2º seminario me glicocalix

8/8/2019 2 seminario ME glicocalix

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Alumna: Nicole Fonseca Rivas

Docente: Patricia Grez Spikin

Curso: Microscopa Electrnica

Universidad de Concepcin

Tecnologa Mdica

Morfofisiopatologa y Citodiagnstico


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Desde el inicio de la microscopia electrnica el

estudio celular ha sido uno de los principalestemas de estudio, ya sea de organismos

eucariotas o procariotas, pero la gran piedra de

tope de los estudios, ya sean citoplasmticos o

sobre ultraestructura celular ha sido el limite deresolucin de los equipos utilizados, tanto as

como los mtodos de fijacin utilizados y

finalmente por los mtodos empleados para

incrementar el contraste.


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La estructura de los componentes de la pared

bacteriana se ha ido describiendo de manerasecuencial y detallada a la vez que se mejoranlas tcnicas de estudio.

Por ejemplo, lo que tradicionalmente sedescribi como el espacio periplsmico y comoexclusivo de bacterias Gram negativas, hoy sedescribe como periplasma y est constituidopor peptidoglican menos laxo que el del restode la pared y este periplasma es comn a

bacterias Gram negativas y Gram positivas,aunque es ms prominente en las primeras.


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Los componentes extracelulares, comoglicoclix, son factores de virulencia

importantes.

Funciones del glucoclix:

1- Selectividad en la incorporacin de sustancias de bajo pesomolecular a la clula.

2- Reconocimiento especfico de clulas entre s.

3- Uniones intercelulares y de las clulas con la matriz extracelular

mediante glucoprotenas transmembrana cmo: integrinas y

catherinas.

4- Propiedades inmunitarias.5- Anclaxe de enzimas.

6 - Cambios en la carga elctrica en medio extracelular.


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No obstante con el mtodo convencional detincin para Inmunohistoqumica no se

evidencian claramente dichos componentes, es

por tanto q en este trabajo se evaluaran la

tcnica convencional versus una tcnica

alternativa de fijacin que incluye rojo de rutenio

para estabilizar esos materiales extracelulares,

gracias al efecto estabilizador del rojo de rutenio

sobre grupos aninicos, lo que pone de

manifiesto el glicoclix.


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Pseudomonas Aeruginosa

Es una bacteria gram-negativa

Bacilo que se puede hallar solo o en par.

Es uno de los principales agentes aislados

de infecciones intrahospitalarias, entre

ellas, neumona asociada a ventilacin

mecnica, infecciones urinarias, de piel y

partes blandas


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Cepa de Pseudomonas Aeruginosa

Inoculacin e incuvacin 37C por 24hrs

Recoleccin de colonias

Y divisin en partes iguales

Protocolo

convencional

Protocolo

ModificadoSuspensin en

Buffer Fostato pH 7.2

1 fijacin con Glutaraldehido

2,5% en buffer Fosfato 0,1mM

a pH 7,2 por 2 hrs a 4C

Postfijacin con Tetroxido de

Osmio en buffer Fosfato 0,1mM

a pH 7,2 por 1 Hrs a 4C

Inclusin en coagulo de plasma

Y seccin de 1mm3

fijacin con Glutaraldehido2,5% en buffer Fosfato 30min

Lavado en buffer

Postfijacin con Tetroxido de

Osmio en buffer Fosfato 0,1mM a

pH 7,2 por 1 Hrs a 4C

Suspensin en Buffer

Cacodilato 0.1mM pH 7.2

fijacin con Glutaraldehido 2,5% en

buffer Cacodilato 0,1mM a pH 7,2 +

Rojo de Rutenio 0,075% y Lisina50mM por 30min a tem. amb

fijacin con Glutaraldehido 2,5%

en buffer Cacodilato 0,1mM a pH

7,2 + Rojo de Rutenio 0,075% por

100min a tem. amb

Deshidratacin en etanol creciente de 30%

a 100% por 10 min en c/u a tem. amb

Inclusin en resina SPURR

Tincin con Acetato de Uranilo

Y Citrato de Plomo


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Resultados

En las muestras fijadas por el mtodo

estndar se obtiene buena informacin del

citoplasma, pero la membranacitoplasmtica y la pared bacteriana

aparecen poco definidas; adems, el

exterior de las bacterias aparece limpio

debido a la prdida de materiales de

glicocalix (figs. 1 y 2).


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Fig. 1 Fig. 2

Figuras 1 y 2.- Micrografas electrnicas de transmisin,

correspondientes a un corte transversal y otro longitudinal dePseudomonas aeruginosa. Muestras procesadas con el mtodo

estndar, utilizando una doble fijacin con glutaraldehido

y osmio. Se observa una buena conservacin del citoplasma y

pared bacteriana, pero el glicoclix no se evidencia. (Barra=

0.25 M).


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Por otra parte, cuando se incluy lisina yrojo de rutenio en la solucin fijadora se

aprecia un mayor contraste, que delimitamejor los componentes como membranacitoplsmica, capa de peptidoglican,periplasma y membrana externa (figs. 3 y

4). Adems, externamente a la paredbacteriana aparece un material amorfoelectrn denso, que corresponde alglicoclix.


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Fig. 3 Fig. 4

Figuras 3 y 4.- Micrografas electrnicas de transmisin de Pseudomonas aeruginosa. Al fijador,

tanto glutaraldehido como osmio, se agreg rojo de rutenio y lisina. Se aprecia un mayor contrastey aparece el glicoclix como un meterial electrn denso (flechas pequeas) rodeando las bacterias.

En la pared bacteriana se aprecian fcilmente los elementos constitutivos. La flecha grande seala

la capa de peptidglican, al lado interno aparece la membrana citoplasmtica como una lnea negra

y hacia el exterior el periplasma y la membrana externa. (Barra=0.25 M).


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Discusin

El mtodo de fijacin empleado en microscopiaelectrnica ms frecuentemente consiste en una doblefijacin secuencial con aldehidos. Generalmente seutiliza glutaraldehido, en una concentracin entre el 1%

y 6% en amortiguador de fosfatos a pH 7.2. Tal mtodo ha brindado magnficos resultados para

describir la ultraestructura tanto de clulas eucariotascomo procariotas. El primer fijador estabilizafundamentalmente la matriz proteica de la clulas y el

segundo los lpidos. Sin embargo, el glicoclix, integradofundamentalmente por mucopolisacridos y localizadoexternamente a la membrana o a la pared bacteriana nose evidencia con esta fijacin estndar, por lo que lasclulas aparecen limpias.


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El mtodo de fijacin alterno, que emplea lisina y rojo derutenio en buffer cacodilato, el cual estabiliza los polmeros

constituyentes de la cpsula e incrementa suelectrodensidad, lo que facilita la observacin al microscopioelectrnico de las estructuras externas a la membranacitoplasmtica (fig 3 y 4).

En la mezcla de fijacin la lisina acta como agenteestabilizador de la cpsula y glicoclix. Adems, tiene la

habilidad de formar largos polmeros cuando reacciona conglutaraldehido, produciendo puentes cruzados, confiriendogran estabilidad a los constituyentes capsulares durante elproceso de deshidratacin y aumentando la electrodensidadde la preparacin. Por otro lado, el rojo de rutenio se une agrupos aninicos y sirve de receptor para el osmio, lo queen ltima instancia se traduce en un aumento de laelectrodensidad en el glicocalix, lo que se evidencia en losresultados obtenidos. Por lo tanto, recomendamos lainclusin de lisina y rojo de rutenio en la fijacin desuspensiones.


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Bibliografa y Linkografa

Comparacin de dos mtodos de fijacin para laestabilizacin de glicoclix bacteriano. Rev Biomed1998; 9:7-11.

Microbiologa Mdica, 5 edicin, Patrick R. Murray,editorial Elsevier Mosby.

http://bases.bireme.br/cgi-bin/wxislind.exe/iah/online/?IsisScript=iah/iah.xis&src=google&base=LILACS&lang=p&nextAction=lnk&exprSearc

h=2346&indexSearch=ID http://www.elergonomista.com/biologia/cit12ma.htm

http://www.microbiologia.org.mx/microbiosenlinea/CAPITULO_06/Capitulo06.pdf

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