de ARNm
1.8.1. Extracción y cuantificación del ARN
En los ensayos donde se especifica, las células fueron pretratadas con inhibidores
específicos durante 1 hora. Una vez expuestas al HCB o vehículo, se retiró el tratamiento y
las células fueron homogeneizadas en Trizol durante 5 minutos, para permitir la completa
disociación de las proteínas, y guardadas a -80 °C. Para realizar la extracción del ARN total,
se agregó cloroformo (0,2 ml para 1 ml de Trizol), se agitaron los tubos y se dejaron
descansar durante 3 minutos. Luego de centrifugar a 12000 xg por 15 minutos a 4 °C, se
Materiales y Métodos 60
recolectó la fase superior acuosa, se agregó isopropanol y se incubó a temperatura
ambiente durante 10 minutos. A continuación, se centrifugó a 12000 xg por 10 minutos a 4
°C, se descartó el sobrenadante y el pellet se resuspendió con ETOH 75 %. Finalmente se
centrifugó a 8000 xg durante 5 minutos a 4 °C, el pellet se resuspendió en agua tratada
con dietilpirocarbonato (DEPC) y se incubó a 55-60 °C por 10 minutos para disolver el
ARN. Seguidamente, se cuantificó y se controló la pureza del ARN extraído mediante la
determinación de la relación de absorbancias 260/280 nm y 260/230 nm, en un
espectofotómetro para microplacas Epoch (BioTec). A su vez, la integridad del ARN se
verificó mediante su visualización en geles de agarosa utilizando el colorante GelRed
(Invitrogen). Las muestras se guardaron a -80 °C.
1.8.2. Reacción de retrotranscripción (RT) seguida de la reacción en cadena de la
polimerasa en tiempo real (qPCR)
Para la síntesis de la primera cadena de ADNc se utilizó 1 µg de ARN total y se
procedió a la retrotranscripción, usando el kit comercial M-MLV RT (Promega) y una
combinación de hexanucleótidos de cadena simple con grupos hidroxilo en sus extremos
5' y 3' (random primers), siguiendo las instrucciones del fabricante. La qPCR fue realizada
empleando 1 µl de una dilución 1:10 del ADNc obtenido y el kit comercial HOT FIREPol
EvaGreen qPCR Mix Plus (Solis Biodyne). El ADNc fue amplificado siguiendo el siguiente
protocolo:
Para los genes analizados de origen humano: 15 segundos a 94 °C, 20 segundos a
60 °C y 30 segundos a 72 °C, 40 ciclos.
Para los genes analizados de origen murino: 30 segundos a 95 °C, 30 segundos a
59 °C y 30 segundos a 72 °C, 50 ciclos.
La qPCR se realizó por triplicado usando el sistema de detección Rotor Gene Q
(Qiagen). Las secuencias de los cebadores específicos se diseñaron empleando el software
Primer Express 1.5 (PE Biosystem) y se muestran en la Tabla 2. La especificidad de la
reacción se controló mediante el sometimiento de todas las reacciones al protocolo de
disociación por calor, luego del ciclo final de la qPCR. Como control interno para la
normalización de los datos, se testearon todas las muestras contra un gen de referencia
“housekeeping”: Actina o Gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH), con el fin de
corregir posibles variaciones en calidad y cantidad de ADNc. El procesamiento de los datos
se realizó utilizando el programa CFX Manager software Versión 3.0 (Bio-Rad) y la
Materiales y Métodos 61
cuantificación del ARNm se efectuó empleando el método 2−ΔΔCt para comparar diferencias
respecto al control. Se asignó un valor arbitrario de 1 a la muestra control.
Gen
(origen) Sentido Antisentido
AhR
(ratón) 5´AGCCGGTGCAGAAAACAGTAA´3 5´AGGCGGTCTAACTCTGTGTTC´3
AhR
(humano) 5´-ACATCACCTACGCCAGTCGC-3´ 5´-TCTATGCCGCTTGGAAGGAT-3´
CYP1A1
(ratón) 5´ACAGACCTCATTGAGCACAG´3 5´GGCTCCACGAGATAGCAGTT´3
CYP1A1
(humano) 5´- GATTGAGCACTGTCAGGAGAAGC-3´ 5´-ATGAGGCTCCAGGAGATAGCAG-3´
TGF-β1
(ratón) 5´GGACTCTCCACCTGCAAGAC´3 5´GACTGGCGAGCCTTAGTTTG´3
TGF-β1
(humano) 5´-TGAACCGGCCTTTCCTGCTTCTCATG-3´ 5´-GCGGAAGTCAATGTACAGCTGCCGC-3´
TβRI
(ratón) 5´GGCGAAGGCATTACAGTGTT´3 5´TGCACATACAAATCGCCTGT´3
TβRII
(ratón) 5´GCTTGGCCAGAAAGACAGAC´3 5´CACTCCACAAGCTGTCTCCA´3
HER1
(ratón) 5`TCTTCAAGGATGTGAAGTGTG´3 5`TGTACGCTTTCGAACAATGT´3
IGF-I
(ratón) 5'GATACACATCATGTCGTCTTCACA´3 5'CAGTACATCTCCAGTCTCCTCAGA´3
GAPDH
(ratón) 5´TGAAGCAGGCATCTCAGGG´3 5´CGAAGGTGCAAGAGTGGGAG´3
Actina
(humano) 5’-GGACTTCGAGCAAGAGATGG-3’ 5’-AGCACTGTGTTGGCGTACAG-3’
Tabla 2: Secuencia de cebadores sentido y antisentido empleados en la qPCR.
Materiales y Métodos 62
1.9. Ensayo de viabilidad celular
Se estudió la viabilidad celular mediante el ensayo de MTT, que permite determinar
la actividad mitocondrial de las células tratadas. Se realizó el tratamiento de las células con
HCB (0,005; 0,05; 0,5 y 5 µM) o vehículo durante 24 horas y, luego, se incubaron por 1 hora
con solución de MTT en solución básica salina [NaCl 137 mM, KCl 3,5 mM, KH2PO4 0,4 mM,
Na2HPO4 ·7H2O 0,33 mM, ácido N-Tris-(hidroximetil)-metil-2-aminoetanosulfónico 5 mM
pH 7,4, D-glucosa 10 mM]. La actividad de la deshidrogenasa mitocondrial de las células
vivas generó formazán como precipitado, que se disolvió con DMSO y se determinó por
espectrofotometría, como la diferencia en la absorbancia a 490 y 650 nm. Se consideró que
la cantidad de células vivas y metabólicamente activas es proporcional a la cantidad de
formazán producido. Cada determinación se realizó por triplicado y los valores graficados
fueron expresados como el porcentaje de viabilidad celular respecto al control.
1.10. Distribución del ciclo celular
Luego de realizar la exposición de las células al HCB durante 12, 24 o 36 horas, se
incubaron con tripsina 0,25 % para despegarlas de la placa y, luego de inhibir su actividad,
se las centrifugó a 1500 xg durante 5 minutos. El precipitado celular se resuspendió en 100
µl de PBS y luego las células fueron fijadas con 1 ml de ETOH 70 % frío y conservadas a -20
°C. Las células fijadas fueron centrifugadas a 1500 xg, y el precipitado fue resuspendido e
incubado a 37 °C durante 30 minutos, en 300 µl de solución RNAsa (10 µg/ml en PBS). Una
vez terminada la incubación las células fueron resuspendidas en 6 µl de ioduro de propidio
(IP, 50 µg/ml) durante 15 minutos a temperatura ambiente y en oscuridad. Luego fueron
agitadas empleando un vortex y conservadas en oscuridad a 4 °C. El contenido de ADN fue
evaluado utilizando un citómetro de flujo (DAKO Cytomation). Se tuvieron en cuenta las
señales provenientes de célula única y al menos 10.000 células fueron evaluadas en cada
muestra. La distribución de células en cada fase del ciclo celular fue calculada a partir de
histogramas de ADN, empleando el software Cylchred 1.0.2 (Cardiff University, UK), y los
resultados se expresaron como el porcentaje de células en cada fase del ciclo.
1.11. Ensayo de proliferación celular
La proliferación de las células NMuMG se determinó mediante la incorporación de
BrdU, un nucleótido sintético análogo a la timidina. La BrdU se incorpora al ADN de las
células en la fase S del ciclo celular, de manera que es posible evidenciar los núcleos
Materiales y Métodos 63
proliferativos por medio de un anticuerpo específico anti-BrdU. Las células se sembraron
sobre cubreobjetos colocados en placas de cultivo de 6 pocillos y se cultivaron durante 24
horas para permitir que se adhieran a los vidrios. Se procedió con el tratamiento de las
células como se describió previamente y, al finalizar, las células fueron incubadas con una
solución de BrdU 30 µM durante 2 horas en una estufa a 37 °C con CO2 5 %. A
continuación, las células se lavaron con PBS y se fijaron con formaldehido 4 % disuelto en
PBS. Luego, se trataron con una solución de HCl 3N y Tritón X-100 1 % en PBS durante 15
minutos, para desnaturalizar el ADN en moléculas de simple cadena. Seguidamente, se
lavaron las células con una solución de Na2B4O7 0,1 M y Tritón X-100 al 1 % en PBS pH 8,5
para neutralizar el ácido. Se realizó el bloqueo de los sitios inespecíficos empleando una
solución de BSA 1 % en PBS durante una hora, y se incubó con el anticuerpo primario
monoclonal anti-BrdU (dilución 1/100), durante toda la noche a 4 °C. Luego, las células se
lavaron con PBS e incubaron por 1 hora a temperatura ambiente con el anticuerpo anti-
IgG de ratón conjugado al fluoróforo Alexa-488 (dilución 1/100). Los núcleos fueron
teñidos con Hoechst 3 mg/ml durante 10 minutos y, luego, se realizó el montaje de los
vidrios. La visualización se realizó por microscopía de epifluorescencia utilizando un
microscopio Olympus BX50 F-3 (Olympus Optical Co., Ltd, Japan). Se realizó un único
ensayo y se evaluaron al menos 1000 núcleos. El porcentaje de células en proliferación en
cada campo fotografiado se determinó según la ecuación: (número de células positivas
para BrdU / número de células teñidas con Hoechst) x 100.
1.12. Ensayo de migración celular
Las células se sembraron en placas de 6 pocillos y se evaluó la migración celular
mediante el ensayo de cicatrización de la herida. Se realizó una herida con la punta de un
tip en la monocapa de células confluentes y se lavaron los pocillos con PBS para remover
las células levantadas en el anterior procedimiento. Luego se agregó el tratamiento con
HCB o ETOH en medio de cultivo suplementado con SFB 5 % y se tomaron las primeras
fotografías al tiempo de 0 horas (To). Las células fueron mantenidas en una estufa a 37 °C
con CO2 5 % y al tiempo final (Tf) se volvieron a fotografiar los mismos campos. Los Tf
fueron variables, tomando en cuenta la velocidad de migración de cada línea celular y que
debe ser menor al tiempo de duplicación de las células. Para las células MDA-MB-231, el Tf
fue de 20 horas, para las células NMuMG fue de 12 horas y para los fibroblastos FGM
AhR+/+ y AhR-/- fue de 9 horas. Se evaluó el cerrado de la herida empleando el programa
Image J (National Institute of Health, MD, USA) y se calculó la tasa de migración como:
(distancia de herida en To – distancia de herida en Tf) / distancia de herida en To x 100. Los
Materiales y Métodos 64
resultados se expresaron en relación al control y asignándole un valor arbitrario de 1. En
los casos donde se indica, las células fueron previamente tratadas con inhibidores
farmacológicos durante 3 horas y el tratamiento se realizó en presencia o ausencia del
inhibidor.
1.13. Ensayo de invasión celular
Se estudió la invasión celular mediante el ensayo de cámara con inserto. Para ello,
los insertos de 8 µm de poro fueron colocados en placas de 24 pocillos y recubiertos con
40 µl de matrigel al 13 % en RPMI. A continuación, se incubaron en la estufa de cultivo a
37 °C durante 2 horas, para permitir la gelificación del matrigel. Las células MDA-MB-231
fueron pretratadas con inhibidores específicos durante 3 horas y, luego, sembradas en la
parte superior del inserto (1,5 x 104 células/inserto) en RPMI libre de SFB, con HCB 5 µM o
vehículo, en presencia o ausencia del inhibidor. Se utilizó RPMI con 10 % de SFB como
quimioatractante en el pocillo donde se apoya el inserto. La invasión celular implica no
sólo procesos de migración sino además requiere que la célula posea la capacidad para
unir y degradar componentes de la matriz extracelular. El matrigel es una preparación de
membrana basal, rico en proteínas de la matriz extracelular, que ocluye los poros del
inserto. Para moverse a través de dichos poros, las células deberán activar proteínas que
degraden la matriz extracelular. Luego de transcurridas 72 horas para permitir la invasión,
las células de la parte superior del inserto fueron removidas con un hisopo de algodón. Las
células que invadieron hacia la parte inferior del filtro se fijaron durante 10 minutos con
metanol, seguidamente se tiñeron con azul de toluidina y se fotografiaron bajo
microscopio, para luego ser cuantificadas. Los resultados graficados fueron expresados en
relación a las células tratadas con vehículo (control). Se asignó un valor arbitrario de 1 a la
muestra control.
1.14. Inmunofluorescencia
Las células fueron sembradas en cubreobjetos de vidrio colocados en placas de 6
pocillos y, en los casos donde se indica, se realizó el tratamiento con HCB o ETOH. A
continuación, fueron lavadas con PBS, fijadas con metanol frío durante 10 minutos e
incubadas con buffer de bloqueo (BSA 1 % y Tritón X-100 1 % en PBS) por 30 minutos a 37
°C. El anticuerpo primario (Tabla 3) se preparó en BSA 0,2 % y Tritón X-100 1 % en PBS, y
se realizó la incubación con el mismo durante 24 horas a temperatura ambiente y en
Materiales y Métodos 65
cámara húmeda. Finalmente, las células se lavaron con PBS y se incubaron con el
anticuerpo secundario anti-conejo conjugado a Alexa 488, anti-ratón conjugado a Alexa
488 o anti-conejo conjugado a Alexa 633 (según corresponda) durante 1 hora a
temperatura ambiente. Los núcleos fueron teñidos por incubación con Hoechst (5 µM/ml
en PBS) o con 4’,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI, 1:8000) durante 10 minutos y, luego, se
realizó el montaje de los vidrios. Se tomaron las imágenes utilizando el microscopio de
epifluorescencia Olympus BX50 F-3 (Olympus Optical Co., Ltd, Japan), eligiendo campos al
azar, de manera de contar al menos 2000 células por tratamiento. El número de células con
marca positiva se determinó según la ecuación: (número de células positivas / número de
células teñidas con Hoechst o DAPI). Los datos fueron relativizados al control y se
mostraron imágenes representativas que se encuentran a una magnificación x600.
Anticuerpo Fabricante Código Origen Dilución
usada
AhR Ab 2770 RM 1/200
Smad 3 CS 9523 CM 1/20
α-SMA Sigma A5228 RM 1/200
Queratina 14 Covance PRB-155P CP 1/500
Vimentina Sigma V6389 RM 1/100
anti- ratón conjugado a Alexa 488 TF A32723 Ca 1/250
anti- conejo conjugado a Alexa 488 TF A11034 Ca 1/100
anti- conejo conjugado a Alexa 633 TF A21070 Ca 1/250
Tabla 3: Anticuerpos utilizados para inmunofluorescencia. CP (policlonal, de conejo), CM
(monoclonal, de conejo), RM (monoclonal, de ratón), Ca (cabra). Ab (abcam), CS (Cell signaling), TF
(Thermo Fisher Scientific), Sigma-Aldrich (Sigma).
Materiales y Métodos 66
1.15. Determinación de los niveles citosólicos de calcio
Se estudiaron los niveles intracelulares de calcio por medio del indicador
fluorescente Fura 2-AM, que atraviesa la membrana celular. Una vez dentro de la célula, las
enzimas esterasas cortan el grupo acetoximetilo, regenerando el indicador Fura 2 y
reteniéndolo en el citosol. Fura 2 tiene la capacidad de unirse al calcio intracelular libre. Si
se encuentra unido a calcio, Fura 2 se excita con luz a 380 nm, pero si está libre se excita a
340 nm, y en ambos casos emite a 505 nm. De este modo, obteniendo la relación entre la
fluorescencia emitida cuando se incide con luz a 340 y 380 nm (F340/F380) se pueden
determinar los niveles intracelulares de calcio. Estas determinaciones se realizaron en
colaboración con la Dra. Natalia Fernández, en el Laboratorio de Farmacología Molecular,
de la Facultad de Farmacia y Bioquímica, Universidad de Buenos Aires.
Para el experimento, se preparó una solución salina tamponada (BSS) la cual
contiene: NaCl 140 mM, KCl 3,9 mM, KH2PO4 0,7 mM, Na2HPO4 0,5 mM, Al2H2O, CaCl2 1
mM, MgCl2 0,5 mM, HEPES 20 mM, glucosa 10 mM y BSA 0,1 %, pH 7,5. Se sembraron las
células en placas de 96 pocillos y, luego de 24 horas, se incubaron en presencia Fura 2-AM
(Plurónico 0,4 %, FURA 0,1 µl/well en BSS). Luego de 90 minutos en oscuridad, se lavaron
con BSS y se centrifugó durante 5 minutos a 1500 xg, para asegurar que las células se
encontraran en el fondo de la placa. Seguidamente, la placa fue introducida en el equipo
FlexStation3 (MolDev) con el termostato ajustado en 37 ºC, y se midió la fluorescencia a
505 nm, cada segundo durante 350 segundos, mediante la exposición alternada de luz a
340 y 380 nm. Luego de 30 segundos, se inyectó HCB (0,05 y 5 µM) o vehículo en cada
pocillo, sin interrumpir la lectura. Luego de 240 segundos, se inyectó Tritón X-100 5 % para
lisar las células y cuantificar todo el calcio presente en el medio (respuesta máxima). Se
realizó un control positivo con histamina (100 µM), dado que se ha reportado que produce
un incremento intracelular de calcio en varios sistemas (Monczor y Fernández, 2016). Los
niveles de calcio citosólico se determinaron como la relación F340/F380, expresada en
relación al tiempo previo a la incorporación del ligando.
Materiales y Métodos 67
2. ENSAYOS IN-VIVO
2.1. Materiales y reactivos
El HCB (>99% de pureza) fue obtenido en Aldrich-Chemie GmbH & Co. (Steinheim,
Germany). Las tabletas de 3,3' tetrahidrocloruro de diaminobencidina (DAB) y el carmín
fueron obtenidas en Sigma-Aldrich Chemical Co. (Mo, USA). El anticuerpo monoclonal
contra PCNA fue comprado en Dako Laboratories (CA, USA). El kit de amplificación
UltraTek HRP (Anti-Polyvalent) fue obtenido en Scytek Laboratories (UT, USA). El
anticuerpo anti-REα fue adquirido en Chemicon International Inc. (CA, USA), mientras que
el anticuerpo contra el RP fue comprado en Santa Cruz Biotechnology, Inc (TX, USA). El
bálsamo de Canadá fue obtenido en Biopack (Bs. As., Argentina). Los anticuerpos anti- E-
cadherina y anti- P-cadherina fueron gentilmente donados por la Dra. Ibarra (Facultad de
Medicina, Universidad de Buenos Aires) y por la Dra. Vázquez-Levin (IBYME, CONICET),
respectivamente. El resto de los reactivos químicos utilizados fueron de grado analítico.
2.2. Ratones
Los ratones C57BL/6N salvajes (AhR+/+) y deficientes (AhR-/-) para el AhR fueron
producidos por recombinación homóloga en células madre embrionarias, como describió
Fernández-Salguero y colaboradores (1995). Estos ratones se encuentran en el Laboratorio
de Biología Molecular del Cáncer, Departamento de Bioquímica y Biología Molecular y
Genética, Facultad de Ciencias, Universidad de Extremadura, España, dirigido por el Dr.
Pedro Fernández-Salguero. Los mismos fueron mantenidos en un ambiente controlado
con aire acondicionado a 20 ± 2 °C, humedad relativa 50 ± 10 %, bajo ciclos de
luz/oscuridad de 12-12 horas, con libre acceso a la comida y al agua. El cuidado de los
animales fue acorde con la Guía de uso y cuidado animal del comité de la Universidad de
Extremadura (España).
Ratones hembra vírgenes C57BL/6N AhR+/+ y AhR-/-, de 4 semanas de edad
fueron segregados aleatoriamente en 4 grupos con 5 animales por grupo (GRUPO 1:
ratones AhR+/+ control, GRUPO 2: ratones AhR+/+ HCB, GRUPO 3: ratones AhR-/-
control, y GRUPO 4: ratones AhR-/- HCB). El HCB (3 mg/kg p.c.) se disolvió en aceite de
maíz y los animales fueron tratados mediante inyección intraperitoneal (i.p.) (0,1 ml), 4
veces por semana durante 21 días. Los animales control fueron inyectados i.p. con aceite
de maíz. El tratamiento con HCB no produjo efectos en la salud general, en el peso
corporal o el consumo de agua y comida de los ratones. Los animales fueron eutanizados
por inhalación de CO2, cuando los mismos se encontraron en la fase estro del ciclo estral.
Materiales y Métodos 68
Para ello, la secreción vaginal de los ratones pertenecientes a los distintos grupos fue
colectada en el mismo horario durante los últimos 7 días de experimentación. Los
exudados vaginales fueron observados al microscopio óptico inmediatamente después de
ser recolectados. La fase estro del ciclo fue reconocida por la ausencia de leucocitos y la
presencia de células epiteliales anucleadas en el preparado. La cuarta glándula mamaria
(abdominal), derecha e izquierda, fueron removidas en condiciones de esterilidad y
procesadas para estudios inmunohistoquímicos y para su montaje completo,
respectivamente.
2.3. Evaluación morfológica de la glándula mamaria completa (whole mount)
La cuarta glándula mamaria del lado izquierdo de cada ratón fue extendida sobre
un vidrio portaobjetos y fijada en solución de Carnoy (ETOH 100 %: cloroformo: ácido
acético glacial, 6:3:1) durante 2 horas a temperatura ambiente. Luego, se realizó un lavado
con ETOH 70 % durante 15 minutos, seguido por otro lavado con agua destilada por 5
minutos. A continuación, se procedió a efectuar la tinción con Carmine Alum (1 g de
carmín y 2,5 g de sulfato de aluminio y potasio en 500 ml de agua) a 4 °C durante 24
horas. Finalmente, los tejidos fueron deshidratados y montados usando bálsamo de
Canadá.
Se tomaron imágenes de los preparados usando una cámara fotográfica y un
microscopio óptico Olympus BX50 F-3 (Olympus Optical Co., Ltd, Tokyo, Japan), que luego
se analizaron empleando el programa ImageJ (National Institute of Health, MD, USA). El
crecimiento ductal se evaluó midiendo la distancia entre el ganglio linfático y el borde de
crecimiento de la glándula mamaria entre dos líneas paralelas dibujadas en cada imagen, y
el resultado se expresó en relación al área de la almohadilla de grasa. La densidad de
ramificaciones se evaluó como el número de puntos de ramificación respecto al área de la
almohadilla de grasa. El número de TEBs se determinó como el número de estructuras
ductales terminales en forma de lágrima, de un área igual o mayor a 0,03 mm2 (Fenton,
2009). Los resultados se expresan respecto al grupo 1 (AhR+/+ control), al cual se le asignó
un valor arbitrario igual a 1.
Materiales y Métodos 69
2.4. Análisis histológico de la glándula mamaria
La cuarta glándula mamaria del lado derecho de cada ratón fue fijada en
formaldehido 4 % en PBS y embebida en parafina. El extremo de crecimiento de la
glándula mamaria y los TEBs fueron localizados y secciones de 5 µm, localizadas a 400 µm
del TEB más próximo, fueron cortadas y empleadas para este estudio (Murray y col., 2007).
Algunas de estas secciones fueron teñidas con hematoxilina - eosina para analizar la
presencia de estructuras preneoplásicas. Esta técnica de coloración consta de los
siguientes pasos: tinción con hematoxilina durante 2 minutos, tinción con eosina durante 2
minutos, incubación con ETOH 50 % durante 1 minuto, incubación con ETOH 70 % durante
1 minuto; incubación con ETOH 95 % durante 1 minuto; dos incubaciones con ETOH 100 %
de 1 minuto cada una y dos incubaciones con xileno de 1 minuto cada una.
Posteriormente, los cortes se observaron al microscopio óptico Olympus BX50 F-3
(Olympus Optical Co., Ltd, Tokyo, Japan). Los ductos fueron contados y clasificados en:
normal, cuando presentaban 2 o menos capas de células; o hiperplásico, si mostraba un
incremento en el número de células que forman el ducto. Los gráficos muestran el
porcentaje de ductos hiperplásicos y normales, en relación a los ductos totales (100 %). Los
resultados se expresan respecto al grupo 1 (AhR+/+ control).
2.5. Inmunohistoquímica
Los cortes se desparafinaron por medio de lavados con xileno (2 lavados de 5
minutos) y se hidrataron con sucesivos lavados con ETOH 100 %, 96 % y 70 % (2 lavados
de 5 minutos en cada caso). Posteriormente, los cortes se lavaron con agua destilada y se
calentaron en un horno a microondas en una solución reguladora de citrato de sodio (10
mM, pH 6,0), dos veces durante 2 minutos, para realizar la exposición de los antígenos.
Luego de realizar tres lavados con agua destilada, se bloqueó la actividad de la enzima
peroxidasa endógena, mediante una incubación con H2O2 al 3 % en agua destilada durante
20 minutos. Los cortes se lavaron con PBS (4 lavados de 5 minutos) y los sitios de unión
inespecífica se bloquearon por incubación, durante 10 minutos, con la solución de bloqueo
Super block (UltraTek HRP Anti-Polyvalent Lab Pack, ScyTek Laboratories, Logan, USA) a
temperatura ambiente. A continuación, las secciones fueron lavadas con PBS por 5 minutos
y, luego, incubadas con los anticuerpos primarios diluidos en BSA 1 % en PBS (Tabla 4), en
cámara húmeda durante 24 horas a temperatura ambiente. El control negativo consistió en
la omisión del anticuerpo primario. Al día siguiente, las muestras fueron incubadas con la
solución Ultra Tek Anti-Polyvalent (UltraTek HRP Anti-Polyvalent Lab Pack, ScyTek
Materiales y Métodos 70
Laboratories) por 10 minutos a temperatura ambiente. Luego de lavar con PBS (4 lavados
de 5 minutos), se incubaron con la solución UltraTek HRP (UltraTek HRP Anti-Polyvalent
Lab Pack, ScyTek Laboratories) durante 10 minutos a temperatura ambiente. Finalmente,
los cortes se revelaron con DAB y se colorearon con hematoxilina durante 30 segundos.
Luego de tres lavados con agua, se procedió a la deshidratación de los cortes. Para ello, las
muestras fueron incubadas sucesivamente con ETOH 70 %, 96 % y 100 % (2 incubaciones
de 5 minutos cada una) y con xileno (2 incubaciones de 5 minutos cada una). Por último, se
colocó una gota de bálsamo de Canadá sobre cada corte histológico y se cubrió con un
cubreobjetos procurando la eliminación completa de burbujas de aire entre ambos vidrios.
Los cortes fueron observados en un microscopio óptico (Nikon, Tokyo, Japan) y se
tomaron 5 fotografías representativas de cada uno, con un aumento de 600x. En todos los
casos, el número de células positivas fue determinado a doble ciego, mediante la
cuantificación de los núcleos marcados para los diferentes antígenos y su relación con el
número de núcleos totales presentes en el campo. Los resultados se expresan respecto al
grupo 1 (AhR+/+ control), al cual se le asignó un valor arbitrario igual a 1.
Anticuerpo Fabricante Código Origen Dilución usada
REα Chemicon MAB447 RM 1/50
RP SC sc-7208 CP 1/50
PCNA DC MO879 RM 1/50
E-cadherina TF NCH-38 RM 1/50
P-cadherina SC sc-7893 RP 1/50
Tabla 4: Anticuerpos empleados para ensayos de inmunohistoquímica. CP (policlonal, de
conejo), RP (policlonal, de ratón), RM (monoclonal, de ratón). CS (Cell signaling), DC (Dako
Cytomation), TF (Thermo Fisher Scientific).
Materiales y Métodos 71
3. ANÁLISIS ESTADÍSTICOS
El análisis de la significación estadística de los resultados obtenidos se realizó con
el programa GraphPad Prism versión 6 (CA, USA). Los resultados fueron evaluados
mediante el análisis de varianzas del tipo ANOVA de un factor. El tipo de prueba empleada
para comparar entre los distintos grupos experimentales dependió de cada ensayo. Los
datos de los experimentos in vivo y de aquellos ensayos in vitro donde se emplearon
células AhR+/+ y AhR-/- o se realizaron ensayos con inhibidores, fueron analizados
mediante la prueba de Tukey, que permite comparar todos los grupos entre sí. Los datos
de los restantes ensayos in vitro fueron evaluados empleando la prueba de Dunnet, que
compara los distintos tratamientos respecto al control. Se consideraron diferencias
significativas cuando los valores de p fueron menores a 0,05. Los resultados representan
las medias ± SD de al menos tres experimentos independientes.
Capítulo I: Carcinogénesis mamaria
Resultados 73
RESULTADOS
1. Acción del HCB sobre los niveles de ARNm del AhR y del TGF-β1
Existen numerosas evidencias que demuestran el papel del AhR regulando diversos
procesos relacionados con el desarrollo y la progresión tumoral mamaria (Dietrich y Kaina,
2010). Incluso se ha reportado que la exposición a ligandos del AhR, como el TCDD y el
benzopireno, predispone a la glándula mamaria para el desarrollo de tumores (Jenkins y
col., 2007; Ronco y col., 2011). En estudios previos de nuestro laboratorio, demostramos
que el HCB estimula la migración y la invasión en la línea celular de cáncer de mama
humano MDA-MB-231 (REα-), de manera dependiente del AhR (Pontillo y col., 2011; 2013).
Por otro lado, la vía de señalización del TGF-β1 es de suma importancia en la progresión
del cáncer de mama, actuando como un promotor tumoral en estadios avanzados de la
enfermedad (Zarzynska, 2014). Teniendo en cuenta la interrelación que existe entre las vías
de señalización del AhR y del TGF-β1 (Gómez-Durán y col., 2009), nos propusimos
investigar si el HCB era capaz de modular la interacción entre estos caminos. Para tal fin,
las células MDA-MB-231 fueron pretratadas con inhibidores específicos de las vías del AhR
(ANF, 1 µM) y del TGF-β1 (SB431542, 2 µM) durante 1 hora y, luego, expuestas al HCB (0,05
y 5 µM), en presencia o ausencia de inhibidores, durante 2 horas. Las dosis empleadas en
este estudio fueron seleccionadas debido al efecto bifásico ejercido por el tóxico en
diversos procesos como proliferación celular y apoptosis. Específicamente, hemos
observado que el HCB induce la proliferación de las células de cáncer de mama humano
MCF-7 (REα+) solo a bajas dosis (0,005-0,05 µM), mientras que estimula la muerte por
apoptosis solo a altas dosis (0,5-5 µM) (García y col., 2010). Además, de las dos dosis bajas
ensayadas, seleccionamos trabajar con HCB 0,05 µM debido a que observamos
previamente que aumenta la migración celular en las células MDA-MB-231 (Pontillo y col.,
2011); mientras que, de las dos dosis altas, elegimos usar la concentración más alta (5 µM)
porque demostramos que incrementa la invasión celular en la misma línea (Pontillo y col.,
2013).
En primer lugar, se analizó la expresión de ARNm del AhR por RT-qPCR. Nuestros
resultados mostraron que la exposición al HCB, a ambas dosis, disminuyó los niveles de
ARNm del receptor y este efecto fue prevenido cuando se pretrataron las células con el
inhibidor específico de TβRI, SB431542. Incluso encontramos que la reducción del AhR
inducida por el HCB 5 µM, no solo es bloqueada en presencia del inhibidor SB431542, sino
que sus niveles se ven incrementados por sobre los niveles basales (Figura 10A). Como se
Capítulo I: Carcinogénesis mamaria
Resultados 74
ha observado que el TGF-β1 modula la expresión del AhR en diferentes líneas celulares,
pensamos que esta acción del HCB podría ser similar a la ejercida por el TGF-β1, entonces
estimulamos las células con TGF-β1 (5 ng/ml) durante 2 horas. Efectivamente, encontramos
una reducción en los niveles de ARNm del AhR tras la exposición a esta citoquina (Figura
10A), sugiriendo que la acción inducida por el HCB sobre la expresión del ARNm del AhR
estaría mediada por la activación de la vía del TGF-β1.
A continuación, se examinó la acción del tóxico sobre el contenido de ARNm del
TGF-β1 por RT-qPCR. Observamos que el HCB (0,05 µM) aumentó los niveles de expresión
del TGF-β1 de manera dependiente del AhR, ya que el pretratamiento con ANF revirtió el
efecto (Figura 10B). Para comparar este resultado con un control positivo, se incubaron las
células con TCDD (1 nM), un ligando fuerte del AhR, observándose un incremento en los
niveles de ARNm del AhR (Figura 10B).
Figura 10: El HCB modula la interacción entre el AhR y el TGF-β1 en MDA-MB-231. Las células
se pretrataron con inhibidores del AhR (ANF, 1 µM) o del TβRI (SB431542, 2 µM) durante 1 hora, y
luego se expusieron a HCB (0,05 y 5 µM), en presencia o ausencia de inhibidor, durante 2 horas.
Como control positivo de la activación de la vía del AhR o del TGF-β1, las células se trataron con
TCDD (1 nM) o TGF-β1 (5 ng/ml), respectivamente. Se purificó el ARN total y se analizó la expresión
de ARNm del (A) AhR y (B) del TGF-β1 por RT-qPCR, usando cebadores específicos. La expresión de
β-Actina se usó como control para normalizar los datos. Los resultados de al menos 3 experimentos
se relativizaron al control y se muestra la media ± SD. Los asteriscos indican diferencias
significativas respecto al control sin HCB ni inhibidor (*p< 0,1, **p< 0,01 y ***p< 0,001), y las cruces
indican diferencias significativas respecto al control sin HCB pero con inhibidor (+++p< 0,001). Los
datos fueron evaluados por ANOVA de un factor, seguido de la prueba de Tukey.
Capítulo I: Carcinogénesis mamaria
Resultados 75
Estos resultados sugieren que el HCB modula la interacción entre el AhR y el TGF-
β1 en las células MDA-MB-231: la unión del HCB al AhR resulta en un incremento de los
niveles de expresión de ARNm del TGF-β1, mientras que la activación de la vía del TGF-β1
por el tóxico produce una disminución del contenido de ARNm del AhR.
2. El HCB altera la expresión proteica del AhR y su localización
Los niveles proteicos del AhR están regulados por diversos mecanismos que
incluyen tanto procesos de síntesis como de degradación, de manera tal que el
tratamiento con diferentes ligandos del AhR puede modular sus niveles de ARNm y de
proteína en forma diferencial. Es por esto, que consideramos necesario estudiar no solo los
niveles de ARNm del AhR, sino también su expresión proteica. Dado que hemos observado
una reducción en los niveles de ARNm luego de 2 horas de tratamiento, evaluamos la
acción del HCB (0,05 y 5 µM) sobre el contenido de proteína del AhR, luego de 2 y 6 horas
de exposición, mediante la técnica de inmunoblot. Los resultados mostraron un aumento
en los niveles del AhR luego de exponer a las células durante 2 y 6 horas a la dosis de 0,05
µM de HCB; sin embargo, no se observaron alteraciones a la dosis mayor del tóxico (5 µM)
(Figura 11). Para evaluar si este efecto podría estar relacionado con la vía del TGF-β1, se
trataron las células con TGF-β1 (5 ng/ml), durante los mismos tiempos utilizados en el
ensayo con HCB. Como se observa en la Figura 11, la expresión proteica del AhR no fue
alterada, sugiriendo que la acción postrancripcional del HCB sobre el AhR no estaría
mediada por la activación de la vía del TGF-β1.
Capítulo I: Carcinogénesis mamaria
Resultados 76
Figura 11: El HCB altera la expresión proteica del AhR. (A-B) Las células MDA-MB-231 fueron
tratadas con HCB (0,05 y 5 µM), TGF-β1 (5 ng/ml) o vehículo durante 2 y 6 horas. Los niveles
proteicos del AhR en el lisado celular fueron evaluados por inmunoblot. Se muestra un resultado
representativo y el gráfico corresponde a la relación entre la cuantificación de los niveles del AhR y
de β-Actina, relativizado al control. Los valores son las medias ± SD de al menos 3 experimentos.
Los asteriscos indican diferencias significativas respecto al vehículo (*p< 0,05 y **p< 0,01; ANOVA
de un factor, prueba de Dunnet).
Una vez que se produce la unión del ligando, el AhR se disocia del complejo
multiproteico al que se encuentra unido y puede desencadenar dos vías: una de
membrana o no genómica, que involucra la activación de c-Src; y otra nuclear o genómica
(Dietrich y Kaina, 2010). En estudios previos, demostramos que el HCB induce la vía de
membrana del AhR en las células MDA-MB-231, incrementando la fosforilación y
activación de c-Src (Pontillo y col., 2011). En este trabajo, decidimos estudiar la vía nuclear,
en la cual el AhR transloca al núcleo y, tras formar un heterodímero con ARNT, actúa como
un factor de transcripción (Matsumura, 1994). En primer lugar, examinamos la localización
del AhR por inmunofluorescencia, luego de 30 minutos y 2 horas de tratamiento con HCB
(0,05 y 5 µM). Observamos que la dosis mayor del pesticida (5 µM) incrementa la
translocación del AhR al núcleo, luego de 2 horas de exposición (Figura 12A-B).
Para evaluar si estos cambios en la localización del receptor involucraban, además,
la activación del camino genómico del AhR, analizamos los niveles de ARNm del CYP1A1,
Capítulo I: Carcinogénesis mamaria
Resultados 77
mediante RT-qPCR. El CYP1A1 es un gen blanco del AhR y el análisis de su expresión es
ampliamente usado para evaluar la actividad transcripcional del receptor. Además, varios
autores reportaron un incremento en su expresión en las células MDA-MB-231 expuestas a
ligandos del AhR (Barhoover y col., 2010; Dohr y col., 1995). Encontramos un aumento en
los niveles de expresión del CYP1A1 cuando las células MDA-MB-231 se expusieron a HCB
5 µM durante 2 horas (Figura 12C).
Figura 12: El HCB activa la vía nuclear del AhR. Las células MDA-MB-231 fueron tratadas con
HCB (0,05 y 5 µM) o vehículo durante (A-B) 30 minutos y (A-C) 2 horas. (A) Luego del tratamiento,
las células se fijaron con metanol frío y la localización del AhR se evaluó por inmunofluorescencia.
Se realizó la tinción de Hoechst para visualizar los núcleos. Magnificación x600. (B) El número de
células con marca nuclear positiva se normalizó a unidades arbitrarias. Para la cuantificación se
eligieron campos al azar, contando al menos 1000 células por tratamiento. (C) Los niveles de ARNm
del CYP1A1 fueron analizados mediante RT-qPCR. Los niveles de ARNm de β-Actina se usaron como
control para normalizar los resultados. En todos los gráficos, los valores son las medias ± SD de al
menos 3 experimentos. Los asteriscos indican diferencias significativas respecto al vehículo (*p<
0,05; ANOVA de un factor, prueba de Dunnet).
Capítulo I: Carcinogénesis mamaria
Resultados 78
3. Efecto del HCB sobre los niveles de expresión y activación del TGF-β1
Debido a que en este estudio observamos que el HCB (0,05 µM) incrementa el
contenido de ARNm del TGF-β1, a continuación, examinamos la acción del tóxico sobre
sus niveles de expresión proteica, mediante la técnica de inmunoblot. El TGF-β1 se sintetiza
como un precursor inactivo, que se secreta al medio extracelular donde, luego, es activado
obteniéndose un homodímero de 25 kDa (Robertson y col., 2015). El anticuerpo anti-TGF-
β1 empleado en estos ensayos (ab27969, Abcam) reconoce la isoforma inactiva de 44 kDa,
así como el monómero de 12,5 kDa y el homodímero de 25 kDa, ambas consideradas
isoformas activas. Esto nos permitió evaluar la expresión proteica del TGF-β1, analizando
los niveles de la isoforma inactiva en el lisado de las células tratadas con HCB (0,05 µM) en
curvas de tiempo (0, 2, 6 y 24 horas). Los resultados del inmunoblot mostraron que el
tóxico produjo un aumento significativo en la expresión del TGF-β1, luego de 2 y 6 horas
de exposición, sin alteraciones a las 24 horas (Figura 13A). Como el TGF-β1 es
notoriamente activado en la carcinogénesis mamaria (Moses y Barcellos-Hoff, 2011), nos
propusimos examinar el rol potencial del HCB en modular la activación de esta citoquina.
Para ello se cuantificó esta isoforma activa, de 12,5 kDa, en el sobrenadante de las células
expuestas al HCB (0,05 µM), durante diferentes tiempos. En un ensayo preliminar,
evaluamos los niveles de TGF-β1 secretado al medio luego de 5 y 15 minutos de
tratamiento, pero la sensibilidad de la técnica no nos permitió detectar la banda
correspondiente a la citoquina (resultados no mostrados), por lo que, a continuación,
ensayamos tiempos más prolongados para acumular una cantidad de proteína mayor, que
pueda ser detectable con esta técnica. Encontramos que el tóxico induce la activación del
TGF-β1 luego de 2, 6 y 24 horas (Figura 13A). Obtuvimos resultados similares cuando
analizamos la banda de 25 kDa, correspondiente al dímero del TGF-β1 (resultados no
mostrados).
A continuación, estudiamos el efecto del HCB a diferentes dosis (0,005; 0,05; 0,5 y 5
µM), luego de 2 horas de tratamiento, tiempo en el cual encontramos que el pesticida
aumentaba tanto la expresión como la activación del TGF-β1. Nuestros resultados
demostraron que el HCB (0,05; 0,5 y 5 µM) aumentó los niveles de expresión del TGF-β1,
en el lisado celular, de manera dependiente del incremento de la dosis. Además, el tóxico
indujo la activación del TGF-β1 de manera similar, a todas las dosis ensayadas (Figura
13B).
Capítulo I: Carcinogénesis mamaria
Resultados 79
Figura 13: Efecto del HCB sobre la expresión proteica y activación del TGF-β1 en MDA-MB-
231. Los niveles proteicos del TGF-β1 fueron evaluados mediante inmunoblot en (A) curvas de
tiempo (0, 2, 6 y 24 horas), tras tratar las células con HCB (0,05 µM); y en (B) curvas de dosis (0,005;
0,05; 0,5 y 5 µM de HCB) luego de 2 horas de exposición. En el panel superior se muestra un
resultado representativo de un inmunoblot. En el gráfico se muestra la cuantificación de 3
experimentos independientes. Los niveles de expresión del TGF-β1 se obtuvieron de la relación
entre los niveles de la isoforma inactiva (44 kDa) y β-actina, en el lisado celular. Los niveles de
activación se obtuvieron cuantificando la isoforma activa (12,5 kDa) en el sobrenadante. Los valores
son las medias ± SD. Los asteriscos indican diferencias significativas respecto al vehículo (*p< 0,05,
**p< 0,01 y ***p< 0,001; ANOVA de un factor, prueba de Dunnet).
4. Acción del HCB sobre la vía de señalización del TGF-β1 dependiente de Smad
4.1. Niveles de fosforilación de Smad3
La unión del TGF-β1 a su receptor, TβRII, conduce a la fosforilación y activación del
receptor TβRI, que posteriormente fosforila a los Smad2 y 3 (Massagué y col., 2005).
Algunos autores han reportado que Smad2 y 3 presentan una acción diferencial en las
células MDA-MB-231, donde Smad2 pareciera tener un efecto protector, mientras que la
activación de Smad3 se relaciona con la inducción de factores pro-angiogénicos y de
genes involucrados en el proceso de metástasis ósea (Petersen y col., 2010). Por esta razón,
estudiamos los niveles de fosforilación de Smad3 mediante inmunoblot, luego de que las
células fueran expuestas al HCB (0,05 µM) durante diferentes tiempos (0, 5, 15 y 30
minutos, 2 y 24 horas). Observamos un aumento significativo en la activación de Smad3
Capítulo I: Carcinogénesis mamaria
Resultados 80
luego de 5 minutos de tratamiento; sin embargo, el tóxico no alteró los niveles de
expresión total de Smad3 (Figura 14A). A continuación, nos propusimos analizar el efecto
del tóxico en diferentes dosis (0,005; 0,05; 0,5 y 5 µM), a los 5 minutos de tratamiento. La
Figura 14B muestra que el HCB induce un incremento significativo en la fosforilación de
Smad3 de manera dependiente del aumento de la dosis.
Figura 14: HCB induce la fosforilación de Smad3 en MDA-MB-231. Las células fueron tratadas
con HCB o ETOH (vehículo) en (A) curva de tiempo (HCB 0,05 µM; por 5, 15, 30 minutos, 2 y 24
horas) y en (B) curva de dosis (HCB 0,005; 0,05; 0,5 y 5 µM; durante 5 minutos). Se analizó la
expresión de P-Smad3 y Smad3 total mediante inmunoblot. La expresión de β-Actina se usó como
control de carga. Se muestra una imagen de un experimento representativo y los gráficos
representan la relación entre la cuantificación de los niveles de Smad3 fosforilado y total. Los
valores representan las medias ± SD de al menos 3 experimentos independientes, relativizado al
control. Los asteriscos indican diferencias significativas respecto al control sin inhibidor (*p< 0,05,
**p< 0,01 y ***p< 0,001; ANOVA de un factor, prueba de Dunnet).
4.2. Localización de Smad3
Una vez activados, los R-Smad interaccionan con Smad4 y este complejo se
traslada al núcleo, donde actúa como un factor de transcripción (Kamato y col., 2013). Por
lo tanto, decidimos confirmar nuestro resultado de que la exposición de células MDA-MB-
231 al HCB activa la vía TGF-β1/Smad3, estudiando la localización de Smad3 por
inmunofluorescencia, tras 5 minutos de exposición al tóxico (0,005; 0,05; 0,5 y 5 µM).
Efectivamente, observamos que el HCB produjo un aumento significativo de la
translocación al núcleo de Smad3, a todas las dosis ensayadas (Figura 15A-B).
Capítulo I: Carcinogénesis mamaria
Resultados 81
4.3. Mecanismo de acción del HCB sobre la vía de TGF-β1/Smad
Los resultados aquí obtenidos demuestran que el tóxico activa la vía del TGF-β1
dependiente de Smad3, sin embargo, el mecanismo de acción aún no es claro. Dado que el
HCB es un agonista débil del AhR (Hahn y col., 1989), hipotetizamos que podría
desencadenar efectos dependientes e independientes del receptor. Por ello, nos
propusimos evaluar si la fosforilación del Smad3, desencadenada por la exposición al
tóxico, dependía de la unión del HCB al AhR. Las células MDA-MB-231 fueron
preincubadas con un inhibidor específico del AhR (ANF, 1 µM) y luego se expusieron al
HCB (0,05 y 5 µM) durante 5 minutos, en presencia o ausencia del inhibidor. Observamos
que el HCB incrementó la fosforilación de Smad3 a ambas concentraciones, y que este
efecto fue revertido por la presencia del antagonista ANF (Figura 15C).
En estudios realizados previamente en nuestro laboratorio, se reportó que el HCB
estimula la fosforilación de c-Src, de manera dependiente del AhR, en la línea MDA-MB-
231 (Pontillo y col., 2011), activando así el camino de membrana de este receptor. Dado
que Galliher y Schiemann, (2006) reportaron que la quinasa c-Src fosforila al TβRII y de esta
manera induce la señalización del TGF-β1, decidimos examinar si la c-Src podría estar
involucrada en la activación de Smad3 mediada por HCB. Para tal fin, las células se
pretrataron con PP2 (0,2 nM), un inhibidor de c-Src, y luego se expusieron al HCB (0,05 y 5
µM), en presencia o ausencia del inhibidor. Encontramos que el tratamiento con PP2
previno la fosforilación de Smad3 inducida por HCB (Figura 15C). Por lo tanto, estos
resultados sugieren que el efecto del tóxico de inducir la activación de Smad3 depende de
su unión al AhR y del camino no genómico de este receptor, en el cual participa la quinasa
c-Src.
Capítulo I: Carcinogénesis mamaria
Resultados 82
Figura 15: Efecto del HCB sobre la localización del Smad3 y mecanismo de acción sobre la vía
del TGFβ-1 dependiente de Smad. (A-B) Las células fueron tratadas con HCB (0,005; 0,05; 0,5 y 5
µM) o ETOH durante 5 minutos. (A) La localización de Smad3 (verde) fue evaluada mediante
inmunofluorescencia y los núcleos (azul) se marcaron con Hoechst. Se muestra la superposición de
ambas fotos. (B) Cuantificación del número de células con señal nuclear positiva para Smad3. (C) Las
células fueron pretratadas con ANF (1 µM), PP2 (0,2 nM) o DMSO (vehículo del inhibidor) por 1 hora
y, luego, expuestas al HCB (0,05 y 5 µM) durante 5 minutos, en presencia o ausencia del inhibidor.
Se analizó la expresión de P-Smad3 y Smad3 total mediante inmunoblot. La expresión de β-Actina
se usó como control de carga. Se muestra una imagen de un experimento representativo y los
gráficos representan la relación entre la cuantificación de los niveles de Smad3 fosforilado y total.
Todos los gráficos representan las medias ± SD de 3 experimentos independientes, relativizado al
control. Los asteriscos indican diferencias significativas respecto al control sin inhibidor (*p< 0,05,
**p< 0,01 y ***p< 0,001). Las cruces indican diferencias significativas respecto al tratamiento con
HCB 0,05 µM sin inhibidor (+p< 0,05 y ++p< 0,01). Los triángulos indican diferencias significativas
respecto al tratamiento con HCB 5 µM sin inhibidor (ΔΔΔp< 0,001). Los datos fueron evaluados por
ANOVA de un factor, seguido de la prueba de Tukey.
Capítulo I: Carcinogénesis mamaria
Resultados 83
5. Efecto del HCB sobre las vías del TGFβ-1, independientes de Smad
Además de la vía canónica que involucra a los Smads, el TGF-β1 estimula un
conjunto cada vez más amplio de moléculas de señalización, como ERK1/2, p38, JNK y
PI3K/Akt (Parvani y col., 2011). En un estudio anterior realizado en las células MDA-MB-
231, demostramos que el HCB induce la fosforilación de ERK1/2, pero no produce
alteraciones sobre la actividad de Akt (Pontillo y col., 2011). En este trabajo de tesis,
analizamos el efecto del HCB sobre los niveles de fosforilación de p38 y JNK, en las células
MDA-MB-231. En primer lugar, se realizó una curva de tiempo, exponiendo a las células al
HCB (0,05 µM) o vehículo, durante 5, 15 y 30 minutos, 2 y 24 horas. Observamos un
aumento significativo en los niveles de fosforilación de JNK a los 15 minutos (Figura 16A)
y de p38 a los 5, 15 y 30 minutos de tratamiento (Figura 16C). Nuestros resultados
mostraron, además, que el tóxico no altera los niveles de expresión proteica de JNK ni de
p38 total a los tiempos analizados.
Dado que ambas vías fueron estimuladas luego de 15 minutos de exposición, se
eligió este tiempo para estudiar la acción del HCB en una curva de dosis (0,005; 0,05; 0,5 y
5 µM). Encontramos que ambas moléculas son activadas a partir de las dosis de 0,05 µM,
exhibiendo un patrón similar de fosforilación (Figura 16B, D).
Capítulo I: Carcinogénesis mamaria
Resultados 84
Figura 16: Acción del HCB sobre las vías del TGFβ-1, independientes de Smad. Las células
fueron expuestas al HCB o ETOH en (A, C) curvas de tiempo (HCB 0,05 µM; durante 5, 15, 30
minutos, 2 y 24 horas) y (B, D) curvas de dosis (HCB 0,005; 0,05; 0,5 y 5 µM; por 15 minutos). Se
analizó la expresión de (A-B) P-JNK y JNK total, y (C-D) P-p38 y p38 total mediante inmunoblot. La
expresión de β-Actina se usó como control de carga, para evaluar variaciones de expresión de las
formas totales de las proteínas. En el panel superior se muestra una imagen de un experimento
representativo del inmunoblot. En el panel inferior se muestra la relación entre la cuantificación de
los niveles de proteína fosforilada y total, por densitometría óptica de 3 experimentos
independientes. Todos los gráficos representan las medias ± SD, relativizado al control. Los
asteriscos indican diferencias significativas respecto al control (*p< 0,05, **p< 0,01 y ***p< 0,001;
ANOVA de un factor, prueba de Dunnet).
Capítulo I: Carcinogénesis mamaria
Resultados 85
6. HCB induce migración celular por medio de las vías del TGF-β1
Varios reportes han demostrado la implicancia de las vías de señalización del TGF-
β1 en la migración, la invasión y la TEM en cáncer de mama (Kim y col., 2003; Mitra y col.,
2011; Muraoka-Cook y col., 2005). En un estudio previo de nuestro laboratorio, hemos
observado que el HCB incrementa la motilidad de las células MDA-MB-231, a las dosis de
0,05; 0,5 y 5 µM (Pontillo y col., 2011). Dado que los resultados de este trabajo de tesis
mostraron que la exposición al HCB estimula la expresión y secreción del TGF-β1, así como
sus caminos de señalización, nos propusimos evaluar si estas vías podrían estar
involucradas en la migración de las células, inducida por el tóxico. Se seleccionó para este
estudio trabajar con HCB 0,05 µM, por ser la dosis menor, ambientalmente relevante, en
tener efecto sobre la migración y activar todas las vías del TGF-β1. Para ello, las células
MDA-MB-231 se pretrataron con inhibidores específicos de la vía de Smad (SB431542, 2
µM), JNK (SP600125, 12,5 µM), p38 (SB203580, 10 µM) o ERK1/2 (PD98059 10 µM), durante
3 horas. A continuación, se realizó el ensayo de cerrado de la herida para evaluar la
migración tras 20 horas de exposición al HCB (0,05 µM). Como habíamos reportado
previamente, el tóxico incrementó, en forma significativa, la migración celular. Además,
nuestros resultados mostraron que este efecto fue bloqueado cuando se utilizaron los
inhibidores específicos, evidenciando que la migración inducida por el HCB depende de las
vías de Smad, ERK1/2, p38 y JNK (Figura 17).
Capítulo I: Carcinogénesis mamaria
Resultados 86
Figura 17: Acción del HCB sobre la migración de las células MDA-MB-231. Rol de las vías del
TGFβ-1. Se pretrataron las células con inhibidores de las vías de Smad (SB431542, 2 µM), JNK
(SP600125, 12,5 µM), p38 (SB203580, 10 µM) o ERK1/2 (PD98059 10 µM), disuelto en DMSO,
durante 3 horas. Posteriormente se realizó una herida empleando un tip y las células se expusieron
al HCB (0,05 µM) o vehículo, en presencia o ausencia del inhibidor. (A) Se tomaron fotografías a los
tiempos de 0 y 20 horas luego de realizada la herida y se muestra una imagen representativa. (B) Se
evaluó la tasa de migración y se graficó la media ± SD de al menos 3 experimentos, en relación al
control. Los asteriscos indican diferencias significativas respecto al control (***p< 0,001), y las cruces
indican diferencias significativas respecto al tratamiento con HCB y DMSO (+++p< 0,001). Los datos
fueron evaluados por ANOVA de un factor, seguido de la prueba de Tukey.
Capítulo I: Carcinogénesis mamaria
Resultados 87
7. Contribución de las vías del TGF-β1 en la invasión celular inducida por HCB
Debido a que previamente reportamos que la exposición al HCB 5 µM induce la
invasión de las células MDA-MB-231 (Pontillo y col., 2013), nos propusimos analizar la
implicancia de las vías de señalización del TGF-β1 en dicho efecto. Para ello, las células
MDA-MB-231 se pretrataron con inhibidores específicos de la vía de Smad (SB431542, 2
µM), JNK (SP600125, 12,5 µM), p38 (SB203580, 10 µM) o ERK1/2 (PD98059, 10 µM), y se
realizó el ensayo de cámara con inserto para evaluar la invasión celular, tras 72 horas de
exposición al HCB (5 µM). Encontramos que el tóxico incrementó significativamente la
invasión de las células (Figura 18A-B, G) y que este efecto fue bloqueado cuando se
utilizaron inhibidores de las vías de Smad, JNK y p38 (Figura 18C-E, G). Sin embargo,
nuestros resultados demuestran que la vía de ERK1/2 no estaría involucrada en la invasión
inducida por el tóxico, ya que el pretratamiento con el inhibidor de esta MAPK no produjo
alteraciones (Figura 18F, G). Los datos obtenidos en estos experimentos nos permiten
inferir que el HCB aumenta la invasión de las células MDA-MB-231, involucrando los
caminos de Smad, p38 y JNK.
Capítulo I: Carcinogénesis mamaria
Resultados 88
Figura 18: El HCB induce invasión de las células MDA-MB-231 mediante las vías del TGF-β1. Se
pretrataron las células MDA-MB-231 con inhibidores de las vías de Smad (SB431542, 2 µM), JNK
(SP600125, 12,5 µM), p38 (SB203580, 10 µM) o ERK1/2 (PD98059, 10 µM) disuelto en DMSO durante
3 horas, y posteriormente se expuesieron al HCB (5 µM) en presencia del inhibidor. Se evaluó la
invasión celular empleando el ensayo de cámara con inserto. Se muestra una imagen representativa
de (A) control (ETOH + DMSO), (B) HCB + DMSO, (C) HCB + SB431542, (D) HCB + SP600125, (E)
HCB + SB203580 y (F) HCB + PD98059. (G) Se cuantificaron las células que invadieron y los
resultados de al menos 3 experimentos se relativizaron al control. Se muestra la media ± SD. Los
asteriscos indican diferencias significativas respecto al control (**p< 0,01), y las cruces indican
diferencias significativas respecto al tratamiento con HCB y DMSO (++p< 0,01). Los datos fueron
evaluados por ANOVA de un factor, seguido de la prueba de Tukey.
Capítulo I: Carcinogénesis mamaria
Resultados 89
8. Validación de los inhibidores PP2, SP600125 y PD98059
Diferentes autores observaron que algunos de los inhibidores empleados en esta
tesis, en particular, el inhibidor de c-Src: PP2; de JNK: SP600125; y de MEK: PD98059,
podrían alterar la señalización del AhR en distintos modelos (Dvorak y col., 2008;
Frauenstein y col., 2015; Reiners y col., 1998). Debido a ello, analizamos el impacto de los
mismos sobre la señalización del AhR inducida por HCB. En primer lugar examinamos el
camino no genómico del AhR, evaluando los niveles de fosforilación de c-Src. Para ello, las
células MDA-MB-231 fueron pretratadas con los inhibidores (PP2 0,2 nM, SP600125 12,5
µM y PD98059 10 µM) o vehículo (DMSO) durante 2 horas y, luego, expuestas al HCB (0,05
y 5 µM) por 5 minutos, en presencia o ausencia del inhibidor. Como se esperaba, el
tratamiento con PP2 previno la fosforilación de c-Src inducida por el tóxico. En cambio, en
presencia de SP600125 o PD98059 observamos que el HCB aún puede estimular la
fosforilación de c-Src, aunque en menor medida (Figura 19A). Este efecto sobre la
fosforilación de c-Src podría deberse a la acción antagónica que ejercen estos inhibidores
sobre el AhR (Dvorak y col., 2008; Reiners y col., 1998). Sin embargo, nuestros resultados
demuestran que el HCB (5 µM) es capaz de inducir la activación de c-Src, a pesar de la
presencia de los inhibidores SP600125 o PD98059.
En segundo lugar, evaluamos el camino genómico del AhR mediante el análisis de
la expresión de ARNm del CYP1A1, por RT-qPCR. De manera similar, se preincubaron las
células con los inhibidores y, luego, se trataron con HCB durante 2 horas, con y sin
inhibidores. En presencia de SP600125 y PD98059 encontramos menores niveles basales
del CYP1A1, en comparación al pretratamiento con el vehículo (Figura 19B). Una vez más,
esto podría deberse a la acción antagónica que producen estos compuestos en la vía de
señalización del AhR. En otros modelos se encontró que, tanto SP600125 como PD98059
bloquean la inducción del CYP1A1 ejercida por TCDD, un ligando fuerte del AhR (Dvorak y
col., 2008; Reiners y col., 1998). Sin embargo, en la línea MDA-MB-231 observamos que el
HCB (5 µM) incrementa los niveles de ARNm del CYP1A1, aun en presencia de los
inhibidores (Figura 19B). Por otro lado, Frauenstein y colaboradores (2015) reportaron que
PP2 actúa como un agonista del AhR en queratinocitos y en células de hepatoma,
incrementando la expresión del CYP1A1. Estos resultados fueron confirmados en nuestro
modelo, ya que obtuvimos un aumento en los niveles de ARNm del CYP1A1 cuando las
células se pretrataron con PP2, aun en ausencia de HCB (Figura 19B). A pesar de que, ante
la presencia de PP2, el HCB no es capaz de incrementar los niveles de CYP1A1,
consideramos que este inhibidor es válido en nuestro modelo, para evaluar el camino no
genómico del AhR. Esto se debe a que lo empleamos para testear el papel de c-Src en la
Capítulo I: Carcinogénesis mamaria
Resultados 90
fosforilación de Smad3, observada a tiempos muy cortos (5 minutos), momento en el cual
la vía genómica aún no se modula.
Figura 19. Efecto de inhibidores sobre el camino genómico y no genómico del AhR inducido
por HCB. La células MDA-MB-231 fueron pretratadas durante 2 horas con PP2 (0,2 nM), SP600125
(12,5 µM), PD98059 (10 µM) o vehículo (DMSO). Luego, las células se trataron con HCB (0,05 y 5 µM)
o vehículo (ETOH), en presencia o ausencia de inhibidores. (A) Estudio del camino no genómico. Los
niveles de c-Src fosforilados y totales se analizaron por inmunoblot, luego de 5 minutos de
exposición al HCB. La expresión de β-Actina se usó como control de carga. Se muestra el
inmunoblot de un experimento representativo y la relación entre la cuantificación de los niveles de
proteína fosforilada y total, por densitometría óptica de 3 experimentos independientes. (B) Estudio
del camino genómico. Los niveles de ARNm del CYP1A1 fueron evaluados por RT-qPCR, luego de 2
horas de exposición al HCB. La expresión de β-Actina se usó como control para normalizar los
resultados. Los valores son las medias ± SD. Los asteriscos indican diferencias significativas respecto
al control (ETOH + DMSO) (*p< 0,05, **p< 0,01 y ***p< 0,001). Los signos más indican diferencias
significativas respecto al tratamiento con ETOH en presencia de inhibidor (+p< 0,05). Los datos
fueron evaluados por ANOVA de un factor, seguido la prueba de Tukey.
Capítulo I: Carcinogénesis mamaria
Resultados 91
9. Niveles citosólicos de calcio
Durante varios años se han llevado a cabo diferentes investigaciones para examinar
si existe un evento inicial que desencadene la activación del camino no genómico del AhR
y la respuesta tóxica de las dioxinas y los compuestos tipo dioxina. Algunas publicaciones
han reportado un incremento rápido en la concentración de calcio intracelular, inducido
por TCDD (Puga y col., 1992). Dong y Matsumura (2008) demostraron que la TCDD induce
la activación de fosfolipasa A2 estimulada por calcio, lo que conduce a la activación de c-
Src en células de epitelio mamario humano MCF-10A. En nuestro laboratorio, observamos
que la activación de c-Src y HER1 fueron los eventos más tempranos (5 min), y ambos
están involucrados en el aumento de migración inducida por HCB en las células MDA-MB-
231 (Pontillo y col., 2011). Sin embargo, no sabemos si estos cambios se podrían
desencadenar por un aumento de calcio en el citoplasma.
En este trabajo de tesis se estudió si la exposición de las células MDA-MB-231 al
HCB podría provocar cambios en los niveles intracelulares de calcio, por medio de la
determinación de la fluorescencia del compuesto quelante de calcio, Fura 2-AM. Este
compuesto atraviesa la membrana celular y, una vez dentro de la célula, las enzimas
esterasas cortan el grupo acetoximetilo (AM), regenerando el indicador Fura 2 y
reteniéndolo en el citosol. Este indicador presenta un máximo de emisión a 510 nm y un
máximo de absorción a 380 nm, el cual se desplaza a 340 nm al quelar calcio. De este
modo, obteniendo la relación entre la fluorescencia emitida cuando se incide con luz a 340
y 380 nm (F340/F380) se pueden determinar los niveles intracelulares de calcio. Las células
MDA-MB-231 se incubaron en presencia Fura 2-AM y se midió la fluorescencia a 505 nm,
cada segundo durante 350 segundos, mediante la exposición alternada de luz a 340 y 380
nm. Luego de 30 segundos, se inyectó HCB (0,05 y 5 µM) o vehículo. Luego de 240
segundos, se inyectó Tritón X-100 5 % para lisar las células y cuantificar todo el calcio
presente en el medio (respuesta máxima). Nuestros resultados no mostraron cambios en
los niveles de calcio citosólico tras la exposición al HCB (Figura 20). Se realizó un control
positivo con histamina (100 µM), dado que se ha reportado que produce un incremento
intracelular de calcio en varios sistemas (Monczor y Fernández, 2016). Observamos un
rápido incremento de calcio citosólico luego de la inyección con histamina, verificando que
las células se encontraban viables y eran capaces de responder al estímulo (Figura 20).
Asimismo, el agregado de Tritón X-100 generó un aumento en la relación F340/F380
(Figura 20), indicando que Fura 2-AM había ingresado y se mantenía retenido en la célula.
De este modo se corrobora que la ausencia de alteraciones en la relación F340/F380
observada tras el tratamiento con HCB, se debe a que el pesticida no tuvo efecto sobre la
localización del calcio y no a una falla de la técnica.
Capítulo I: Carcinogénesis mamaria
Resultados 92
Figura 20. Acción del HCB sobre los niveles citosólicos de calcio. Las células MDA-MB-231
fueron sembradas en placas de 96 pocillos y, luego de 24 horas, se incubaron con la solución BSS en
presencia del indicador fluorescente Fura 2-AM. Las células fueron incubadas en oscuridad durante
90 minutos en estufa a 37 ºC con CO2 5 % y, luego, se lavaron con la solución BSS. Se realizó una
exposición alternada de luz a 340 nm (Fura 2-AM libre) y 380 nm (Fura 2-AM unido al calcio) y se
midió la fluorescencia a 505 nm. Luego de 30 segundos se inyectó el ligando: HCB (0,05 y 5 µM) o
vehículo (ETOH). Se empleó histamina (100 µM) como control positivo. Luego de 240 segundos se
inyectó Tritón X-100 5 %. Tiempo total del ensayo: 350 segundos. El gráfico muestra el promedio de
la relación entre las intensidades de luz (F340/F380), respecto al tiempo inicial, de un experimento
representativo (3 réplicas por experimento). Se obtuvieron resultados similares en 3 experimentos
independientes.
Capítulo I: Carcinogénesis mamaria
Discusión
93
DISCUSIÓN
Debido al potencial efecto adverso de los pesticidas sobre diversas patologías
humanas, incluyendo al cáncer de mama, el mecanismo de acción de estos compuestos es,
actualmente, un área de activa investigación. En particular, este trabajo de tesis se centró
en el estudio del HCB, un contaminante ambiental presente en el medio ambiente y en
diferentes muestras humanas, como factor de riesgo para el cáncer de mama. Estudios
previos de nuestro laboratorio demostraron que el HCB incrementa la migración y la
invasión de las células MDA-MB-231, por medio de la activación de la vía de señalización
AhR/c-Src (Pontillo y col., 2011; 2013). De acuerdo a los datos experimentales presentados
aquí, proponemos un mecanismo de acción que integra la interacción entre las vías del
AhR y del TGF-β1, y la acción pro-migratoria que ejerce el HCB sobre esta línea celular
(Figura 21). Reportamos que el tóxico activa las vías de señalización del TGF-β1 en las
células MDA-MB-231, efecto que observamos previamente en las células de tiroides de
rata (Chiappini y col., 2014). En el presente estudio, encontramos una fosforilación
temprana de Smad3, mediada por la vía no genómica del AhR (AhR/c-Src). De acuerdo con
esto, Galliher y Schiemann (2006) demostraron que c-Src puede fosforilar a TβRII y así
activar los caminos del TGF-β1. Sin embargo, no podemos descartar la posibilidad de que
en el medio de cultivo, existan niveles bajos de la isoforma activa de TGF-β1, que no
fueron detectados a tiempos cortos debido a la baja sensibilidad de la técnica de
inmunoblot, pero que puedan unirse a su receptor TβRII y contribuir, también, a la
activación de las vías de señalización dependiente e independientes de Smad. A pesar de
que se reportó que la TCDD estimula el ingreso de calcio al citosol en células de epitelio
mamario y, subsecuentemente, activa la quinasa c-Src (Dong y Matsumura, 2008), nuestros
resultados mostraron que la exposición al HCB no produjo alteraciones en los niveles de
calcio citosólico en las células MDA-MB-231.
Varias investigaciones evidenciaron la conexión existente entre los caminos de
señalización del AhR y del TGF-β1 (Gómez-Durán y col., 2009; Haarmann-Stemmann y col.,
2009). Dada esta interacción funcional, es razonable asumir que existen mecanismos de
regulación recíproca entre ambas moléculas, y los resultados presentados aquí apoyan
esta idea. El HCB altera la relación entre estas moléculas, aumentando la expresión del
TGF-β1, mientras que reduce los niveles de ARNm del AhR y exacerba la migración e
invasión celular en MDA-MB-231. De acuerdo con esto, Rico-Leo y colaboradores (2013)
probaron que el TGF-β1 promueve la TEM, tanto en células de epitelio mamario que
Capítulo I: Carcinogénesis mamaria
Discusión
94
expresan el AhR, como en células que no lo expresan, aunque el efecto en estas últimas es
más pronunciado. Los mecanismos moleculares que explican el fenotipo migratorio e
invasivo, en los distintos carcinomas, incluyen la inducción de la vía canónica del TGF-β1,
así como de las MAPKs (Shen y col., 2001). En el presente trabajo, demostramos que la
activación de Smad, JNK y p38 es requerida para que el HCB incremente la migración y la
invasión de las células MDA-MB-231; sin embargo, ERK1/2 solo es necesario para la
migración inducida por el tóxico. En nuestro estudio, la fosforilación de JNK, p38 y ERK1/2
luego del tratamiento con HCB, sería una consecuencia de la activación de la vía no
canónica del TGF-β1, tal como describen Parvani y colaboradores (2011). Aunque estas
proteínas podrían, también, ser fosforiladas debido a la activación de otros receptores de
factores de crecimiento, como el HER1 (Wee y Wang, 2017) y el receptor de IGF-I
(Grimberg, 2003).
Es importante resaltar que en nuestros resultados, tanto la expresión del AhR como
del TGF-β1, a nivel del ARNm, fueron diferencialmente alteradas dependiendo de la dosis
de HCB. A bajas dosis (0,05 µM), encontramos una clara modulación de la interacción
AhR/TGF-β1. La exposición al tóxico reduce el contenido de ARNm del AhR de manera
dependiente de las vías del TGF-β1; mientras que aumenta los niveles del TGF-β1,
involucrando la señalización del AhR. Sin embargo, a dosis altas (5 µM), nuestros
resultados sugieren que podría estar involucrado más de un mecanismo de acción.
Primero, la reducción del AhR inducida por el HCB, no solo es bloqueada en presencia del
inhibidor del TGF-β1, sino que sus niveles se ven incrementados por sobre los niveles
basales. Adicionalmente, dado que el HCB es un ligando débil del AhR, era de esperar que,
a la dosis más alta del pesticida, los niveles de TGF-β1 aumentaran de manera similar a la
acción de TCDD; sin embargo, solo se observó una incremento no significativo. Estos
hallazgos requerirán futuras investigaciones para clarificar su mecanismo molecular de
acción.
En este estudio, observamos que el HCB induce alteraciones en la expresión del
TGF-β1. La acción del HCB sobre los niveles proteicos del TGF-β1 ha sido observada a todo
el rango de dosis estudiado, mientras que la modulación del ARNm se produce solo a una
dosis baja (0,05 M), sugiriendo que el HCB desencadena mecanismos de regulación a nivel
transcripcional y traduccional sobre el TGF-β1, que dependen de la concentración del
tóxico. El aumento en los niveles del ARNm del TGF-β1, solo a la dosis de 0,05 µM, es un
hallazgo interesante ya que constituye el primer efecto observado que ocurre a dosis
bajas, que no se presenta a dosis altas. Hasta el momento, todas las acciones observadas
del HCB, sobre las células MDA-MB-231, presentaban una curva del tipo dosis-respuesta
monotónica, donde el efecto va aumentando en función del incremento de la dosis
Capítulo I: Carcinogénesis mamaria
Discusión
95
(Pontillo y col., 2011; 2013). Dado que los resultados de este trabajo reportaron que a la
dosis de 0,05 µM, el tóxico activa el camino de membrana del AhR (c-Src) y no el camino
nuclear, es probable que esta vía sea responsable de la acción del HCB sobre la regulación
transcripcional del TGF-β1. El promotor del gen que codifica para TGF-β1 contiene
elementos de respuesta a SP1 y AP1 (Birchenall-Roberts y col., 1990; Kim y col., 1988), y se
ha demostrado que JNK, p38 y ERK1/2 están involucrados en su regulación transcripcional
(Xiao y col., 2008).
Por otro lado, hemos observado que el HCB aumenta los niveles de ambas
isoformas del TGF-β1 (inactiva y activa), indicando que el tóxico no solo induce su
expresión proteica, sino también su activación. De manera similar, la TCDD promueve la
activación del TGF-β1, así como induce la vías dependiente e independientes de Smad, en
testículo de ratón (Jin y col., 2008). Dalal y colaboradores (1993) reportaron que la
deposición del TGF-β1, tanto intracelular como extracelular, está aumentada en los
tumores mamarios. Debido a que existe una correlación entre los niveles de TGF-β1 y el
estadío de la enfermedad (Tan y col., 2009), los resultados presentados aquí sugieren que
la exposición al HCB podría estar activando mecanismos de señalización involucrados en la
promoción del cáncer de mama. Una manera posible de regular la activación de esta
citoquina consiste en la liberación de MMPs que degradan a LAP, liberando al TGF-β1
activo (Curran y Keely, 2013). Al respecto, demostramos previamente que el HCB (0,05, 0,5
y 5 µM) induce la expresión y activación de la MMP9 en las células MDA-MB-231 (Pontillo
y col., 2013). Además, en ensayos in vitro e in vivo se ha encontrado que el AhR es
necesario para mantener los niveles del TGF-β1 activo (Gómez-Durán y col., 2009). A pesar
del incremento en la activación del TGF-β1, observado a mayores tiempos de exposición (2
a 24 horas), la fosforilación de Smad3 y de las MAPK se dispara rápidamente y vuelve a los
valores basales luego de 30 minutos del tratamiento con HCB. Este fenómeno podría ser
explicado por el desencadenamiento de mecanismos encargados de detener la activación
continua de las vías del TGF-β1. Estos procesos involucran la internalización rápida de los
receptores, que pueden ser luego degradados por un mecanismo dependiente de
ubiquitinación (Di Guglielmo y col., 2003); o la inducción de Smad7, un potente inhibidor
de la señalización del TGF-β1 (Nagarajan y col., 1999).
Por otra parte, los resultados presentados aquí demuestran que la señalización
dependiente de Smad es requerida para la reducción de los niveles de ARNm del AhR,
inducida por el tóxico. El mecanismo de acción que explique nuestros hallazgos podría ser
aquel expuesto por Wolff y colaboradores (2001). Estos autores reportaron que el camino
de TGF-β1/Smad reprime la transcripción del AhR, a través de la interacción del complejo
Smad2-3/Smad4 con elementos de respuesta a TGF-β1 localizados en la región promotora
Capítulo I: Carcinogénesis mamaria
Discusión
96
del AhR, lo que resulta en el reclutamiento de co-represores. A pesar de esta represión
transcripcional del AhR, a la dosis de 0,05 µM de HCB se observaron mayores niveles
proteicos del AhR, sugiriendo que, de algún modo, el pesticida está aumentando los
niveles de la proteína, ya sea por incrementar su síntesis o reducir su degradación.
Hipotetizamos que el contenido proteico del AhR podría estar relacionado con su
localización intracelular. Específicamente, a la dosis de HCB 0,05 µM este receptor es
retenido en el citosol y los niveles del AhR son mayores, mientras que a HCB 5 µM la
proteína se transloca al núcleo y el contenido del AhR es comparable al control. Estos
resultados sugieren que cuando se exponen las células a altas dosis de HCB, el AhR podría
estar siendo degradado luego de ejercer su actividad transcripcional en el núcleo. Al
respecto, Feng y colaboradores (2013) demostraron que el AhR es rápidamente degradado
a través del proteosoma, luego de la activación de la señalización nuclear del AhR. Debido
a que los resultados de nuestros ensayos mostraron que el TGF-β1 no modula los niveles
de la proteína del AhR, a diferencia de lo encontrado en la regulación transcripcional, este
efecto del tóxico parece ser independiente de la vía de señalización del TGF-β1.
Algunos contaminantes ambientales pueden activar, de manera incrementada y
prolongada, diversas vías de señalización asociadas a los receptores de factores de
crecimiento, que contribuyen al desarrollo de cánceres epiteliales (Rho y col., 2010). Se
considera que la exposición a DEs puede agravar la enfermedad para aquellos pacientes
que sufren cáncer y los resultados obtenidos en este trabajo advierten sobre los efectos
adversos del HCB para la salud humana, así como su papel como factor de riesgo en la
carcinogénesis mamaria. En particular, en este estudio demostramos que el HCB altera las
vías de señalización del AhR y del TGF-β1, favoreciendo un fenotipo promigratorio en las
células MDA-MB-231. De manera similar, Reyes-Reyes y colaboradores (2016) reportaron
que el ligando del AhR, benzopireno, reactiva el retrotransposón elemento nuclear largo
intercalado-1 (LINE-1) e induce la TEM a través de la vía canónica del TGF-β1. Asimismo, se
observó que diversos DEs, incluyendo el bifenol A, TCDD, ftalatos y triclosan, inducen la
TEM y la migración celular, lo que podría favorecer la metástasis (Lee y col., 2017).
En resumen, nuestros resultados mostraron que, luego de ingresar a la célula, el
HCB se une al AhR y activa la vía AhR/c-Src, lo que podría desencadenar la fosforilación del
TβRII. De esta manera se estimularían las vías de señalización canónicas (Smad3) y no
canónicas (ERK1/2, p38 y JNK) del TGF-β1, ejerciendo un incremento en la migración e
invasión de las células MDA-MB-231. Adicionalmente, la inducción de la vía canónica del
TGF-β1 por el tóxico reduce la expresión de ARNm del AhR, mientras que mediante un
mecanismo que involucra al AhR, el HCB aumenta la expresión de ARNm del TGF-β1.
Finalmente, la exposición al HCB provoca un aumento en la expresión TGF-β1 en el citosol,
Capítulo I: Carcinogénesis mamaria
Discusión
97
así como en los niveles de proteína activa en el medio extracelular, contribuyendo a un
fenotipo de mayor malignidad.
Figura 21. Mecanismo molecular de acción del HCB en células de cáncer de mama MDA-MB-
231. (A) Efectos a tiempos cortos (5-30 minutos): el HCB se une al complejo AhR-c-Src,
desencadenando la fosforilación de c-Src y la activación de las vías de señalización del TGF-β1,
dependientes e independientes de Smad (Smad3, JNK, p38 y ERK1/2). (B) Efectos a tiempos largos
(2-24 horas): la inducción de estas vías del TGF-β1 desencadena, a tiempos más largos, un
incremento en la migración y la invasión de las células MDA-MB-231. Asimismo, el camino TGF-
β1/Smad, activado por el tóxico, reduce el contenido del ARNm del AhR. Por otro lado, por un
mecanismo dependiente del AhR, el HCB podría estar activando factores de transcripción que
estimulan el aumento de la expresión del TGF-β1, el cual es secretado y acumulado en el medio de
cultivo.
Capítulo II: Glándula mamaria
Resultados 99
RESULTADOS
1. Acción del HCB sobre las células epiteliales mamarias murinas NMuMG
1.1. Análisis de la viabilidad y del ciclo celular
Varios reportes sugieren que el AhR está involucrado en caminos de señalización
críticos para la regulación del ciclo celular (Barhoover y col., 2010; Marlowe y Puga, 2005).
En nuestro laboratorio, hemos demostrado que el HCB altera la viabilidad y la progresión
del ciclo celular de manera diferencial, dependiendo de la dosis empleada. A dosis bajas
(0,005 y 0,05 µM), el HCB induce proliferación en la línea celular de cáncer de mama
humano MCF-7 (REα+), mientras que a dosis altas (0,5 y 5 µM), reduce la viabilidad e
incrementa la muerte por apoptosis, tanto en las células MCF-7, como en células de
tiroides (Chiappini y col., 2013; García y col., 2010; Ventura y col., 2017). En consecuencia,
decidimos estudiar la acción del HCB sobre estos procesos en la línea celular de epitelio
mamario normal de ratón, NMuMG.
Se evaluó la viabilidad celular por medio del ensayo de MTT, que permite
determinar la actividad mitocondrial de las células tratadas. Se expusieron las células al
HCB (0,005; 0,05; 0,5 y 5 µM) o vehículo durante 24 horas y luego se incubaron por 1 hora
con solución de MTT. Nuestros resultados demostraron que el tóxico (0,05; 0,5 y 5 µM)
reduce la viabilidad de las células epiteliales NMuMG (Figura 22A). A continuación,
analizamos los efectos del tratamiento con HCB sobre las etapas del ciclo celular. Luego de
exponer las células al tóxico (0,005; 0,05; 0,5 y 5 µM) durante 12, 24 o 36 horas, se analizó
la proporción de células en cada fase del ciclo, mediante citometría de flujo. Encontramos
que el HCB incrementó el número de células en fase G0/G1 a 0,5 µM luego de 36 horas de
exposición, y a 5 µM a todos los tiempos testeados (Figura 22B-D). Además, el número de
células epiteliales en fase S fue reducido a la dosis de 5 µM cuando se ensayaron 12 horas
de tratamiento (Figura 22B), y a todas las dosis luego de 36 horas (Figura 22D). Estos
resultados sugieren que la exposición al HCB 5 µM induce un arresto de las células
NMuMG en la fase G0/G1, previniendo la entrada a la fase S.
Capítulo II: Glándula mamaria
Resultados 100
Figura 22. Acción del HCB sobre la viabilidad y el ciclo celular en NMuMG. (A) La viabilidad
celular se evaluó por el ensayo de MTT, luego de incubar las células durante 24 horas con HCB
(0,005; 0,05; 0,5 y 5 µM) o vehículo. (B-D) La distribución de las células en cada fase del ciclo celular
se determinó por tinción con IP y citometría de flujo. Para ello, las células fueron tratadas con HCB
(0,005; 0,05; 0,5 y 5 µM) o vehículo durante (B) 12 horas, (C) 24 horas y (D) 36 horas. En todos los
casos, los resultados representan las medias ± SD de al menos tres experimentos independientes.
Los asteriscos indican diferencias significativas respecto al vehículo (*p< 0,05, **p< 0,01 y ***p<
0,001; ANOVA de un factor, prueba de Tukey).
1.2. Efecto sobre la proliferación celular
Dado que el tóxico redujo la viabilidad de las células NMuMG luego de 24 horas de
exposición a un amplio rango de dosis, pero el efecto sobre el arresto del ciclo celular fue
observado solo a la dosis mayor del tóxico (5 µM), decidimos efectuar un control
evaluando la proliferación celular. Para tal fín, se realizó un ensayo de incorporación de
Capítulo II: Glándula mamaria
Resultados 101
BrdU, luego de exponer las células al HCB (0,05 y 5 µM) o vehículo, durante 24 horas.
Observamos que el pesticida redujo el número de células con marca nuclear positiva para
BrdU solo a la dosis de 5 µM (Figura 23). Estos resultados sugieren que el HCB reduce la
proliferación e induce un arresto del ciclo celular, a la dosis más alta ensayada (5 µM);
mientras que, a la dosis de 0,05 µM, reduce la viabilidad pero sin alterar la proliferación ni
la progresión del ciclo celular.
Figura 23: Proliferación de las células NMuMG expuestas al HCB. Se trataron las células con
HCB (0,05 y 5 µM) o vehículo, durante 24 horas, y la proliferación celular se evaluó mediante el
ensayo de incorporación de BrdU. (A) Se muestra una imagen representativa de las células teñidas
con BrdU. (B) El gráfico muestra el porcentaje de células en proliferación, que fue calculado como el
número de núcleos positivos para BrdU en relación al número de núcleos totales teñidos con
Hoechst. Se realizó un experimento donde se evaluaron al menos 1000 células por tratamiento.
1.3. Estudio de la migración de las células NMuMG
Existe evidencia creciente de que el AhR puede estimular la migración celular y la
TEM en varias líneas celulares e in vivo (Goode y col., 2013; Mulero Navarro y col., 2005). En
nuestro laboratorio reportamos previamente que el HCB induce migración celular en
función del aumento de la dosis en las células MDA-MB-231 (Pontillo y col., 2011). Para
Capítulo II: Glándula mamaria
Resultados 102
investigar si el tóxico altera la migración de las células del epitelio mamario normal, las
células NMuMG fueron tratadas con HCB (0,005; 0,05; 0,5 y 5 µM) y se evaluó su capacidad
migratoria por medio del ensayo del cerrado de la herida. Se tomaron fotografías a 0 y 12
horas, y se determinó la tasa de migración. Observamos un efecto de tipo bifásico, ya que
la migración fue aumentada a la dosis de 0,05 µM y reducida a 5 µM, luego de 12 horas de
exposición (Figura 24).
Figura 24: Acción del HCB sobre la migración de las células epiteliales NMuMG. Las células
fueron expuestas al HCB (0,005; 0,05; 0,5 y 5 µM) o vehículo, y se analizó la migración celular por
medio del ensayo del cerrado de la herida. (A) Se muestran fotos representativas de las heridas
realizadas en los pocillos con los diferentes tratamientos, al tiempo inicial y luego de 12 horas del
tratameinto. (B) El gráfico representa las medias de la tasa de migración ± SD de al menos tres
experimentos independientes. Los asteriscos indican diferencias significativas respecto al vehículo
(*p< 0,05 y **p< 0,01; ANOVA de un factor, prueba de Dunnet).
Capítulo II: Glándula mamaria
Resultados 103
1.4. Efecto del HCB sobre la expresión y señalización del AhR en células NMuMG
El AhR juega un rol importante en el desarrollo de la glándula mamaria (Powell y
col., 2013) y se ha observado que su sobreexpresión induce la transformación maligna de
las células epiteliales de mama (Brooks y Eltom, 2011). Por esta razón, decidimos estudiar si
el HCB es capaz de modular los niveles de expresión del AhR en las células epiteliales
mamarias murinas NMuMG. En primer lugar, evaluamos el contenido de ARNm mediante
RT-qPCR, luego de 24 horas de exposición. Para este estudio elegimos la dosis de HCB
0,05 µM, ya que observamos que incrementa la migración de esta línea celular; y la dosis
de HCB 5 µM, que reduce la migración e induce arresto del ciclo celular. Los resultados
evidenciaron un aumento significativo en los niveles de ARNm del AhR cuando las células
fueron tratadas con HCB 5 µM (Figura 25A). Dado que en el Capítulo I de este trabajo de
tesis hemos encontrado que la exposición al pesticida produce resultados opuestos en
cuanto a los niveles de ARNm y de la proteína del AhR en las células MDA-MB-231, a
continuación examinamos los niveles proteicos del AhR por inmunoblot en las células
NMuMG. Luego de 24 horas de tratamiento con HCB (0,005; 0,05; 0,5 y 5 µM), observamos
una reducción de los niveles de proteína del AhR a todas las dosis ensayadas, con un
efecto más pronunciado a las dosis de 0,5 y 5 µM (Figura 25B).
La activación del AhR por la unión del ligando puede desencadenar diferentes tipos
de respuestas. En una vía rádida, ejerce acciones de membrana mediante la activación de
c-Src; y en una vía lenta, el receptor actúa como factor de transcripción. Para examinar si el
HCB puede modular estas vías de señalización, analizamos los niveles de ARNm del
CYP1A1, un gen blanco del AhR, y la fosforilación de c-Src. Las células NMuMG fueron
expuestas al HCB (0,05 y 5 µM) durante 24 horas y los resultados de RT-qPCR mostraron
un incremento en la expresión de ARNm del CYP1A1 solo a la dosis alta (5 µM) (Figura
25C).
Para estudiar la fosforilación de c-Src, realizamos una curva en función del tiempo
(5, 15 y 30 minutos, y 2 horas), exponiendo las células NMuMG a HCB 0,05 µM HCB, dosis
en la cual habíamos encontrado elevada la migración celular. Observamos un aumento de
la fosforilación de c-Src, a partir de los 15 minutos de tratamiento (Figura 25D). A
continuación, estudiamos el efecto del tóxico sobre la activación de la c-Src en función de
la dosis. Luego de 15 minutos de exposición, encontramos que el HCB induce la
fosforilación de c-Src a las dosis de 0,005 y 0,05 µM (Figura 25E). Estos resultados
evidencian que la vía nuclear del AhR es activada solo a la dosis más alta de HCB, mientras
que el camino no genómico o de membrana del AhR es estimulado a dosis bajas.
Capítulo II: Glándula mamaria
Resultados 104
Figura 25: El HCB altera la expresión del AhR y activa sus vías de señalización en las células
NMuMG. Niveles de expresión de (A) ARNm y (B) proteína del AhR. (C) Vía de señalización nuclear
del AhR, evaluada mediante la determinación de los niveles de ARNm del CYP1A1. (D) Vía de
señalización no genómica o de membrana del AhR, determinada como la relación entre los niveles
de c-Src fosforilada y c-Src total. (A, C) Las células fueron expuestas al HCB (0,05 y 5 µM) o vehículo
durante 24 horas, y los niveles de expresión de ARNm del AhR y del CYP1A1 fueron evaluados por
RT-qPCR. La expresión de GADPH se usó como control para normalizar los datos. (B) Las células
fueron tratadas con HCB (0,005; 0,05; 0,5 y 5 µM) o vehículo durante 24 horas, y los niveles de
expresión de proteica del AhR se evaluaron por inmunoblot. Se muestra un experimento
representativo y se grafican los resultados, que fueron normalizados a la expresión de β-Actina y
relativizados al control. (D) Las células se trataron en curvas de tiempo con HCB 0,05 µM durante 5,
15, 30 minutos, y 2 horas, y (E) en curvas de dosis (HCB 0,005; 0,05; 0,5 y 5 µM) durante 15 minutos.
A continuación, los niveles de c-Src fosforilada y de c-Src total fueron evaluados por inmunoblot. Se
muestra el inmunoblot de un experimento representativo y la relación entre la cuantificación de los
niveles de proteína fosforilada y total. En todos los casos, los valores son las medias ± SD de al
menos 3 experimentos independientes. Los asteriscos indican diferencias significativas respecto al
control (*p< 0,05, **p< 0,01 y ***p< 0,001; ANOVA de un factor, prueba de Dunnet).
Capítulo II: Glándula mamaria
Resultados 105
1.5. Análisis de la expresión y señalización del TGF-β1 en células NMuMG expuestas
al HCB
El TGF-β1 se expresa en las células epiteliales a lo largo de todas las fases del
desarrollo mamario y regula procesos celulares como proliferación, diferenciación,
migración, invasión y apoptosis (Johnson y Lapadat, 2002; Moses y Barcellos Hoff, 2011).
Con el objetivo de estudiar la acción del HCB sobre esta vía de señalización, las células
NMuMG se expusieron al HCB (0,05 y 5 µM) durante 24 horas y se evaluaron los niveles de
ARNm del TGF-β1 y sus receptores (TβRI y TβRII) mediante RT-qPCR. Los resultados
revelaron un incremento en los niveles de ARNm del TGF-β1 y del TβRII a la dosis baja de
HCB (0,05 µM), mientras que la expresión de TβRI fue incrementada a 5 µM (Figura 26A).
Seguidamente, estudiamos los niveles de expresión proteica del TGF-β1 en el lisado
total, luego de exponer las células al tóxico (0,005; 0,05; 0,5 y 5 µM) durante 24 horas.
Empleando la técnica de inmunoblot, encontramos que los niveles de la isoforma inactiva
del TGF-β1 (44 kDa) estaban elevados luego del tratamiento con HCB 0,005 y 0,05 µM
(Figura 26B).
Capítulo II: Glándula mamaria
Resultados 106
Figura 26: Acción del HCB sobre la expresión del TGF-β1 y sus receptores. Las células NMuMG
fueron expuestas al HCB (A) 0,05 y 5 µM o (B) 0,005; 0,05; 0,5 y 5 µM, durante 24 horas. (A) Los
niveles de ARNm del TGF-β1, TβRI, TβRII y HER1 se evaluaron por RT-qPCR. La expresión de GADPH
se usó como control para normalizar los datos. (B) Los lisados celulares totales fueron empleados
para analizar la expresión del TGF-β1 (isoforma inactiva de 44 kDa), mediante ensayos de
inmunoblot. Se muestra un experimento representativo y se grafican los resultados, que fueron
normalizados a la expresión de β-Actina y relativizados al control. En todos los casos, los valores
representan las medias ± SD de al menos tres experimentos independientes. Los asteriscos indican
diferencias significativas respecto al vehículo (*p< 0,05 y **p< 0,01; ANOVA de un factor, prueba de
Dunnet).
Capítulo II: Glándula mamaria
Resultados 107
A continuación decidimos examinar si el tóxico podría activar las vías de
señalización del TGF-β1, dependiente e independientes de Smad. Debido a que la
expresión de TGF-β1 se encuentra aumentada a HCB 0,05 µM, se eligió esta dosis para
evaluar la activación de las vías. En primer lugar, evaluamos los niveles de fosforilación de
Smad3 por inmunoblot, luego de exponer las células durante 5, 15 y 30 minutos, y 2 horas.
Se observó un incremento significativo en la fosforilación de Smad3 a partir de los 15
minutos de tratamiento, con un máximo efecto a los 30 minutos (Figura 27A). Luego, nos
propusimos analizar el efecto del HCB a diferentes dosis (0,005; 0,05; 0,5 y 5 µM), luego de
15 minutos de tratamiento, y los resultados revelaron un incremento de los niveles de
Smad3 fosforilado solo a la dosis de 0,05 µM (Figura 27B).
Para estudiar si el HCB podría inducir la activación de las vías del TGF-β1,
independientes de Smad (ERK1/2 y p38), realizamos curvas de tiempo exponiendo a las
células al HCB 0,05 µM durante 5, 15 y 30 minutos, y 2 horas. Observamos un aumento
significativo en la fosforilación de ERK1/2 a los 15 minutos de exposición (Figura 27C); sin
embargo, no encontramos alteraciones en los niveles de activación de p38 (Figura 27D).
La fosforilación de ERK1/2 podría ser consecuencia de la activación del camino no
canónico del TGF-β1 o de otros receptores de factores de crecimiento como el HER1
(Derynck y Zhang, 2003; Parsons y Parsons, 2004). Dado que previamente reportamos que
el HCB incrementa la fosforilación de ERK1/2 mediante la activación del HER1 en las células
MDA-MB-231 (Pontillo y col., 2011), estudiamos los niveles de expresión de ARNm del
HER1 por RT-qPCR. Nuestros resultados mostraron que el HCB 0,05 µM aumenta el
contenido de ARNm del HER1 en las células NMuMG, luego de 24 horas de exposición
(Figura 26A).
Capítulo II: Glándula mamaria
Resultados 108
Figura 27: Alteraciones en las vías de señalización del TGF-β1 por exposición al HCB. Las
células NMuMG fueron tratadas con HCB o vehículo en (A, C-D) curvas de tiempo (HCB 0,05 µM;
durante 5, 15, 30 minutos y 2 horas) y en (B) curva de dosis (HCB 0,005; 0,05; 0,5 y 5 µM; durante 15
minutos). Se analizó la expresión de (A-B) P-Smad3 y Smad3 total, (C) P-ERK1/2 y ERK1/2 total, (D)
P-p38 y p38 total, mediante inmunoblot. La expresión de β-Actina se usó como control de carga. Se
muestra una imagen de un experimento representativo y los gráficos muestran la relación entre la
cuantificación de los niveles de proteína fosforilada y total. Los valores representan las medias ± SD
de 3 experimentos independientes, relativizado al control. Los asteriscos indican diferencias
significativas respecto al control (*p< 0,05, **p< 0,01 y ***p< 0,001; ANOVA de un factor, prueba de
Dunnet).
Capítulo II: Glándula mamaria
Resultados 109
1.6. Participación de las vías del AhR y del TGF-β1 sobre la migración inducida por
HCB
En este estudio hemos reportado que la exposición al HCB 0,05 µM aumenta la
migración y activa el camino de membrana del AhR, así como las vías canónica y no
canónicas del TGF-β1. Por otro lado, el HCB 5 µM reduce la migración y estimula el camino
de señalización nuclear del AhR en las células NMuMG. A continuación, nos propusimos
examinar si estos cambios en la motilidad celular, promovidos por el HCB, dependen de las
vías del AhR y del TGF-β1, como hemos observado en las células MDA-MB-231. Para tal
fín, las células NMuMG fueron pretratadas con inhibidores específicos del AhR (ANF, 1 µM)
y del TβRI (SB431542, 2 µM), y se realizó el ensayo de cerrado de la herida para evaluar la
migración, tras 12 horas de exposición al tóxico (0,05 y 5 µM). Encontramos que la dosis
menor de HCB incrementó la migración celular de manera dependiente del AhR y del
camino canónico del TGF-β1. Por otro lado, la dosis de HCB 5 µM redujo la motilidad de
las células, y este efecto fue prevenido cuando se utilizaron los inhibidores específicos de
ambas proteínas (Figura 28).
Capítulo II: Glándula mamaria
Resultados 110
Figura 28: Rol del AhR y del TGF-β1 en la migración inducida por HCB en las células NMuMG.
Se pretrataron las células con inhibidores del AhR (ANF, 1 µM) y del TβRI (SB431542, 2 µM), durante
1 hora. Posteriormente, las células se expusieron al HCB (0,05 y 5 µM) por 12 horas, en presencia o
ausencia del inhibidor. (A) Se evaluó la migración celular por el ensayo del cerrado de la herida. (B)
Se calculó la tasa de migración y los resultados fueron relativizados al control (ETOH y DMSO). Se
grafica la media ± SD de al menos 3 experimentos. Los asteriscos indican diferencias significativas
respecto al control ETOH y DMSO (*p< 0,05), los signos más indican diferencias significativas
respecto al tratamiento con HCB 0,05 µM y DMSO (++p< 0,01), y las cruces indican diferencias
significativas respecto al tratamiento con HCB 5 µM y DMSO (xxp< 0,01). Los datos fueron
evaluados por ANOVA de un factor, seguido de la prueba de Tukey.
Capítulo II: Glándula mamaria
Resultados 111
2. Cultivos primarios de células epiteliales de glándula mamaria de ratones AhR+/+ y
AhR-/-
2.1. Caracterización del cultivo primario de células epiteliales (EMG)
Debido a que el HCB es un ligando débil del AhR, decidimos estudiar si los efectos
observados sobre la vía de señalización del TGF-β1 requieren de la presencia del receptor.
Como se detalla en Materiales y métodos, se realizaron cultivos primarios de células
epiteliales a partir de glándulas mamarias de ratones hembras vírgenes C57BL/6N AhR+/+
y AhR-/-, de 8-10 semanas de edad. Las células aisladas se denominaron EMG AhR+/+ y
EMG AhR-/- (respectivamente), y fueron fotografiadas bajo la luz de un microscopio
óptico. Como se observa en la Figura 29A-B, encontramos que presentaban la morfología
epitelial típica. Para confirmar su identidad, se evaluó la expresión un marcador de células
epiteliales de mama, queratina-14, y de un marcador de fibroblastos, vimentina, por
inmunofluorescencia. Nuestros resultados mostraron que las células sólo expresaban
queratina-14, confirmando así su identidad de células epiteliales (Figura 29C-J).
Figura 29: Caracterización del cultivo primario de células epiteliales. (A, C, E, G, I) Células EMG
AhR+/+ y (B, D, F, H, J) EMG AhR-/-. (A-B) Las células se fotografiaron bajo un microscopio óptico.
Luego se fijaron y se realizó la marcación por inmunohistoquímica. Se muestra un resultado
representativo de (C-D) los núcleos marcados con DAPI, (E-F) queratina-14 (K-14) y (G-H) vimentina
(Vim). (I-J) Superposición de las imágenes de K-14, Vim y DAPI. Se obtuvieron resultados similares
en todas las determinaciones.
Capítulo II: Glándula mamaria
Resultados 112
2.2. Efecto del HCB sobre el AhR y su vía de señalización en cultivos EMG
A continuación, evaluamos la acción del HCB (0,05 y 5 µM) sobre la expresión de
ARNm del AhR y del CYP1A1, mediante RT-qPCR luego de 24 horas de exposición. En las
células EMG AhR+/+, se observó una disminución significativa en la expresión de ARNm
de AhR luego del tratamiento. Sin embargo, el pesticida incrementó la expresión del
ARNm de CYP1A1 a ambas dosis (Figura 30A). Como esperábamos, en las células EMG
AhR-/-, la expresión de CYP1A1 fue significativamente menor y la exposición al HCB no
produjo alteraciones (Figura 30A).
2.3. Expresión del TGF-β1 y sus receptores en cultivos EMG tratados con HCB
Las células EMG se expusieron al pesticida (0,05 y 5 µM) durante 24 horas y se
evaluaron los niveles de expresión del TGF-β1 y sus receptores (TβRI y TβRII) por RT-qPCR.
Encontramos que, sin exposición al tóxico, las células EMG AhR-/- presentaban niveles de
ARNm del TGF-β1 mayores y del TβRII menores, respecto de las células EMG AhR+/+
(Figura 30B). Cuando las células EMG AhR+/+ se trataron con HCB 0,05 µM, los niveles de
ARNm del TGF-β1 y del TβRI fueron significativamente incrementados. Además, a la dosis
de 5 µM de HCB, la expresión del ARNm de TβRII resultó aumentada (Figura 30B). Debido
a que no observamos alteraciones en los cultivos EMG AhR-/- luego de la exposición al
HCB, podemos concluir que estos efectos son dependientes del AhR (Figura 30B).
2.4. Acción del HCB sobre la expresión de IGF-I y HER1 en cultivos EMG
Previamente observamos que el HCB activa al receptor de IGF-I en las células de
cáncer de mama humano MCF-7 (REα+) (García y col., 2010), así como el HER1 en las
células MDA-MB-231 (REα-) (Pontillo y col., 2011). Teniendo en cuenta que ambas vías de
señalización están implicadas en el desarrollo de la glándula mamaria y en la progresión
del cáncer de mama (Hynes y Watson, 2010), decidimos estudiar si la exposición de
cultivos EMG al HCB podría modificar los niveles de ARNm del IGF-I y del HER1 por RT-
qPCR. Como se muestra en la Figura 30C, el HCB 0,05 µM incrementó el contenido de
ARNm del IGF-I en las células EMG AhR+/+. Por otro lado, se observó un aumento en los
niveles de ARNm del HER1 en las células EMG AhR+/+ tratadas con HCB 5 µM. En cambio,
en las células EMG AhR-/- el tóxico no produjo alteraciones en el contenido de ARNm de
IGF-I ni de HER1 (Figura 30C), demostrando que esta acción inducida por el pesticida
requiere de la presencia del AhR.
Capítulo II: Glándula mamaria
Resultados 113
Figura 30. Efecto del HCB sobre los niveles de ARNm de moléculas de interés, en cultivos
EMG. Se trataron las células EMG AhR+/+ y EMG AhR-/- con HCB (0,05 y 5 µM) durante 24 horas y,
luego, se realizaron ensayos de RT-qPCR para evaluar el contenido de ARNm del (A) AhR y CYP1A1;
(B) TGF-β1, TβRI y TβRII; y (C) IGF-I y HER1. La expresión de GADPH se usó como control para
normalizar los datos. Los resultados representan las medias ± SD de al menos tres experimentos
independientes. Los asteriscos indican diferencias significativas respecto al control (*p< 0,05, p<
0,01 y ***p< 0,001; ANOVA de un factor, prueba de Tukey).
Capítulo II: Glándula mamaria
Resultados 114
3. Efecto del HCB sobre fibroblastos de glándula mamaria (FGM) de ratones AhR +/+
y AhR-/-
3.1. Análisis de la viabilidad, el ciclo celular y la migración
Dado que el estudio de las interacciones entre células epiteliales y fibroblastos es
fundamental para comprender los mecanismos de TEM y de transformación maligna, nos
propusimos examinar las acciones del HCB sobre los fibroblastos FGM AhR+/+ y AhR-/-.
Estas líneas celulares fueron establecidas por Mulero-Navarro y colaboradores (2005), a
partir de la glándula mamaria de ratones C57BL/6N AhR+/+ y AhR-/-, respectivamente. De
manera similar a lo realizado con las células epiteliales NMuMG, se procedió a estudiar el
efecto del HCB sobre distintos procesos, tales como la viabilidad, el ciclo celular y la
migración.
Como se establece en la sección Materiales y métodos, la viabilidad celular se
evaluó mediante el ensayo de MTT, luego de exponer a las células al HCB (0,005; 0,05; 0,5 y
5 µM) durante 24 horas. Nuestros resultados mostraron que el tóxico no produce
alteraciones en la viabilidad celular tanto en FGM AhR+/+ como en FGM AhR-/- (Figura
31A-B). A continuación, se analizó la distribución de las células en cada fase del ciclo por
citometría de flujo, tras 12, 24 y 36 horas de exposición al HCB (0,005; 0,05; 0,5 y 5 µM), sin
encontrarse diferencias significativas (Figura 31C-H).
Finalmente, se determinó la tasa de migración celular mediante el ensayo del
cerrado de la herida, luego de tratar a los fibroblastos durante 9 horas con HCB (0,005;
0,05; 0,5 y 5 µM). Como se observa en la Figura 32, no observamos cambios en la tasa de
migración en ninguna de las líneas de fibroblastos.
Capítulo II: Glándula mamaria
Resultados 115
Figura 31. Acción del HCB sobre la viabilidad y el ciclo celular de los fibroblastos FGM. (A, C, E,
G) Células FGM AhR+/+. (B, D, F, H) Células FGM AhR-/-. (A-B) La viabilidad celular se evaluó por el
ensayo de MTT, luego de incubar las células por 24 horas con HCB (0,005; 0,05; 0,5 y 5 µM) o
vehículo. (C-H) La distribución de las células en cada fase del ciclo celular se determinó por tinción
con IP y citometría de flujo. Para ello, las células fueron tratadas con HCB (0,005; 0,05; 0,5 y 5 µM) o
vehículo durante (C-D) 12 horas, (E-F) 24 horas y (G-H) 36 horas. En todos los casos, los resultados
representan las medias ± SD de al menos tres experimentos independientes. Los datos fueron
evaluados por ANOVA de un factor, seguido de la prueba de Tukey.
Capítulo II: Glándula mamaria
Resultados 116
Figura 32: Migración de los fibroblastos FGM expuestos al HCB. (A y C) FGM AhR+/+. (B y D)
FGM AhR-/-. Las células fueron tratadas con HCB (0,005; 0,05; 0,5 y 5 µM) o vehículo durante 9
horas, y se analizó la migración celular por medio del ensayo del cerrado de la herida. Se muestran
fotos representativas de las heridas practicadas en las monocapas de las células (A) FGM AhR+/+ y
(B) FGM AhR-/-, a los tiempos de 0 y 9 horas. El gráfico representa las medias de la tasa de
migración de (C) FGM AhR+/+ y de (D) FGM AhR-/-. Los resultados representan las medias ± SD de
al menos tres experimentos independientes. Los datos fueron evaluados por ANOVA de un factor,
seguido de la prueba de Dunnet.
Capítulo II: Glándula mamaria
Resultados 117
3.2. Estudio de la expresión y señalización del AhR en fibroblastos expuestos al HCB
Con el objetivo de estudiar la acción del HCB sobre los niveles de expresión del
AhR y su vía de señalización nuclear, los fibroblastos FGM AhR+/+ y AhR-/- fueron
tratados con HCB (0,05 y 5 µM) durante 24 horas, y los niveles del AhR y del CYP1A1 se
evaluaron mediante RT-qPCR. En las células FGM AhR+/+, el tóxico disminuyó el contenido
de ARNm del AhR a la dosis más alta (5 µM). Sin embargo, se observó un aumento
significativo en la expresión de CYP1A1 a esta misma dosis, que fue dependiente del AhR,
ya que no se observó en los fibroblastos FGM AhR-/- (Figura 33A).
3.3. Efecto del HCB sobre la expresión del TGF-β1 y sus receptores en fibroblastos
Seguidamente, se expusieron las células FGM AhR+/+ y FGM AhR-/- al HCB (0,05 y
5 µM), durante 24 horas, y se evaluaron los niveles de ARNm del TGF-β1 y de sus
receptores (TβRI y TβRII) por RT-qPCR. Al estudiar la expresión basal del TGF-β1 en ambas
líneas de fibroblastos, observamos que las células FGM AhR-/- exhibían niveles
significativamente mayores, en comparación con las células FGM AhR+/+. Luego de tratar
a las células, los resultados revelaron que el HCB 0,05 µM fue capaz de reducir los niveles
de TGF-β1 solo en FGM AhR-/-, siendo este un efecto del HCB independiente del AhR
(Figura 33B). No se observaron alteraciones en los niveles de TβRI en ninguna de las líneas
de fibroblastos, a las dosis ensayadas (Figura 33B). Por otra parte encontramos que, en
ausencia del tratamiento, la expresión de TβRII fue menor en los fibroblastos FGM AhR-/-,
respecto a los FGM AhR+/+. Adicionalmente, el HCB 5 µM redujo los niveles de TβRII en
FGM AhR+/+, de un modo dependiente del AhR (Figura 33B).
Capítulo II: Glándula mamaria
Resultados 118
Figura 33. Acción del HCB sobre los niveles de ARNm de moléculas de interés, en fibroblastos.
Se trataron las células con HCB (0,05 y 5 µM) durante 24 horas y, luego, se evaluaron los niveles de
ARNm de (A) AhR y CYP1A1; (B) TGF-β1, TβRI y TβRII; y (C) IGF-I y HER1, mediante RT-qPCR. La
expresión de GADPH se usó como control para normalizar los datos. Los resultados representan las
medias ± SD de tres experimentos independientes. Los asteriscos indican diferencias significativas
respecto a las células FGM AhR+/+ control (*p<0,05; **p< 0,01 y p< 0,001) y las cruces indican
diferencias significativas respecto a las células FGM AhR-/- control (+p< 0,05). Los datos fueron
analizados por ANOVA de un factor, seguido de la prueba de Tukey.
Capítulo II: Glándula mamaria
Resultados 119
3.4. Acción del HCB sobre los niveles de expresión de IGF-I y HER1
Tanto la secreción del IGF-I por parte del estroma, como la activación de la vía de
señalización del HER1 en los fibroblastos, son claves en la morfogénesis mamaria
(Sternlicht, 2006). Por esta razón, analizamos los niveles ARNm del IGF-I y del HER1 en
fibroblastos expuestos al HCB (0,05 y 5 µM), mediante RT-qPCR. Al comparar los
fibroblastos FGM AhR+/+ y AhR-/-, encontramos importantes diferencias en cuanto a la
expresión de ambas proteínas. Aún en ausencia del tratamiento con HCB, las células FGM
AhR-/- presentan niveles mayores del IGF-I, pero menores del HER1 (Figura 33C).
Asimismo, la exposición al tóxico produjo alteraciones. El HCB redujo los niveles del IGF-I
en las células FGM AhR+/+ a ambas dosis ensayadas, y en FGM AhR-/- a la dosis de 5 µM
(Figura 33C), resultando entonces, en un efecto del HCB independiente del AhR. Por otro
lado, observamos que el tóxico, a la dosis 5 µM, induce un incremento en el contenido del
HER1 solo en los FGM AhR+/+, indicando que esta acción ocurre de manera dependiente
de la unión al AhR (Figura 33C).
3.5. Expresión de α-SMA en los fibroblastos tratados con HCB
Los fibroblastos en el estroma tumoral adquieren un fenotipo activado, que se
denominan CAFs, y pueden ser identificados mediante la expresión de α-SMA, el principal
marcador de CAFs actualmente usado (Kalluri y Zeisberg, 2006). Para investigar si el tóxico
es capaz de alterar a los fibroblastos, modificando su fenotipo hacia el de los CAFs, se
analizaron los niveles de expresión de α-SMA por inmunofluorescencia. En condiciones
basales, se observó que las células FGM AhR-/- presentaban niveles de α-SMA
significativamente menores que las FGM AhR+/+ (Figura 34). Luego de 24 horas de
tratamiento con HCB (0,05 y 5 µM), se encontró un aumento significativo en la expresión
de α-SMA en las células FGM AhR+/+ solo a la dosis de 5 µM. Debido a que el tóxico no
produjo alteraciones en los niveles de esta proteína en los FGM AhR-/-, podemos afirmar
que se trata de un efecto dependiente del AhR (Figura 34).
Capítulo II: Glándula mamaria
Resultados 120
Figura 34. Análisis de los niveles de α-SMA en fibroblastos expuestos al HCB. Se trataron las
células FGM AhR+/+ y FGM AhR-/- con HCB (0,05 y 5 µM) durante 24 horas y, luego, se evaluaron
los niveles de expresión de α-SMA por inmunofluorescencia (rojo). Para visualizar los núcleos se
realizó la marcación con DAPI (azul). (A) Se muestra una imagen representativa de la superposición
de las fotos de α-SMA y DAPI. (B) Cuantificación de células positivas para α-SMA, en relación al
control (FGM AhR+/+ tratadas con vehículo). Los resultados representan las medias ± SD de al
menos tres experimentos independientes. Los asteriscos indican diferencias significativas respecto al
control (*p<0,05 y ***p< 0,001; ANOVA de un factor, prueba de Tukey).
Capítulo II: Glándula mamaria
Resultados 121
4. Acción del medio condicionado de fibroblastos expuestos al HCB, sobre las células
epiteliales
4.1. Efecto sobre la viabilidad y el ciclo celular
Ensayos de co-cultivo demuestran que la falta de expresión del TβRII en CAF es
suficiente para aumentar la proliferación y la sobrevida de células de cáncer de mama
(Busch y col., 2015). Dado que el HCB 5 µM aumenta el contenido de α-SMA, mientras que
reduce el contenido de ARNm del TβRII en las células FGM AhR+/+, nos preguntamos si
los diferentes factores secretados por los fibroblastos expuestos al tóxico podrían tener
algún efecto sobre las células epiteliales NMuMG. Para responder a este interrogante, se
recolectó el sobrenadante de las células FGM AhR+/+ y AhR-/- tratadas con HCB (0,05 y 5
µM) o vehículo, y se lo utilizó para cultivar las células NMuMG. Dado que ambos tipos
celulares (NMuMG y FGM) requieren distintos medios de cultivo (RPMI y DMEM-F12,
respectivamente), en una primer instancia estudiamos el impacto del medio condicionado
(MC) de los fibroblastos sobre la viabilidad de las células epiteliales. Mediante el ensayo de
MTT, comparamos la viabilidad de las células NMuMG cuando eran cultivadas en su propio
medio (RPMI) o en el MC proveniente de las células FGM AhR+/+ expuestas al vehículo.
Luego de 24 horas, no observamos alteraciones en la sobrevida celular (resultados no
mostrados).
Seguidamente, se evaluó la viabilidad de las células NMuMG, luego de 24 horas de
tratamiento con el MC de los fibroblastos expuestos al HCB. Los resultados del ensayo de
MTT mostraron una reducción de la sobrevida celular cuando el MC provenía de las células
FGM AhR+/+ expuestas al tóxico (0,05 y 5 µM). De manera similar, el MC de las células
FGM AhR-/- disminuyó la viabilidad de las células NMuMG, pero el tratamiento con HCB
no produjo ningún cambio (Figura 35A).
Finalmente, se analizó la proporción de células en cada fase del ciclo celular por
citometría de flujo, tras exponer las células NMuMG al MC durante 24 horas. Como se
muestra en la Figura 35B, el MC de las células FGM AhR+/+ tratadas con HCB (0,05 y 5
µM) redujo el porcentaje de células NMuMG en la fase G0/G1, mientras que aumentó la
proporción de células en la fase S. Debido a que no observamos cambios en la fase G2/M y
encontramos una reducción en la viabilidad celular, estos resultados podrían indicar que
las células NMuMG fueron arrestadas en la fase S. Cuando se empleó el MC de las células
FGM AhR-/- se obtuvieron resultados similares, evidenciando el arresto en la fase S. Sin
embargo, no se encontraron diferencias entre las NMuMG tratadas con los MC de FGM
AhR-/- control y de aquellas tratadas con MC de FGM AhR-/- expuestas al HCB (Figura
Capítulo II: Glándula mamaria
Resultados 122
35B). Estos hallazgos, sobre los efectos en la viabilidad celular y el ciclo celular, indican que
las acciones del HCB son dependientes del AhR (Figura 35A-B).
4.2. Estudio de la migración celular
Debido a que la presencia de CAFs es evidente en los tumores mamarios más
invasivos (Sappino y col., 1988), nos propusimos examinar si los MC de los fibroblastos
tratados con HCB, eran capaces de alterar la migración de las células NMuMG. Los
resultados del ensayo del cerrado de la herida mostraron un incremento en la migración
de las células NMuMG, crecidas en el MC proveniente de los fibroblastos FGM AhR+/+
expuestos al HCB 5 µM (Figura 35C-D). Sin embargo, no se observaron cambios en la
motilidad celular cuando el MC provenía de las células FGM AhR-/- (Figura 35C-D),
indicando que el HCB requiere de la presencia del AhR en los fibroblastos, para producir
este efecto en las células epiteliales.
4.3. Niveles de expresión del AhR y del TGF-β1
Por último, se estudió si el MC de los fibroblastos expuestos al tóxico podría alterar
los niveles de ARNm del AhR o del TGF-β1 en las células epiteliales. Se realizó el ensayo de
RT-qPCR y encontramos que el MC de FGM AhR+/+ tratados con HCB 0,05 µM redujo los
niveles de expresión de ARNm del AhR, en las células NMuMG. De manera similar, las
células NMuMG expresaban menores niveles de ARNm del AhR cuando el MC provenía de
las células FGM AhR-/-, pero el tratamiento con HCB no produjo alteraciones (Figura 35E).
En cambio, cuando analizamos los niveles de ARNm del TGF-β1, no observamos
alteraciones en ninguna de las condiciones ensayadas (Figura 35F).
Capítulo II: Glándula mamaria
Resultados 123
Figura 35: Efecto del MC de fibroblastos expuestos al HCB, sobre las células epiteliales. Las
células FGM AhR+/+ y FGM AhR-/- fueron tratadas con HCB (0,05 y 5 µM) o vehículo durante 48
horas, en medio de cultivo con SFB 5 %. El sobrenadante fue recolectado y usado en el cultivo de las
células NMuMG. (A) La viabilidad de las células NMuMG fue determinada por el ensayo de MTT,
luego de 24 horas de tratamiento con el MC. (B) El ciclo celular fue evaluado por citometría de flujo,
luego de exponer a las células NMuMG al MC por 24 horas. (C) La migración de las células NMuMG
se estudió por el ensayo del cerrado de la herida luego 12 horas de exposición al MC. Se muestra
un resultado representativo. (D) El gráfico muestra la tasa de migración, respecto al control. (E) Los
niveles de ARNm del AhR y (F) del TGF-β1 fueron determinados por RT-qPCR, luego de 24 horas de
tratamiento con el MC. Todos los gráficos representan las medias ± SD de al menos 3 experimentos
independientes. Los asteriscos indican diferencias significativas respecto al MC de FGM AhR+/+
control (*p<0,05, **p<0,01 y ***p<0,001; ANOVA de un factor, prueba de Tukey).
Capítulo II: Glándula mamaria
Resultados 124
5. Ensayos in vivo: acción del HCB sobre la glándula mamaria de ratones AhR+/+ y
AhR-/-
5.1. Estudio morfológico de la glándula mamaria mediante whole mount
En estudios previos de nuestro laboratorio reportamos que la exposición de ratas
con HCB (100 mg/kg p.c.) incrementa el número de TEBs en la glándula mamaria y genera
lesiones preneoplásicas, tales como hiperplasia ductal e hipercelularidad del estroma (Peña
y col., 2012). Dado que en el presente trabajo de tesis observamos que el tóxico altera
diferentes procesos celulares y caminos de señalización, tanto en células epiteliales como
en fibroblastos, decidimos examinar el rol potencial del HCB de alterar la estructura de la
glándula mamaria. Las edades de los animales fueron seleccionadas de manera que el
tratamiento con HCB se efectuara en la ventana temporal donde, normalmente, se produce
la mayor ramificación de los ductos mamarios (etapa puberal). Con este objetivo, se
intoxicaron ratones hembras vírgenes C57BL/6N AhR+/+ y AhR-/-, de 4 semanas de edad,
con HCB (3 mg/kg p.c., i.p.) o vehículo, 4 veces por semana durante 21 días. El diseño
experimental fue el siguiente: GRUPO 1: ratones AhR+/+ tratados con vehículo, GRUPO 2:
ratones AhR+/+ expuestos al HCB, GRUPO 3: ratones AhR-/- tratados con vehículo y
GRUPO 4: ratones AhR-/- expuestos al HCB.
Luego del tratamiento, la cuarta glándula mamaria del lado izquierdo fue removida,
montada en un vidrio y teñida en su totalidad para evaluar si el HCB produjo cambios
morfológicos. En primera instancia se evaluó el crecimiento ductal, midiendo la distancia
entre el ganglio linfático y el borde de crecimiento de la glándula mamaria, como se
muestra en la Figura 36A, y el resultado se expresó en relación al área de la almohadilla de
grasa. Observamos que la glándula mamaria de los ratones AhR-/- presentaban un
aumento significativo en el crecimiento ductal, respecto a las glándulas mamarias de los
ratones AhR+/+. Sin embargo, el tratamiento con HCB no produjo alteraciones (Figura
36B).
Por otro lado, se estudió la densidad de ramificaciones, analizada como el número
de puntos de ramificación respecto al área total de la almohadilla de grasa; y el número de
TEBs, determinado como el número de estructuras ductales terminales en forma de
lágrima, de un diámetro igual o mayor a 0,03 mm2 (Fenton, 2009) (Figura 36C).
Encontramos que la exposición al HCB incrementó ambos parámetros solo en los ratones
AhR+/+, indicando que esta acción es dependiente del AhR (Figura 36D-E).
Capítulo II: Glándula mamaria
Resultados 125
Figura 36: El HCB induce cambios morfológicos en la glándula mamaria de ratón. Los ratones
AhR+/+ y AhR-/- fueron expuestos al HCB (3 mg/kg p.c.) o vehículo, 4 veces por semana durante 21
días, y la glándula abdominal entera fue montada, teñida y evaluada. (A) Imagen representativa de
la glándula mamaria de un ratón (whole mount). La distancia entre las dos líneas paralelas,
dibujadas en la imagen representa el crecimiento longitudinal de la glándula mamaria (línea de
puntos). Escala 1 mm. (B) En el panel superior se muestra una imagen representativa por grupo. Los
gráficos muestran la cuantificación de la distancia entre el ganglio linfático y el extremo de
crecimiento de la glándula mamaria. (C) Imagen representativa de la glándula mamaria mostrando
un TEB y una ramificación. Escala 0,25 mm. Cuantificación de (D) la densidad de ramificaciones, y (E)
el número de TEBs. Los resultados se expresan como la media ± SD de tres experimentos
independientes (n=5). Los asteriscos indican diferencias significativas respecto al control AhR+/+
(grupo 1) (*p< 0,05; ANOVA de un factor, prueba de Tukey). GL: ganglio linfático; GM: glándula
mamaria.
Capítulo II: Glándula mamaria
Resultados 126
5.2. Análisis histológico de la glándula mamaria
Diversos disruptores endocrinos promueven alteraciones en tejidos dependientes
de estrógenos, como la glándula mamaria. Dado que observamos, en trabajos previos, que
el HCB induce lesiones preneoplásicas en glándula mamaria de rata (Peña y col., 2012), y
estas son consideradas estructuras pre-malignas y precursoras de lesiones neoplásicas
(Singh y col., 2000), nos propusimos evaluar los cambios histológicos que podrían
generarse por la exposición al HCB en glándula mamaria de ratones AhR+/+ y AhR-/-.
En primer lugar, los cortes de las glándulas mamarias se tiñeron con hematoxilina-
eosina y los ductos fueron contados y clasificados en: normal, cuando el ducto presentaba
una o dos capas de células epiteliales; o hiperplásicos, si se observaba un incremento en el
número de capas de células. Nuestros resultados mostraron que el tratamiento con HCB
aumenta el número de ductos hiperplásicos en los ratones AhR+/+. En los ratones AhR-/-
observamos un incremento similar en el número de ductos hiperplásicos, sin embargo el
pesticida no produjo cambios (Figura 37A, C). Estos estudios indican que el AhR está
involucrado en el incremento de la hiperplasia ductal inducido por el tóxico. Para examinar
si la inducción de hiperplasia se debe a una mayor proliferación celular, se analizó la
expresión de PCNA, una proteína implicada en la replicación del ADN, por
inmunohistoquímica. Efectivamente, observamos un aumento de núcleos positivos para
PCNA en las células epiteliales de los ductos mamarios de los ratones AhR+/+ expuestos al
HCB, así como en los ratones AhR-/- controles y tratados (Figura 37B, D).
Daniel y colaboradores (1995) han reportado que tanto las células epiteliales de los
ductos como de los TEBs expresan E-cadherina, pero solo las células de los TEBs expresan
P-cadherina. Para poder identificar si las estructuras observadas en la Figura 37A son
efectivamente ductos hiperplásicos o TEBs, se realizó una marcación con E-cadherina y P-
cadherina por inmunohistoquímica. Los resultados mostraron que dichas estructuras
expresaban E-cadherina, pero no P-cadherina, confirmando que se trataban de ductos
hiperplásicos (Figura 38A-D). Como control positivo se analizó un corte que contenía
TEBs y, como se muestra en la Figura 38E-F, se observó que expresaban ambas proteínas,
E-cadherina y P-cadherina.
Capítulo II: Glándula mamaria
Resultados 127
Figura 37: El HCB induce hiperplasia ductal y proliferación de las células epiteliales. Los
ratones AhR+/+ y AhR-/- fueron expuestos al HCB (3 mg/kg p.c.) o vehículo, 4 veces por semana
durante 21 días. La glándula mamaria abdominal fue fijada, incluida en parafina y cortada en
secciones de 5 µm. (A) Para evaluar alteraciones histológicas, algunas de las secciones se tiñeron
con hematoxilina-eosina. (B) Los niveles de PCNA se evaluaron mediante ensayos de
inmunohistoquímica. La detección de la señal se llevó a cabo revelando con DAB, y se realizó la
contratinción con hematoxilina. Se muestra una imagen representativa y en los gráficos se presenta
(C) el porcentaje de ductos normales e hiperplásicos, y (D) la cuantificación del número de núcleos
positivos para PCNA, respecto al control AhR+/+. Los resultados se expresan como la media ± SD
de tres experimentos independientes (n=5). Los asteriscos indican diferencias significativas contra el
control AhR+/+ (*p<0,05 y **p<0,01; ANOVA de un factor, prueba de Tukey).
Capítulo II: Glándula mamaria
Resultados 128
Figura 38: Expresión de E-cadherina y P-cadherina en ductos mamarios y TEBs. Los ratones
AhR+/+ y AhR-/- fueron expuestos al HCB (3 mg/kg p.c.) o vehículo, 4 veces por semana durante 21
días. La glándula mamaria abdominal fue fijada, incluida en parafina y cortada en secciones de 5
µm. Las secciones se emplearon para ensayos de inmunohistoquímica. La detección de la señal se
llevó a cabo revelando con DAB, y se realizó la contratinción con hematoxilina. Se muestra una
imagen representativa de de ductos mamarios de ratones AhR+/+ expuestos al HCB, teñidos con (A
y C) E-cadherina y (B y D) P-cadherina; y de un TEB teñido con (E) E-cadherina y (F) P-cadherina. (G)
Se muestra un control negativo. (A, B, E, F y G) Magnificación 40x. (C y D) Magnificación 100x. Se
analizaron 3 cortes por animal de tres experimentos independientes (n=5).
5.3. Expresión y localización del REα y del RP
Dado que el RP y el REα juegan un papel clave en el desarrollo y función de la
glándula mamaria (Sternlicht, 2006), para complementar nuestros estudios, evaluamos sus
Capítulo II: Glándula mamaria
Resultados 129
niveles de expresión y localización por inmunohistoquímica. Debido a que observamos que
las mayores diferencias en las marcas con los anticuerpos se presentaban en los núcleos
celulares y no en los citosoles, decidimos cuantificar solamente núcleos. Los resultados
revelaron un aumento en el número de núcleos marcados con anticuerpo anti-REα en los
ductos de los ratones AhR+/+ expuestos al HCB y de los ratones AhR-/- control (Figura
39A, C). Sin embargo, ni la localización ni la expresión del RP fueron alteradas (Figura 39B,
D).
Figura 39: Efecto del HCB sobre los niveles del REα y del RP en ensayos in vivo. Los ratones
AhR+/+ y AhR-/- fueron expuestos a HCB (3 mg/kg p.c.) o vehículo, 4 veces por semana durante 21
días. Secciones de la glándula mamaria abdominal se emplearon para ensayos de
inmunohistoquímica, empleando anticuerpos contra A) REα y B) RP. La detección de la señal se llevó
a cabo revelando con DAB, y se realizó la contratinción con hematoxilina. Se muestra una imagen
representativa y la cuantificación del número de núcleos positivos, respecto al control AhR+/+. Los
resultados se expresan como la media ± SD de tres experimentos independientes (n=5). Los
asteriscos indican diferencias significativas contra el control AhR+/+ (*p<0,05; ANOVA de un factor,
prueba de Tukey).
Capítulo II: Glándula mamaria
Resultados 130
6. Niveles citosólicos de calcio en las células epiteliales mamarias humanas MCF-10A
Con el objetivo de estudiar el efecto del HCB sobre los niveles intracelulares de
calcio en las células epiteliales de glándula mamaria normal, se trabajó con la línea celular
MCF-10A. Elegimos trabajar con estas células, ya que habían sido previamente utilizadas
por Dong y Matsumura (2008), quienes observaron que la TCDD desencadena acciones
que dependían de los niveles intracelulares de calcio.
El ensayo se realizó por medio de la determinación de la fluorescencia del
compuesto quelante de calcio Fura 2-AM, obteniendo la relación entre la fluorescencia
emitida cuando se incide con luz a 340 y 380 nm (F340/F380), como se indica en
Materiales y métodos. Se midió la fluorescencia a 505 nm, cada segundo durante 350
segundos, mediante la exposición alternada de luz a 340 y 380 nm. Luego de 30 segundos,
se inyectó el HCB (0,05 y 5 µM) o vehículo y, a los 240 segundos, se inyectó Tritón X-100 5
% para lisar las células y cuantificar todo el calcio presente en el medio. Los resultados no
mostraron alteraciones en los niveles de calcio citosólicos por efecto del HCB. Sin
embargo, el agregado de Tritón X-100 generó un aumento en la relación F340/F380
(Figura 40), indicando que estos resultados no son consecuencia de una falla en la técnica.
Figura 40. Efecto del HCB sobre los niveles citosólicos de calcio en células epiteliales de
glándula mamaria. Las células MCF-10A fueron sembradas en placas de 96 pocillos y, luego de 24
horas, se evaluaron los niveles de calcio citosólico empleando el indicador fluorescente Fura 2-AM.
Se realizó una exposición alternada de luz a 340 nm (Fura 2-AM libre) y 380 nm (Fura 2-AM unido al
calcio) y se midió la fluorescencia a 505 nm. Luego de 30 segundos se inyectó el ligando: HCB (0,05
y 5 µM) o vehículo (ETOH). Al pasar 240 segundos se inyectó Tritón X-100 5 %. Tiempo total del
ensayo: 350 segundos. El gráfico muestra el promedio de la relación entre las intensidades de luz
(F340/F380) de un experimento representativo (3 réplicas por experimento). Se obtuvieron
resultados similares en 3 experimentos independientes.
Capítulo II: Glándula mamaria
Discusión 131
DISCUSIÓN
La incidencia de cáncer de mama está aumentando en muchos países (Bergman y
col., 2012), y esta evidencia refuerza la plausibilidad biológica de que contaminantes
ambientales, como los pesticidas organoclorados, podrían contribuir también al riesgo de
padecer esta enfermedad. La segunda parte del presente trabajo de tesis apoya esta
hipótesis, dado que concentraciones ambientalmente relevantes de HCB (Bravo y col.,
2017; Guo y col., 2014; Saoudi y col., 2014), produjeron alteraciones en las células
mamarias normales, así como en la glándula mamaria de ratón. La Figura 41 resume los
resultados obtenidos en los ensayos in vivo y propone algunos mecanismos de acción por
los cuales el HCB podría inducir dichas alteraciones morfológicas en la glándula mamaria.
Curiosamente, los cambios inducidos por el tóxico a través del AhR, en la morfogénesis y
en la ramificación ductal de la mama, encuentran su correlación con otros reportes que
muestran la implicancia del AhR en el desarrollo de la glándula mamaria y la lactogénesis.
Lew y colaboradores (2011) mostraron que la activación del AhR por TCDD, tanto en el
parénquima epitelial como en el estroma, es requerida para que este tóxico impida el
desarrollo mamario asociado al embarazo y la lactogénesis. Las alteraciones observadas
aquí incluyen un incremento en la densidad de ramificaciones y en el número de TEBs,
ambos parámetros empleados como una medida de la progresión del desarrollo mamario
(Fenton, 2009). La prevalencia de un el elevado número de TEBs muestra que se estaría
retrasando la diferenciación de estas estructuras, por lo que nuestros resultados podrían
ser interpretados como un enlentecimiento en el desarrollo. De acuerdo con esto, otros
autores encontraron que la exposición perinatal a bisfenol A y a DES impide la
diferenciación de la glándula mamaria (Kass y col., 2012). Asimismo, Fenton y
colaboradores (2002) reportaron que las ratas expuestas a TCDD retienen estructuras
terminales indiferenciadas en sus glándulas mamarias, como los TEBs. El incremento de
estas estructuras indiferenciadas y altamente proliferativas podría aumentar el riesgo de
cáncer de mama, ya que son muy sensibles al efecto de carcinógenos y otros químicos
(Macon y Fenton, 2013).
De acuerdo con un reporte que indica que la señalización del REα en necesaria para
que ocurra la ramificación ductal durante el período adolescente (Curtis Hewitt y col.,
2000), en esta investigación encontramos un incremento en la localización nuclear del REα
en los ratones AhR+/+ expuestos al HCB (Figura 41A). En coincidencia con estos
hallazgos, previamente observamos que el HCB induce la fosforilación del REα, vía c-Src, y
Capítulo II: Glándula mamaria
Discusión 132
en consecuencia, estimula la proliferación de las células de cáncer de mama MCF-7 (García
y col., 2010). La activación del REα en las células epiteliales promueve la señalización de
HER1 en el estroma y, en consecuencia, se induce la ramificación ductal a través de la
estimulación de MMPs, así como la proliferación de las células epiteliales (Sternlicht, 2006).
Nuestros resultados han mostrado que el HCB genera un aumento en la expresión de
HER1 en los fibroblastos FGM AhR+/+, lo cual podría relacionarse con el incremento en el
número de TEBs y en la densidad de ramificaciones, observado en los ratones AhR+/+
expuestos al tóxico (Figura 41A). En este sentido, se ha reportado que el estroma juega un
papel muy importante en el retraso del desarrollo de la glándula mamaria producido por la
exposición a TCDD (Fenton y col., 2002).
Otros autores encontraron que el TGF-β1 inhibe la síntesis de ADN en los TEBs,
resultando en una reducción del crecimiento ductal (Sun y Ingman, 2014). A pesar de que
las células EMG AhR-/- mostraron niveles incrementados de ARNm del TGF-β1, los ratones
AhR-/- presentaban un mayor crecimiento ductal, en comparación a los ratones AhR+/+.
Esta discrepancia puede ser explicada por la ausencia del AhR, lo cual resulta en la
modificación de otras moléculas claves en el desarrollo mamario, como son el IGF-I y el
REα. Los altos niveles de IGF-I en los FGM AhR-/- podrían conducir a un aumento en la
proliferación y la sobrevida, dado que este factor de crecimiento puede estimular al
receptor de IGF-I presente en las células epiteliales, como describió previamente Sternlicht
(2006). Este comportamiento podría, finalmente, inducir el crecimiento ductal y la
hiperplasia, explicando el fenotipo observado en los ratones AhR-/-. Además, la
translocación del REα al núcleo también podría contribuir a este fenotipo (Figura 41B).
En investigaciones previas demostramos que el HCB ejerce una acción co-
carcinogénica en tumores mamarios de rata (Randi y col., 2006), y Charlier y Dejardin
(2007) encontraron una fuerte asociación entre la incidencia de recidivas en cáncer de
mama en mujeres y altos concentraciones séricas de HCB. En este estudio mostramos que
el HCB induce proliferación celular e hiperplasia ductal en la glándula mamaria de los
ratones AhR+/+. Resultados similares fueron observados previamente en ratas, donde el
tratamiento con HCB produjo la aparición de lesiones preneoplásicas en la mama (Peña y
col., 2012). Como los ratones usados para los cultivos primarios (células EMG) tenían la
misma edad que aquellos utilizados en los ensayos in vivo, la hiperplasia observada podría
estar relacionada a la reducción de los niveles del AhR encontrada en las células EMG
AhR+/+ tratadas con HCB (Figura 41A). De manera similar, los ratones AhR-/- también
presentaron hiperplasia ductal, apoyando la idea de que el AhR juega un papel
fundamental como inhibidor de la proliferación en la glándula mamaria normal. Por otro
lado, estos resultados observados en los ratones AhR-/- podrían explicarse, además, por el
Capítulo II: Glándula mamaria
Discusión 133
aumento en los niveles de ARNm del TGF-β1, junto a la reducción en la expresión del TβRII,
encontrado en las células EMG AhR-/- control (Figura 41B). Al respecto, Gorska y
colaboradores (1998) reportaron que ratones transgénicos, cuyas células epiteliales
mamarias expresaban una forma dominante negativa del TβRII, exhibían mayor hiperplasia.
Asimismo, niveles elevados del TGF-β1 pero bajos del TβRII, en tumores mamarios
humanos, correlacionan con peor prognosis, sugiriendo que las células tumorales están
perdiendo la sensibilidad a los efectos antimitóticos del TGF-β1 (Chen y col., 2015).
Figura 41: Modelo de acción del HCB en la glándula mamaria de ratones. (A) Ratones AhR+/+
tratados con HCB: De manera dependiente del AhR, el tóxico induce la proliferación de las células
epiteliales, generando hiperplasia ductal, y aumenta el número de TEBs y de ramificaciones. Estos
resultados podrían explicarse por la activación del REα en las células epiteliales, lo que conduciría a
la activación de la vía del HER1 en los fibroblastos y, finalmente, estimularía la proliferación de las
células epiteliales. Por otro lado, el HCB reduce la expresión del AhR en las células epiteliales EMG
AhR+/+, lo que aclararía por qué el AhR no alcanza a inhibir la proliferación celular. (B) Ratones
AhR-/-: En ausencia del AhR, un potente inhibidor de la proliferación, los ductos mamarios de los
ratones, intoxicados o no con HCB, exhiben una mayor proliferación, hiperplasia y crecimiento
longitudinal. Estos hallazgos podrían justificarse por el incremento de los niveles nucleares del REα
en las células epiteliales. Asimismo, los FGM AhR-/- mostraron niveles aumentados del IGF-I, lo que
podría estimular la proliferación de las células epiteliales y el crecimiento ductal. A pesar de que
estos fibroblastos exhiben un mayor contenido de TGF-β1, conocido por inhibir la proliferación, las
células EMG AhR-/- presentaron menores niveles de TβRII, lo que puede conducir a la falta de
sensibilidad de las mismas a responder a la señalización del TGF-β1. Las flechas continuas muestran
los resultados obtenidos en este trabajo de tesis. Las flechas discontinuas representan los
mecanismos propuestos, luego de revisar la literatura.
Capítulo II: Glándula mamaria
Discusión 134
De manera similar a lo que ocurre en cáncer de mama, en las células NMuMG el
HCB altera la expresión del AhR en forma diferencial, aumentando los niveles de ARNm a
la dosis de 5 µM, pero reduciendo el contenido proteico. Sin embargo, a pesar de que
disminuyan los niveles de proteína del receptor, podemos reconocer que se está activando,
ya que se observa un aumento significativo en los niveles de ARNm del CYP1A1. Este
hallazgo ha sido observado previamente por otros grupos, quienes demostraron que
diferentes ligandos del AhR pueden mediar la activación del camino nuclear, modulando la
expresión de sus genes blanco, aún en presencia de modestos niveles del AhR (Ma y
Baldwin, 2000; Murray y col., 2014; Staršíchová y col., 2012). Nuestros resultados podrían
indicar que, luego de ser estimulada su actividad transcripcional, el AhR se estaría
degradando por la vía del proteosoma (Feng y col., 2013) y, en consecuencia, se
desencadenaría su transcripción de manera de compensar los niveles de AhR en la célula.
Por otro lado, es ampliamente aceptado que la modulación del AhR, tanto a nivel del
ARNm como de la proteína, depende del tejido en cuestión y es específica de cada línea
celular (Safe y col., 2013). En este sentido encontramos que, a pesar de que el HCB
aumenta los niveles de ARNm del AhR en las células NMuMG, los reduce en las células
EMG AhR+/+. Lo remarcable es que, en ambos casos, la exposición al pesticida resulta en
la activación de la vía nuclear del AhR.
Nuestro interés en estudiar la función del AhR en la proliferación, el control del
ciclo celular y la migración, radica en el hecho de que estos procesos se descontrolan
durante el desarrollo tumoral. Luego de analizar los resultados in vitro, obtenidos en el
capítulo 2 de este trabajo de tesis, planteamos un mecanismo de acción que explica como
el HCB podría alterar estos procesos, en las células epiteliales y los fibroblastos de la
glándula mamaria (Figura 42). Se ha observado que el desarrollo, el mantenimiento, la
quimioresistencia y la autoregeneración de las células madre, en el cáncer de mama
humano, involucran la activación del camino nuclear del AhR (Al-Dhfyan y col., 2017). En
este estudio demostramos que el HCB reduce levemente la viabilidad de las células
NMuMG. Además, a la dosis mayor (5 µM), el tóxico activa el camino nuclear del AhR e
induce un arresto del ciclo celular en las fases G0/G1, impidiendo que las células ingresen
en la fase S (Figura 42A). Existe amplia evidencia de que, en presencia de ligandos
exógenos, el AhR inhibe la proliferación ya que genera un arresto del ciclo celular en
diferentes poblaciones de células ciclando normalmente (Puga y col., 2009). En particular,
Barhoover y colaboradores (2010) encontraron que, en células de cáncer de mama
humano expuestas a TCDD, el arresto se producía en la fase G1. De acuerdo con los
resultados reportados en este estudio, previamente observamos que el HCB (5 µM)
favorece la formación de un complejo entre la ciclina E, la CDK2 y el inhibidor p27,
retrasando la progresión del ciclo celular (Ventura y col., 2017), e induce apoptosis en la
Capítulo II: Glándula mamaria
Discusión 135
línea de cáncer de mama humano MCF-7 (García y col., 2010). Asimismo, el HCB reduce la
viabilidad e induce la muerte celular por apoptosis en células de tiroides (Chiappini y col.,
2013), mientras que el bisfenol A disminuye la sobrevida en células epiteliales mamarias
(Lee y Rhee, 2007). Además, la reducción en la migración de las células NMuMG, observada
en el presente trabajo a la dosis de 5 µM, podría estar relacionado con la citotoxicidad y el
arresto celular inducido por HCB. En contraste a lo encontrado en las células epiteliales, el
pesticida no alteró la viabilidad, el ciclo celular ni la migración en los fibroblastos,
indicando que estas células son menos sensibles a la exposición del tóxico.
Previamente demostramos que el HCB induce la migración de las células MDA-MB-
231, en función del aumento de la dosis (Pontillo y col., 2011). Sin embargo, en este
estudio encontramos que la tasa de migración de las células NMuMG fue aumentada
solamente a la dosis 0,05 µM, y reducida a la dosis de 5 µM. Este efecto bifásico es
característico de los disruptores endocrinos y ya ha sido observado en nuestro laboratorio,
en estudios realizados con las células MCF-7 tanto cuando fueron expuestas al HCB (García
y col., 2010) o al clorpirifos (Ventura y col., 2012). Como se demostró en los ensayos de
migración en presencia de los inhibidores del AhR y del TGF-β1, la acción del HCB sobre la
motilidad de las células NMuMG puede ser explicada por la modulación de la interacción
entre ambas vías (Figura 42A). El HCB 5 µM activa la vía nuclear del AhR, y Rico-Leo y
colaboradores (2013) reportaron que células NMuMG, que expresan un AhR
constitutivamente activo, exhiben una migración reducida. Por otro lado, los mismos
autores demostraron que el TGF-β1 exacerba la migración de las células NMuMG, y aquí
encontramos que el HCB 0,05 µM incrementa los niveles del TGF-β1 y activa su vía de
señalización. Bakiri y colaboradores (2015) observaron que la modulación de la expresión
del TGF-β1 conduce a que las células epiteliales mamarias adquieran un fenotipo
mesenquimático, invasivo y tumorigénico. Además, la activación de Smad3 y ERK1/2,
ejercida por el HCB a esta misma dosis, podría contribuir a la migración celular, tal como
otros autores han reportado (Dzwonek y col., 2009; Joslin y col., 2007). La inducción de la
vía de señalización del TGF-β1 podría deberse a la activación del camino no genómico del
AhR, mediado por c-Src, tal como reportamos en el Capítulo I de esta tesis para las células
MDA-MB-231. El hecho de que la estimulación de la migración inducida por el HCB en las
células NMuMG, no solo depende de la vía del TGF-β1, sino también del AhR, apoya esta
hipótesis.
Por otro lado, otros autores reportaron que varios ligandos del AhR pueden
estimular el ingreso de calcio a la célula (Archuleta y col., 1993; Puga y col., 1992;
Tannheimer y col., 1997), lo que conduciría a un aumento en la proliferación, migración,
metástasis y angiogénesis (Déliot y Constantin, 2015). En particular, en las células de
Capítulo II: Glándula mamaria
Discusión 136
epitelio mamario humano MCF-10A, la TCDD induce la activación de la vía de membrana
del AhR, mediada por c-Src, de manera dependiente de la internalización de calcio y la
fosfolipasa A2 (Dong y Matsumura, 2008). Sin embargo, empleando la misma línea celular
no encontramos alteraciones en los niveles citosólicos de calcio, luego del tratamiento con
HCB.
Es de aceptación general que el diálogo entre el epitelio y el estroma es crítico para
el desarrollo de la glándula mamaria (Sternlicht, 2006). Un gran número de estudios se
focalizan en los efectos de los ligandos del AhR sobre las células epiteliales mamarias, pero
su acción en los fibroblastos aún no es completamente entendida. En este trabajo
observamos que la exposición al HCB 5 µM puede alterar las características de los
fibroblastos, haciéndolos semejantes a los fibroblastos encontrados en el estroma asociado
al tumor mamario, o CAF. Mediante un proceso que involucra al AhR, el tóxico incrementa
el número de células positivas para α-SMA, mientras que reduce los niveles de ARNm del
TβRII en los fibroblastos. La presencia de CAFs, los cuales expresan α-SMA, es evidente en
el estroma de la mayoría de los tumores de mama invasivos (Sappino y col., 1998). De
acuerdo con este comportamiento, en el presente estudio encontramos que el MC de
estos fibroblastos FGM AhR+/+ expuestos al HCB 5 µM, promueve la migración de las
células epiteliales NMuMG (Figura 42B). En contraste, las células FGM AhR-/- mostraron
niveles reducidos de α-SMA y su MC no produjo alteraciones en la migración de las células
NMuMG.
Por otro lado, ensayos de co-cultivo han mostrado que los CAFs que no expresan
TβRII pueden estimular la proliferación y la sobrevida de las células de cáncer de mama
(Busch y col., 2015), pero reducen el crecimiento de las células epiteliales mamarias
normales MCF-10A (Sadlonova y col., 2005). En el presente trabajo de tesis reportamos una
reducción en la viabilidad de las células NMuMG creciendo en el MC de los FGM AhR+/+
expuestos al HCB. Además, este MC redujo el porcentaje de células NMuMG en la fase
G0/G1 y lo incrementó en la fase S. Dado que no se produjeron cambios en la fase G2/M y
una reducción de la viabilidad fue reportada, podría suponerse que las NMuMG se
encuentran arrestadas en la fase S (Figura 42B). Este tipo de arresto fue previamente
reportado en un estudio que realizamos con Ventura y colaboradores (2012), donde
mostramos que el pesticida clorpirifos, un agonista débil del AhR, induce arresto del ciclo
celular en la fase S en las células MCF-7. Debido a que nuestros resultados in vivo
mostraron un incremento en la proliferación de las células epiteliales, generando ductos
hiperplásicos, hipotetizamos que la acción de los CAFs sobre las células epiteliales
depende de la existencia o no del contacto célula-célula. Por otro lado, el MC de los FGM
AhR-/- expuestos o no al HCB, redujo la viabilidad de las células NMuMG e indujo un
Capítulo II: Glándula mamaria
Discusión 137
arresto en la fase S, que podría estar relacionado con el incremento en los niveles de TGF-
β1 reportado en las células FGM AhR-/-. En este sentido, se ha demostrado que la
señalización del TGF-β1 desempeña un papel muy importante como un potente inhibidor
de la proliferación (Macias y Hinck, 2012). Incluso se ha encontrado que el medio
condicionado de los FGM AhR-/- reduce la proliferación de las células epiteliales de
pulmón Mv1Lu, debido a su elevado contenido de TGF-β1 (Gómez-Durán y col., 2009).
Figura 42: Modelo del mecanismo de acción del HCB in vitro. (A) Efecto directo del HCB sobre
las células epiteliales NMuMG: A una dosis baja (0,05 µM), el tóxico activa la vía de membrana del
AhR, mediada por la c-Src, así como las vías del TGF-β1, estimulando la fosforilación de Smad3 y de
ERK1/2. Esto conduce, finalmente, a un aumento en la migración celular. En cambio, a una dosis alta
(5 µM), el HCB activa el camino nuclear del AhR, evaluado mediante la determinación de los niveles
de CYP1A1. Además, reduce la migración celular e induce el arresto del ciclo celular. (B) Acción de
los factores secretados por los fibroblastos expuestos al HCB, sobre las células epiteliales: De
manera dependiente del AhR, el HCB 5 µM reduce los niveles de TβRII y transforma las células FGM
AhR+/+ en CAFs, evaluado por el aumento de α-SMA. En consecuencia, estos fibroblastos liberan
factores solubles que actúan sobre las células NMuMG, induciendo la migración y el arresto del
ciclo celular.
Conclusiones y Perspectivas 139
CONCLUSIONES Y PERSPECTIVAS
El cáncer de mama es la neoplasia más común en las mujeres a nivel mundial y, en
Argentina, es la principal causa de muerte por cáncer en mujeres. Estudios previos
realizados por nuestro laboratorio, en animales de experimentación, revelaron que el HCB
se comporta como un DE, ejerciendo efectos estrogénicos en la glándula mamaria, y actúa
como un co-carcinógeno, favoreciendo la formación y el crecimiento de tumores inducidos
químicamente. Asimismo, induce la migración e invasión celular in vitro, lo que se
correlaciona con un aumento de metástasis in vivo. En este trabajo de tesis estudiamos el
efecto del HCB sobre la glándula mamaria normal, así como en carcinogénesis mamaria,
evaluando si las vías de señalización del TGF-β1 y del AhR podrían estar involucradas en el
mecanismo de acción del tóxico.
Los resultados demuestran que concentraciones de HCB relevantes
ambientalmente, alteran en forma diferencial las células epiteliales y los fibroblastos de la
glándula mamaria, desencadenando un incremento en la proliferación de las células
epiteliales que conforman los ductos mamarios y, en consecuencia, generando hiperplasia
ductal. Debido a que varias de las moléculas involucradas en el desarrollo normal de la
mama están implicadas, también, en el desarrollo tumoral (Lanigan y col., 2007), otra
posible implicancia de este estudio es su potencial conexión con el cáncer de mama. Los
resultados de los ensayos in vivo demostraron que el HCB altera la morfogénesis mamaria
normal, a través de un mecanismo que requiere la presencia del AhR. En particular, se
observó un incremento en la densidad de ramificaciones ductales y en el número de TEBs,
lo que podría indicar que se está retrasando el desarrollo. Nuevamente, la prevalencia de
estructuras indiferenciadas y altamente proliferativas, como los TEBs, podrían incrementar
el riesgo de cáncer de mama (Macon y Fenton, 2013).
Previamente demostramos que el HCB favorece la promoción tumoral mamaria y,
los resultados presentados aquí, ayudan a caracterizar los mecanismos moleculares
subyacentes a los efectos del HCB en la progresión del cáncer de mama. Es claro que el
HCB altera las vías de señalización del AhR y del TGF-β1, lo que resulta en la inducción de
distintos efectores, dependiendo del tipo celular y de la dosis de exposición. En las células
de cáncer de mama humano MDA-MB-231, la modulación de estas vías conduce a la
activación de los caminos de señalización del TGF-β1 a todas las dosis ensayadas,
exacerbando un fenotipo migratorio e invasivo. Estos resultados sugieren que las
Conclusiones y Perspectivas 140
alteraciones en la interacción entre estas proteínas, podrían tener graves implicancias en la
progresión del cáncer de mama.
De forma alarmante, concentraciones de HCB menores a las encontradas en
poblaciones humanas contaminadas, pueden contribuir a una migración anormal de las
células epiteliales mamarias, afectando potencialmente la acción tumorigénica de este
tóxico. De manera similar a lo reportado en las células MDA-MB-231, en las células
epiteliales murinas NMuMG se indujo la migración celular cuando el HCB activó las vías del
TGF-β1, pero esto efecto solo fue observado a dosis bajas (0,05 µM). En cambio, a dosis
altas (5 µM), el tóxico estimula la vía nuclear del AhR y, en consecuencia, no solo se reduce
la motilidad celular, sino que induce un arresto del ciclo celular. Por otro lado, los
fibroblastos expuestos al HCB (5 µM) adquirieron un fenotipo semejante al de los
fibroblastos asociados a cáncer. Mediante un proceso que involucra al AhR, el tóxico
indujo la expresión de α-SMA, mientras que redujo el contenido del TβRII, ambas
características asociadas con una mayor progresión y agresividad de los tumores mamarios
(Busch y col., 2015; Gorska y col., 2003). Resulta interesante que el medio condicionado de
estos fibroblastos activados estimula la migración de las células NMuMG, al mismo tiempo
que retrasa la progresión del ciclo celular, sugiriendo que se está seleccionando y
priorizando la capacidad migratoria de las células.
Históricamente, las inversiones en la investigación del cáncer de mama se han
centrado principalmente en el diagnóstico y el tratamiento, mientras que los avances en el
área de la prevención del cáncer de mama, y en encontrar formas de identificar y mitigar
las causas ambientales de la enfermedad, no han sido una prioridad (IBCERCC, 2013). La
exploración específica del impacto de los factores ambientales en el desarrollo mamario es
necesaria, porque las alteraciones que induzcan, podrán influir en el riesgo de cáncer de
mama. Se ha postulado que el aumento significativo de la incidencia del cáncer de mama
en el mundo industrializado, observado en los últimos años, puede ser debido a la
exposición a los productos químicos que actúan como DEs. Los resultados obtenidos en
este estudio advierten sobre los efectos adversos del HCB para la salud humana, así como
su papel como factor de riesgo en la carcinogénesis mamaria. Estudios epidemiológicos
serían fundamentales para evaluar si existe una correlación entre lo observado a nivel
experimental y lo que ocurre en diferentes poblaciones humanas.
El HCB se encuentra prohibido en la mayoría de los países del mundo, por sus
características toxicológicas, su persistencia y biomagnificación en el hombre y el medio
ambiente. Sin embargo, varios estudios reportaron la presencia de HCB en una gran
proporción de muestras humanas, que incluyen tejido adiposo mamario, suero de
Conclusiones y Perspectivas 141
puérperas y de cordón umbilical, así como leche materna (Arrebola y col., 2016; Bravo y
col., 2017; Der Parsehian, 2008; Guo y col., 2014). Del análisis de estos resultados, se pone
de manifiesto la relevancia del problema, la baja adhesión a las normas y la persistencia de
pesticidas organoclorados en la cadena alimentaria. Consideramos que se debería tomar
con mayor seriedad y compromiso las decisiones de políticas públicas de control con
respecto al uso de este tipo de sustancias. De esta manera, se tendrían que implementar
reglamentaciones que tengan como objetivo reducir o eliminar las exposiciones
ambientales perjudiciales. Adicionalmente, los organismos correspondientes deberían
determinar los niveles de HCB en suelo, agua y alimentos en las distintas zonas del país,
con el fin de evaluar la implementación de dichas regulaciones. Por otro lado, la
complejidad del cáncer de mama requiere que se intensifiquen los esfuerzos para
identificar aquellos compuestos químicos con consecuencias adversas sobre la salud
humana y el medio ambiente.
En resumen, los resultados de esta Tesis evidenciaron que concentraciones
ambientales de HCB modulan las vías de señalización del AhR y del TGF-β1. Esto podría
contribuir a las alteraciones observadas en la morfogénesis mamaria normal y a exacerbar
un fenotipo promigratorio, tanto en las células epiteliales normales como en las células
neoplásicas, generando un mayor grado de malignidad.
En conclusión, nuestros hallazgos apoyan la hipótesis de que la presencia y
bioacumulación de disruptores endocrinos como el HCB en tejidos con alto contenido
graso y ventanas temporales de elevada sensibilidad, hacen de este compuesto un factor
de riesgo para el desarrollo tumoral mamario.
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