PRÁCTICA N° 01

MÉTODOS DE SIEMBRA Y AISLAMIENTO

I. INTRODUCCIÓN

El funcionamiento de un ecosistema depende en gran medida de la actividad microbiana del suelo, ya que los microorganismos son los protagonistas de diversas acciones benéficas para las plantas a las que se asocien. Entre otras capacidades, los microorganismos facilitan la captación de nutrientes, producen fitohormonas favorecedoras del enraizamiento, protegen a la planta frente a los patógenos, descomponen sustancias tóxicas en el ecosistema y mejoran la estructura del suelo.

La gran variabilidad en la composición de los suelos referida a la cantidad y el tipo de sustancias nutritivas, la humedad, la aireación, la temperatura, el pH, las interacciones, la presencia de raíces y las prácticas agrícolas, entre otras, producen grandes diferencias en la densidad y diversidad de la población microbiana.

Es fundamental el conocimiento de la gran diversidad microbiana del suelo, su estructura físico química, etc.; solo así podremos determinar los microorganismos presentes cuando se realiza la siembra y aislamiento de los mismos.

MÉTODOS DE SIEMBRA: Es el procedimiento por el cual se pone en contacto el microorganismo con el medio de cultivo para que en condiciones óptimas de nutrición, temperatura y tiempo pueda desarrollarse la bacteria in vitro. El dispositivo empleado se denomina “asa de siembra”, “asa de platino”, “asa bacteriológica” o “asa de Kolle” y se usan diversos métodos: Siembra por diseminación en superficie en placas de agar (estría, agotamiento, por cuadrantes, por diseminación con la espátula de Drigalsky), Siembra por difusión en placa o placa vertida, Siembra en tubo con agar inclinado, siembra en tubo con agar, siembra en medios líquidos, etc.

Técnicas para medio sólidoCuando el medio de cultivo a sembrar es sólido, se puede sembrar en superficie, en profundidad o en profundidad y superficie.

a. Por estría simple o agotamiento: Se levanta la tapa lo suficiente como para permitir la introducción del asa bacteriológica con la carga de microorganismos, iniciándose la estría en el borde del medio más alejado del operador y se la extiende hasta llegar al otro extremo de la placa, siendo mayor la separación o espaciado de las estrías. Esta división evita el obstáculo del borde de la placa. (Figura 1)

b. Por estría en cuadrantes: Se divide la placa en cuatro sectores y se siembra en estría cada uno de ellos, partiendo del borde de la caja hacia el centro. (Figura 2)

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c. Por diseminación con la espátula de Drigalsky: Se deposita sobre el medio sólido contenido en la placa, un porcentaje del material a sembrar con una pipeta, que luego se extenderá por toda la superficie del medio con una espátula de DRIGALSKY. (Figura 3)

El conjunto de pasos a efectuar para lograr una siembra correcta, se conoce como técnica aséptica. La toma del inóculo es simple, pero se requiere tener en cuenta lo siguiente:

La siembra siempre debe realizarse al abrigo de las corrientes de aire (cerrar bien puertas y ventanas), con movimientos pausados, poco amplios, sin brusquedad y sin hablar.Coloque frente a usted el mechero y la preparación o muestra que contiene los microorganismos, así como el resto del material necesario (tubos, placas Petri, etc.). Todo ello ha de ser alcanzado con facilidad.Se debe trabajar a una distancia no mayor de 15 cm de la llama de un mechero.El asa o aguja de siembra se esteriliza por llameado directo (flamear hasta que alcance un rojo incandescente) y antes de retirar el inóculo debe facilitarse su enfriamiento, a fin de evitar el deterioro del material a sembrar (enfriar en la proximidad de la llama unos 10 segundos).Una vez realizada la siembra se esteriliza nuevamente el asa o aguja a la llama del mechero antes de depositarla sobre la mesa de trabajo.

¡IMPORTANTE!Es así que en nuestra práctica realizada en el laboratorio de microbiología tiene como finalidad el aislamiento de un cierto tipo de colonia.

MÉTODOS DE AISLAMIENTOEl aislamiento de microorganismos a partir de muestras naturales se realiza en la mayoría de los casos mediante la producción de colonias aisladas en cultivos sólidos.

El crecimiento explosivo de los microorganismos permite producir un gran número de ellas a partir de una única célula inicial de forma que, tras un periodo de incubación en las condiciones ambientales adecuadas, se produce una colonia observable a simple vista y formada por individuos iguales (un clon bacteriano).

Sin embargo, no todos los microorganismos presentes en las muestras ambientales son cultivables (microorganismos no cultivables). Esto es debido a dificultades intrínsecas en el cultivo (microorganismos parásitos de otros), al desconocimiento de los requerimientos específicos de cultivo, y a la existencia de grupos de microorganismos que deben mantenerse en equilibrio para poder sobrevivir (casos de sintrofía por ejemplo). Se estima que en sólo en torno al 1% de las bacterias del suelo al 0,1 - 0,01 % de las bacterias marinas son cultivables.

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MANIPULACIÓN DE CULTIVOSLos cultivos bacterianos deben ser tratados con el mayor cuidado, para evitar tanto laContaminación del operador como la de los cultivos mismos; las recomendaciones son:

Trabajar siempre frente a la llama de un mechero.Mantener los tubos en posición vertical y tapados. Colocar las placas petri en posición invertida, para evitar que el agua de condensación contamine la superficie y mantenerlas cerradas.El asa de siembra debe ser esterilizada antes y después de su uso.Todos los cultivos deben tener las anotaciones siguientes: nombre del germen, nombre del alumno, número de mesa y fecha. En conclusión, deben estar rotuladas correctamente.En caso de accidente durante el trabajo, avisar al profesor.

ESQUEMA DEL PROCESO DE TRABAJO

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AISLAMIENTO PRIMARIO

AISLAMIENTO SECUNDARIO

LECTURA

LECTURA

Muestra sembrada directamente

- Elegir una colonia (descripción)- Tinción Gram

Resiembra

Se confirma con la 1ra lectura (estudio microscópico). Tinción Gram

PRIMERA PRÁCTICA

SEGUNDA PRÁCTICA

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II. OBJETIVOS

Objetivo General

Dar a cada estudiante la manejabilidad necesaria para sembrar muestras en diversos medios, y comprende que la finalidad del trabajo es el aislamiento de los microorganismos realizando correctamente la lectura.

Objetivos Específicos

Conocer los principios generales de las técnicas de esterilización de materiales de vidrio y medios de cultivo.Conocer las diferentes técnicas de siembra y aislamiento en medios de cultivos sólido y líquido.Aprender hacer la correcta lectura de las colonias.

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III. MATERIALES

Muestra de suelo (a) Placas Petri con Agar Nutritivo (b)Placas Petri estériles (c)Asa bacteriológica (d)Tubos de ensayo con Caldo Nutritivo (e)Solución salina fisiológica estéril (f)Pipetas de 1 ml (g)Espátula de Drigalsky (h)Balón con Agar Nutritivo (i)

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IV. PROCEDIMIENTOA. SIEMBRA

1. Siembra por diseminación en superficie en placas de agar.1.1.Agotamiento y estría simple o por cuadrantes.

PRIMERA PLACA PETRIEn nuestro caso hicimos uso de la técnica de estría por cuadrantes, también se pudo haber realizado por agotamiento o estría simple. Los pasos fueron:

¡No olvidar los pasos de la Manipulación de cultivos!a. Se esteriliza el matraz en el cual se depositará la muestra de suelo.

b. Se agrega una porción de la muestra al matraz, muestra previamente tamizada (partículas muy finas).

c. Se agrega solución salina fisiológica en el matraz que contiene la muestra de suelo, el objetivo es diluir y homogenizar la muestra.

d. En la placa que contiene agar nutritivo realizamos la siembra: Se esteriliza el asa bacteriológica, se enfría, con la misma se toma la muestra y se agota sobre el agar nutritivo, con la técnica estría por cuadrantes (nuestro caso). Luego rotular la placa y se incuba a 37°C/24 h.

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1.2.Por diseminación con la espátula de Drigalsky.

SEGUNDA PLACA PETRIPara este segundo procedimiento también se contó con una placa Petri conteniendo agar nutritivo. Los pasos fueron:

a. Haciendo uso de la misma muestra del ejercicio 1.1. (muestra del suelo diluida con solución salina fisiológica), se pipetea 1 mL de la misma hacia la placa Petri con agar nutritivo. Es importante aclarar los pasos de la “manipulación de cultivos”: hacer usos del mechero para esterilizar la zona de trabajo, hacer uso de los materiales y las técnicas siempre a una distancia prudente del mechero.

b. Hacer uso de la espátula de Drigalsky para extender la muestra de suelo por toda la superficie de la placa con agar nutritivo.

c. Se incuba la placa Petri con la siembra a 37°C/24 h.

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2. Siembra por difusión en placa o placa vertida.

TERCERA PLACA PETRIPara este tercer caso se hace uso de una placa Petri vacía estéril, un balón que contiene agar nutritivo, y la misma muestra de suelo ya preparada para los ejercicios anteriores. Los pasos son:

a. Haciendo uso de una pipeta se toma 0,5 ml de la muestra de suelo, ésta es llevada hacia la placa Petri vacía y se deposita en la misma.

b. La boca del balón que contiene agar nutritivo se flamea, la finalidad es “esterilizar”. Se agrega aproximadamente 10 ml de agar nutritivo en la placa Petri conteniendo la muestra. Se tapa la placa Petri, se esteriliza la boca del balón y se tapa con un corcho de algodón.

c. Acto seguido se realiza movimientos circulatorios de la placa Petri, colocándola sobre la superficie o mesa. El objetivo es homogenizar la muestra con el agar nutritivo.

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3. Siembra en tubo con agar inclinado.Para este método se cuenta con tubos de ensayo contiendo el agar, pero el agar se encuentra inclinado, también se llama pico de flauta. Las técnicas con las que se hace la siembra son diversas.

4. Siembra en tubo con agar.De la misma manera que en procedimiento anterior se cuenta con un tubo de ensayo conteniendo agar, pero a diferencia del anterior ya no se cuenta con el pico de flauta o agar inclinado.

5. Siembra en medio líquidos.

Para este procedimiento se cuenta con dos tubos de ensayo con Caldo Nutritivo, además de hacer uso de la muestra de suelo; entonces el procedimiento fue:

a. Tomar y esterilizar el asa bacteriológica sobre el mechero.

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b. Se toma una muestra con el asa bacteriológica, se siembra en el tubo de ensayo que contiene Caldo Nutritivo y se agita con el asa bacteriológica. Posteriormente se tapa los tubos de ensayo con una porción de algodón.

B. LECTURA

La lectura consiste en dos procedimientos simples: una lectura macroscópica y una lectura microscópica. Para la primera se escoge una colonia de bacterias de interés y observamos sus características, tales como:

En medios sólidos En medio líquidoForma TurbidezColor ¿Formación de película?Borde ¿Formación de anillo?Tamaño (diámetro) ¿Se sedimenta?Elevación CoposAspecto

Y para la segunda se realiza un procedimiento un poco más sofisticado pero no difícil, se realiza la Tinción Gram y se observa al microscopio. Este procedimiento a nivel microscópico se explicará mejor en la “Segunda Práctica”.

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V. RESULTADOS

Siembra por diseminación en superficie en placas de agar

Siembra por difusión en placa

o placa vertida

Siembra en medios líquidos

Placa 1 Placa 2 Placa 3 Tubo 1Forma: circularColor: cremaBorde: enteroTamaño: 5 mmElevación: convexaAspecto: liso

Debido a la manera en que realizó la siembra el crecimiento de las colonias fue en toda la placa, no pudiendo obtener el crecimiento de las colonias separadas.

Al igual que en la placa 2, debido a la manera en que realizó la siembra el crecimiento de las colonias fue en toda la placa, no pudiendo obtener el crecimiento de las colonias separadas.

Turbidez: Si existióSe formó una película.

VI. CONCLUSIONES

Se aprendió los métodos y las técnicas de siembra: Siembra por diseminación en superficie en placas de agar (agotamiento y estría simple y por cuadrantes), siembra por difusión o placa vertida y siembra en medios líquidos.Se obtuvo la confianza y manejabilidad para realizar las siembras correctamente, además haciendo uso de los principios generales de las técnicas de esterilización de los materiales y medios de cultivo.Se comprendió que la finalidad de la siembra de microorganismos, haciendo uso de los métodos y técnicas tienen como fin último la lectura; lectura tanto a nivel macro como microscópico. La lectura en medios sólidos como en medios líquidos se lleva a cabo de diferente manera. Por ejemplo en medios sólidos se observa: forma, color, borde, tamaño, elevación, aspecto. Y en medios líquidos se observa: si existe turbidez, si se formó una película u anillo en la superficie, si sedimentó, copos, etc.

VII. REFERENCIA MANACORDA, Ana M., CUADROS, Daniela P., ALVAREZ, Anahí. 2007. Manual Práctico de Microbiología Ambiental I. Argentina-Buenos Aires. Editorial Universidad Nacional del Comahue, 2da Ed. DOMINGUEZ , N. 2009. Microbiología Médica. Universidad Ricardo Palma.Apuntes de clase práctica

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VIII. ANEXOS

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Fig. 1. Estría simple o agotamiento Fig. 2. Por cuadrantes

Fig. 3. Con la espátula de Drigalsky

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a. Se esteriliza el medio, así como el asa bacteriológica, la boca del balón que contiene el agua destilada estéril.

b. Se coge con el asa bacteriológica un porcentaje de agua destilada estéril y se coloca sobre una lámina portaobjetos; acto seguido se hace uso de una aguja bacteriológica para tomar una muestra de la colonia que se desea estudiar y observar, ésta se extiende sobre la lámina portaobjetos (frotis) y luego se flamea.

c. Una vez flameada la lámina se realiza la tinción Gram

Pasos de la Tinción Gram:

Sobre la lámina portaobjetos primero se agrega Cristal Violeta (reposar de 3-5 minutos), acto seguido se lava.Se procede agregar Lugol (reposar 1 min), acto seguido lavar.Se agrega Alcohol Acetona (reposar de 30 segundos a un minuto), acto seguido se lava.Y por último se agrega Safranina (se reposa por 3 minutos), y se lava por última vez, para proceder a observar en el microscopio.

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